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重组人源性抗菌肽C16LL-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法

阅读：331发布：2020-08-09

专利汇可以提供重组人源性抗菌肽C16LL-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物工程技术领域，是一种重组人源性抗菌肽C16LL‑37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法，对重组抗菌肽C16LL‑37的抗菌活性、靶向性、溶血性等各项生物活性分析应用。采用标准固相合成技术合成，将人源性抗菌肽LL‑37的氨基酸序列与变异链球菌CSP的C端16个氨基酸序列CSPC16通过连接体‑GGG‑连接，合成特异性靶向能力的重组人源性抗菌肽C16LL‑37。综上所述，人源性特异性靶向抗菌肽C16LL‑37的研发不仅解决了天然抗菌肽抗菌谱广、易产生耐药性、生物效能低、筛选难度高等问题，而且克服了化学合成抗菌肽化学结合效率低、融合性蛋白不稳定等缺点。此外，C16LL‑37的AMP区域来源于人体，较高的生物安全性为其今后在临床的广泛应用奠定了坚实基础。，下面是重组人源性抗菌肽C16LL-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种重组人源性抗菌肽C16LL-37，采用标准固相合成技术合成，其特征在于将人源性抗菌肽LL-37的氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES与变异链球菌CSP的C端16个氨基酸序列CSPC16为TFFRLFNRSFTQALGK通过连接体-GGG-连接，合成特异性靶向能力的重组人源性抗菌肽C16LL-37为TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2。
2.根据权利要求1所述的重组人源性抗菌肽C16LL-37的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
A、树脂的溶胀
使用前，将反应管在浓度为7.6ml/g的二氯甲烷DCM中浸泡处理5h，再称取5g Fomc-Rink-amide-MBHA树脂加至反应管中，沿管壁加入浓度为7.6ml/g的二氯甲烷DCM50ml，使其将树脂浸没，浸泡2-3h树脂充分溶胀后，滤去反应液保留树脂，用质量浓度20%的N,N二甲基甲酰胺DMF洗涤3次；
B、氨基Fmoc保护基团的脱去
氨基酸缩合之前，需将Fmoc保护基团从树脂上脱去，向反应管中加入质量浓度25%的哌啶溶液，并通入氮气反应3min，滤除溶液，使用哌啶溶液反复进行5次，再用质量浓度30%的异丙醇溶液和质量浓度20% 的DMF溶液将树脂洗涤3次，每次3min；
C、激活和交联
按目标多肽LL-37及C16LL-37的氨基酸序列自C端向N端依次缩合氨基酸，逐一缩合每一个氨基酸，反应时观察树脂是否变色，若不变色始终淡黄色代表缩合反应已完成，若变色变为淡蓝色则需延长缩合时间直至变回淡黄色代表缩合反应已完成；再对氨基酸的羧基用
20ml质量浓度为90% N,N-二环己基碳二亚胺DCC进行溶胀活化，活化的氨基酸与已接在固相载体的第一个氨基酸，氨基反应形成肽键，LL -3 7氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其C端的第一个氨基酸为L，即亮氨酸；C16LL-
37的氨基酸序列为
TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2，其C端的第一个氨基酸为T，即苏氨酸，将要合成的目标多肽羧基端的第一个氨基酸缩合后，在树脂载体上形成了含一个肽键的暂时的短肽为二肽，即在树脂载体上就形成了一个带有保护基的二肽；
D、洗脱和脱保护
向反应管内加入20ml质量浓度25%哌啶溶液浸没树脂，通入氮气进行吹沸反应2min，重复5次，脱去多肽链最后一个氨基酸的Fmoc保护基团；再向反应管加入20ml质量浓度25% 乙酸酐-哌啶溶液于室温下处理30min，使多肽的末端氨基乙酰化，分别使用20ml 质量浓度
20%的异丙醇及DFM溶液洗涤树脂3次，用氮气吹干树脂；
E、分离、纯化及检测
应用反相高效液相色谱法RP-high pressure liquid chromatography-RP-HPLC分离、利用C18反相柱纯化，尺寸为柱内径4.6mm×柱长度250mm，填料的粒径为5µm，检测波长为
220nm，并利用Mass spectroscopy对色谱分离主峰尖出现时的馏分进行质谱图分析。
3.根据权利要求2所述的重组人源性抗菌肽C16LL-37的制备方法，其特征在于所述步骤E的检测结果为LL-37的分子质量为4493.37km，纯度为95.22%； C16LL-37的分子质量为
6579.77km，纯度为98.87%。
4.根据权利要求1或2所述的一种重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌生物活性作用的应用方法，其特征在于包括如下步骤：
A、指示细菌制备
选用变异链球菌ATCC 2517、粘性放线菌ATCC 15987、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌，上述指示菌选用标准菌，在厌氧条件下37℃恒温摇床增殖处理12小时，增殖培养基选用MH培养基，增殖后菌落通过麦氏标准比
8 6
浊法测定浊度为0.5-1，菌落数为10CFU/ml，用MH培养基将各菌液稀释至1×10CFU/ml的细菌悬液备用；
B、抗菌肽最小抑菌浓度MIC及最小杀菌浓度MBC测试
将C16LL-37及LL-37母液进行二倍梯度稀释法稀释，母液浓度选用5120µmol/L，分别稀释为256µmol/L、128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L、16µmol/L、8µmol/L，取各浓度抗菌肽100µl分别装入无菌离心管内，每个浓度多肽均设5组，分别加入变异链球菌ATCC 2517、粘性放线菌ATCC 15987、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC
25923充分混匀；
