用于处理生物薄膜的方法和涂层
阅读：593发布：2023-01-03
专利汇可以提供用于处理生物薄膜的方法和涂层专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种处理、减少或抑制由细菌引起的 生物 薄膜 形成的方法，所述方法包括：将物品与包含有效量的D- 氨 基酸的组合物 接触 ，所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜形成，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D- 色氨酸 、D-酪氨酸及其组合所组成的组。，下面是用于处理生物薄膜的方法和涂层专利的具体信息内容。
1.一种处理、减少或抑制由细菌引起的生物薄膜形成的方法，所述方法包括：
将物品与包含有效量的D-氨基酸的组合物接触，所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜形成，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合所组成的组。
2.一种处理、减少或抑制由细菌引起的生物薄膜形成的方法，所述方法包括：
使物品与组合物接触，所述组合物包含有效量的D-氨基酸的组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜形成。
3.如权利要求2所述的方法，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸所组成的组。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述物品是选自由工业设备、管道系统、水体、家具表面、纺织品以及纸张所组成的组的一种或多种。
5.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述物品是涉及冷凝水收集、水循环、污水运输、造纸制浆及制造、以及水处理和运输的一种或多种组件。
6.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述物品是下水道、浴盆、厨房用具、工作台面、浴帘、水泥浆、卫生间、工业食品或饮料生产设施、地板、船只、码头、石油平台、取水口、筛子、水管、冷却系统，或动力装置。
7.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述物品由选自由金属、金属合金、合成聚合物、天然聚合物、陶瓷、木材、玻璃、皮革、纸张、织物、非金属无机物、复合材料及其组合所组成的组的材料制成。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中接触包括将涂层涂覆在所述物品上，所述涂层包含有效量的所述D-氨基酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述涂层进一步包含粘合剂。
10.如权利要求8所述的方法，其中涂布是通过将涂布组合物芯吸、喷涂、浸涂、旋涂、层压、刷涂、丝网涂布、挤压或刮涂到所述表面上来完成的。
11.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中接触包括将D-氨基酸引入先驱体材料中并且将所述先驱体材料处理成浸渍有D-氨基酸的所述物品。
12.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中接触包括将D-氨基酸引入液体组合物中。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含D-酪氨酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物进一步包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸中的一种或多种。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物进一步包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸，D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括使所述表面与生物杀灭剂接触。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物含有低于1%的L-氨基酸。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物实质上不包含去污剂。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述组合物包含聚六亚甲基双胍、氯己定、木糖醇、三氯生或二氧化氯。
23.一种对生物薄膜形成有抗性的经涂布的物品，其包含：
在至少一个暴露表面上包含涂层的物品，所述涂层包含有效量的D-氨基酸并且实质上不包含所述对应的L-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合所组成的组。
24.一种对生物薄膜形成有抗性的经涂布的物品，其包含：
在至少一个暴露表面上包含涂层的物品，所述涂层包含有效量的D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成。
25.如权利要求24所述的经涂布的物品，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-天冬酰胺和D-酪氨酸所组成的组。
26.如权利要求23、24或25中任一项所述的经涂布的物品，其中所述物品是选自由工业设备、管道系统、水体、家居表面、纺织品以及纸张所组成的组的一种或多种。
27.如权利要求23、24或25中任一项所述的经涂布的物品，其中所述物品是涉及冷凝水收集、水循环、污水运输、造纸制浆及制造、以及水处理和运输的一种或多种组件。
28.如权利要求23、24或25中任一项所述的经涂布的物品，其中所述物品是下水道、浴盆、厨房用具、工作台面、浴帘、水泥浆、卫生间、工业食品或饮料生产设施、地板、船只、码头、石油平台、取水口、筛子、水管、冷却系统，或动力装置。
29.如权利要求23、24或25中任一项所述的经涂布的物品，其中所述物品由选自由金属、金属合金、合成聚合物、天然聚合物、陶瓷、木材、玻璃、皮革、纸张、织物、非金属无机物、复合材料及其组合所组成的组的材料制成。
30.如权利要求23至29中任一项所述的经涂布的物品，其中所述涂层进一步包含粘合剂。
31.如权利要求23至30中任一项所述的经涂布的物品，其中所述涂层进一步包含聚合物并且所述D-氨基酸分布在所述聚合物中。
32.如权利要求23至31中任一项所述的经涂布的物品，其中所述D-氨基酸涂层被配制成缓释制剂。
33.如权利要求23至32中任一项所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物包含D-酪氨酸。
34.如权利要求34所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物进一步包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。
35.如权利要求34所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸中的一种或多种。
36.如权利要求34所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物进一步包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。
37.如权利要求34所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸。
38.如权利要求34所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸。
39.如权利要求23至38中任一项所述的经涂布的物品或组合物，其进一步包含生物杀灭剂。
40.如权利要求39所述的经涂布的物品或组合物，其中所述生物杀灭剂包含聚六亚甲基双胍、氯己定、木糖醇、三氯生或二氧化氯。
41.如权利要求23至40中任一项所述的经涂布的物品或组合物，其中所述组合物实质上不包含去污剂。
42.一种对生物薄膜形成有抗性的组合物，其包含
液体基质；以及
分布于所述基质中的有效量的D-氨基酸，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，并且
其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合所组成的组。
43.一种对生物薄膜形成有抗性的组合物，其包含
液体基质；以及
分布于所述基质中的有效量的D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，
其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的组合，所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸所组成的组。
44.如权利要求42或43所述的组合物，其中所述液体基质选自液体、凝胶、膏体。
45.如权利要求42或43所述的组合物，其中所述组合物选自由水、洗涤制剂、消毒制剂、油漆和涂布制剂所组成的组。
46.一种涂布组合物，其包含：
两种或更多种D-氨基酸，其中至少一种D-氨基酸选自由D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸组成的组，并且至少一种D-氨基酸是选自由D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸组成的组的不同D-氨基酸，以及
聚合物粘合剂。
47.一种物品，其包含：
至少一种包含有效量的D-氨基酸的组分，其中至少一种D-氨基酸选自由D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸和D-色氨酸组成的组，并且至少一种D-氨基酸是选自由D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸组成的组的不同D-氨基酸，其中所述组合物实质上不包含所述对应的L-氨基酸，所述D-氨基酸包埋在所述组分中。
用于处理生物薄膜的方法和涂层
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求针对共同待决的2010年1月8日提交的美国临时申请第61/293,414号和2010年4月30日提交的美国临时申请第61/329,930号的优先权。
[0004] 这些申请的内容通过引用结合在此。
[0006] 本发明由美国政府支持通过美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)基金第CA24487号、第GM058213号、第GM082137号、第GM086258号和第GM18568号而完成。美国政府在本发明中具有特定权益。
[0007] 发明背景
[0008] 生物薄膜是在表面定居和增殖，并且被胞外聚合物基质(exopolymer matrix)所覆盖的细胞群落。它们生长缓慢并且许多处于生长停滞期。它们由大多数(即使不是全部)病原体所形成。根据CDC，在美国，全部感染的65%由生物薄膜所导致，所述生物薄膜可以由普通病原体所形成。生物薄膜也见于工业设施中，诸如饮用水分配系统。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明的方面的特征在于处理、减少或抑制由细菌引起的生物薄膜形成的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将表面与包含有效量的D-氨基酸的组合物接触，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成。在一些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在特定的实施方案中，所述细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌。
[0012] 在其它方面，本发明的特征在于包含一种或多种D-氨基酸的组合物，诸如工业、治疗或药物组合物。在特定的实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸或其组合。在一些实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸或其组合。在进一步的实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸和D-色氨酸中的两种或更多种，并且在更为进一步的实施方案中后者组合物实质上不包含去污剂和/或L氨基酸。在其它的实施方案中，所述组合物被用于处理本文所述的工业生物薄膜，诸如水处理或管道系统中的生物薄膜。
[0013] 本申请的一方面涉及处理、减少或抑制由一种生物薄膜形成性细菌所导致的生物薄膜形成的方法，所述方法包括将物品与包含有效量的D-氨基酸或D-氨基酸组合的组合物接触，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸组成的组。
[0014] 在一些实施方案中，所述组合物相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。
[0015] 在一些实施方案中，所述物品是选自由工业设备、管道系统、水体、家居表面、纺织品以及纸张所组成的组的一种或多种。在进一步实施方案中，所述物品是涉及冷凝水收集、水循环、污水运输、造纸制浆及制造、以及水处理和运输的一种或多种组件。在其它实施方案中，所述物品是下水道、浴盆、厨房用具、工作台面、浴帘、水泥浆、卫生间、工业食品或饮料的生产设施、地板、船只、码头、石油平台、取水口、筛子、水管、冷却系统，或动力装置。
[0017] 在其它的实施方案中，接触包括将一种涂层涂覆在所述物品上，所述涂层包含有效量的D-氨基酸。在进一步实施方案中，所述涂层进一步包含一种粘合剂。在一些实施方案中，涂布是通过将一种涂布组合物芯吸、喷涂、浸涂、旋涂、层压、刷涂、丝网涂布、挤压或刮涂到表面来完成的。在其它的实施方案中，接触包括将一种D-氨基酸引入到一种先驱体材料中并且将所述先驱体材料处理成由D-氨基酸浸渍的物品。在进一步实施方案中，接触包括将一种D-氨基酸引入至液体组合物中。
[0018] 在前述方法的一些实施方案中，所述组合物包含D-酪氨酸。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸中的一种或多种。在更进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸和D-色氨酸中的一种或多种。
[0020] 在任意前述方法的其它实施方案中，所述组合物含有低于1%的L-氨基酸。
[0021] 在任意前述方法的进一步实施方案中，所述组合物实质上不包含去污剂。
