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蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用

阅读：922发布：2020-05-13

专利汇可以提供蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用，所述内参基因为UBC，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。UBC的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-14。所述筛选方法为：（1）选择12个内参基因为备选内参基因，设计引物；（2）将蛹虫草冷胁迫处理，提取菌丝体总RNA，测RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板，用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行分析；（3）实时荧光定量PCR数据进行Ct值分析，筛选出稳定内参基因。所述应用是以UBC为内参基因，用实时荧光定量PCR检测目的基因在冷胁迫下的相对表达量。所述内参基因稳定性好；所述方法简单、快捷、成本低。，下面是蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因，其特征在于：所述内参基因为UBC，所述UBC的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种如权利要求1所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的引物，其特征在于：所述UBC的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-14。
3.一种如权利要求1所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选择12个内参基因UBC、ACTIN、FBOX、TUB、EF-1α、PGK、GTPB、RPS、UBQ、CYP、GAPDH、PP2A作为备选内参基因，并设计其荧光定量PCR引物；
（2）将蛹虫草菌丝体进行冷胁迫处理，处理后收集蛹虫草菌丝体样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，以步骤（1）的引物利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行分析；
（3）采用GeNorm，NormFinder和BestKeeper 软件对实时荧光定量PCR数据进行内参基因Ct值稳定性分析，从而筛选出蛹虫草体内在冷胁迫下最稳定表达的内参基因。
4.根据权利要求3所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，所述12个内参基因的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-12；所述12个内参基因的正向、反向引物利用primer5.0软件设计；所述12个内参基因的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-36。
5.根据权利要求3或4所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的筛选方法，其特征在于：
步骤（2）中，所述蛹虫草菌丝体的培养条件为：将蛹虫草菌丝接种于含有大米培养基的玻璃瓶中，恒温遮光培养至菌丝长满大米培养基，即成；所述大米培养基的配方为：大米、蚕蛹粉与营养液以固液比30～50:1:40～60混匀；所述营养液的配方为：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖15～25 g、KH2PO4 1～3g、MgSO4 0.5～1.5g、柠檬酸铵0.5～1.5g、蛋白胨4～6g、维生素B1 15～25mg；所述恒温遮光培养的温度为20～28℃，时间为20～30天；所述冷胁迫处理的温度为10～20℃，时间为＞0～8h；所述实时荧光定量PCR的扩增体系由cDNA、PCR buffer Mix、正向引物、反向引物和双蒸水以体积比1:8～12:1:1:5～10组成；所述cDNA按10倍等比稀释成4～8个不同浓度的稀释液作为模板；所述实时荧光定量PCR的反应体系由cDNA稀释液、荧光试剂、正向引物、反向引物和双蒸水以体积比1:8～12:1:1:5～10组成；所述实时荧光定量PCR的反应条件为：90～95℃预变性25～35s，90～95℃变性5～15s，50～60℃退火25～35s，共30～50个循环，然后进行55～95℃熔解曲线分析，每0.5℃收集一次荧光信号。
6.根据权利要求3～5之一所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的筛选方法，其特征在于：步骤（3）中，所述GeNorm软件通过标准化因子配对差异分析得出两两比较的变异值V，最终选择适合的内参基因数量，当Vn/n+1值小于阈值0.15时，最合适的基因内参数目为n，选择前n个基因作为内参基因；所述NormFinder软件直接运算出各基因的表达稳定值M，根据M值的大小排序，M值越小，稳定性越高；所述BestKeeper软件通过原始Ct值和引物扩增效率决定出最适内参基因，并依次排序，稳定值小于1的内参基因，定性为稳定的内参基因。
7.一种如权利要求1所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的应用，其特征在于：以UBC为内参基因，使用实时荧光定量PCR检测与适应低温调节相关的目的基因在蛹虫草菌丝体冷胁迫下的相对表达量。
8.根据权利要求7所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的应用，其特征在于：所述与适应低温调节相关的目的基因为组氨酸激酶基因；所述组氨酸激酶基因为HK1-3；所述HK1-3的核苷酸序列为SEQ ID NO:37-39；所述HK1-3的正向、反向引物利用primer5.0软件设计；
所述HK1-3的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:40-45。