阴性对照组，即无抑菌活性的培养基，与实验组多肽的抑菌效果进行比较，加入100µl MHB培养基，将离心管置于37℃恒温培养箱孵育2h，将各菌液1×103倍稀释后均匀涂布于MH琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数；
C、C16LL-37对变异链球菌靶向特异性的测定
将浓度为64µmol/L的C16LL-37分别加至含5种细菌悬液1×106CFU/ml的无菌离心管内，
100µl/支，充分混匀，置于37℃恒温培养箱培养，分别选30、60、120 mins为两种抗菌肽作用观察时间点，取每组样品10µl并行1×103倍稀释后，再取各样品30µl分别均匀涂布于MHA琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数，并计算各组细菌的存活率，菌落计数法同上；
D、时间-杀菌实验
分别取步骤B中浓度128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L的C16LL-37抗菌肽100µl装入无菌离心管内，分别加入含100µl 浓度1×106CFU/ml的变异链球菌细菌悬液，充分混匀；
MHB培养基为阴性对照组，将离心管置于37℃恒温培养箱孵育，分别于0、30、60、90、
120、150mins时作用观察时间点，取每组样品10µl并行1×103倍稀释后，再取各样品30µl分别均匀涂布于MHA琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数，计算各组细菌的存活率，并对菌落计数。
5.如权利要求4所述的一种重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌生物活性作用的应用方法，其特征在于还包括如下步骤：
E、溶血实验
取健康人体新鲜静脉血分装至含质量浓度1g/L肝素钠溶液的无菌离心管内，静脉血和肝素钠溶液共1.5ml，离心力1000g离心处理10min，弃上清液留存红细胞，将KCl 0.2g、NaCl
8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4•12H2O 3.14g等化学试剂依次溶解于含1000ml无菌去离子水中制得PBS缓冲液，并装入三角烧瓶内，充分混匀，调节PH值为7，置于灭菌锅中灭菌处理，清洗红细胞2-3次后，再利用PBS缓冲液将红细胞配制成体积浓度4%的悬液，加入至96孔聚苯乙烯板内，每孔添加100µl；再将步骤B中512µmol/L、128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L、16µmol/L、8µmol/L不同浓度的C16LL-37和LL-37加入至各孔内，每孔添加100µl；
阴性对照组及阳性对照组分别加入100µl PBS缓冲液及体积浓度0.2%聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100，将各板置于37℃恒温培养箱孵育2h后，离心力1000g离心处理10min，取上清100µl，多肽如果具有溶血活性，将红细胞的细胞膜溶解破坏，上清液的OD值会显著增加，转移置新的96孔聚苯乙烯板，利用酶标仪检测450nm处各样品的OD值；
F、扫描电子显微镜SEM观察
设MHB培养基为阴性对照组，取500µl浓度32µmol/L的C16LL-37、32µmol/L 的LL-37及MHB培养基分别加入500µl 变异链球菌悬液1×106CFU/ml的无菌离心管内，充分混匀，并置于37℃恒温培养箱孵育2hrs，2hrs后，10000 rpm离心5min弃上清，加入步骤E中PBS缓冲液清洗2-3次，加入体积浓度2.0％戊二醛缓冲剂并于4 ℃条件下固定24h，取出各样品，离心，弃上清，PBS 缓冲液清洗2-3次后乙醇梯度脱水，再用体积浓度100 %叔丁醇置换体积浓度
100 %乙醇 2-3 次后溶于体积浓度100%叔丁醇，吸取细菌-叔丁醇悬浮液滴于覆有盖玻片的样品台，放置于ES-2030形冻结真空干燥装置冷冻干燥机，0.03pa内真空-40℃干燥5h，E-
1010离子溅射装置喷金， S-3400N镜下观察。
6. 如权利要求1所述的一种重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌生物活性作用的应用方法，其特征在于还包括
G、C16LL-37的稳定性分析
G1、不同温度测定
64µmol/L的 C16LL-37分别置于17℃、27℃、37℃、47℃、57℃温度下处理30min，待降至常温，将抗菌肽分别加入100µl变异链球菌细菌悬液1×106CFU/ml的96孔聚苯乙烯板内；
G2、不同盐浓度测定
128µmol/L的C16LL-37 50µl分别加入100µl变异链球菌悬液1×106CFU/ml的96孔聚苯乙烯板内，再分别加入50µl的200µmol/L、300µmol/L、400µmol/L、800µmol/L的Nacl溶液，充分混匀，稀释调节使Nacl的浓度分别为100µmol/L、200µmol/L、300µmol/L、400µmol/L；
G3、不同PH值测定
分别利用PH值为6的HCL溶液及PH值为8的NaOH缓冲液将三组64µmol/L 的C16LL-37的PH值调至5.5、6.5、7.5；
G4、不同浓度胰蛋白酶测定
128µmol/L的C16LL-37分别用不同浓度0µmol/L、2µmol/L、20µmol/L、200µmol/L、2000µmol/L的胰蛋白酶37℃处理6h ，分别加入至含100µl变异链球菌细菌悬液1×106CFU/ml的
96孔聚苯乙烯板内，充分混匀；
将以上G1、G2、G3、G4各组样品分别置于37℃恒温培养箱孵育2h后，利用酶标仪检测
600nm处各组的OD值。
7. 根据权利要求4所述的一种重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌生物活性作用的应用方法，其特征在于所述步骤B中以浓度为256µmol/L的C16LL-37为例，分别取5 支无菌离心管内100µl该浓度多肽，分别标记为256a、256b、256c、256d、256e,再分别向其中加入步骤A中的细菌悬液100µl，分别在256a中加入变异链球菌ATCC 2517、256b中加入粘性放线菌ATCC 15987、256c中加入嗜酸乳杆菌ATCC 4356、256d中加入大肠杆菌ATCC 25922和
256e中加入金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