[0022] 本公开的另一个方面涉及对生物薄膜形成具有抗性的经涂布的物品，所述经涂布的物品包含在至少一个暴露表面包含涂层的物品，所述涂层包含有效量的D-氨基酸或D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制生物薄膜的形成，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，或者其中所述D-氨基酸组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸组成的组。
[0023] 在一些实施方案中，所述涂层相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。
[0024] 在一些实施方案中，所述物品是选自由工业设备、管道系统、水体、家居表面、纺织品以及纸张所组成的组的一种或多种。在其它的实施方案中，所述物品是涉及冷凝水收集、水循环、污水运输、造纸制浆及制造、以及水处理和运输的一种或多种组件。在其它实施方案中，所述物品是下水道、浴盆、厨房用具、工作台面、浴帘、水泥浆、卫生间、工业食品或饮料的生产设施、地板、船只、码头、石油平台、取水口、筛子、水管、冷却系统，或动力装置。
[0025] 在一些实施方案中，所述物品由一种材料制成，所述材料选自由金属、金属合金、合成聚合物、天然聚合物、陶瓷、木材、玻璃、皮革、纸张、织物、非金属无机物、复合材料及其组合所组成的组。在进一步实施方案中，所述涂层进一步包含一种粘合剂。在其它的实施方案中，所述涂层进一步包含聚合物并且D-氨基酸分布在所述聚合物中。
[0026] 在其它的实施方案中，D-氨基酸涂层被配制成为缓释制剂。
[0027] 在一些实施方案中，所述组合物包含D-氨基酸。在进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种D-脯氨酸、D-苯丙氨酸。在更进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含D-亮氨酸、D-色氨酸、D-蛋氨酸中的一种或多种。在其它实施方案中，所述组合物进一步包含D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸.utamic acid、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸，以及D-色氨酸中的一种或多种。
[0028] 在一些实施方案中，所述组合物进一步包含生物杀灭剂。在进一步的实施方案中，所述生物杀灭剂包含聚六亚甲基双胍、氯己定、木糖醇、三氯生或二氧化氯。
[0029] 在一些实施方案中，任意前述经涂布的物品或组合物含有低于1%的L-氨基酸。在其它实施方案中，所述经涂布的物品或组合物实质上不包含去污剂。
[0030] 本申请的另一方面涉及对生物薄膜形成具有抗性的组合物，其包含液体基质，以及分布于所述基质中的有效量的D-氨基酸或D-氨基酸组合，由此处理、减少或抑制所述生物薄膜的形成，其中所述D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸及其组合组成的组，并且其中所述D-氨基酸的组合是两种或更多种D-氨基酸的协同性组合，所述两种或更多种D-氨基酸选自由D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸组成的组。
[0031] 在一些实施方案中，所述组合物相对于所述D-氨基酸或D-氨基酸组合实质上不包含对应的L-氨基酸或L-氨基酸组。
[0032] 在一些实施方案中，所述液体基质选自液体、凝胶、膏体。
[0033] 在一些的实施方案中，所述组合物选自由水、洗涤制剂、消毒制剂、油漆和涂布制剂所组成的组。
[0034] 本公开的又一方面涉及包含两种或更多种D-氨基酸的涂布组合物，其中至少一种D-氨基酸选自由D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸组成的组，并且至少一种D-氨基酸是不同的选自由D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸组成的组的D-氨基酸，以及聚合物粘合剂。
[0035] 在一些的实施方案中，所述组合物相对于所述D-氨基酸实质上不包含对应的L-氨基酸。
[0037] 下列图仅为说明目的而给出，并且并非意在进行限制。
[0038] 图1A和图1B示出了枯草杆菌(B.subtilis)菌株NCIB3610的细胞，其在22℃下在液体生物薄膜诱导培养基中生长于12孔板内3天(A)或8天(B)。
[0039] 图1C和图1D示出了在培养基中生长了3天的细胞，所述培养基中加入了来自C18 Sep Pak柱的干燥和重悬浮的甲醇洗脱液(1:100v/v)，所述柱已加载来自6-8天程度的培养物(C)或3天程度培养物(D)的条件化培养基。加入所述孔中的浓缩因子的最终浓度为基于所述原始条件化培养基体积的1:4稀释。
[0040] 图1E与图1C相同，区别在于所述因子通过使用甲醇进行的逐步洗脱而在所述C-18柱上被进一步纯化。示出的是加入了3μl的所述40%甲醇洗脱液的结果。
[0041] 图1F与图1C相同，区别在于在加入新鲜培养基之前将所述40%甲醇洗脱液与蛋白酶K珠粒进行孵育2小时，随后离心除去所述珠粒。
[0042] 图2A示出了向孵育三天后的处于生物薄膜诱导培养基中的新鲜接种的培养物内加入D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)、L-酪氨酸(7mM)或L-亮氨酸(8.5mM)对薄膜形成的效果。
[0043] 图2B示出了对薄膜形成的完全抑制所需的D-氨基酸的最小生物薄膜抑制浓度(MBIC)。
[0044] 图2C示出了3天程度的培养物，所述培养物中已加入无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(3μM)或D-酪氨酸、D-色氨酸、D-蛋氨酸和D-亮氨酸的混合物(各2.5nM)，随后进行8小时的进一步孵育。
[0045] 图2D示出了来自所述野生型或ylmE和racX双突变菌株(IKG55)的8小时程度培养物的条件化培养基的Sep Pak C-18柱浓缩洗脱液的效果。
[0046] 图2E示出了已在37℃下在包含葡萄糖(0.5%)和NaCl(3%)的TSB培养基中生长于12孔聚苯乙烯平板内24小时的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(菌株SCO1)。此外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(50μM)或D-氨基酸混合物(各15nM)。通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。
[0047] 图3A示出了放射性D-酪氨酸向所述细胞壁中的并入。将细胞生长于生物薄膜诱14 14
导培养基中并将其与 C-D-酪氨酸或 C-L-脯氨酸(10μCi/ml)在37℃下孵育2h。结果以向细胞中的总并入(对于L-脯氨酸为360,000cpm/ml并且对于D-酪氨酸为46,000cpm/ml)的百分比的形式给出。
导培养基中并将其与 C-D-酪氨酸或 C-L-脯氨酸(10μCi/ml)在37℃下孵育2h。结果以向细胞中的总并入(对于L-脯氨酸为360,000cpm/ml并且对于D-酪氨酸为46,000cpm/ml)的百分比的形式给出。
[0048] 图3B示出了来自包含功能性tasA-mCherry翻译融合蛋白的细胞的总荧光(DR-30(Romero等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010，出版中))。通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将所述细胞生长至生长停滞期。
[0049] 图3C通过荧光显微法示出了TasA-mCherry的细胞结合。根据说明通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在(未处理)的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将包含所述tasA-mCherry融合蛋白的野生型细胞和yqxM6(IKG51)突变体细胞生长至生长停滞期(OD=1.5)，在PBS中洗涤并且通过荧光显微法显现。
[0050] 图3D通过电子显微法示出了TasA纤维的细胞结合。不使用(图像1和2)或使用(图像3-6)D-酪氨酸(0.1mM)对24小时程度的培养物进行另外12小时的孵育。通过使用抗TasA抗体进行的免疫金标记对TasA纤维染色，并且根据实施例中所述通过透射电子显微法将其显现。所述细胞是eps操纵子的突变体(Δeps)，因为胞外多糖的缺乏显著地改善了TasA纤维的成像。实箭头标出了纤维簇；空箭头标出了单个纤维。所述尺度条为500nM。在图像2、4和6的放大部分中的尺度条为100nm。图像1和2示出了结合于细胞的纤维簇，图像3、4和6示出了与细胞解离的单个纤维和簇，并且图像3-5示出了几乎没有纤维物质的细胞。
[0051] 图4A示出了在包含或不包含D-酪氨酸的固体(顶部图像)或液体(底部图像)生物薄膜诱导培养基中生长3天的细胞。
[0053] 图5示出了包含补充以D-色氨酸(0.5mM)、D-蛋氨酸(2mM)、L-色氨酸(5mM)或L-蛋氨酸(5mM)的MSgg培养基的孔，使用菌株NCIB3610对其进行了接种并孵育了3天。
[0054] 图6示出了包含补充以D-酪氨酸(3μM)或D-亮氨酸(8.5mM)的固体MSgg培养基的平板，使用菌株NCIB3610对其进行了接种并孵育了4天。
[0055] 图7示出了NCIB3610(WT)和ylmE和racX双缺失突变体(IKG155)，其生长于12孔平板内并孵育5天。
[0056] 图8示出了D-氨基酸对细胞生长的效果。在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中伴以振荡使细胞生长。
[0057] 图9A示出了菌株FC122(携带PyqxM-lacZ)对PyqxM-lacZ的表达，并且图9B示出了菌株FC5(携带PepsA-lacZ)对PepsA-lacZ的表达，所述菌株在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中伴以振荡生长。
[0058] 图10示出了D-氨基酸对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)生物薄膜形成的抑制。在30℃下在12孔聚苯乙烯平板中将绿脓杆菌菌株P014在包含甘油(0.2%)和酪蛋白氨基酸(20μg/ml)的M63培养基中生长48小时。另外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸或所述D-氨基酸混合物。通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。使用500μl 1.0%的结晶紫染料对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。
[0059] 图11示出了对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生物薄膜的结晶紫染色，其在TSB培养基中使用单种D-氨基酸或所述四重混合物生长24小时。
[0060] 图12示出了对绿脓杆菌的结晶紫染色，其在M63培养基中使用单种D-氨基酸或所述四重混合物生长48小时。
[0061] 图13示出了对金黄色葡萄球菌生物薄膜的结晶紫染色，其在TSB培养基中使用单种D-氨基酸或混合物生长24小时。
[0062] 图14示出了对金黄色葡萄球菌生物薄膜的结晶紫染色，其在含L-氨基酸的TSB培养基中生长24小时。
[0063] 图15示出了在除去浮游细菌后在涂覆了D-氨基酸的TSB培养基中形成的金黄色葡萄球菌生物薄膜的典型图像。
[0064] 图16示出了在除去浮游细菌后在涂覆了L-氨基酸的TSB培养基中形成的金黄色葡萄球菌生物薄膜的典型图像。
[0065] 图17是在除去浮游细菌后形成于TSB培养基中的金黄色葡萄球菌生物薄膜中的细胞定量。将细胞重悬浮于PBS中。
[0066] 图18示出了D-aa混合物(1mM)对于表面上的金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的效果。环氧树脂表面被浸以D/L aa混合物并随后将其与细菌孵育24小时。
[0067] 图19示出了D-aa混合物(1mM)对于表面上的金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的效果。环氧树脂表面被浸以D/L aa混合物并随后将其与细菌孵育24小时。
[0068] 图20示出了D-aa对于M63固体培养基上绿脓杆菌中的生物薄膜形成的效果。将菌落在室温下生长4天。
[0069] 图21示出了在生物薄膜诱导条件下在绿脓杆菌的6孔板圆座(button)中对单贴附细胞的Sytox-染色。
[0070] 图22示出了对奇异变形菌(Proteus mirabilis)的结晶紫染色，其在LB培养基中使用D-氨基酸(100μM)或L-氨基酸(100μM)混合物生长了48小时。
[0071] 图23示出了对变异链球菌(Streptococcus mutans)的结晶紫染色，其在涂覆了蔗糖(0.5%)培养基的BHI培养基中使用D-或L-氨基酸(1mM)生长了72小时。
[0072] 发明详述
[0073] 除非另外进行限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述类似的或等同的方法和材料可被用于本发明的实施或测试，但在下文描述了适当的方法和材料。本文所提及的全部公布、专利申请、专利和其它参考文献全部通过引用结合在此。在不一致的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并且并非意在进行限制。
[0074] 术语“预防”在本文指的是对生物薄膜的发展或发作的抑制，或指的是在表面的生物薄膜的一种或多种指征或症状的复发、发作或发展的预防，其由本文所述的组合物(例如，预防性或治疗性组合物)的施用或疗法组合(例如，预防性或治疗性组合物的组合)的施用所导致。
[0076] 本发明至少部分地基于如下发现：存在于来自成熟生物薄膜的条件化培养基中的D-氨基酸预防了生物薄膜形成并且引发了已存在的生物薄膜的解体。标准氨基酸可以互为镜像的称为L-或D-氨基酸的两种光学异构体的任意一种存在。虽然L-氨基酸是见于蛋白质中的最主要氨基酸，但是D-氨基酸是细菌的肽聚糖细胞壁的组分。本文所述的D-氨基酸能够穿透活体或非活体表面上的生物薄膜，能够预防细菌对表面的附着和所述生物薄膜的任何进一步构建，能够解离这些生物薄膜和/或抑制所述生物薄膜形成微生物在所述生物基质上的进一步生长，或能够杀灭这些微生物。
[0077] D-氨基酸在本领域中是已知的并且可使用已知技术制备。示例性的方法包括，例如，描述于美国专利公开号第20090203091号中的方法。D-氨基酸也可商购(例如，来自Sigma Chemicals,St.Louis,Mo.)。