说明书全文

蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种内参基因、引物、筛选方法及应用，具体涉及一种蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用。

背景技术

[0002] 蛹虫草为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属的模式种，学名为Cordyceps militaris，是一种著名的中药，在中国作为保健食品已有很长时间。蛹虫草子实体具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗衰老和免疫调节作用。目前，采用昆虫（如家蚕蛹），大米等为培养基的主要原料，建立了蛹虫草子实体种植的商业化生产方法。然而，对蛹虫子实体形成的分子机制的研究却很少，而这是一个基本的生物学问题。

[0003] 温度是影响蘑菇菌丝体形成子实体的关键因素之一，从菌丝体发育形成子实体代表了在温差诱导条件下，细胞从简单到复杂的转变，多类蘑菇的子实体形成依赖于低温（冷胁迫）诱导。例如，金针菇的子实体发育需要将菌丝培养条件25℃改为低温15℃，平菇的子实体发育需要将菌丝培养温度20℃降低到15℃。然而，在冷诱导条件下，蘑菇菌丝体发育形成子实体的分子机制却鲜有研究，这将严重制约蘑菇子实体商品化生产的进一步发展。

[0004] 实时荧光定量PCR因其高灵敏度、特异性和可靠性，已经成为研究生物体在不同刺激下复杂信号网络的重要工具。然而，实时荧光定量PCR分析在很大程度上取决于内参基因的选择，并且由于在特定实验条件未能筛选合适的内参基因将导致错误的结果。因此，选择一个在处理因素作用的条件下表达相对稳定的基因作内参基因或内参标准，这是实时荧光定量PCR成功与否的关键所在。

[0005] 现有技术中，还没有蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的相关研究公开。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种稳定性好的蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因。

[0007] 本发明进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种扩增效率高的蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的引物。

[0008] 本发明更进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种简单、快捷、成本低的蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的筛选方法。

[0009] 本发明再进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种目标基因表达量稳定、准确的蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的应用。

[0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因，所述内参基因为UBC，所述UBC的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。UBC的全称为：泛素结合酶，Ubiquitin-conjugating enzyme。所述冷胁迫处理的温度为10～20℃，时间为＞0～8h。

[0011] 本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的引物，所述UBC的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-14。

[0012] 本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的筛选方法，包括以下步骤：（1）选择12个内参基因UBC、ACTIN、FBOX、TUB、EF-1α、PGK、GTPB、RPS、UBQ、CYP、GAPDH、PP2A作为备选内参基因，并设计其荧光定量PCR引物；
（2）将蛹虫草菌丝体进行冷胁迫处理，处理后收集蛹虫草菌丝体样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，以步骤（1）的引物利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行分析；
（3）采用GeNorm，NormFinder和BestKeeper 软件对实时荧光定量PCR数据进行内参基因Ct值稳定性分析，从而筛选出蛹虫草体内在冷胁迫下最稳定表达的内参基因。

[0013] 优选地，步骤（1）中，所述12个内参基因的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-12。所述12个内参基因的全称为：泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme，UBC），肌动骨架蛋白（Actin cytoskeleton protein，ACTIN），F-box蛋白（F-box protein，FBOX），微管蛋白（Tubulin，TUB），延伸因子-1α（Elongation factor-1α，EF-1α），磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase，PGK），GTP结合蛋白（GTP-binding protein，GTPB），核糖体蛋白S25（Ribosomal protein S25，RPS），聚泛素蛋白（Polyubiquitin，UBQ），亲环素蛋白（Cyclophilin，CYP），3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（Serine/threonine protein phosphatase 2A，PP2A）。这些基因包括传统的稳定内参基因，例如TUB，UBQ，GAPDH，EF-1α；
RNA测序及定量PCR实验分析出的稳定内参基因，例如UBC，CYP等；以及一些新的潜在内参基因，例如PGK，PP2A等。