说明书全文

重组人源性抗菌肽C16LL-37及其对变异链球菌生物活性作用

的应用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，是一种重组人源性抗菌肽C16LL-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法，对重组抗菌肽C16LL-37的抗菌活性、靶向性、溶血性等各项生物活性分析应用。

背景技术

[0002] 变异链球菌(Streptococcus mutans，SM)为人类龋病的最主要致病菌，抑制变异链球菌的增殖对阻断龋病的发生发展具有重要意义。目前，临床常用的抗龋药物如氯己定、氟制剂、银离子制剂等均为化学合成抗生素，具有广谱的抗菌活性，长期使用易导致耐药菌株增多及口腔菌群失衡等不良后果。

[0003] 天然抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是一种具有生物活性的小分子多肽，种类繁多，作用迅速，为机体免疫系统的重要组成部分。AMP主要通过破坏细菌细胞膜，使其内容物外溢导致细菌死亡，这一独特的抗菌机制赋予了其不易产生耐药性、对大多耐药微生物仍具显著抗菌活性的优势。但因AMP具备广谱的抗菌活性，无法针对特定病原菌发挥抑制作用，易造成口腔生态系统失衡等不良后果。此外，AMP还存在生物效能低、筛选难度高、蛋白水解不稳定等缺点。以上问题的出现伴随着耐药致病菌日益增多，研发一种可针对某种病原菌发挥显著抑菌活性的抗菌肽尤为迫切。

[0004] 1995年，研究者首次发现天然抗菌肽LL-37广泛分布于人体，如皮肤、口腔、精液及创伤部位等，是迄今为止唯一被发现的cathelicidins家族抗菌肽,也是人体内唯一的α-螺旋结构抗菌肽。作为人源性抗菌肽，LL-37不仅具备极高的生物安全性，且与其它AMP相似，其独特的抗菌机制不易导致病原菌发生抗性突变。因此，LL-37可作为新型抗生素设计、合成的理想模板和分子骨架。

[0005] 特异性靶向抗菌肽(Specifically Targeted AntiMicrobial Peptides, STAMPs)由靶向定位区域（KH）、抗菌区域(AMP)和(或)连接体区域组成。STAMPs通过KH区域增高目标细菌表面AMP浓度，使抗菌肽的杀伤效力及动态性能全面提升。Eckert等以变异链球菌非依赖感受态刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）C端16个氨基酸序列（TFFRLFNRSFTQALGK）即CSPC16作为STAMP的KH区域，通过连接体（-GGG-）与抗生素novispirin G2连接合成新型抗菌肽C16G2。研究发现，C16G2抗菌活性强,且对变异链球菌有显著的靶向特异性。然而，novispirin G2作为一种化学合成抗生素，具有一定的细胞毒性。因此，C16G2能否长期安全的应用于临床还需进一步考证。

[0006] 本研究拟以LL-37为AMP区域，以变形链球菌CSPC16为KH区域合成一种人源性重组抗菌肽，并对其靶向特异性、体外抗菌活性、生物安全性及稳定性等生物学活性进行分析讨论。

发明内容

[0007] 本发明提供一种重组人源性抗菌肽C16LL-37及其对变异链球菌生物活性作用的应用方法，其目的在于重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌具备显著的靶向特异性及较强的抗菌活性，且具有较高的生物安全性及良好的稳定性；C16LL-37主要通过破坏细菌细胞膜使细胞内容物外溢，导致细菌死亡。

[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种重组人源性抗菌肽C16LL-37，采用标准固相合成技术合成，其特征在于将人源性抗菌肽LL-37的氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES与变异链球菌CSP的C端16个氨基酸序列CSPC16为TFFRLFNRSFTQALGK通过连接体-GGG-连接，合成特异性靶向能力的重组人源性抗菌肽C16LL-37为
TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2。

[0009] 2、根据权利要求1所述的重组人源性抗菌肽C16LL-37的制备方法，其特征在于包括如下步骤：A、树脂的溶胀
使用前，将反应管在浓度为7.6ml/g的二氯甲烷DCM中浸泡处理5h，再称取5g Fomc-Rink-amide-MBHA树脂加至反应管中，沿管壁加入浓度为7.6ml/g的二氯甲烷DCM50ml，使其将树脂浸没，浸泡2-3h树脂充分溶胀后，滤去反应液保留树脂，用质量浓度20%的N,N二甲基甲酰胺DMF洗涤3次；
B、氨基Fmoc保护基团的脱去
氨基酸缩合之前，需将Fmoc保护基团从树脂上脱去，向反应管中加入质量浓度25%的哌啶溶液，并通入氮气反应3min，滤除溶液，使用哌啶溶液反复进行5次，再用质量浓度30%的异丙醇溶液和质量浓度20% 的DMF溶液将树脂洗涤3次，每次3min；
C、激活和交联
按目标多肽LL-37及C16LL-37的氨基酸序列自C端向N端依次缩合氨基酸，逐一缩合每一个氨基酸，反应时观察树脂是否变色，若不变色始终淡黄色代表缩合反应已完成，若变色变为淡蓝色则需延长缩合时间直至变回淡黄色代表缩合反应已完成；再对氨基酸的羧基用
20ml质量浓度为90% N,N-二环己基碳二亚胺DCC进行溶胀活化，活化的氨基酸与已接在固相载体的第一个氨基酸，氨基反应形成肽键，LL-37氨基酸序列为
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其C端的第一个氨基酸为L，即亮氨酸；
C16LL-37的氨基酸序列为
TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2，其C端的第一个氨基酸为T，即苏氨酸，将要合成的目标多肽羧基端的第一个氨基酸缩合后，在树脂载体上形成了含一个肽键的暂时的短肽为二肽，即在树脂载体上就形成了一个带有保护基的二肽；
D、洗脱和脱保护
向反应管内加入20ml质量浓度25%哌啶溶液浸没树脂，通入氮气进行吹沸反应2min，重复5次，脱去多肽链最后一个氨基酸的Fmoc保护基团；再向反应管加入20ml质量浓度25% 乙酸酐-哌啶溶液于室温下处理30min，使多肽的末端氨基乙酰化，分别使用20ml 质量浓度
20%的异丙醇及DFM溶液洗涤树脂3次，用氮气吹干树脂；
E、分离、纯化及检测
应用反相高效液相色谱法RP-high pressure liquid chromatography-RP-HPLC分离、利用C18反相柱纯化，尺寸为柱内径4.6mm×柱长度250mm，填料的粒径为5µm，检测波长为
220nm，并利用Mass spectroscopy对色谱分离主峰尖出现时的馏分进行质谱图分析。