[0078] 本文所述的方法中可使用任意D-氨基酸，其包括但不限于D-丙氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-赖氨酸、D-亮氨酸、D-天冬酰胺、D-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-精氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸、D-色氨酸或D-酪氨酸。D-氨基酸可单独使用或与其它D-氨基酸组合使用。在示例性的方法中，可将2种、3种、4种、5种、6种或更多种D-氨基酸组合使用。优选的情况下，在本文所述的方法中单独使用或组合使用D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-蛋氨酸或D-色氨酸。在其它优选的实施方案中，在本文所述的方法中单独使用或组合使用D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸。
[0079] 可以以约0.1nM至约100μM的浓度使用D-氨基酸，如约1nM至约10μM、约5nM至约5μM或约10nM至约1μM，例如以0.1nM至100μM、1nM至10μM、5nM至5μM，或10nM至1μM的浓度使用。
[0080] 在抑制或治疗生物薄膜形成中所发现的特别有效的示例性D-氨基酸组合物、涂层或溶液包含D-酪氨酸。在一些实施方案中，D-酪氨酸被单独使用并且可以例如低于1mM的浓度使用，或低于100μM或低于10μM的浓度，或0.1nM至100μM的浓度，例如1nM至10μM、5nM至5μM或10nM至1μM。
[0081] 在其它实施方案中，将D-酪氨酸与D-脯氨酸和D-苯丙氨酸中的一种或多种组合使用。在一些实施方案中，将D-酪氨酸与D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸中的一种或多种组合使用。D-酪氨酸与D-脯氨酸、D-苯丙氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸中的一种或多种的组合可以是协同促进的并且可在10μM或更低的总D-氨基酸浓度下有效抑制或处理生物薄膜形成，例如约1nM至约10μM、约5nM至约5μM或约10nM至约1μM的浓度，或0.1nM至100μM的浓度，例如1nM至10μM、5nM至5μM或10nM至1μM。
[0082] 在一些实施方案中，D-氨基酸的组合是等摩尔量的。在其它实施方案中，D-氨基酸的组合并非是等摩尔量的。
[0083] 在一些实施方案中，本发明实质上不包含L-氨基酸。例如，所述组合物包含低于约30%、低于约20%、低于约10%、低于约5%、低于约1%、低于约0.5%、低于约0.25%、低于约0.1%、低于约0.05%、低于约0.025%、低于约0.01%、低于约0.005%、低于约0.0025%、低于约
0.001%或更低的L-氨基酸。在其它实施方案中，所述组合物包含低于30%、低于20%、低于10%、低于5%、低于1%、低于0.5%、低于0.25%、低于0.1%、低于0.05%、低于0.025%、低于
0.01%、低于0.005%、低于0.0025%、低于0.001%的L-氨基酸。在优选的实施方案中，L-氨基酸的百分比是相对于对应的D-氨基酸的百分比。以实例的方式，L-氨基酸和D-氨基酸的外消旋混合物包含50%的L-氨基酸。
0.001%或更低的L-氨基酸。在其它实施方案中，所述组合物包含低于30%、低于20%、低于10%、低于5%、低于1%、低于0.5%、低于0.25%、低于0.1%、低于0.05%、低于0.025%、低于
0.01%、低于0.005%、低于0.0025%、低于0.001%的L-氨基酸。在优选的实施方案中，L-氨基酸的百分比是相对于对应的D-氨基酸的百分比。以实例的方式，L-氨基酸和D-氨基酸的外消旋混合物包含50%的L-氨基酸。
[0084] 在一些实施方案中，所述组合物实质上不包含去污剂。例如，所述组合物包含低于约30wt%、低于约20wt%、低于约10wt%、低于约5wt%、低于约1wt%、低于约0.5wt%、低于约0.25wt%、低于约0.1wt%、低于约0.05wt%、低于约0.025wt%、低于约0.01wt%、低于约0.005wt%、低于约0.0025wt%、低于约0.001wt%或更低的去污剂。在其它实施方案中，所述组合物相对于所述总体组合物包含低于约30wt%、低于30wt%、低于20wt%、低于10wt%、低于
5wt%、低于1wt%、低于0.5wt%、低于0.25wt%、低于0.1wt%、低于0.05wt%、低于0.025wt%、低于0.01wt%、低于0.005wt%、低于0.0025wt%或低于0.001wt%的去污剂。在包含去污剂如表面活性剂的制剂中，很多情况下所述表面活性剂将与所述活性剂，此前的所述D-氨基酸，进行相互作用，其可极大地影响所述药剂的效力。在一些实施方案中，可能必须筛选相对于阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂的药剂效能，所述筛选是测定所述表面活性剂类型的存在是否改变了所述效力的筛选。减少或消除去污剂可提高所述组合物的效力和/或降低制剂复杂性。
5wt%、低于1wt%、低于0.5wt%、低于0.25wt%、低于0.1wt%、低于0.05wt%、低于0.025wt%、低于0.01wt%、低于0.005wt%、低于0.0025wt%或低于0.001wt%的去污剂。在包含去污剂如表面活性剂的制剂中，很多情况下所述表面活性剂将与所述活性剂，此前的所述D-氨基酸，进行相互作用，其可极大地影响所述药剂的效力。在一些实施方案中，可能必须筛选相对于阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂的药剂效能，所述筛选是测定所述表面活性剂类型的存在是否改变了所述效力的筛选。减少或消除去污剂可提高所述组合物的效力和/或降低制剂复杂性。
[0085] 生物薄膜
[0086] 大多数细菌可形成复合的包含基质的多细胞群落，其被称为生物薄膜 (O’Toole 等 ,Annu.Rev.Microbiol.54:49(2000);López 等 ,FEMSMicrobiol.Rev.33:152(2009);Karatan 等 ,Microbiol.Mol.Biol.Rev.73:310(2009))。 生 物薄膜相关细菌受到保护以免受环境侵害，诸如抗生素的侵害(Bryers,Biotechnol.Bioeng.100:1(2008))。但是，随着生物薄膜老化，营养物变得具限制性，废料进行了积累，并且返回浮游态生存对于生物薄膜结合细菌是有利的(Karatan等,Microbiol.Mol.Biol.Rev.73:310(2009))，因此，生物薄膜具有有限的寿命，其特征在于最终的解体。
[0087] 通常认为生物薄膜为附着于活体或非活体表面的活体和死亡微生物，特别是细菌与其细胞外多聚物质(EPS基质)形式的代谢物如多糖的聚集物。通常对浮游细胞表现出显著的生长抑制或致死效能的抗生物薄膜物质的活性相对于在生物薄膜中组织化的微生物被严重降低，例如，由于所述活性物质向所述生物基质中的不完全穿透所导致。
[0088] 除其它单细胞生物外，革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌也可产生生物薄膜。细菌生物薄膜是附着于表面的细胞群落，其封闭于所述移生细胞所产生的细胞外多糖基质中。生物薄膜发展通过一系列的程序化步骤而进行，其包括对表面的初始附着、三维微菌落的形成以及成熟生物薄膜的随后发展。细胞在生物薄膜的定位越深(例如，所述细胞进入所述生物薄膜所附着的固体表面越深，由此更为受到所述生物薄膜基质主体的遮蔽和保护)，则所述细胞在代谢上更不活跃。该生理变化和梯度的结果产生了一系列细菌群落，其中存在有效的系统，微生物通过所述系统而具有多样化的功能特征。生物薄膜还由多种并且多样化的非细胞组分所产生，其可包含但不限于碳水化合物(简单和复杂)、脂类、蛋白质(包括多肽)以及糖和蛋白质的脂类复合体(脂多糖和脂蛋白)。
[0089] 所述生物薄膜可使细菌以休眠状态存在特定的时间直至适当的生长条件出现，由此为所述微生物提供了选择优势以确保其存活。但是，该选择可对人体健康产生严重威胁，因为已观察到生物薄膜参与了约65%的人类细菌感染(Smith,Adv.Drug Deliv.Rev.57:1539-1550(2005)；Hall-Stoodley等,Nat.Rev.Microbiol.2:95-108(2004))。
[0090] 根据本文所述，生物薄膜可侵扰广泛多种的生物、医学、商业、工业和加工运作。在工业环境中，生物薄膜可以附着在表面上，如管道和过滤器。生物薄膜在工业环境中会产生问题，因为它们会在工业系统(如热交换器、石油管道、供水系统、过滤器等)中导致生物腐蚀和生物淤积(Coetser等,(2005)Crit.Rev.Micro.31:212-32)。因此，生物薄膜会抑制液体在管道中流动，堵塞水和其它液体系统，同时还充当致病细菌、原生动物以及真菌的储槽。正因为如此，工业生物薄膜是导致工业加工系统经济效率低下的重要原因。此外，不同种类的产生生物薄膜的细菌可能会在这样的系统中共存。因此，在这样的系统中存在由多个物种导致的生物薄膜形成的可能。
[0091] 本文中所描述的方法和材料可以阻止或减少与各种各样的商业、工业和加工操作相关的生物薄膜的形成，如那些在水处理/加工行业发现的生物薄膜的形成。在一些情况中，可以将D-氨基酸涂覆于在这些表面上发现的生物薄膜上。在其它情况中，可以将D-氨基酸用来阻止形成生物薄膜的细菌附着在表面上。例如，所述表面可以是工业设备(如位于良好生产规范(GMP)的设施、食品加工厂、照片处理场所的设备)的表面、管道系统的表面，或水体(如湖、游泳池、海洋等)的表面。
[0092] 所述表面在使用之前可以用D-氨基酸进行涂布、喷涂或浸渍以便预防细菌生物薄膜的形成，。这类表面的特定的非限制性实例包括涉及冷凝水收集、污水排放、纸张打浆操作、再循环水系统(如空调系统、冷却塔等)的管道、配管和支撑组件，以及在水承载、处理、加工和收集系统中的组件。添加D-氨基酸可以预防或减少在水的表面或水处理系统的管道或管道装置表面，或水与之接触的收集和/或操作系统所涉及的其它表面上的生物薄膜的形成。
[0093] 生物薄膜形成细菌
[0094] 本文所述的方法可被用于预防或延迟生物薄膜的形成，和/或处理生物薄膜。在示例性的方法中，所述生物薄膜由生物薄膜形成细菌所形成。所述细菌可以是革兰氏阴性细菌种类或革兰氏阳性细菌种类。这些细菌的非限制性实例包括放线杆菌属(诸如伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)成员、不动杆菌属(诸如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii))成员、气单胞菌属的成员、包特氏菌属的成员(诸如百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、支气管炎包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)或副百日咳包特氏菌(Bordetella parapertussis))、短芽孢杆菌属的成员、布鲁杆菌属的成员、拟杆菌属的成员(诸如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、伯克氏菌属的成员(诸如洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)或类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei))、伯氏菌属的成员(诸如伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi))、芽孢杆菌属的成员(诸如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌)、弯曲菌属的成员(诸如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni))、二氧化碳噬纤维菌属的成员、心杆菌属的成员(诸如人心杆菌(Cardiobacterium hominis))、柠檬酸杆菌属的成员、梭菌属的成员(诸如破伤风梭菌(Clostridium tetani)或艰难梭菌(Clostridium difficile))、衣原体属的成员(诸如砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)或鹦鹉衣原体(Chlamydia psiffaci))、艾肯菌属的成员(诸如啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens))、肠杆菌属的成员、埃希氏菌属的成员(诸如大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、弗朗西斯氏菌属的成员(诸如土拉热弗朗西氏菌(Francisella tularensis))、梭杆菌属的成员、黄杆菌属的成员、嗜血杆菌属的成员(诸如杜克嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、螺杆菌属的成员(诸如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、金氏杆菌属的成员(诸如金氏金氏菌(Kingella kingae))、克雷伯氏菌属的成员(诸如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))、军团菌属的成员(诸如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))、李斯特菌属的成员(诸如单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))、钩端螺旋体属的成员、莫拉氏菌属的成员(诸如卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))、摩根氏菌属的成员、支原体属的成员(诸如人型支原体(Mycoplasma hominis)或肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae))、分枝杆菌属的成员(诸如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))、奈瑟菌属的成员(诸如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis))、巴斯德氏菌属的成员(诸如多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida))、变形菌属的成员(诸如普通变形菌(Proteus vulgaris)或奇异变形菌(Proteus mirablis))、普雷沃氏菌属的成员、邻单胞菌属的成员(诸如类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides))、假单胞菌属的成员(诸如绿脓假单胞菌)、普罗威登斯菌属的成员、立克次氏体属的成员(诸如立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)或斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi))、寡养单胞菌属的成员(诸如嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila))、葡萄球菌属的成员(诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、链球菌属的成员(诸如草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、产脓链球菌(A型)(Streptococcus pyogenes(group A))、无乳链球菌(B型)(Streptococcus agalactiae(group B))、牛链球菌(Streptococcus bovis)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、链霉菌属的成员(诸如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus))、沙门氏菌属的成员(诸如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属的成员(诸如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、志贺氏菌属的成员、螺菌属的成员(诸如小螺菌(Spirillum minus))、密螺旋体属的成员(诸如梅毒密螺旋体(Treponema pallidum))、韦荣球菌属的成员、弧菌属的成员(诸如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)或创伤弧菌(Vibrio vulnificus))、耶尔森氏菌属的成员(诸如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)或假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis))和黄单胞菌属的成员(诸如嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia))。