[0014] 优选地，步骤（1）中，所述12个内参基因的正向、反向引物利用primer5.0软件设计。

[0015] 优选地，步骤（1）中，所述12个内参基因的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-36。

[0016] 优选地，步骤（2）中，所述蛹虫草菌丝体的培养条件为：将蛹虫草菌丝接种于含有大米培养基的玻璃瓶中，恒温遮光培养至菌丝长满大米培养基，即成。

[0017] 优选地，所述大米培养基的配方为：大米、蚕蛹粉与营养液以固液比（g/g/mL）30～50:1:40～60混匀。

[0018] 优选地，所述营养液的配方为：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖15～25 g、KH2PO4 1～3g、MgSO4 0.5～1.5g、柠檬酸铵0.5～1.5g、蛋白胨4～6g、维生素B1 15～25mg。

[0019] 优选地，所述恒温遮光培养的温度为20～28℃，时间为20～30天。

[0020] 优选地，步骤（2）中，所述冷胁迫处理的温度为10～20℃，时间为＞0～8h（优选为0.5～3.0h）。本发明即是通过研究蛹虫草对于冷胁迫下短时间内细胞响应关键基因的表达量来选择内参基因。

[0021] 优选地，步骤（2）中，所述实时荧光定量PCR的扩增体系由cDNA、PCR buffer Mix、正向引物、反向引物和双蒸水以体积比1:8～12:1:1:5～10组成。

[0022] 优选地，步骤（2）中，所述cDNA按10倍等比稀释成4～8个不同浓度的稀释液作为模板。

[0023] 优选地，步骤（2）中，所述实时荧光定量PCR的反应体系由cDNA稀释液、荧光试剂、正向引物、反向引物和双蒸水以体积比1:8～12:1:1:5～10组成。

[0024] 优选地，步骤（2）中，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：90～95℃预变性25～35s，90～95℃变性5～15s，50～60℃退火25～35s，共30～50个循环，然后进行55～95℃熔解曲线分析，每0.5℃收集一次荧光信号。各样品设置≥3个技术重复。

[0025] 优选地，步骤（2）中，相同条件下的冷胁迫处理设置≥3个生物学重复。

[0026] 优选地，步骤（2）中，所述RNA的提取方法为：取0.1～0.3g蛹虫草菌丝样品加入液氮研磨成细粉，加入400～600μL Trizol试剂，手动匀浆3～8min，此后步骤参照Trizol试剂说明书完成。

[0027] 所述RNA的质量和浓度检测方法为：取1μL RNA样品，利用NanoDrop2000检测OD260/280和浓度，OD260/280值介于1.8～2.2为合格样品。

[0028] 第一链cDNA的合成：利用3μg RNA进行反转录，步骤参照Thermo Fisher反转录试剂盒说明书进行。

[0029] 优选地，步骤（3）中，所述GeNorm软件通过标准化因子配对差异分析得出两两比较的变异值V，最终选择适合的内参基因数量，当Vn/n+1值小于阈值0.15时，最合适的基因内参数目为n，选择前n个基因作为内参基因。GeNorm程序可用于筛选任何条件下任意数量的内参基因，选择出两个以上内参基因，而不是传统地使用单一内参基因，这将有利于系统偏差的校正，得到更可靠的基因准确定量结果，对于细微表达差异的生物学研究具有极其重要的意义。

[0030] 优选地，步骤（3）中，所述NormFinder软件直接运算出各基因的表达稳定值M，根据M值的大小排序，M值越小，稳定性越高。

[0031] 优选地，步骤（3）中，所述BestKeeper软件通过原始Ct值和引物扩增效率决定出最适内参基因，并依次排序，稳定值小于1的内参基因，定性为稳定的内参基因。BestKeeper可以比较100个样品中多个内参基因和多个目的基因的表达水平。操作时把原始Ct值数据输入BestKeeper软件的Excel表格中，运行后内参基因和目的基因进行单独分析。该程序在每个基因之间产生配对的相关系数和BestKeeper指数，即每个候选基因Ct值的几何平均数，根据其值的大小进行比较。