[0010] 所述步骤E的检测结果为LL-37的分子质量为4493.37km，纯度为95.22%； C16LL-37的分子质量为6579.77km，纯度为98.87%。

[0011] 一种重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌生物活性作用的应用方法，其特征在于包括如下步骤：A、指示细菌制备
选用变异链球菌ATCC 2517、粘性放线菌ATCC 15987、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌，上述指示菌选用标准菌，在厌氧条件下37℃恒温摇床增殖处理12小时，增殖培养基选用MH培养基，增殖后菌落通过麦氏标准比
8 6
浊法测定浊度为0.5-1，菌落数为10CFU/ml，用MH培养基将各菌液稀释至1×10CFU/ml的细菌悬液备用；
B、抗菌肽最小抑菌浓度MIC及最小杀菌浓度MBC测试
将C16LL-37及LL-37母液进行二倍梯度稀释法稀释，母液浓度选用5120µmol/L，分别稀释为256µmol/L、128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L、16µmol/L、8µmol/L，取各浓度抗菌肽100µl分别装入无菌离心管内，每个浓度多肽均设5组，分别加入变异链球菌ATCC 2517、粘性放线菌ATCC 15987、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC
25923充分混匀；
阴性对照组，即无抑菌活性的培养基，与实验组多肽的抑菌效果进行比较，加入100µl MHB培养基，将离心管置于37℃恒温培养箱孵育2h，将各菌液1×103倍稀释后均匀涂布于MH琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数；
C、C16LL-37对变异链球菌靶向特异性的测定
将浓度为64µmol/L的C16LL-37分别加至含5种细菌悬液1×106CFU/ml的无菌离心管内，100µl/支，充分混匀，置于37℃恒温培养箱培养，分别选30、60、120 mins为两种抗菌肽作用观察时间点，取每组样品10µl并行1×103倍稀释后，再取各样品30µl分别均匀涂布于MHA琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数，并计算各组细菌的存活率，菌落计数法同上；
D、时间-杀菌实验
分别取步骤B中浓度128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L的C16LL-37抗菌肽100µl装入无菌离心管内，分别加入含100µl 浓度1×106CFU/ml的变异链球菌细菌悬液，充分混匀；
MHB培养基为阴性对照组，将离心管置于37℃恒温培养箱孵育，分别于0、30、60、90、
3
120、150mins时作用观察时间点，取每组样品10µl并行1×10倍稀释后，再取各样品30µl分别均匀涂布于MHA琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数，计算各组细菌的存活率，并对菌落计数。

[0012] E、溶血实验取健康人体新鲜静脉血分装至含质量浓度1g/L肝素钠溶液的无菌离心管内，静脉血和肝素钠溶液共1.5ml，离心力1000g离心处理10min，弃上清液留存红细胞，将KCl 0.2g、NaCl
8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4•12H2O 3.14g等化学试剂依次溶解于含1000ml无菌去离子水中制得PBS缓冲液，并装入三角烧瓶内，充分混匀，调节PH值为7，置于灭菌锅中灭菌处理，清洗红细胞2-3次后，再利用PBS缓冲液将红细胞配制成体积浓度4%的悬液，加入至96孔聚苯乙烯板内，每孔添加100µl；再将步骤B中512µmol/L、128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L、16µmol/L、8µmol/L不同浓度的C16LL-37和LL-37加入至各孔内，每孔添加100µl；
阴性对照组及阳性对照组分别加入100µl PBS缓冲液及体积浓度0.2%聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100，将各板置于37℃恒温培养箱孵育2h后，离心力1000g离心处理10min，取上清100µl，多肽如果具有溶血活性，将红细胞的细胞膜溶解破坏，上清液的OD值会显著增加，转移置新的96孔聚苯乙烯板，利用酶标仪检测450nm处各样品的OD值；
F、扫描电子显微镜SEM观察
设MHB培养基为阴性对照组，取500µl浓度32µmol/L的C16LL-37、32µmol/L 的LL-37及MHB培养基分别加入500µl 变异链球菌悬液1×106CFU/ml的无菌离心管内，充分混匀，并置于37℃恒温培养箱孵育2hrs，2hrs后，10000 rpm离心5min弃上清，加入步骤E中PBS缓冲液清洗2-3次，加入体积浓度2.0％戊二醛缓冲剂并于4 ℃条件下固定24h，取出各样品，离心，弃上清，PBS 缓冲液清洗2-3次后乙醇梯度脱水，再用体积浓度100 %叔丁醇置换体积浓度
100 %乙醇 2-3 次后溶于体积浓度100%叔丁醇，吸取细菌-叔丁醇悬浮液滴于覆有盖玻片的样品台，放置于ES-2030形冻结真空干燥装置冷冻干燥机，0.03pa内真空-40℃干燥5h，E-
1010离子溅射装置喷金，S-3400N镜下观察。
G、C16LL-37的稳定性分析
G1、不同温度测定
64µmol/L的 C16LL-37分别置于17℃、27℃、37℃、47℃、57℃温度下处理30min，待降至常温，将抗菌肽分别加入100µl变异链球菌细菌悬液1×106CFU/ml的96孔聚苯乙烯板内；
G2、不同盐浓度测定
128µmol/L的C16LL-37 50µl分别加入100µl变异链球菌悬液1×106CFU/ml的96孔聚苯乙烯板内，再分别加入50µl的200µmol/L、300µmol/L、400µmol/L、800µmol/L的Nacl溶液，充分混匀，稀释调节使Nacl的浓度分别为100µmol/L、200µmol/L、300µmol/L、400µmol/L；
G3、不同PH值测定
分别利用PH值为6的HCL溶液及PH值为8的NaOH缓冲液将三组64µmol/L 的C16LL-37的PH值调至5.5、6.5、7.5；
G4、不同浓度胰蛋白酶测定
128µmol/L的C16LL-37分别用不同浓度0µmol/L、2µmol/L、20µmol/L、200µmol/L、2000µmol/L的胰蛋白酶37℃处理6h ，分别加入至含100µl变异链球菌细菌悬液1×106CFU/ml的
96孔聚苯乙烯板内，充分混匀；
将以上G1、G2、G3、G4各组样品分别置于37℃恒温培养箱孵育2h后，利用酶标仪检测
600nm处各组的OD值。