[0095] 特别地，枯草杆菌在半固体表面形成结构性复合群落并在长期培养物的气液交界面处形成厚膜(López等,FEMS Microbiol.Rev.33:152(2009);Aguilar等,Curr.Opin.Microbiol.10:638(2007);Vlamakis 等 ,Genes Dev.22:945(2008);Branda 等 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11621(2001))。枯草杆菌生物薄膜由通过细胞外基质结合在一起的细胞长链所组成，所述细胞外基质由胞外多糖和淀粉体纤维所组成，所述淀粉体纤维包含蛋白质TasA(Branda等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:11621(2001);Branda等 ,Mol.Microbiol.59:1229(2006);Romero 等 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2010, 出 版中))。由所述epsA-O操纵子(“eps操纵子”)编码的酶产生所述胞外多糖，并且所述yqxM-sipW-tasA操纵子(“yqxM操纵子”)的远启动子基因编码了所述TasA蛋白(Chu等,Mol.Microbiol.59:1216(2006))。
[0096] 根据本文所述，产生生物薄膜的细菌，如本文所述的菌种，可见于活体受试者、体外或表面。
[0097] 应用/制剂
[0098] D-氨基酸组合物可以用来减少或阻止在非生物的半固体或固体表面上的生物薄膜的形成。这样的表面可以是倾向于形成生物薄膜或被细菌附着的任何表面。表面的非限制性实例包括由以下材料的一种或多种制成的坚硬表面：金属、塑料、橡胶、木板、玻璃、木材、纸张、混凝土、岩石、大理石、石膏和陶瓷材料如瓷器，这些表面可任选地用例如油漆或搪瓷来涂布。
[0099] 在某些实施方案中，所述表面是与水、尤其是静止水接触的表面。例如，所述表面可以是管道系统、工业设备、冷凝水收集器、用于污水运输、水循环、造纸制浆和水处理及运输的设备的表面。非限制性实例包括下水道、浴盆、厨房用具、工作台面、浴帘、水泥浆、卫生间、工业食品和饮料的生产设施以及地板的表面。其它表面包括海上构筑物，如船只、码头、石油平台、取水口、筛子，以及观察口。
[0100] 可通过任意已知方式将D-氨基酸涂覆于表面，诸如使用有效量的D-氨基酸对所述表面进行覆盖、涂布、接触、结合、填充或加载。可以使用合适的载体，如液体载体(其通过蒸发被去除，余下D-氨基酸涂层)，将D-氨基酸涂覆于表面。在特定的实例中，例如，通过使用聚合物/D-氨基酸薄膜对所述表面喷洒、通过将所述表面浸入例如聚合物/D-氨基酸溶液或将其在所述表面上旋涂，或通过其它共价或非共价方法将D-氨基酸直接附着于表面。在其它的情况下，使用吸附所述D-氨基酸的吸附性物质(诸如水凝胶)涂布所述表面。
[0101] D-氨基酸适合用于处理医院或医学环境中的表面。当所述D-氨基酸和组合物以涂层、润滑剂、洗涤或清洗溶液等形式涂覆时，本文所述的D-氨基酸和组合物的涂覆可以抑制生物薄膜的形成或减少生物薄膜的形成。
[0102] 本文所述的D-氨基酸还适合用于处理纺织纤维材料，尤其对其进行防腐处理。这类材料是未染色和染色或印花的纤维材料，如丝绸、羊毛、聚酰胺或聚氨酯材料，尤其是各种纤维素纤维材料。这种纤维材料是例如天然纤维素纤维，如棉、亚麻、黄麻和大麻，以及纤维素和再生纤维素。还可以使用一种或多种本文所述的D-氨基酸使纸张，例如用于卫生目的的纸张具有抗生物薄膜特性。还可使非织造布，例如尿片/尿布、卫生巾、护垫、卫生和家庭用布具有抗生物薄膜特性。
[0103] 本文所述的D-氨基酸还适合用于处理工业制剂如涂料、润滑剂等，尤其赋予其抗生物薄膜特性，或对其进行防腐处理。
[0104] 本文所述的D-氨基酸还适合用在洗涤和清洗制剂中，如用在液体或粉末洗涤剂或软化剂中。本文所述的D-氨基酸还可以用在清洗和消毒坚硬表面的家庭和通用清洁剂中。示例性清洗制品具有例如以下组成：0.01重量%至5重量%的一种或多种D-氨基酸、3.0重量%的辛醇4EO、1.3重量%的脂肪醇C8-C10糖苷、3.0重量%的异丙醇，以及补足至
100重量%的水。
100重量%的水。
[0105] 本文所述的D-氨基酸还可以用于对木材的生物薄膜处理、对皮革的生物薄膜处理、对皮革的防腐处理以及为皮革提供抗生物薄膜特性。本文所述的D-氨基酸还可以用于保护化妆产品和家居产品免于微生物损害。
[0106] 本文所述的D-氨基酸可用于预防生物淤积，或消除或控制微生物积累，这是通过将一种或多种本文所述的D-氨基酸并入所关注的物品或物品表面或通过将所述抗生物薄膜物质作为涂层或薄膜的一部分涂覆在这些表面上来实现的。这些表面包括与海洋环境(包括淡水、半咸水和咸水环境）接触的表面，例如，船只的船体、码头表面或循环或流经水系统的管道内部。其它表面容易受到类似的生物淤积，例如暴露在雨水中的墙壁、淋浴间墙壁、屋顶、水槽、游泳池区、桑拿浴室、地板和暴露于潮湿环境的墙壁如地下室或车库，甚至工具箱及户外家具。全部内容通过引用结合在此的美国专利7,618,697公开了在保护表面不受生物淤积影响的涂层或薄膜中所使用的化合物。
[0107] 当作为薄膜或涂层的一部分被涂覆时，本文所述的一种或多种D-氨基酸可以是组合物的一部分，所述组合物进一步包含粘合剂。所述粘合剂可以是相容于本抗生物薄膜物质的任意聚合物或寡聚物。所述粘合剂在所述抗淤积组合物制备前可以是聚合物或寡聚物形式，或者在制备期间或制备后(包括在涂覆至所述基底之后)通过多聚化而形成。在特定的应用中，诸如特定的涂布应用，在涂覆后对所述抗淤积组合物的寡聚物或多聚物进行交联是理想的。本文所使用的术语“粘合剂”还包括商业上被用于木材、塑料、玻璃和其它表面进行护理的材料，诸如二元醇类、油类、蜡和表面活性剂。实例包括木材防水材料、乙烯保护剂、保护蜡等。
[0108] 所述组合物可以是涂层或薄膜。当所述组合物是通过，例如，使用胶粘剂或包括压延和共挤压在内的熔融涂覆而被用于表面的热塑性薄膜时，所述粘合剂是用于制备所述薄膜的热塑性聚合物基质。当所述组合物是涂层时，其可作为液体溶液或混悬液、膏体、凝胶、油类而涂覆，或所述涂布组合物可以是固体，例如粉末涂层，其随后通过加热、UV照射或其它方法而固化。
[0109] 因为本发明的组合物可以是涂层或薄膜，所述粘合剂可以包含用于涂布制剂或薄膜制备物的任意聚合物。例如，所述粘合剂是热固性、热塑性、弹性体的、固有交联或交联的聚合物。热固性、热塑性、弹性体的、固有交联或交联的聚合物包括聚烯烃、聚酰胺、聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚酯、卤化乙烯聚合物如PVC、天然和合成橡胶、醇酸树脂、环氧树脂、不饱和聚酯、不饱和聚酰胺、聚酰亚胺、含硅和氨基甲酸酯聚合物、氟化聚合物、源自取代丙烯酸酯的可交联丙烯酸树脂，如源自环氧丙烯酸酯、聚氨酯丙烯酸酯或聚酯丙烯酸酯。所述聚合物还可以是前述化学品的混合物和共聚物。
[0110] 生物相容性涂布聚合物如聚[-烷氧基链烷酸酯-共-3-羟基烯酸酯](PHAE)聚酯 (poly[-alkoxyalkanoate-co-3-hydroxyalkenoate](PHAE)polyesters)，Geiger 等，Polymer Bulletin 52,65-70(2004)也可在本发明中作为粘合剂。醇酸树脂、聚酯、聚氨酯、环氧树脂、含硅酮聚合物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、氟化聚合物和乙酸乙烯酯、乙烯醇和乙烯胺聚合物是有用于本发明的常见涂布粘合剂的非限制性实例。其它已知涂布粘合剂是本申请的一部分。
[0111] 可以使用，例如，三聚氰胺树脂、尿素树脂、异氰酸酯、异氰尿酸酯、聚异氰酸酯、环氧树脂、酐类、多元酸和胺在使用或不使用加速剂的情况下使涂层交联。本文所述的组合物可以是，例如，涂覆于表面的涂层，所述表面暴露于利于生物积累的条件。本文所述的一种或多种D-氨基酸在所述涂层中的存在可预防生物体对所述表面的附着。
[0112] 本文所述的D-氨基酸可以是完整涂料或油漆制剂(如海洋凝胶涂层、虫漆、清漆、天然漆或油漆)的一部分，或者抗淤积组合物可能只包含本发明的聚合物和粘合剂，或本发明的聚合物、粘合剂和载体物质。本领域已知的这些涂布制剂或涂覆中的其它添加剂也是合适的。
[0113] 所述涂层可以是溶剂型或含水的。一般认为含水涂层更为环保。在一些实例中，所述涂层可以是本文所述的一种或多种D-氨基酸和粘合剂的含水分散液或是水基涂层或涂料。例如，所述涂层可包含一种或多种D-氨基酸与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺聚合物或共聚物或聚[-烷氧基链烷酸酯-共-3-羟基烯酸酯]聚酯的含水分散液。
[0114] 所述涂层可以用于已经被涂覆的表面中，如涂覆在先前涂覆过的物品上的保护涂层、透明涂层或保护蜡。涂层系统包括船舶涂层、木器涂层、其它用于金属的涂层，以及覆盖塑料和陶瓷的涂层。船舶涂层的实施例是包含不饱和聚酯、苯乙烯和催化剂的凝胶涂层。在一些例子中，所述涂层是房屋油漆，或其它装饰性或保护性油漆。所述涂层可以是油漆或其它涂覆于水泥、混凝土或其它砌体物质的涂层。所述涂层可以是地下室或地基的防水材料。
[0115] 在一些情况下，可通过任意常规方法将所述涂布组合物涂覆于表面，所述方法包括旋转式涂布、浸泡式涂布、喷雾式涂布、刮涂(draw down)或通过毛刷、滚筒或其它涂覆设备进行。可进行干燥或固化过程。
[0116] 涂层或薄膜厚度可根据涂覆方法而变，并且本领域的技术人员在进行有限的测试后可容易地对其测定。
[0117] 在一些情况下，本文所述的组合物可以是保护性压膜的形式。这样的膜可包含热固性、热塑性、弹性体的或交联的聚合物。这些聚合物的实例包括但不限于，聚烯烃、聚酰胺、聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚酯、卤化乙烯聚合物如PVC、天然和合成橡胶、醇酸树脂、环氧树脂、不饱和聚酯、不饱和聚酰胺、聚酰亚胺、氟化聚合物、含硅和氨基甲酸酯聚合物。所述聚合物还可以是前述化学品的混合物和共聚物。
[0118] 当本文所述的组合物是预制膜时，其可通过，例如，使用胶粘剂而涂覆于表面或共挤压至所述表面。其还可通过紧固器进行机械附着，所述紧固器可能需要使用密封剂或弥缝泥，其中还可有利地使用本发明的酯类。还可通过加热涂覆塑料膜，所述加热涂覆包括压延、熔融涂覆和收缩包装。
[0119] 在其它情况下，本文所述的组合物可以是上光剂如家具上光剂，或分散剂或表面活性剂制剂如乙二醇或矿物油分散剂，或其它用于例如木材保护的制剂的一部分。有效的表面活性剂包括，但不限于基于聚氧乙烯的表面活性物质，其包括：聚氧乙烯山梨聚糖四油酸酯(PST)、聚氧乙烯山梨醇六油酸酯(PSH)、聚氧乙烯6十三烷基醚、聚氧乙烯12十三烷基醚、聚氧乙烯18十三烷基醚、 表面活性剂、 表面活性剂；以及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物如 和 产品系列(来自BASF)。其
它基质形成组分包括右旋糖酐、线性PEG分子(MW为500至5,000,000)、星型PEG分子、梳形和树枝状超支化PEG分子，以及类似线性、星状及树枝状多胺聚合物，以及各种碳化、全氟化(例如， 含氟表面活化剂)和硅化的(如二甲基硅氧烷-环氧
乙烷嵌段共聚物)表面活性剂。
它基质形成组分包括右旋糖酐、线性PEG分子(MW为500至5,000,000)、星型PEG分子、梳形和树枝状超支化PEG分子，以及类似线性、星状及树枝状多胺聚合物，以及各种碳化、全氟化(例如， 含氟表面活化剂)和硅化的(如二甲基硅氧烷-环氧
乙烷嵌段共聚物)表面活性剂。
[0120] 考虑到本文所述的D-氨基酸应用的广阔范围，包含D-氨基酸的组合物可包括其它添加剂，诸如抗氧化剂、UV吸收剂、受阻胺、亚磷酸盐或膦酸盐、苯并呋喃-2-酮、硫代协同剂、聚酰胺稳定剂、硬脂酸金属盐、成核剂、填料、增强剂、润滑剂、乳化剂、染料、着色剂、分散剂、其它光学增亮剂、阻燃剂、抗静电剂、起泡剂以及类似物质，诸如下文所列的物质，或它们的混合物。
[0121] 待处理的基底可以是无机或有机基底，例如一种金属或金属合金、一种如上所述的热塑性、弹性、固有交联或交联的聚合物、一种天然聚合物如木材或橡胶、一种陶瓷材料、玻璃、皮革或其它纺织品。基底可以是例如无机非金属表面，如硅石、二氧化硅、钛氧化物、铝氧化物、铁氧化物、碳、硅、各种硅酸盐和溶胶、砖石以及复合材料，如玻璃纤维和塑料木材(聚合物和木屑、木粉或其它木材颗粒的混合物)。
[0122] 所述基底可以是多层物品，其由每层中相同或不同的组分构成。所涂布或层压的表面可以是具有所涂覆涂层或层压层的暴露表面。
[0123] 待涂布或层压的无机或有机基底可以是任意固体形式。
[0124] 例如，聚合物基底可以是薄膜形式的塑料、注射模塑制品、挤压工件、纤维、毛毡或机织物。例如，用于建筑或制造耐用品，如壁板、招牌和邮箱的模压或挤压的聚合物制品都可以从并入本发明的D-氨基酸中获益。在某些情况下，聚合物制品可在成形期间，如模塑期间，并入一种或多种D-氨基酸。