[0032] 本发明再进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的应用，以UBC为内参基因，使用实时荧光定量PCR检测与适应低温调节相关的目的基因在蛹虫草菌丝体冷胁迫下的相对表达量。该应用可分析与适应低温调节相关的目的基因在冷胁迫下蛹虫草体内的表达规律。

[0033] 优选地，所述与适应低温调节相关的目的基因为组氨酸激酶基因。

[0034] 优选地，所述组氨酸激酶基因为HK1-3。根据模式物种例如酵母和拟南芥的研究，组氨酸激酶在响应温度改变，例如冷、热中发挥信号转导作用，但是在蛹虫草中，HK的功能研究还很少。

[0035] 优选地，所述HK1-3的核苷酸序列为SEQ ID NO:37-39。

[0036] 优选地，所述HK1-3的正向、反向引物利用primer5.0软件设计。

[0037] 优选地，所述HK1-3的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:40-45。

[0038] 本发明的有益效果如下：（1）本发明内参基因在蛹虫草菌丝体冷胁迫下均满足三个分析软件的稳定阈值，稳定性好，为冷胁迫下蛹虫草体内基因表达谱分析提供稳定的内参基因参考，为研究蛹虫草冷诱导子实体形成的调控机制提供借鉴；
（2）本发明内参基因的引物扩增效率高；
（3）本发明筛选方法简单、快捷、成本低，为其它物种在特定实验条件下实时荧光定量PCR内参基因的筛选提供了借鉴；
（4）本发明应用分析了3个HK基因在冷胁迫下的相对表达水平，并建立了在冷胁迫下，利用实时荧光定量PCR检测蛹虫草体内各基因的方法。
附图说明

[0039] 图1是本发明实施例冷胁迫后蛹虫草中各备选内参基因的Ct值（0h，0.5h，1h，2h，4h，8h下）；
图2是本发明实施例冷胁迫后蛹虫草中GeNorm软件分析的各备选内参基因表达的稳定性（0h，0.5h，1h，2h，4h，8h下）；
图3是本发明实施例冷胁迫后蛹虫草内参基因表达最合适的内参基因数目；
图4是本发明实施例以UBC为内参基因，冷胁迫后蛹虫草体内HK1基因的相对定量表达水平；
图5是本发明实施例以UBC为内参基因，冷胁迫后蛹虫草体内HK2基因的相对定量表达水平；
图6是本发明实施例以UBC为内参基因，冷胁迫后蛹虫草体内HK3基因的相对定量表达水平。

具体实施方式

[0040] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

[0041] 本发明参考例所使用的蛹虫草菌丝购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为 CGMCC 3.14242，蚕蛹粉购于山东省美越饲料科技有限公司；所述12个内参基因和HK1-3的正向、反向引物设计后，由生工生物工程（上海）股份有限公司公司合成；本发明实施例所使用的Trizol试剂，批号：15596026，购于Invitrogen；Thermo Fisher反转录试剂盒，批号：K1622，购于Themo Fisher；PCR buffer Mix购于近岸蛋白质novoprotein科技有限公司；SYBR Green荧光试剂购于Bio-Rad公司；CFX96仪购于Bio-Rad公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

[0042] 本发明实施例所涉及的内参基因稳定性分析软件的使用按其使用说明进行。

[0043] 参考例1蛹虫草菌丝体的培养条件为：将蛹虫草菌丝在超净工作台接种于含有大米培养基的玻璃瓶中，在25℃下，恒温遮光培养25天至菌丝长满大米培养基，即成；所述大米培养基的配方为：20g大米、0.5g蚕蛹粉与25mL营养液混匀；所述营养液的配方为：每1000mL蒸馏水中含有葡萄糖20g、KH2PO4 2g、MgSO4 1g、柠檬酸铵1g、蛋白胨5g、维生素B1 20mg。
实施例