[0013] 所述步骤B中以浓度为256µmol/L的C16LL-37为例，分别取5 支无菌离心管内100µl该浓度多肽，分别标记为256a、256b、256c、256d、256e,再分别向其中加入步骤A中的细菌悬液100µl，分别在256a中加入变异链球菌ATCC 2517、256b中加入粘性放线菌ATCC 15987、256c中加入嗜酸乳杆菌ATCC 4356、256d中加入大肠杆菌ATCC 25922和256e中加入金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

[0014] 本发明的有益效果为：各指示菌对C16LL-37的敏感性较LL-37略低；C16LL-37对变异链球菌ATCC 2517 具备显著的靶向特异性P<0.05，且随浓度增高，抗菌活性增强，作用持续时间延长；SEM观察，发现C16LL-37处理后部分变异链球菌形态发生不规则改变，表面粗糙，可见细胞外碎屑；有效浓度≤64µM下，C16LL-37溶血率较低，具备较高的生物安全性；不同温度、PH值、盐浓度对C16LL-37抗菌活性影响较小，但高浓度胰蛋白酶处理后，C16LL-37抗菌活性显著降低P＜
0.05。重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌具备显著的靶向特异性及较强的抗菌活性，且具有较高的生物安全性及良好的稳定性；C16LL-37主要通过破坏细菌细胞膜使细胞内容物外溢，导致细菌死亡。

[0015] STAMPs由KH区域、AMP区域和(或)连接体区域组成。KH区域主要包括以下三种：1、细菌信息素或信号肽，如肠球菌信号肽cCF10 和cOB1、变异链球菌密度感应系统CSP等；2、化学合成的小分子多肽；3、抗菌肽自身携带的KH区域。变异链球菌作为口腔主要致龋菌，其密度感应系统中由comC基因编码的菌种间特异性信号分子非依赖感受态的刺激肽（CSP）具有介导细菌进入基因感受态，影响细胞转化突变、粘附聚集等重要作用。

[0016] Syvitski等通过对CSP的构效分析发现，CSP包含C端区域和α-螺旋结构两个重要的功能区域，C端去除部分氨基酸残基后仍能竞争性的抑制变形链球菌UA 159的密度感应，而被扰乱的α-螺旋结构却不能与受体结合，此研究表明，CSP的C端区域更适合作为KH区域。

[0017] 此外，Mai等将从比目鱼（Pleuronectes americanus）表皮中分离出的天然多肽pleurocidin的变异体NRC-4的部分氨基酸片段作为AMP区域，以变异链球菌CSP的C端部分氨基酸作为KH区域，成功地合成了变异链球菌特异性靶向抗菌肽IMB-2，并对其结构及生物活性研究发现，IMB-2对变异链球菌具有较强的抗菌活性及显著的靶向特异性。

[0018] LL-37为宿主天然免疫系统产生的具有广谱抗菌活性的小分子多肽，与传统抗生素不同，LL-37主要通过破坏细菌细胞膜使细胞内容物外溢或穿过细胞膜作用于胞内的多聚阴离子发挥抗菌活性，这一抗菌机制使其不仅不易导致耐药菌株的出现，对大部分耐药菌株都也具有较强的抑菌作用。LL-37作为内源性抗菌肽，广泛分布于人体，相对化学合成抗生素，具有极高的生物安全性。因此，本研究选择利用人源性抗菌肽LL-37的氨基酸序列与变异链球菌CSP的C端16个氨基酸序列（CSPC16）通过连接体（-GGG-）连接，合成了特异性靶向抗菌肽C16LL-37。

[0019] 研究发现，C16LL-37各区域分别发挥作用，KH区域（CSPC16）可靶向诱导抗菌肽到达目标菌即变异链球菌细胞表面，并与其表面受体特异性结合，细菌细胞表面抗菌肽浓度在短时间内急剧上升，因此，C16LL-37对变异链球菌的抑菌效果较其它指示菌显著提高。然而，LL-37为α-螺旋结构抗菌肽，其抗菌活性主要依赖α-螺旋结构的维持。LL-37与CSPC16重组后，其α-螺旋结构受到一定程度的破坏，因此，C16LL-37对五种指示菌的抗菌活性均不同程度降低，但其对变异链球菌的抗菌活性最强，表现出显著的靶向特异性。此外，本研究通过红细胞溶血实验发现，C16LL-37在有效剂量下溶血率甚小，即便在高浓度药物作用下，溶血率仍低于30%，表明C16LL-37具备较高的生物安全性，具有进一步的研究价值及临床应用价值。