[0125] 受益于本方法的塑料包括但不限于，用于建构或制造耐用品或机械零件的塑料，包括户外家具、船只、墙板、屋顶、玻璃、保护膜、贴花、密封剂、复合材料如塑料木材和纤维增强复合材料、功能性薄膜，其包括用于显示器的薄膜，以及由合成纤维构成的制品如遮阳篷、如用于帆布或船帆的织物，以及橡胶制品如户外地垫、地板护面、塑料涂层、塑料容器和包装材料；厨房和浴室用具(如刷子、浴帘、海绵、防滑垫)、乳胶、过滤材料(空气和水过滤器)；用于医疗领域的塑料制品，如敷贴材料、注射器、导管等、所谓“医疗器械”、手套和褥垫。这些塑料制品的示例为聚丙烯、聚乙烯、PVC、POM、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯类以及甲基丙烯酸类、聚丁二烯、热塑性聚烯烃、离子型聚合物、不饱和聚酯和包括ABS、SAN和PC/ABS在内的聚合物树脂的混合物。
[0126] 在某些情况下，如将本文所述的一种或多种D-氨基酸并入循环冷却水中，若干个百万分率的D-氨基酸可有效地预防管道和其它机械装置的壁上的生物薄膜积累。然而，浸出引起的一些损失、涉及氨基酸的反应引起的一些损失以及降解反应引起的一些损失等意味着在实践中，人们可制备的制剂所具有的浓度将在为应用所设想的一段时间内有效，并且这种有效性考虑到D-氨基酸将要面对的环境压力。
[0127] 例如，在工业水应用中，可以使用相对于被处理的水约0.001重量%约10重量%例如约0.001重量%至约10重量%的一种或多种D-氨基酸，通常可使用的上限为低于约10％，例如约5%、约3%、约2%或者甚至约1%或者更少可以在许多情况下有效，例如可以使用负载水平为约0.01%至约5%，或约0.01%至约2%的一种或多种D-氨基酸。在其它实施方案中，可以使用的上限低于10%、5%、3%、2%、1%，如可以使用0.01重量%至5重量%，或约.01重量%至2重量%的一种或多种D-氨基酸。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在许多情况下极少的量是有效的，并且约0.000001%至约0.5%，例如，约0.000001%至约0.1%或约0.000001%至约0.01%的浓度可以用于工业水应用中。在其它实施方案中，0.000001%至0.5%，例如，0.000001%至0.1%或0.000001%至0.01%的浓度可以用于工业水应用中。
[0128] 特别是在低浓度下的所述D-氨基酸可完全在可摄食的应用中，诸如可能出现生物薄膜的可再利用的水瓶或自动饮水器中被安全地使用。可以使用包含本文所述的一种或多种D-氨基酸的制剂清洗这些水转运器械的表面，或在流经管道容器的水中引入低水平的一种或多种D-氨基酸。例如，可向这些水中引入约0.0001重量%或更低或最高达1重量%的一种或多种D-氨基酸，一般为低于约0.1重量%。在其它实施方案中，可向这些水中引入约0.0001重量%或更低或最高达1重量%的一种或多种D-氨基酸，一般为低于约0.1重量%。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在许多情况下极少的量是有效的，并且在这些应用中可使用约0.000001%至约0.1%的浓度，例如约0.000001%至约0.01%或约0.000001%至约0.001%。在其它实例中，可以使用0.000001%至0.1%、0.000001%至0.01%或0.000001%至0.001%的浓度。
[0129] 在一些情况下，液体制剂以约0.0005μM的D-氨基酸至约50μM的D-氨基酸制备，例如，约0.001μM的D-氨基酸至约25μM的D-氨基酸、约0.002μM的D-氨基酸至约10μM的D-氨基酸、约0.003μM的D-氨基酸至约5μM的D-氨基酸、约0.004μM的D-氨基酸至约1μM的D-氨基酸、约0.005μM的D-氨基酸至约0.5μM的D-氨基酸、约0.01μM的D-氨基酸至约0.1μM的D-氨基酸或约0.02μM的D-氨基酸至约0.1μM的D-氨基酸。
在其它实施方案中，液体制剂以约0.0005μM的D-氨基酸至约50μM的D-氨基酸制备，例如，0.001μM的D-氨基酸至25μM的D-氨基酸、0.002μM的D-氨基酸至10μM的D-氨基酸、0.003μM的D-氨基酸至5μM的D-氨基酸、0.004μM的D-氨基酸至1μM的D-氨基酸、0.005μM的D-氨基酸至0.5μM的D-氨基酸、0.01μM的D-氨基酸至0.1μM的D-氨基酸或0.02μM的D-氨基酸至0.1μM的D-氨基酸。优选地，D-氨基酸组合物是以纳摩尔浓度，例如，以约5nM、以约10nM、以约15nM、以约20nM、以约25nM、以约30nM、以约50nM或更高浓度。在其它实施方案中，D-氨基酸组合物为以5nM、以10nM、以15nM、以20nM、以
25nM、以30nM或以50nM的浓度。
在其它实施方案中，液体制剂以约0.0005μM的D-氨基酸至约50μM的D-氨基酸制备，例如，0.001μM的D-氨基酸至25μM的D-氨基酸、0.002μM的D-氨基酸至10μM的D-氨基酸、0.003μM的D-氨基酸至5μM的D-氨基酸、0.004μM的D-氨基酸至1μM的D-氨基酸、0.005μM的D-氨基酸至0.5μM的D-氨基酸、0.01μM的D-氨基酸至0.1μM的D-氨基酸或0.02μM的D-氨基酸至0.1μM的D-氨基酸。优选地，D-氨基酸组合物是以纳摩尔浓度，例如，以约5nM、以约10nM、以约15nM、以约20nM、以约25nM、以约30nM、以约50nM或更高浓度。在其它实施方案中，D-氨基酸组合物为以5nM、以10nM、以15nM、以20nM、以
25nM、以30nM或以50nM的浓度。
[0130] 当用于涂层或薄膜时，可存在少量的一种或多种D-氨基酸以用于短期用途，例如，一次性使用、周期性或可抛式物品等。通常在这些涂层或薄膜中可使用约0.001重量%或更低最高达约5重量%的一种或多种D-氨基酸，例如最高达约3重量%或约2重量%。在其它实施方案中，可使用0.001重量%至5重量%、或最高达3重量%或2重量%的一种或多种D-氨基酸。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在许多情况下极少的量是有效的，并且在涂布应用中可使用约0.0001重量%至约1重量%的浓度，例如约0.0001重量%至约
0.5重量%或约0.0001重量%至约0.01重量%的浓度。在其它实施方案中，在涂层应用中可使用0.0001重量%至1重量%、0.0001重量%至0.5重量%或0.0001重量%至0.01重量%的一种或多种D-氨基酸。
0.5重量%或约0.0001重量%至约0.01重量%的浓度。在其它实施方案中，在涂层应用中可使用0.0001重量%至1重量%、0.0001重量%至0.5重量%或0.0001重量%至0.01重量%的一种或多种D-氨基酸。
[0131] 为了更稳固的用途，如用于船舶、游泳池、淋浴器或建筑材料，可以使用更高水平的一种或多种D-氨基酸。例如，可以使用基于涂层或薄膜试剂的约0.01%至约30%，在多数应用中，约0.01%至约15%、或至约10%是有效的，并且通常可以使用约0.01%至约5%，或约0.01%至约1%，或甚至约0.1%或更少的D-氨基酸。
[0132] 为进行向成型塑料部件中的并入，可使用约0.00001重量%至约10重量%的一种或多种D-氨基酸，例如约0.001重量%至约3重量%，例如可使用约0.001重量%最高达约1重量%的一种或多种D-氨基酸。在一些实施方案中，可以使用0.00001%至10%的一种或多种D-氨基酸，或0.0001%至3%，或0.001%最高达1%的一种或多种D-氨基酸。在将所述D-氨基酸浸渍进入已制备成型的部件或纤维的表面的情况下，在所述表面存在的D-氨基酸的实际量可取决于所述基底材料、所述浸渍用组合物的制剂以及所述浸渍步骤中所用的温度和时间。考虑到本发明D-氨基酸的高活性，在许多情况下极少的量是有效的，并且在塑料制品中可使用约0.0001重量%至约1重量%的浓度，例如约0.0001重量%至约0.1重量%或约0.0001重量%至约0.01重量%的浓度。在其它实施方案中，在塑料中可以使用0.0001重量%至1重量%，或0.0001重量%至0.1重量%或0.0001重量%至0.01重量%的一种或多种D-氨基酸。
[0133] 可使用本领域中广为接受的技术测量使用D-氨基酸进行处理而生物薄膜中引起的抑制或降低。这些技术使人能够通过测量所述粘附生物材料的染色而估测细菌附着、能够使用显微方法对微生物进行体内观测或在所述生物薄膜内检测反应于毒性药剂的细胞死亡。随着处理之后，可对于由所述生物薄膜所覆盖的表面面积、厚度和粘稠度(例如，所述生物薄膜的完整度)而减少所述生物薄膜。生物薄膜分析的非限制实例包括微滴度平板生物薄膜分析、基于荧光的生物薄膜分析、根据Walker等，Infect.Immun.73:3693-3701(2005)的静态生物薄膜分析、气液交界面分析、菌落生物薄膜分析和Kadouri Drip-Fed生物薄膜 分析(Merritt等,(2005)Current Protocols in Microbiology1.B.1.1-1.B.1.17)。可将这些分析用于测量D-氨基酸破坏或抑制生物薄膜形成的活性(Lew等,(2000)Curr.Med.Chem.7(6):663-72；Werner等,(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic 5(1):32-6)。
[0134] 在一些情况下，为处理生物薄膜或预防生物薄膜的形成，可将D-氨基酸与第二种药剂组合使用，例如生物杀灭剂、抗生素。可将抗生素与D-氨基酸先后地或同步地结合使用。例如，可配制本文所述的任意组合物以包含一种或多种D-氨基酸和一种或多种第二药剂。
[0135] 所述抗生素可以是本领域的普通技术人员所知的可抑制细菌生长或对其杀灭的任意化合物。抗生素的可用的非限制实例包括林可酰胺类抗生素(lincosamide)(克林霉素(clindomycin))；氯霉素类；四环类(诸如四环素、金霉素、地美环素(Demeclocycline)、美他环素(Methacycline)、多西环素(Doxycycline)、米诺环素(Minocycline))；氨基糖甙类(诸如庆大霉素(Gentamicin)、妥布霉素、奈替米星(Netilmicin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、链霉素、新霉素)；β-内酰胺(诸如青霉素、头孢菌素类(cephalosporin)、亚胺培南(Imipenem)、氨曲南(Aztreonam))；糖肽类抗生素(诸如万古霉素(vancomycin))；多肽类抗生素(诸如杆菌肽)；大环内酯类(红霉素)、两性霉素；磺胺类(诸如磺胺、磺胺甲噁唑、酞磺醋胺、磺胺嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺西汀(Sulfacytine)、磺胺多辛(Sulfadoxine)、磺胺米隆(Mafenide)、对氨基苯甲酸、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-Sulfamethoxazole))；乌洛托品(Methenamin)；呋喃妥因(Nitrofurantoin)；非那吡啶(Phenazopyridine)；甲氧苄啶(trimethoprim)；利福平(rifampicin)；甲硝唑(metronidazole)；头孢唑林类(cefazolin)；林可霉素(Lincomycin)；大观霉素；莫匹罗星类(mupirocin)；喹诺酮类(诸如萘啶酸(Nalidixic Acid)、西诺沙星(Cinoxacin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、环丙沙星、甲氟哌酸(Perfloxacin)、氧氟沙星、依诺沙星(Enoxacin)、氟罗沙星(Fleroxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin))；新生霉素类；多粘菌素类；短杆菌肽类以及抗假单胞菌药物(antipseudomonals)(诸如羧苄西林(Carbenicillin)、卡茚西林(Carbenicillin Indanyl)、替卡西林(Ticarcillin)、阿洛西林(Azlocillin)、美洛西林(Mezlocillin)、哌拉西林(Piperacillin))或其任意盐类或变体。这些抗生素可商购，例如获 自Daiichi Sankyo,Inc.(Parsipanny，NJ)、Merck(Whitehouse Station,NJ)、Pfizer(New York,NY)、Glaxo Smith Kline(Research Triangle Park,NC)、Johnson & Johnson(New Brunswick,NJ)、AstraZeneca(Wilmington,DE)、Novartis(East Hanover,NJ)和Sanofi-Aventis(Bridgewater,NJ)。所使用抗生素应取决于细菌感染的类型。
[0136] 此外已知的生物杀灭剂包括三氯生、二氧化氯、双胍、氯己定、木糖醇等。
[0137] 抗微生物剂的可用实例包括但不限于，羟基吡啶硫酮类，特别是锌复合体(ZPT)；二羟基甲基二甲基乙内酰脲 甲基氯异噻唑啉酮/甲基异噻唑
啉酮 亚硫酸钠；亚硫酸氢钠；咪唑烷基脲( 重氮烷基脲
苯甲醇；2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇 福尔马林(Formalin)
(甲醛)；碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(Polyphase )；氯乙酰胺；甲胺；甲基二溴戊二腈(1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷或 )；戊二醛；5-溴-5-硝基-1,3-二氧杂环
己烷 苯乙醇；邻苯基苯酚/邻苯基苯酚钠；羟甲基甘氨酸钠(Suttocide
)；聚亚甲氧基双环噁唑烷(Nuosept )；二甲氧烷；硫柳汞；2,4-二氯苯甲醇；克菌丹(Captan)；氯苯甘醚(Chlorphenenesin)；双氯酚；氯代丁醇；甘油月桂酸酯；卤代二苯醚；2,4,4'-三氯-2'-羟基二苯醚( 或TCS)；2,2'-二羟基-5,5'-二溴二苯
醚；酚类化合物；苯酚；2-甲基苯酚；3-甲基苯酚；4-甲基苯酚；4-乙基苯酚；2,4-二甲基苯酚；2,5-二甲基苯酚；3,4-二甲基苯酚；2,6-二甲基苯酚；4-n-丙基苯酚；4-正丁基苯酚；4-正戊基苯酚；4-叔戊基苯酚；4-正己基苯酚；4-正庚基苯酚；单烷基和多烷基及芳香基卤代酚；对氯苯酚；甲基对氯苯酚；乙基对氯苯酚；正丙基对氯苯酚；正丁基对氯苯酚；正戊基对氯苯酚；仲戊基对氯苯酚；环己基对氯苯酚；正庚基对氯苯酚；正辛基对氯苯酚；邻氯苯酚；甲基邻氯苯酚；乙基邻氯苯酚；正丙基邻氯苯酚；正丁基邻氯苯酚；正戊基邻氯苯酚；叔戊基邻氯苯酚；正己基邻氯苯酚；正庚基邻氯苯酚；邻苄基对氯苯酚；o-苄基(Benxyl)-间甲基对氯苯酚；o-苄基-m；间二甲基对氯苯酚；邻苯乙基对氯苯酚；邻苯乙基间甲基对氯苯酚；3-甲基对氯苯酚；3,5-二甲基对氯苯酚；6-乙基-3-甲基对氯苯酚；
6-正丙基-3-甲基对氯苯酚；6-异丙基-3-甲基对氯苯酚；2-乙基-3,5-二甲基对氯苯酚；6-仲丁基-3-甲基对氯苯酚；2-异丙基-3,5-二甲基对氯苯酚；6-二乙基甲基-3-甲基对氯苯酚；6-异丙基-2-乙基-3-甲基对氯苯酚；2-仲戊基-3,5-二甲基对氯苯酚；