[0044] （1）选择12个内参基因UBC、ACTIN、FBOX、TUB、EF-1α、PGK、GTPB、RPS、UBQ、CYP、GAPDH、PP2A作为备选内参基因，并设计其荧光定量PCR引物；所述12个内参基因的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:1-12，利用primer5.0软件设计所述12个内参基因的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-36；
（2）将参考例1培养的蛹虫草菌丝体置于黑暗培养箱中，在20℃下，进行冷胁迫处理，处理后，分别收集处理时间为0h，0.5h，1h，2h，4h，8h（0h为对照样本）的蛹虫草菌丝体样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，以步骤（1）的引物利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行分析；
所述RNA的提取方法为：取0.2g蛹虫草菌丝体样品加入液氮研磨成细粉，加入500μL Trizol试剂，手动匀浆5min，此后步骤参照Trizol试剂说明书完成；
所述RNA的质量和浓度检测方法为：取1μL RNA样品，利用NanoDrop2000检测OD260/280值为2.0，为合格样品，利用NanoDrop2000检测浓度为900 ng/μL；
第一链cDNA的合成：利用3μg RNA进行反转录，步骤参照Thermo Fisher反转录试剂盒说明书进行；
所述实时荧光定量PCR的扩增体系由1μL cDNA、10μL 2X PCR buffer Mix、1μL正向引物、1μL反向引物和7μL双蒸水组成，扩增片段长度结果如表1所示；
所述实时荧光定量PCR的反应体系由1μL cDNA（分别稀释成5个不同浓度的稀释液：含有总RNA 3μg、0.3μg、0.03μg、0.003μg、0.0003μg）、10μL 2X iTaq SYBR Green荧光试剂、1μL正向引物、1μL反向引物和7μL双蒸水组成；
所述实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，共
40个循环，然后进行55～95℃熔解曲线分析，CFX96仪每0.5℃收集一次荧光信号；各样品设置3个技术重复；
相同条件下的冷胁迫处理设置3个生物学重复；
（3）采用GeNorm，NormFinder和BestKeeper软件对实时荧光定量PCR数据进行内参基因Ct值稳定性分析，结果如表2所示，从而筛选出蛹虫草体内在冷胁迫下最稳定表达的内参基因；
所述GeNorm软件通过标准化因子配对差异分析得出两两比较的变异值V，最终选择适合的内参基因数量，当Vn/n+1值小于阈值0.15时，最合适的基因内参数目为n，选择前n个基因作为内参基因；所述NormFinder软件直接运算出各基因的表达稳定值M，根据M值的大小排序，M值越小，稳定性越高；所述BestKeeper软件通过原始Ct值和引物扩增效率决定出最适内参基因，并依次排序，稳定值小于1的内参基因，定性为稳定的内参基因。

[0045] 步骤（2）中，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度是否与选取的目的片段一致，然后回收PCR产物并测序进行验证。

[0046] 步骤（2）中，不同cDNA浓度下，引物扩增效率由CFX96仪给出，以扩增效率（%）是否在90～110%之间判断引物是否合适，结果如表1所示。

[0047] 表1 实时荧光定量PCR扩增的蛹虫草体内备选内参基因的引物序列、扩增长度及扩增效率表由表1可知，利用以上设计的引物可以有效扩增出目的片段，与设计的目的片段大小一致，条带单一，无特异性扩增；而扩增效率为95.5～106.2%（在90～110%之间），可知该引物扩增效率高。

[0048] 如图1所示，由CFX96仪所得12种不同的备选内参基因的Ct值变异较大，Ct最小的为16.6，最大的为28.4。而Ct值变异大小是能否作为内参基因的首要筛选条件，合适的内参基因的Ct值需适中，大约在15～25之间，表达过高（Ct值很小）或过低（Ct值很大）的基因均不适合做内参基因。此外，不同基因的Ct变化如此之大说明这些基因在冷胁迫下的表达量并不是恒定不变的，相反处于变化的状态中。