[0020] 为初探C16LL-37的抗菌机制，本研究将C16LL-37处理后的变异链球菌通过SEM镜下观察发现，部分处理后的细菌细胞形态发生不规则改变，细胞膜破坏，可见细胞外碎屑。此现象进一步证实，与天然抗菌肽相似，C16LL-37也是通过破坏细菌细胞膜使细胞内容物外溢导致细菌死亡。因此，这一抗菌机制同样赋予C16LL-37不易产生耐药性的特点。

[0021] 口腔为牙齿的外环境与龋病的发生发展密切相关。改变口腔环境的主导因素包括两个方面：食物和唾液。进入口腔的食物不仅可通过自身的温度、湿度、酸碱度等直接改变口腔环境，还可刺激唾液腺唾分泌唾液间接改变口腔环境，其改变程度与进食频率、食物在口腔内的滞留时间等息息相关。面对如此复杂多变的口腔环境，本研究已证实，C16LL-37具备较高的稳定性，除胰蛋白酶的极度增高会影响C16LL-37的抗菌活性外，在口腔环境正常变化范围内，C16LL-37可充分发挥抗菌活性。

[0022] 综上所述，人源性特异性靶向抗菌肽C16LL-37的研发不仅解决了天然抗菌肽抗菌谱广、易产生耐药性、生物效能低、筛选难度高等问题，而且克服了化学合成抗菌肽化学结合效率低、融合性蛋白不稳定等缺点。此外，C16LL-37的AMP区域来源于人体，较高的生物安全性为其今后在临床的广泛应用奠定了坚实基础。

[0023] 然而，本研究选用天然抗菌肽LL-37全部（37个）的氨基酸作为AMP区域，导致重组抗菌肽氨基酸数目多，分子量大，结构不稳定，合成、分离及纯化过程费时、费力。因此，多肽合成前应对LL-37进行构效分析确定其氨基酸序列的主要功能区域后，在保证具备较强抗菌活性的基础上尽量减少氨基酸数目，使得STAMPs的合成及处理过程高效、快捷，结构稳定性增强。

[0024] 近年来，抗生素的大规模及大量应用带来了一系列公共安全问题。耐药菌株的日益增多成为许多感染性疾病难以控制的根本因素。因此，医学工作者们需研发出新药物新方法才能从根本上解决耐药菌株增多的问题，以更好地控制感染性疾病的发生发展。STAMPs在靶向抑制病原菌增殖的同时，良好的预防了口腔菌群失衡及耐药菌株增多等问题，随着各项研究手段日益成熟，其势必成为解决以上临床问题的一把金钥匙。
附图说明

[0025] 图 1 为C16LL-37对变异链球菌 ATCC 2517的靶向特异性；图 2 为C16LL-37、LL-37的红细胞溶血实验；
图 3 为不同浓度C16LL-37对变异链球菌 ATCC 2517的时间—杀菌曲线；
图4 为扫描电镜观察变异链球菌ATCC 2517的细胞形态学变化；
图5 为不同浓度胰蛋白酶处理后C16LL-37对S.mutans ATCC 2517 的抑菌活性；
图6为LL-37产物色谱图；
图7为LL-37产物色谱图峰值读取结果；
图8为LL-37主峰馏分的质谱鉴定图谱；
图9为C16 LL-37产物色谱图；
图10为 C16LL-37产物色谱图峰值读取结果；
图11为C16LL-37主峰馏分的质谱鉴定图谱。

具体实施方式

[0026] 一种重组人源性抗菌肽C16LL-37，采用标准固相合成技术合成，将人源性抗菌肽LL-37的氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES与变异链球菌CSP的C端16个氨基酸序列CSPC16为TFFRLFNRSFTQALGK通过连接体-GGG-连接，合成特异性靶向能力的重组人源性抗菌肽C16LL-37为
TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2。

[0027] 一种重组人源性抗菌肽C16LL-37的制备方法，包括如下步骤：A、树脂的溶胀
使用前，将反应管在浓度为7.6ml/g的二氯甲烷DCM中浸泡处理5h，再称取5g Fomc-Rink-amide-MBHA树脂加至反应管中，沿管壁加入浓度为7.6ml/g的二氯甲烷DCM50ml，使其将树脂浸没，浸泡2-3h树脂充分溶胀后，滤去反应液保留树脂，用质量浓度20%的N,N二甲基甲酰胺DMF洗涤3次；
B、氨基Fmoc保护基团的脱去
氨基酸缩合之前，需将Fmoc保护基团从树脂上脱去，向反应管中加入质量浓度25%的哌啶溶液，并通入氮气反应3min，滤除溶液，使用哌啶溶液反复进行5次，再用质量浓度30%的异丙醇溶液和质量浓度20% 的DMF溶液将树脂洗涤3次，每次3min；
C、激活和交联
按目标多肽LL-37及C16LL-37的氨基酸序列自C端向N端依次缩合氨基酸，逐一缩合每一个氨基酸，反应时观察树脂是否变色，若不变色始终淡黄色代表缩合反应已完成，若变色变为淡蓝色则需延长缩合时间直至变回淡黄色代表缩合反应已完成；再对氨基酸的羧基用
20ml质量浓度为90% N,N-二环己基碳二亚胺DCC进行溶胀活化，活化的氨基酸与已接在固相载体的第一个氨基酸，氨基反应形成肽键，LL -3 7氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其C端的第一个氨基酸为L，即亮氨酸；C16LL-
37的氨基酸序列为
TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2，其C端的第一个氨基酸为T，即苏氨酸，将要合成的目标多肽羧基端的第一个氨基酸缩合后，在树脂载体上形成了含一个肽键的暂时的短肽为二肽，即在树脂载体上就形成了一个带有保护基的二肽；
D、洗脱和脱保护
向反应管内加入20ml质量浓度25%哌啶溶液浸没树脂，通入氮气进行吹沸反应2min，重复5次，脱去多肽链最后一个氨基酸的Fmoc保护基团；再向反应管加入20ml质量浓度25% 乙酸酐-哌啶溶液于室温下处理30min，使多肽的末端氨基乙酰化，分别使用20ml 质量浓度
20%的异丙醇及DFM溶液洗涤树脂3次，用氮气吹干树脂；
E、分离、纯化及检测
应用反相高效液相色谱法RP-high pressure liquid chromatography-RP-HPLC分离、利用C18反相柱纯化，尺寸为柱内径4.6mm×柱长度250mm，填料的粒径为5µm，检测波长为
220nm，并利用Mass spectroscopy对色谱分离主峰尖出现时的馏分进行质谱图分析。所述步骤E的检测结果为LL-37的分子质量为4493.37km，纯度为95.22%； C16LL-37的分子质量为6579.77km，纯度为98.87%。