2-二乙基甲基-3,5-二甲基对氯苯酚；6-仲辛基-3-甲基对氯苯酚；对氯间甲酚：对溴苯酚；甲基对溴苯酚；乙基对溴苯酚；正丙基对溴苯酚；正丁基对溴苯酚；正戊基对溴苯酚；
仲戊基对溴苯酚；正己基对溴苯酚；环己基对溴苯酚；邻溴苯酚；叔戊基邻溴苯酚；正己基邻溴苯酚；正丙基-间二甲基邻溴苯酚；2-苯基苯酚；4-氯-2-甲基苯酚；4-氯-3-甲基苯酚；4-氯-3,5-二甲基苯酚；2,4-二氯-3,5-二甲基苯酚；3,4,5,6-四溴-2-甲基苯酚；5-甲基-2-戊基苯酚；4-异丙基-3-甲基苯酚；对氯间二甲酚(PCMX)；氯代百里酚；苯氧基乙醇；苯氧基异丙醇；5-氯-2-羟基二基苯甲烷；间苯二酚及其衍生物；间苯二酚；甲基间苯二酚；乙基间苯二酚；正丙基间苯二酚；正丁基间苯二酚；正戊基间苯二酚；正己基间苯二酚；正庚基间苯二酚；正辛基间苯二酚；正壬基间苯二酚；苯基间苯二酚；苄基间苯二酚；苯乙基间苯二酚；苯丙基间苯二酚；对氯苄基间苯二酚；5-氯-2,4-二羟基二苯基甲烷；4'-氯-2,4-二羟基二苯基甲烷；5-溴-2,4-二羟基二苯基甲烷；4'-溴-2,4-二羟基二苯基甲烷；双酚化合物；2,2'-亚甲基双(4-氯苯酚)；2,2'-亚甲基双(3,4,6-三氯苯酚)；2,2'-亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)；双(2-羟基-3,5-二氯苯基)硫醚；双(2-羟基-5-氯苄基)硫醚；苯甲酸酯(对羟基苯甲酸酯)；羟苯甲酯；羟苯丙酯；羟苯丁酯；羟苯乙酯；羟苯异丙酯；羟苯异丁酯；羟苯苄酯；羟苯甲酯钠；羟苯丙酯钠；卤化对称二苯脲；
3,4,4'-三氯对称二苯脲( 或TCC)；3-三氟甲基-4,4'-二氯对称二苯脲；
3,3',4-三氯对称二苯脲；氯己定及其二葡萄糖酸盐；双乙酸盐和双盐酸盐；十一烯酸；噻菌灵(thiabendazole)、海克替啶(Hexetidine)；盐酸聚六亚甲基双胍 银化
合物诸如有机银盐或无机银盐，包括其制剂如JM 在内的氯化银，以及微化银颗粒。
啉酮 亚硫酸钠；亚硫酸氢钠；咪唑烷基脲( 重氮烷基脲
苯甲醇；2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇 福尔马林(Formalin)
(甲醛)；碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(Polyphase )；氯乙酰胺；甲胺；甲基二溴戊二腈(1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷或 )；戊二醛；5-溴-5-硝基-1,3-二氧杂环
己烷 苯乙醇；邻苯基苯酚/邻苯基苯酚钠；羟甲基甘氨酸钠(Suttocide
)；聚亚甲氧基双环噁唑烷(Nuosept )；二甲氧烷；硫柳汞；2,4-二氯苯甲醇；克菌丹(Captan)；氯苯甘醚(Chlorphenenesin)；双氯酚；氯代丁醇；甘油月桂酸酯；卤代二苯醚；2,4,4'-三氯-2'-羟基二苯醚( 或TCS)；2,2'-二羟基-5,5'-二溴二苯
醚；酚类化合物；苯酚；2-甲基苯酚；3-甲基苯酚；4-甲基苯酚；4-乙基苯酚；2,4-二甲基苯酚；2,5-二甲基苯酚；3,4-二甲基苯酚；2,6-二甲基苯酚；4-n-丙基苯酚；4-正丁基苯酚；4-正戊基苯酚；4-叔戊基苯酚；4-正己基苯酚；4-正庚基苯酚；单烷基和多烷基及芳香基卤代酚；对氯苯酚；甲基对氯苯酚；乙基对氯苯酚；正丙基对氯苯酚；正丁基对氯苯酚；正戊基对氯苯酚；仲戊基对氯苯酚；环己基对氯苯酚；正庚基对氯苯酚；正辛基对氯苯酚；邻氯苯酚；甲基邻氯苯酚；乙基邻氯苯酚；正丙基邻氯苯酚；正丁基邻氯苯酚；正戊基邻氯苯酚；叔戊基邻氯苯酚；正己基邻氯苯酚；正庚基邻氯苯酚；邻苄基对氯苯酚；o-苄基(Benxyl)-间甲基对氯苯酚；o-苄基-m；间二甲基对氯苯酚；邻苯乙基对氯苯酚；邻苯乙基间甲基对氯苯酚；3-甲基对氯苯酚；3,5-二甲基对氯苯酚；6-乙基-3-甲基对氯苯酚；
6-正丙基-3-甲基对氯苯酚；6-异丙基-3-甲基对氯苯酚；2-乙基-3,5-二甲基对氯苯酚；6-仲丁基-3-甲基对氯苯酚；2-异丙基-3,5-二甲基对氯苯酚；6-二乙基甲基-3-甲基对氯苯酚；6-异丙基-2-乙基-3-甲基对氯苯酚；2-仲戊基-3,5-二甲基对氯苯酚；
2-二乙基甲基-3,5-二甲基对氯苯酚；6-仲辛基-3-甲基对氯苯酚；对氯间甲酚：对溴苯酚；甲基对溴苯酚；乙基对溴苯酚；正丙基对溴苯酚；正丁基对溴苯酚；正戊基对溴苯酚；
仲戊基对溴苯酚；正己基对溴苯酚；环己基对溴苯酚；邻溴苯酚；叔戊基邻溴苯酚；正己基邻溴苯酚；正丙基-间二甲基邻溴苯酚；2-苯基苯酚；4-氯-2-甲基苯酚；4-氯-3-甲基苯酚；4-氯-3,5-二甲基苯酚；2,4-二氯-3,5-二甲基苯酚；3,4,5,6-四溴-2-甲基苯酚；5-甲基-2-戊基苯酚；4-异丙基-3-甲基苯酚；对氯间二甲酚(PCMX)；氯代百里酚；苯氧基乙醇；苯氧基异丙醇；5-氯-2-羟基二基苯甲烷；间苯二酚及其衍生物；间苯二酚；甲基间苯二酚；乙基间苯二酚；正丙基间苯二酚；正丁基间苯二酚；正戊基间苯二酚；正己基间苯二酚；正庚基间苯二酚；正辛基间苯二酚；正壬基间苯二酚；苯基间苯二酚；苄基间苯二酚；苯乙基间苯二酚；苯丙基间苯二酚；对氯苄基间苯二酚；5-氯-2,4-二羟基二苯基甲烷；4'-氯-2,4-二羟基二苯基甲烷；5-溴-2,4-二羟基二苯基甲烷；4'-溴-2,4-二羟基二苯基甲烷；双酚化合物；2,2'-亚甲基双(4-氯苯酚)；2,2'-亚甲基双(3,4,6-三氯苯酚)；2,2'-亚甲基双(4-氯-6-溴苯酚)；双(2-羟基-3,5-二氯苯基)硫醚；双(2-羟基-5-氯苄基)硫醚；苯甲酸酯(对羟基苯甲酸酯)；羟苯甲酯；羟苯丙酯；羟苯丁酯；羟苯乙酯；羟苯异丙酯；羟苯异丁酯；羟苯苄酯；羟苯甲酯钠；羟苯丙酯钠；卤化对称二苯脲；
3,4,4'-三氯对称二苯脲( 或TCC)；3-三氟甲基-4,4'-二氯对称二苯脲；
3,3',4-三氯对称二苯脲；氯己定及其二葡萄糖酸盐；双乙酸盐和双盐酸盐；十一烯酸；噻菌灵(thiabendazole)、海克替啶(Hexetidine)；盐酸聚六亚甲基双胍 银化
合物诸如有机银盐或无机银盐，包括其制剂如JM 在内的氯化银，以及微化银颗粒。
[0138] 本发明在下列多个实施例中被进一步描述，其并非限制描述于权利要求中的本发明范围。室温指的是20-25℃范围中的温度。实施例
[0139] 材料与方法
[0140] 菌株和培养基。将枯草杆菌NCIB3610及其衍生株在37℃下生长于Luria-Bertani(LB)培养基中或在23℃下生长于MSgg培养基中(Branda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:11621(2001))。固体培养基包含1.5%的Bacto琼脂。在适当的情况下加入以下浓度的抗生素用于枯草杆菌的生长。10μg每ml的四环素以及5μg每ml的红霉素，500μg每ml的大观霉素。
[0141] 本研究中使用的菌株：
[0142] 所有枯草杆菌均为NCIB 3610的衍生株，所述NCIB 3610是形成强生物薄膜的野生型菌株(Branda等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11621(2001))；
[0143] 菌株FC5(PepsA-lacZcat)(Chu等,Mol.Microbiol.59:1216(2006))；
[0144] 菌株FC122(PyqxM-lacZ spec)(Chu等,Mol.Microbiol.59:1216(2006))；
[0145] 菌株IKG55(ΔracX::spec ΔylmE::tetR)；
[0146] 菌株DR-30(tasA-mCherry cat)；
[0147] 菌株IKG40(yqxM2)；
[0148] 菌株IKG44(yqxM6)；
[0149] 菌株IKG50(yqxM2 tasA-mCherry)；
[0150] 菌株IKG51(yqxM6 tasA-mCherry)；
[0151] 来自Kolter实验室收藏的金黄色葡萄球菌SC01。
[0152] 菌株构建。使用标准方法构建菌株(J.Sambrook,D.W.Russell,Molecular Cloning.A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，USA,2001))。使用长侧生PCR突变发生以创建ΔracX::spec和ΔylmE::tetR(Wach,Yeast 12:259(1996))。通过DNA介导的感受态细胞转化将DNA引入菌株PY79衍生株(Gryczan等,J.Bacteriol.134:318(1978))。使用SPP1噬菌体介导的转导以将来自PY79衍生株的抗生素抗性连锁的突变引入NCIB3610(Yasbin等,J.Virol.14:1343(1974))。
[0153] 试剂。氨基酸获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。14C-D-酪氨酸和14C-L-脯氨酸获自American Radiolabeled Chemicals,Inc(St.Louis,MO)。
[0154] 菌落和薄膜形成。对于固体培养基上的菌落形成，首先在LB液体培养基中将细胞生长至指数生长期并将3μl培养物涂布于包含1.5%Bacto琼脂的固体MSgg培养基上。在23℃下孵育所述平板。对于液体培养基中的薄膜形成，将细胞生长至指数生长期并在12孔平板(VWR)中将6μl培养物与6ml的培养基混合。在23℃下孵育平板。使用SPOT照相机(Diagnostic Instruments,USA)拍摄菌落和薄膜图像。
[0155] 制备条件化培养基。将细胞在LB培养基中生长至指数生长期。将0.1ml培养基加入100ml MSgg培养基中并且在23℃下在500ml烧杯内进行无振荡培养。下一步，通过在8,000rpm下进行15分钟离心而收集薄膜和条件化培养基。除去所述条件化培养基(上清液)并通过0.22μm滤器进行过滤。在4℃下储存所述滤过物。为进一步的纯化，在C-18Sep Pak柱筒(cartridge)上使用0%至100%甲醇以5%增幅逐步洗脱而对生物薄膜抑制活性进行级分分离。
[0156] 所述条件化培养基中对D-氨基酸的鉴定和定量。(A)氨基酸定量。在不同浓度(0.001-0.2mM)下制备Tyr、Leu、Met和Trp的标准溶液。使用分步梯度溶剂系统通过LC/MS分析这些溶液，所述分步梯度溶剂系统为包含0.1%的甲酸的0%至60%随后至100%的CH3CN(0-12-20分钟)(Thermo Scientific Hypercarb 4.6mm×100mm，5μm)，用以通过离子计数整合(ion count integration)获得各氨基酸浓度的校准曲线。以相同的方式通过LC/MS分析条件化培养基样品以测量全部4种手性氨基酸的总浓度。(B)D-氨基酸的鉴定。在SpeedVac干燥所述样品并且将其溶解于100μl的1N NaHCO3中。在丙酮中制备10mg/mL的L-FDAA(N-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)溶液并将50μl所述丙酮溶液加入1N NaHCO3中的所述样品内。在80℃下孵育所述反应混合物5分钟并且加入50μl的2N HCl以淬灭所述反应。使用梯度溶剂系统通过LC/MS分析所述衍生物，所述梯度溶剂系统为包含0.1%的甲酸的在30分钟内从10%升至100%的CH3CN(Agilent 1200系列HPLC/6130系列MS，Phenomenex Luna C18，4.6mm×100mm，5μm)。将L-FDAA氨基酸的保留时间与L-FDAA-可信标准氨基酸进行比较。
[0157] 结晶紫染色。结晶紫染色根据先前描述而进行(O’Toole等,Mol.Microbiol.30:295(1998))，区别在于所述细胞生长于6孔平板中。使用500μl 1.0%的结晶紫对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。
[0158] 荧光显微法。为进行荧光显微分析而收集了1ml培养物。使用PBS缓冲液洗涤所述细胞并且将其悬浮于50μl的PBS缓冲液中。使用多聚L-赖氨酸(Sigma)预处理盖玻片。使用Olympus工作站BX61显微镜检视样品。使用自动软件程序SimplePCI拍摄图像并使用程序MetaMorph(Universal Imaging Corporation)对其分析。
[0159] 透射电子显微法和免疫标记。使用蒸馏水稀释样品并将其吸附于碳或Formvar/碳涂布网格。通过在真空蒸发器中进行的辉光放电而使所述网格表面在用前具亲水性。一旦所述标本被吸附于所述薄膜表面，将过量的样品在滤纸(Whatman#1)上拭去并且将所述网格浮于5μl染液(1-2%的乙酸铀水溶液)之上数分钟并随后拭去。干燥所述样品并在TM 280KV的加速电压下在Tecnai GSpirit BioTWIN显微镜中检视所述样品。使用AMT 2k CCD照相机拍摄图像。
[0160] 对于TasA的免疫定位，将处于镍网格上的稀释样品浮于由PBS中的1%脱脂奶粉和0.1%Tween 20所组成的封闭缓冲液中30分钟，使用处于封闭缓冲液中以1∶150稀释的抗TasA一级抗体进行2小时孵育，在PBST中洗涤，随后将其暴露于山羊抗兔20nm金二级抗体(Ted Pella,Inc.,Redding,CA)1小时并进行清洗。全部网格使用乙酸铀和柠檬酸铅进行染色，随后根据上文所述进行观察。
[0161] β-半乳糖苷酶活性分析。在水浴中在37℃下将细胞振荡培养于MSgg培养基中。在各时间点采集1ml培养物。根据先前描述测定β-半乳糖苷酶活性(Chai等,Mol.Microbiol.67:254(2008))。
[0162] 氨基酸向所述细胞壁内的并入。通过离心收集50ml的处于指数生长期中期的培养物中的细胞，并且使用0.05M的磷酸缓冲液(pH 7)洗涤并将其重悬浮于5ml的相同缓冲14 14
液中。使用10μCi/ml的 C-D-酪氨酸或 C-L-脯氨酸处理细胞并进一步在37℃下孵育
2小时。对全细胞和细胞壁部分的放射性进行监测，并且以一定间隔除去样品。为对进入全细胞的并入进行测量而收集了0.1ml的样品。为对进入细胞壁的并入进行测量而收集了
0.5ml的样品。通过离心收集所述细胞并将其重悬浮于包含0.1mg/ml溶菌酶的SM缓冲液中[0.5M蔗糖、20mM MgCl2和10mM磷酸钾，pH(6.8)]。随后将所述细胞在37℃下孵育10分钟。下一步，通过在5000rpm下离心10分钟除去所产生的原生质体，将所述细胞壁物质保留于上清液中。使用抗sigma A抗体通过免疫印迹分析证实所述细胞壁部分中不含蛋白质。
最后，向所述全细胞样品和所述细胞壁物质中加入10ml 5%的三氯乙酸并将其保持于冰上至少30分钟。将所述TCA不可溶物质收集于Millipore滤器(0.22μm孔径，Millipore)并且使用5%的TCA洗涤。对所述滤器进行空气干燥并将其置于闪烁瓶内，并且使用闪烁计数器测定TCA不可溶物的每分钟计数。
液中。使用10μCi/ml的 C-D-酪氨酸或 C-L-脯氨酸处理细胞并进一步在37℃下孵育
2小时。对全细胞和细胞壁部分的放射性进行监测，并且以一定间隔除去样品。为对进入全细胞的并入进行测量而收集了0.1ml的样品。为对进入细胞壁的并入进行测量而收集了