[0049] 表2 冷胁迫后蛹虫草中各备选内参基因表达的稳定性表（0h，0.5h，1h，2h，4h，8h下）由表2、图2可知，GeNorm软件分析显示备选内参基因的稳定性由低到高如下：PGK＜ACTIN＜GAPDH＜TUB＜EF-1α＜FBOX＜RPS＜UBQ＜CYP＜GTPB＜PP2A=UBC，其中PP2A和UBC最稳定；由表2可知，NormFinder软件分析显示备选内参基因的稳定性由低到高如下：PGK＜TUB＜GAPDH＜ACTIN＜EF-1α＜RPS＜FBOX＜CYP＜GTPB＜PP2A＜UBQ＜UBC，其中UBC最稳定；
综合GeNorm和NormFinder软件分析的稳定性结果，平均排名第一的内参基因为UBC，第二名为PP2A。再通过BestKeeper软件分析显示，排名前两名的内参基因UBC和 PP2A的稳定值均小于1，表明稳定性良好。综合上述分析结果，3种分析软件分析结果显示：冷胁迫下最稳定的内参基因为UBC。

[0050] 如图3所示，GeNorm软件关于最适内参基因数目的分析结果中显示V2/3＜0.15（当Vn/n+1值小于阈值0.15时，最合适的基因内参数目为n），说明在冷胁迫下蛹虫草进行荧光定量PCR检测时，最合适的内参基因数目是2个，即UBC和PP2A。

[0051] 综合以上3种软件分析方法筛选出冷胁迫下蛹虫草最适合的内参基因为UBC，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，所述UBC的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:13-14。

[0052] 蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因的应用：以UBC为内参基因，使用实时荧光定量PCR检测与HK1-3在参考例1培养的蛹虫草菌丝体冷胁迫下的相对表达量；所述HK1-3的核苷酸序列为SEQ ID NO:37-39；利用primer5.0软件设计所述HK1-3的正向、反向引物的核苷酸序列依次为SEQ ID NO:40-45；所述蛹虫草菌丝体冷胁迫下的相对表达量的测试方法同实施例步骤（2）；实时荧光定量PCR扩增的蛹虫草体内HK1-3的引物序列、扩增长度及扩增效率如表3所示。

[0053] 表3 实时荧光定量PCR扩增的蛹虫草体内HK1-3的引物序列、扩增长度及扩增效率表由表3可知，利用以上设计的引物可以有效扩增出目的片段，与设计的目的片段大小一致，条带单一，无特异性扩增；而扩增效率为95.9～102.6%，可知该引物扩增效率高。

[0054] 为了评价HK1-3的基因表达量，对荧光定量PCR采集的数据进行处理，△△Ct＝△Ct处理样本（0.5h，1h，2h，4h，8h）-△Ct对照样本（0h），△Ct＝△Ct目的基因-△Ct内参基因。各样本间差异显著性采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。

[0055] 如图4～6所示，实施例冷胁迫下对蛹虫草HK基因的相对表达量均显著上调；与对照样本相比，低温处理1h后，HK1和HK2基因相对表达量上调了5倍，HK3上调了13倍。

[0056] 综上，本发明筛选出了冷胁迫下蛹虫草体内最稳定的内参基因UBC，并以UBC为内参基因，蛹虫草组氨酸激酶基因HK1-3为目的基因，明确了在冷胁迫下蛹虫草HK1-3基因的表达规律。本发明筛选出的内参基因UBC适合冷胁迫下蛹虫草体内目的基因的表达谱分析，为以后冷胁迫下蛹虫草基因的定量PCR实验提供了参考。

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蛹虫草菌丝体冷胁迫下内参基因、引物、筛选方法及应用

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