[0028] 一种重组人源性抗菌肽C16LL-37对变异链球菌生物活性作用的应用方法，包括如下步骤：A、指示细菌制备
选用变异链球菌ATCC 2517、粘性放线菌ATCC 15987、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌，上述指示菌选用标准菌，在厌氧条件下37℃恒温摇床增殖处理12小时，增殖培养基选用MH培养基，增殖后菌落通过麦氏标准比浊法测定浊度为0.5-1，菌落数为108CFU/ml，用MH培养基将各菌液稀释至1×106CFU/ml的细菌悬液备用；
B、抗菌肽最小抑菌浓度MIC及最小杀菌浓度MBC测试
将C16LL-37及LL-37母液进行二倍梯度稀释法稀释，母液浓度选用5120µmol/L，分别稀释为256µmol/L、128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L、16µmol/L、8µmol/L，取各浓度抗菌肽100µl分别装入无菌离心管内，每个浓度多肽均设5组，分别加入变异链球菌ATCC 2517、粘性放线菌ATCC 15987、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC
25923充分混匀；
所述步骤B中以浓度为256µmol/L的C16LL-37为例，分别取5 支无菌离心管内100µl该浓度多肽，分别标记为256a、256b、256c、256d、256e,再分别向其中加入步骤A中的细菌悬液
100µl，分别在256a中加入变异链球菌ATCC 2517、256b中加入粘性放线菌ATCC 15987、256c中加入嗜酸乳杆菌ATCC 4356、256d中加入大肠杆菌ATCC 25922和256e中加入金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

[0029] 阴性对照组，即无抑菌活性的培养基，与实验组多肽的抑菌效果进行比较，加入100µl MHB培养基，将离心管置于37℃恒温培养箱孵育2h，将各菌液1×103倍稀释后均匀涂布于MH琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数；
C、C16LL-37对变异链球菌靶向特异性的测定
将浓度为64µmol/L的C16LL-37分别加至含5种细菌悬液1×106CFU/ml的无菌离心管内，100µl/支，充分混匀，置于37℃恒温培养箱培养，分别选30、60、120 mins为两种抗菌肽作用观察时间点，取每组样品10µl并行1×103倍稀释后，再取各样品30µl分别均匀涂布于MHA琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数，并计算各组细菌的存活率，菌落计数法同上；
D、时间-杀菌实验
分别取步骤B中浓度128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L的C16LL-37抗菌肽100µl装入无菌离心管内，分别加入含100µl 浓度1×106CFU/ml的变异链球菌细菌悬液，充分混匀；
MHB培养基为阴性对照组，将离心管置于37℃恒温培养箱孵育，分别于0、30、60、90、
120、150mins时作用观察时间点，取每组样品10µl并行1×103倍稀释后，再取各样品30µl分别均匀涂布于MHA琼脂平板，置于37℃恒温培养箱孵育16-18h，利用菌落计数仪计数，计算各组细菌的存活率，并对菌落计数。

[0030] E、溶血实验取健康人体新鲜静脉血分装至含质量浓度1g/L肝素钠溶液的无菌离心管内，静脉血和肝素钠溶液共1.5ml，离心力1000g离心处理10min，弃上清液留存红细胞，将KCl 0.2g、NaCl
8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4•12H2O 3.14g等化学试剂依次溶解于含1000ml无菌去离子水中制得PBS缓冲液，并装入三角烧瓶内，充分混匀，调节PH值为7，置于灭菌锅中灭菌处理，清洗红细胞2-3次后，再利用PBS缓冲液将红细胞配制成体积浓度4%的悬液，加入至96孔聚苯乙烯板内，每孔添加100µl；再将步骤B中512µmol/L、128µmol/L、64µmol/L、32µmol/L、16µmol/L、8µmol/L不同浓度的C16LL-37和LL-37加入至各孔内，每孔添加100µl；
阴性对照组及阳性对照组分别加入100µl PBS缓冲液及体积浓度0.2%聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100，将各板置于37℃恒温培养箱孵育2h后，离心力1000g离心处理10min，取上清100µl，多肽如果具有溶血活性，将红细胞的细胞膜溶解破坏，上清液的OD值会显著增加，转移置新的96孔聚苯乙烯板，利用酶标仪检测450nm处各样品的OD值；
F、扫描电子显微镜SEM观察
设MHB培养基为阴性对照组，取500µl浓度32µmol/L的C16LL-37、32µmol/L 的LL-37及
6
MHB培养基分别加入500µl 变异链球菌悬液1×10 CFU/ml的无菌离心管内，充分混匀，并置于37℃恒温培养箱孵育2hrs，2hrs后，10000 rpm离心5min弃上清，加入步骤E中PBS缓冲液清洗2-3次，加入体积浓度2.0％戊二醛缓冲剂并于4 ℃条件下固定24h，取出各样品，离心，弃上清，PBS 缓冲液清洗2-3次后乙醇梯度脱水，再用体积浓度100 %叔丁醇置换体积浓度
100 %乙醇 2-3 次后溶于体积浓度100%叔丁醇，吸取细菌-叔丁醇悬浮液滴于覆有盖玻片的样品台，放置于ES-2030形冻结真空干燥装置冷冻干燥机，0.03pa内真空-40℃干燥5h，E-
1010离子溅射装置喷金， S-3400N镜下观察。
G、C16LL-37的稳定性分析
G1、不同温度测定
64µmol/L的 C16LL-37分别置于17℃、27℃、37℃、47℃、57℃温度下处理30min，待降至常温，将抗菌肽分别加入100µl变异链球菌细菌悬液1×106CFU/ml的96孔聚苯乙烯板内；
G2、不同盐浓度测定
128µmol/L的C16LL-37 50µl分别加入100µl变异链球菌悬液1×106CFU/ml的96孔聚苯乙烯板内，再分别加入50µl的200µmol/L、300µmol/L、400µmol/L、800µmol/L的Nacl溶液，充分混匀，稀释调节使Nacl的浓度分别为100µmol/L、200µmol/L、300µmol/L、400µmol/L；
G3、不同PH值测定
分别利用PH值为6的HCL溶液及PH值为8的NaOH缓冲液将三组64µmol/L 的C16LL-37的PH值调至5.5、6.5、7.5；
G4、不同浓度胰蛋白酶测定
128µmol/L的C16LL-37分别用不同浓度0µmol/L、2µmol/L、20µmol/L、200µmol/L、2000µmol/L的胰蛋白酶37℃处理6h ，分别加入至含100µl变异链球菌细菌悬液1×106CFU/ml的
96孔聚苯乙烯板内，充分混匀；
将以上G1、G2、G3、G4各组样品分别置于37℃恒温培养箱孵育2h后，利用酶标仪检测
600nm处各组的OD值。