0.5ml的样品。通过离心收集所述细胞并将其重悬浮于包含0.1mg/ml溶菌酶的SM缓冲液中[0.5M蔗糖、20mM MgCl2和10mM磷酸钾，pH(6.8)]。随后将所述细胞在37℃下孵育10分钟。下一步，通过在5000rpm下离心10分钟除去所产生的原生质体，将所述细胞壁物质保留于上清液中。使用抗sigma A抗体通过免疫印迹分析证实所述细胞壁部分中不含蛋白质。
最后，向所述全细胞样品和所述细胞壁物质中加入10ml 5%的三氯乙酸并将其保持于冰上至少30分钟。将所述TCA不可溶物质收集于Millipore滤器(0.22μm孔径，Millipore)并且使用5%的TCA洗涤。对所述滤器进行空气干燥并将其置于闪烁瓶内，并且使用闪烁计数器测定TCA不可溶物的每分钟计数。
[0163] 实施例1.在枯草杆菌的生物薄膜形成中对D-氨基酸的筛选
[0164] 在生物薄膜诱导培养基中孵育3天后枯草杆菌在长期培养物的气液交界面处形成厚膜(图1A)。但是，在额外的3至5天孵育后，所述薄膜失去其结构完整性(图1-B)。为研究成熟生物薄膜是否产生引发生物薄膜解体的因子而分析了当将条件培养基的浓缩和部分纯化的提取物加入新鲜培养基中时其对薄膜形成的效果。为此目的，将来自8天程度的培养物的条件化培养基加载于C18 Sep Pak柱。随后将来自所述柱的浓缩洗脱液加入新鲜接种的培养物中。对应于来自等体积条件化培养基的物质的25%的浓缩洗脱液的量足以预防薄膜形成(图1C)。作为对照，据观察使用来自3天程度培养物的条件化培养基而制备的浓缩洗脱液的加入对薄膜形成几乎无影响或无影响(图1D)。通过以逐步方式使用渐增浓度的甲醇洗脱所述柱筒而实现对所述因子的进一步纯化。使用40%甲醇进行的洗脱产生了在抑制薄膜形成中具高度活性的洗脱份(图1E)。然而，这种物质对细胞生长几乎无影响或无影响。所述生物薄膜抑制活性对于在100℃下的2小时加热和蛋白酶K处理具抗性(图1F)。
[0165] 针对在液体和固体培养基中抑制枯草杆菌的生物薄膜形成而筛选了D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸(图2A、5、6)。图2A示出了向孵育三天的处于生物薄膜诱导培养基中的新鲜接种的培养物内加入D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)、L-酪氨酸(7mM)或L-亮氨酸(8.5mM)对薄膜形成的影响。同对应的L-氨基酸相比较，D-酪氨酸和D-亮氨酸均表现出对生物薄膜生长的显著抑制。类似地，图5示出了包含补充以D-色氨酸(0.5mM)、D-蛋氨酸(2mM)、L-色氨酸(5mM)或L-蛋氨酸(5mM)的MSgg培养基的孔，使用菌株NCIB3610对其进行接种并孵育3天。仅仅所述D-氨基酸在抑制生物薄膜形成中具有活性。
[0166] 图6示出了包含补充以D-酪氨酸(3μM)或D-亮氨酸(8.5mM)的固体MSgg培养基的平板，使用菌株NCIB3610对其进行接种并孵育4天。D-酪氨酸和D-亮氨酸均抑制生物薄膜形成。
[0167] 同对应的L-氨基酸相比较，D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-亮氨酸均表现出对生物薄膜生长的显著抑制。与之对比，其它氨基酸的对应L-异构体和D-异构体，诸如D-丙氨酸和D-苯丙氨酸，在枯草杆菌的生物薄膜抑制分析中不具效力。
[0168] 下一步，测定了预防生物薄膜形成所需要的最低浓度(MIC指的是最低抑制浓度)。根据图2B中所示，个别D-氨基酸在其活性上有所变化，D-酪氨酸最具效力。D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸具有约1mM的MIC，而D-酪氨酸具有约100nM的MIC。引人注意的是，全部4种D-氨基酸的等摩尔量混合物特别地强效，其具有<10nM的MBIC。因此，D-氨基酸协同地发挥作用。所述D-氨基酸不仅预防生物薄膜的形成，而且破坏了已经存在的生物薄膜。图2C示出了3天程度的培养物，所述培养物中已被加入无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(3μM)或D-酪氨酸、D-色氨酸、D-蛋氨酸和D-亮氨酸的混合物(各2.5nM)，随后进行8小时的进一步孵育。D-酪氨酸或所述4种D-氨基酸的混合物的加入在8小时期间内导致了薄膜的明显分裂。
[0169] D-氨基酸通过氨基酸消旋酶而产生，其为将这些氨基酸的α-碳立体中心从L-转化为D-型的酶(Yoshimura等,J.Biosci.Bioeng.96:103(2003))。与所述生物薄膜抑制因子是D-氨基酸的设想相一致的基因证据是通过ylmE和racX突变体而获得的，所述基因的预期产物与已知的消旋酶表现出序列相似性。单独的ylmE或racX的菌株突变体在薄膜解体上表现出中度延迟(数据未示出)。图7示出了NCIB3610(WT)和ylmE和racX双缺失突变体菌株(IKG155)，其生长于12孔平板内并孵育5天。所述假定消旋酶的双突变体细胞所形成的薄膜在解体上显著地延迟，这暗示了消旋酶活性被特别降低的菌株也表现出降低的抗生物薄膜性抑制。此外，与来自野生型的条件化培养基相对比，来自所述双突变体的条件化培养基在抑制生物薄膜形成中无效。图2D示出了来自所述野生型或ylmE和racX双突变体菌株(IKG55)的8小时程度培养物的条件化培养基的Sep Pak C-18柱浓缩洗脱液的效果，其中所述双突变体表现出显著的生物薄膜建立。
[0170] 下一步，测定了D-氨基酸是否在生物薄膜成熟期间产生以及其是否以足以导致成熟生物薄膜解体的丰度产生。因此，进行了LC/MS，随后使用在薄膜形成后的早期和晚期所采集的条件化培养基进行的Nα-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(L-FDAA)衍生化而对所述D-氨基酸进行了鉴定。所述结果显示，在第6天D-酪氨酸(6μM)、D-亮氨酸(23μM)和D-蛋氨酸(5μM)在抑制生物薄膜形成所需的浓度或更高的浓度下存在，但是在第3天以<10nM的浓度存在，例如，以不足以抑制生物薄膜形成的水平存在。
[0171] 与所述条件化培养基类似，D-氨基酸并不抑制细胞生长，它们也不抑制所述基质操纵子eps和yqxM的表达(图8-9)。图8示出了D-氨基酸对细胞生长的效果。在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中振荡生长细胞。在D-氨基酸处理的培养物中的细胞生长实质上与所述未处理样品相同。图9A示出了菌株FC122(携带PyqxM-lacZ)对PyqxM-lacZ的表达，并且9B图示出了菌株FC5(携带PepsA-lacZ)对PepsA-lacZ的表达，所述菌株在包含D-酪氨酸(3μM)、D-亮氨酸(8.5mM)或所述4种D-氨基酸混合物(各2.5nM)的MSgg培养基中振荡生长。此外，所述经D-氨基酸处理的样品的yqxM和eps表达实质上与所述未处理样品相同。
[0172] 此前有报道，D-氨基酸被并入所述细胞壁的肽聚糖组分的肽联桥(peptide cross14
bridge)中。为对此进行证实，将细胞生长于诱导生物薄膜的培养基中并将其与 C-D-酪
14
氨酸或 C-L-脯氨酸(10μCi/ml)在37℃下孵育2h。图3A示出了放射性D-酪氨酸向所
14 14
述细胞壁中的并入。通过使用 C-D-酪氨酸显示D-酪氨酸(而非 C-L-脯氨酸)并入了所述细胞壁。结果以向细胞中的总并入(对于L-脯氨酸为360,000cpm/ml并且对于D-酪氨酸为46,000cpm/ml)的百分比的形式给出。
bridge)中。为对此进行证实，将细胞生长于诱导生物薄膜的培养基中并将其与 C-D-酪
14
氨酸或 C-L-脯氨酸(10μCi/ml)在37℃下孵育2h。图3A示出了放射性D-酪氨酸向所
14 14
述细胞壁中的并入。通过使用 C-D-酪氨酸显示D-酪氨酸(而非 C-L-脯氨酸)并入了所述细胞壁。结果以向细胞中的总并入(对于L-脯氨酸为360,000cpm/ml并且对于D-酪氨酸为46,000cpm/ml)的百分比的形式给出。
[0173] 为研究并入所述细胞壁的D-氨基酸是否将TasA纤维从与所述细胞的锚定中解离，检测了TasA与所述荧光报告蛋白mCherry的功能性融合蛋白的定位。图3B示出了来自包含功能性TasA-mCherry翻译融合蛋白的细胞的总荧光。通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将所述细胞生长至生长停滞期。根据图3B所示，使用D-酪氨酸的处理对于TasA-mCherry总积累几乎无影响或无影响。相反，当通过离心洗涤所述细胞，将其重悬浮并随后通过荧光显微法检视时，发现未处理的细胞(通常成簇存在)受到TasA-mCherry的强烈染色。与之对比，经D-酪氨酸处理的细胞(大多不成簇)仅显示出低水平的荧光。使用D-亮氨酸以及使用4种D-氨基酸等摩尔量混合物获得了类似的结果。还可使用金标记的抗TasA抗体通过透射电子显微法分析未修饰TasA蛋白的定位。图3D通过电子显微法示出了TasA纤维的细胞结合。不使用(图像
1和2)或使用(图像3-6)D-酪氨酸(0.1mM)对24小时程度的培养物进行另外12小时的孵育。通过使用抗TasA抗体进行的免疫金标记对TasA纤维染色，并且根据实施例中所述通过透射电子显微法将其显现。所述细胞是eps操纵子的突变体(Δeps)，因为胞外多糖的缺乏显著地改善了TasA纤维的成像。实箭头标出了纤维簇；空箭头标出了单个纤维。所述尺度条为500nM。在图像2、4和6的放大部分中的尺度条为100nm。图像1和2示出了结合于细胞的纤维簇，图像3、4和6示出了与细胞解离的单个纤维和簇，并且图像3-5示出了几乎无或无纤维物质的细胞。TasA纤维被发现锚定于未处理薄膜的细胞(图3D，图像1和
2)。与之对比，使用D-酪氨酸处理12小时的细胞由大部分未受到TasA纤维染色的细胞与未锚定于细胞的游离TasA纤维或纤维聚集物的混合物组成(图3D，图像3－6)。不期望受理论的束缚，D-酪氨酸处理生物薄膜的机制之一可能是诱导了细胞的纤维脱离。
1和2)或使用(图像3-6)D-酪氨酸(0.1mM)对24小时程度的培养物进行另外12小时的孵育。通过使用抗TasA抗体进行的免疫金标记对TasA纤维染色，并且根据实施例中所述通过透射电子显微法将其显现。所述细胞是eps操纵子的突变体(Δeps)，因为胞外多糖的缺乏显著地改善了TasA纤维的成像。实箭头标出了纤维簇；空箭头标出了单个纤维。所述尺度条为500nM。在图像2、4和6的放大部分中的尺度条为100nm。图像1和2示出了结合于细胞的纤维簇，图像3、4和6示出了与细胞解离的单个纤维和簇，并且图像3-5示出了几乎无或无纤维物质的细胞。TasA纤维被发现锚定于未处理薄膜的细胞(图3D，图像1和
2)。与之对比，使用D-酪氨酸处理12小时的细胞由大部分未受到TasA纤维染色的细胞与未锚定于细胞的游离TasA纤维或纤维聚集物的混合物组成(图3D，图像3－6)。不期望受理论的束缚，D-酪氨酸处理生物薄膜的机制之一可能是诱导了细胞的纤维脱离。
[0174] 通过D-酪氨酸抗性突变体的分离获得了D-氨基酸通过破坏TasA纤维对所述细胞的锚定而发挥作用的基因证据。图4A示出了在包含或不包含D-酪氨酸的固体(顶部图像)或液体(底部图像)生物薄膜诱导培养基中生长3天的细胞。在包含D-酪氨酸(图4A)或D-亮氨酸(数据未示出)的固体培养基上的生长期间所形成的平菌落上自发地出现了起皱的突起。重要的是，在包含全部4种活性D-氨基酸的平板上未出现这些突起。当被纯化后，这些自发突变体在D-酪氨酸或D-亮氨酸存在的情况下产生了起皱的菌落和薄膜。分离出多种这样的突变体并且其中大多数突变体包含所述yqxM操纵子中或其附近的突变。对2种突变进行了详细地检测并且发现其为所述长度为759个碱基对的yaxM基因
3'末端附近的移框突变。yqxM2是在所述yqxM开放读码框的第728碱基对位置的一个G:C插入，并且yqxM6是在第568碱基对位置的一个A:T缺失(图4B)。图4B示出了YqxM的简写氨基酸序列。带下划线的是密码子所指定的残基，其中所述yqxM2和yqxM6移框突变在所述密码子处产生了所标明的序列变化。
3'末端附近的移框突变。yqxM2是在所述yqxM开放读码框的第728碱基对位置的一个G:C插入，并且yqxM6是在第568碱基对位置的一个A:T缺失(图4B)。图4B示出了YqxM的简写氨基酸序列。带下划线的是密码子所指定的残基，其中所述yqxM2和yqxM6移框突变在所述密码子处产生了所标明的序列变化。
[0175] 图3C通过荧光显微法示出了TasA-mCherry的细胞结合。根据说明通过在D-酪氨酸(6μM)存在或不存在(未处理)的情况下在生物薄膜诱导培养基中伴以振荡而将包含所述tasA-mCherry融合蛋白的野生型细胞和yqxM6(IKG51)突变体细胞生长至生长停滞期，在PBS中洗涤并且通过荧光显微法显现。荧光显微法显示yqxM2和yqxM6的存在使经D-酪氨酸处理的细胞回复了成簇化和TasA-mCherry对细胞的染色(图3C)。此前的研究已经显示YqxM为TasA与细胞的结合所需(Branda等,Mol.Microbiol.59:1229(2006))。不期望受理论的束缚，D-氨基酸的生物薄膜抑制效果可被YqxM的突变体所抵消的这一发现强化了D-氨基酸向所述细胞壁的并入的效果是破坏所述TasA纤维与所述细胞的锚定的观点。YqxM的C末端附近的结构域可能应对于D-酪氨酸或D-亮氨酸在细胞壁中的存在而引发TasA的释放。
[0176] 实施例2.在金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的生物薄膜形成中对D-氨基酸筛选[0177] 检测了D-氨基酸对其它细菌的生物薄膜形成的效果。所述病原性细菌金黄色葡萄球菌在塑料表面形成生物薄膜(Otto,Curr.Top.Microbiol.Immunol.322:207(2008))，其可通过洗去未结合细胞并且使用结晶紫对所述结合细胞进行染色而检测。图2E示出了已在37℃下在包含葡萄糖(0.5%)和NaCl(3%)的TSB培养基中生长于12孔聚苯乙烯平板内24小时的金黄色葡萄球菌(菌株SCO1)。另外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸(50μM)或D-氨基酸混合物(各15nM)。通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。图2E显示50μM浓度的D-酪氨酸和50nM浓度的混合D-氨基酸(D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸；各50nM)高度有效预防所述病原性细菌的生物薄膜形成。
[0178] 此外，图10显示10μM的D-酪氨酸有效预防绿脓杆菌的生物薄膜形成，而D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸和D-蛋氨酸的1μM等摩尔量混合物是有效的。图10示出了D-氨基酸对绿脓杆菌生物薄膜形成的抑制。在30℃下在12孔聚苯乙烯平板中将绿脓杆菌菌株P014在包含甘油(0.2%)和酪蛋白氨基酸(20μg/ml)的M63培养基中生长48小时。另外向所述孔内加入了无氨基酸(未处理)、D-酪氨酸或所述D-氨基酸等摩尔量混合物。
通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。使用500μl 1.0%的结晶紫对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。