[0031] 统计分析应用SPSS 17.0 软件对数据进行单因素方差统计分析，利用Tukey HSD多重比较检验，检验水准为P <0.05。下文中µM为µmol/L。

[0032] MIC及MBC的测定本研究通过测定重组抗菌肽C16LL-37的MIC及MBC，并将其与CSPC16、LL-37进行比较，检测细菌对C16LL-37的敏感性。结果显示（图2），五种指示菌对C16LL-37的敏感性较LL-37减弱，但相对其他四种指示菌，变异链球菌对C16LL-37的敏感性最强（MIC=16µM，MBC=64µM）；
CSPC16不具备抗菌活性。

[0033] 表 1 多肽的氨基酸序列、纯度、分子量及抗菌活性Tab 1 Amino acid sequence, purity, molecular weight , and antimicrobial activity of peptides.
2.2 C16LL-37对变异链球菌靶向特异性的测定
本研究将C16LL-37与LL-37的体外抗菌活性进行分析比较，检测C16LL-37的靶向特异性。结果显示图1，与对照组相比，C16LL-37对变异链球菌的抗菌活性最为显著(P＜0.05)，在30min时变异链球菌的存活率显著下降，1h、1.5h时变异链球菌的存活率为0%；C16LL-37对其它四种指示菌的抑菌作用较弱，各时间点，其余四种指示菌存活率均大于60%。

[0034] 2.3 红细胞溶血实验本研究通过红细胞溶血实验对C16LL-37的安全性进行分析。结果显示图2，C16LL-37的红细胞溶血率与LL-37无显著差异（P>0.05）；当C16LL-37浓度为32µM时，溶血率约为
0.1%；当C16LL-37浓度为64µM时，溶血率约为0.3%；当C16LL-37浓度高达128µM及256µM时，溶血率仍低于30%；C16LL-37与LL-37均具备较高生物安全性。

[0035] 2.4 时间—杀菌实验本研究通过时间—杀菌实验对C16LL-37对变异链球菌的杀菌动力学分析发现图3，4×MIC时，C16LL-37作用30min后可将细菌全部杀死，150min后，细菌的存活率仍为0%；2×MIC时，C16LL-37在90min内可显著抑制细菌的增殖，细菌生存率小于10%，90min-150min时抑菌效果稳定，细菌生存率仍略有降低；1×MIC时，C16LL-37的抑菌活性最弱，于2h后抑菌效果显著下降，细菌有增殖趋势。研究表明，C16LL-37对变异链球菌的抑菌效果呈一定的时间依赖性，C16LL-37浓度越高，抑菌活性越强，作用时间越长。

[0036] 2.5 扫描电子显微镜(SEM)观察用有效抑菌浓度（32µM）C16LL-37处理变异链球菌2h后，置于扫描电子显微镜（日本，S-
3400N）镜下观察发现图4），药物作用后部分变异链球菌细胞形态不规则改变，表面粗糙，可见大量细胞外碎屑；部分细菌细胞与阴性对照组相似，形态呈球状或短棒状，表面光滑完整，未见细胞溶解或碎片形成。由此可见，C16LL-37主要通过破坏变异链球菌的细胞膜，使细胞内容物外溢，进而导致细胞裂解死亡。

[0037] C16LL-37的稳定性分析将一定浓度C16LL-37分别于不同温度、PH值、不同浓度的盐及胰蛋白酶条件下作用于变形链球菌，以检测C16LL-37的稳定性。研究发现图5，在各温度、PH值、盐浓度条件下，C16LL-37的抑菌效果并无显著改变（P＞0.5）；低浓度（0µM、2µM、20µM）胰蛋白酶处理后，C16LL-37的抑菌效果也无显著改变（P＞0.5），但高浓度（20µM、2000µM）胰蛋白酶处理后，C16LL-37的抑菌效果显著下降，样品的OD值分别为0.18、0.26（P＜0.5）。

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