通过洗去未结合细胞并随后使用结晶紫进行染色而显现了结合于所述聚苯乙烯的细胞。使用500μl 1.0%的结晶紫对孔染色，使用2ml双蒸水清洗两次并彻底干燥。
[0179] 实施例3.在对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌生物薄膜的抑制中具有活性的D-氨基酸混合物
[0180] 两种不同的混合物在对金黄色葡萄球菌生物薄膜的形成中非常具有活性。一种是D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-亮氨酸和D-色氨酸的等摩尔量混合物。在全部受测的细菌菌株枯草杆菌、金黄色葡萄球菌(图11)和绿脓杆菌(图12)中，D-trp、D-met、D-tyr和D-leu的D-aa混合物在与单独氨基酸相比在显著更低的浓度下具有活性。对于表1中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是9
2×10cfu。对于表2中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard PA14，所述培养
9
基是M63并且所述细胞接种量是1.5×10cfu。使用所述结晶紫方法显现生物薄膜。所述数据在下文表1和2中示出：
2×10cfu。对于表2中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard PA14，所述培养
9
基是M63并且所述细胞接种量是1.5×10cfu。使用所述结晶紫方法显现生物薄膜。所述数据在下文表1和2中示出：
[0181] 表1(图11的数据)
[0182]
[0183] 表2(图12的数据)
[0184]
[0185] D-酪氨酸、D-苯丙氨酸、D-脯氨酸的等摩尔混合物比上述混合物甚至更为有效。而且，所述混合物作为混合物与各个氨基酸单独相比更为有效(图13和14)。对于表3和
4中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细
9
胞接种量是2×10cfu。使用所述结晶紫方法显现生物薄膜。所述数据在表3和4中示出：
4中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细
9
胞接种量是2×10cfu。使用所述结晶紫方法显现生物薄膜。所述数据在表3和4中示出：
[0186] 表3(图13的数据)
[0187]
[0188] 表4(图14的数据)
[0189]
[0190] 实施例4.对于金黄色葡萄球菌中的生物薄膜形成的替代性定量方法
[0191] 使用Gilson微量移液器完全除去浮游细胞，随后在纸巾上拍打。随后以黑色背景小心地拍摄所述生物薄膜平板的图像(图15和16)。对于表5和6中所报道的实验，所述9
生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×10cfu。
使用以黑色为背景的视图作为方法显现生物薄膜。所述数据在表5和6中示出：
生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×10cfu。
使用以黑色为背景的视图作为方法显现生物薄膜。所述数据在表5和6中示出：
[0192] 表5(图15的数据)
[0193]
[0194] 表6(图16的数据)
[0195]
[0196]
[0197] 在表5和6中通过在PBS中的重悬浮而从上述平板中除去生物薄膜细胞，并且使用分光光度计测定它们的OD600(图17)。对于表7中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×109cfu。通过测量吸附细菌的OD600显现生物薄膜。所述数据在表7中示出：
[0198] 表7(图17的数据)
[0199]
[0200] 实施例5.D-氨基酸对于金黄色葡萄球菌在环氧表面的生物薄膜形成的效果[0201] 为对开发D-氨基酸从不同表面的受控释放的方法的可能性进行检验，将环氧表面在D-氨基酸混合物中孵育24小时。将其完全地干燥并在使用金黄色葡萄球菌接种的新鲜的TSB培养基中孵育。对于表8和9中所报道的实验，所述生物体/菌株是S.a.Harvard9
SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×10cfu。使用以黑色为背景的视图显现生物薄膜。根据图18和19所示，D-aa混合物(如上文所述)在所述经过浸泡的基底上强烈地减少了金黄色葡萄球菌生物薄膜形成。所述数据在表8和9中示出：
SCO1，所述培养基是TSB并且所述细胞接种量是2×10cfu。使用以黑色为背景的视图显现生物薄膜。根据图18和19所示，D-aa混合物(如上文所述)在所述经过浸泡的基底上强烈地减少了金黄色葡萄球菌生物薄膜形成。所述数据在表8和9中示出：
[0202] 表8(图18的数据)
[0203]
[0204] 表9(图19的数据)
[0205]
[0206] 此外，将Norland Optical Adhesive 61表面与D-酪氨酸、D-脯氨酸和D-苯丙氨酸孵育24小时。将其完全地干燥并在使用金黄色葡萄球菌接种的新鲜的TSB培养基中孵育。所述D-aa混合物(但并非所述L-混合物)强烈地减少了金黄色葡萄球菌的生物薄膜形成。
[0207] 对于本实施例，聚合物基底通过UVO-114(Epoxy Technology)和Norland Optical Adhesive 61(Norland Products)UV可固化聚合物在聚二甲硅氧烷(SYLGARD 184,Dow Corning)中成型。
[0208] 实施例6.在绿脓杆菌中观测D-氨基酸对生物薄膜形成的效果的其它方法[0209] 与枯草杆菌类似，绿脓杆菌在限定培养基中形成复合结构。这些复合结构需要所述细胞外基质的适当形成和组装。D-酪氨酸(500μM)或D-色氨酸(500μM)的添加在绿脓杆菌中抑制限定培养基上的生物薄膜形成(图20)，而L-酪氨酸(500μM)和L-色氨酸的添加并不抑制。使用枯草杆菌获得了类似的结果。对于这些实验，所述生物体/菌株为P.a.Harvard PA14，所述培养基是M63并且所述细胞接种量是1.5×109cfu。
[0210] 在包含或不包含D-氨基酸的6孔平板上并且使用Syto-9染色观察生物薄膜形成的替代性方法如下：使用PBS洗涤绿脓杆菌生物薄膜2次并且将其在PBS中的5%戊二醛内固定至少1小时。随后使用PBS洗涤所述经固定的生物薄膜1次并将其在PBS中的0.1%v/vTriton X-100(PBST)内浸泡15分钟。使用冰冷PBST中的0.1nMSYTOX green(Invitrogen)替换所述溶液并在黑暗中轻柔地摇动至少15分钟。通过使用氙灯和K3 Leica滤镜的Leica DMRX复式显微镜捕获所述生物薄膜的荧光图像。根据图21所示，在D-酪氨酸存在下附着于所述生物薄膜平板底部的细胞数量存在强烈的下降。使用image J对附着的单细胞数量进行定量。与L-aa对照相比较，附着于使用D-aa浸泡的环氧表面的细胞数量的下降实质上更多。
[0211] 表10(图21的数据)
[0212]
[0213]
[0214] 实施例7.D-氨基酸对于革兰氏阴性病原体的效果的估测
[0215] 为估测广谱抗生物薄膜活性的可能性，针对所述革兰氏阴性病原体奇异变形菌而测试了D-酪氨酸、D-苯丙氨酸和D-脯氨酸的强效等摩尔四重混合物。根据图22所示，所述D-aa混合物针对奇异变形菌具有活性。使用所述结晶紫方法显现表11中的生物薄膜。所述数据在表11中示出：
[0216] 表11(图22的数据)
[0217]
[0218] 实施例8：D-氨基酸对于革兰氏阳性病原体的效果的估测
[0219] 为估测广谱抗生物薄膜活性的可能性，针对所述革兰氏阳性病原体变异链球菌而测试了D-酪氨酸、D-苯丙氨酸和D-脯氨酸的强效等摩尔四重混合物。根据图23所示，所述D-aa混合物针对变异链球菌具有活性。使用所述结晶紫方法显现表12中的生物薄膜。所述数据在表12中示出：
[0220] 表12(图23的数据)
[0221]
[0222] 实施例9：包含D-酪氨酸的涂层。
[0223] 将基于所述树脂固体重量的0.5重量%的D-酪氨酸并入双组分聚酯聚氨酯涂层，所述涂层基于可商购的聚酯多元醇和可商购的异氰尿酸酯。使用基于总树脂固体的0.015%二月桂酸二丁基锡催化所述涂布系统。
[0224] 通过刮涂于约4"×6"的透明玻片上直至约2mil(0.002")的薄膜厚度而涂覆所述涂布制剂。
[0225] 在120°F(49℃)烘箱中将这些薄膜固化。
[0226] 实施例10：包含D-氨基酸混合物的聚合物
[0227] 根据美国专利第5,973,030号中的描述制备液体硅酮橡胶片。所述制剂中进一步包含0.01至1重量百分比的D-氨基酸混合物，其为1∶1:1:1比率的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸。
[0228] 实施例11：包含D-氨基酸混合物的水基工业涂层
[0229] 以2mil的厚度将包含1重量百分比的D-氨基酸混合物的水基澄清丙烯酸工业涂布制剂涂布于玻片上，所述D-氨基酸混合物为1:1:1:1比率的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸。
[0230] 实施例12：包含D-氨基酸混合物的基于溶剂的工业涂层
[0231] 基于溶剂的聚氨酯涂层经制备而包含1重量百分比的D-氨基酸混合物，其为1:1:1:1的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸。将所述涂层以2mil的厚度涂覆于玻片上。
[0232] 实施例13：包含D-氨基酸混合物的UV可固化的水基工业涂层
[0233] 通过高速搅拌所述成分(见下表)而配制澄清的UV可固化水性工业涂层。
[0234]
[0235] 向所制备的制剂中加入比率为1∶1:1∶1的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸的D-氨基酸混合物，并在室温下以高切向速度(2000rpm)搅拌30分钟。出于比较目的，以相同的方式制备了不包含D-氨基酸的对照制剂。
[0236] 使用50μm狭缝涂布器(coater)将所述涂层涂覆于白色涂布的铝板上，在60℃下干燥10分钟并且使用两个中压汞汽灯(2×80W/cm)在5m/min下对其进行固化。
[0237] 实施例14：包含D-氨基酸混合物的基于溶剂的工业涂层
[0238] 根据以下程序制备了2种包装溶剂型聚氨酯涂层：
[0239] 将比率为1:1:1:1的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸的D-氨基酸混合物加入至所述粘合剂和溶剂中以作为漆浆(mill-base)制剂，并且将其在高切向速度下搅拌10分钟直至达到小于5μm的颗粒大小。
[0240] 漆浆制剂：
[0241]
[0242] 通过将组分A的成分混合并在最后于使用前加入组分B(参加下表)而制备所述涂布制剂。总制剂中的所述D-氨基酸的含量为0.1wt.%。
[0243]
[0244]
[0245] 将各涂布制剂喷洒于白色涂布的铝板之上(干薄膜厚度：40μm)并且在80℃下干燥30分钟。
[0246] 实施例15：油包水W/O典型制剂
[0247] 下列W/O乳液经制备而包含0.1%wt/wt的D-氨基酸混合物，其为1∶1:1:1比率的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸。
[0248] W/O乳液：
[0249]
[0250] 实施例16：水包油O/W典型制剂
[0251] 下列O/W乳液经制备而包含0.1%wt/wt的D-氨基酸混合物，其为1:1:1:1比率的D-酪氨酸:D-亮氨酸:D-蛋氨酸:D-色氨酸。
[0252] O/W乳液
[0253]
[0254]
[0255] 实施例17：金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的体内抑制
[0256] 根 据 Anguita-Alonso 等 ,Antimicrobial Agents and Chemotherapy，51:2594(2007)中的描述进行了对D-氨基酸或两种或更多种D-氨基酸的组合的体内测试。
[0257] 实施例18：金黄色葡萄球菌生物薄膜形成的替代性体内抑制
[0258] 根据Beenken等,J.Bacteriology，186:4665(2004)中的描述进行了对D-氨基酸或两种或更多种D-氨基酸的组合的体内测试。
[0259] 实施例19：D-Tyr、D-Leu、D-Typ和D-Met的稳定含水混合物的制备
[0260] 在室温下将氨基酸D-Met和D-Leu以5mg/mL的浓度各自溶解于去离子水中。一般对各氨基酸制备10mL溶液。在5mg/mL下将D-色氨酸溶解于去离子水中，但需要在40-50℃下进行5-10分钟的轻度加热。在5mg/mL下将D-酪氨酸溶解于0.05M HCl中并且需要在40-50℃下进行5-10分钟的加热。可以使用加热的超声波浴以协助所述氨基酸的溶解。合并全部溶液并将其在室温下消毒过滤，产生了约40mL储存液。
[0261] 实施例20：D-Tyr、D-Pro和D-Phe的稳定含水混合物的制备
[0262] 根据实施例19中所述制备了水溶液。
[0263] 实施例21：D-Tyr、D-Asp和D-Glu的稳定水混合物的制备
[0264] 根据实施例19中所述制备了水溶液。
[0265] 实施例22：D-Tyr、D-Arg、D-His和D-Lys的稳定水混合物的制备
[0266] 根据实施例19中所述制备了水溶液。
[0267] 实施例23：D-Tyr、D-Ile、D-Val和D-Asn的稳定水混合物的制备
[0268] 根据实施例19中所述制备了水溶液。
[0269] 实施例24：D-Tyr、D-Cys、D-Ser、D-Thr和D-Gln的稳定水混合物的制备[0270] 根据实施例19中所述制备了水溶液。
[0271] 等同物
[0272] 应当了解尽管本发明已经结合其详细描述部分进行了描述，前文的描述意在进行说明并且并非限制本发明的范围，所述范围由附属权利要求书的范围所界定。其它方面、优点和改进处于下文权利要求的范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 喷墨打印头及其制造方法 | 2020-05-13 | 447 |
| 使用电子束辐照固化旋涂玻璃膜的方法 | 2020-05-11 | 810 |
| 形成半导体器件的旋涂玻璃膜的方法 | 2020-05-11 | 43 |
| 一种ITO膜导电玻璃生产方法及一种真空旋涂设备 | 2020-05-12 | 164 |
| 半导体器件及其制造方法 | 2020-05-12 | 484 |
| 旋涂玻璃组合物和在半导体制造工序中使用该旋涂玻璃形成氧化硅层的方法 | 2020-05-11 | 173 |
| 一种疏水性低反射率玻璃表面的制备方法 | 2020-05-12 | 494 |
| 形成栓塞孔的方法 | 2020-05-13 | 645 |
| 一种基于定位分析的ITO玻璃旋涂黑胶系统装置 | 2020-05-11 | 424 |
| 红外截止滤光片 | 2020-05-12 | 334 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