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融合蛋白构建体

阅读:780发布:2022-10-07

专利汇可以提供融合蛋白构建体专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本公开提供了包含第一融合蛋白、第二融合蛋白和连接体的构建体,其中所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含亲和 试剂 和活性酶,并且所述连接体包含对不可逆抑制第一和第二融合蛋白活性酶具有特异的第一和第二官能团。本公开还提供了一种方法,包括(a)将包括亲和试剂和活性酶的第一融合蛋白与连接体 接触 ,所述连接体包括对不可逆地抑制所述第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,从而将所述第一融合蛋白与所述连接体偶联,以及(b)将包括亲和试剂和活性酶的第二融合蛋白与所述连接体接触,所述连接体包括对不可逆地抑制所述第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,从而将所述第二融合蛋白与所述连接体偶联。,下面是融合蛋白构建体专利的具体信息内容。

1.一种构建体,其包含:
第一融合蛋白、第二融合蛋白,和连接体,
其中,
所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含亲和试剂和活性酶;并且
所述连接体包含在第一末端对不可逆地抑制所述第一融合蛋白活性酶具有特异性的第一官能团,和在第二末端对不可逆地抑制所述第二融合蛋白活性酶具有特异性的第二官能团。
2.根据权利要求1所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶不同。
3.根据权利要求1所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶相同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂不同。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂相同。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的构建体,其中每个亲和试剂独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体蛋白质及其组合组成的群组。
7.根据权利要求6所述的构建体,其中所述亲和试剂为抗体或其片段。
8.根据权利要求7所述的构建体,其中所述抗体或其片段选自由轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)、重链恒定结构域(CH1)及其组合组成的群组。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的构建体,其中所述第一融合蛋白抗体或其片段是嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的构建体,其中所述抗体或其片段包含曲妥珠单抗或其片段。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的构建体,其中所述抗体或其片段选自由阿达木单抗、阿仑单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、英西单抗、卡罗单抗、英夫利昔单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、若莫单抗(nofetumomab)、奥珠单抗、达利珠单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗、依决洛单抗、吉姆单抗奥佐米星、戈利木单抗、赛妥珠单抗、依库珠单抗、优斯它单抗、帕尼单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、瑞西巴库单抗、托珠单抗、本妥昔单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、雷莫卢单抗、维多珠单抗、奥比妥珠单抗、培布利珠单抗、雷尼珠单抗、帕妥珠单抗、狄诺塞麦单抗、卡妥索单抗、戈利木单抗、司妥昔单抗、那他珠单抗、帕尼单抗和狄诺塞麦单抗组成的群组。
12.根据权利要求6所述的构建体,其中所述亲和试剂为小分子。
13.根据权利要求12所述的构建体,其中所述小分子为药物。
14.根据权利要求13所述的构建体,其中所述小分子选自由阿地白介素、阿仑膦酸、苜蓿(alfaferone)、阿利维A酸、别嘌呤醇、别嘌醇钠、阿洛西、六甲蜜胺、鲁米特、左旋天冬酰胺酶、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安泽梅特(anzmet)、安然爱斯普、阿格拉宾、三化二砷、阿诺新、5-氮杂胞苷、咪唑硫嘌呤、卡介苗或泰斯-卡介苗(tice-BCG)、苯丁抑制素、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、贝沙罗汀、硫酸博莱霉素、溴尿苷、替佐米、博莱霉素、白消安、降血素、坎帕斯(campath)、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡索地司、头孢烯酮(cefesone)、西莫白介素、柔红比星、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋冬酰胺酶、克拉屈滨、氯甲双磷酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、地塞米松、地塞米松磷酸盐、去雌激素(delestrogen)、地尼白介素-毒素连接体(denileukin diftitox)、德博美德罗(depomedrol)、地洛瑞林、右丙亚胺、道诺霉素、二乙基己烯雌酚,2′,2′-二氟脱氧胞苷、大扶康、多西他奇、脱氧氟尿苷、阿霉素、屈大麻酚、DW-166HC、加尔德(eligard)、埃立特克(elitek)、埃伦斯(ellence)、埃漫德(emend)、表阿霉素、促红细胞生成素α、红细胞生成素针剂(epogen)、依铂、盐酸左旋米唑和5-氟尿嘧啶制剂(ergamisol)、雌二醇制剂(estrace)、雌二醇、雌氮芥(estramustine)磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、羟基磷酸、凡毕复(etopophos)、依托泊苷、法倔唑、法斯通(farstone)、非格司亭、非那司提、弗拉格汀(fligrastim)、氟尿苷、氟康唑、氟达拉宾(fludarabin)、氟达拉宾磷酸盐、5-氟脱氧尿苷、
5-氟脱氧尿苷单磷酸酯、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟羟甲基睾丸素、氟他胺、六甲基三聚氰胺、福美坦、福司他滨(fosteabine)、福莫司汀、氟维司群、伽玛伽(gammagard)、吉西他滨、吉姆单抗、格列卫、卡氮芥糯米纸胶囊剂(gliadel)、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、托泊替康、氢化可通、赤羟腺嘌呤(erythro-hydroxynonyladenine)、羟基脲、己酸羟孕酮、替伊莫单抗、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白细胞介素-2、基因内区A、易瑞沙、依立替康、凯特瑞、香菇多糖硫酸盐、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、亮丙瑞林醋酸盐、左旋咪唑、左亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂(levoxyl)、环己亚硝脲、氯尼达明、屈大麻酚、二氯甲基二乙胺、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、左旋溶肉瘤素、梅尼斯特(menest)、6-巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、美特维克、米替福新、二甲胺四环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、莫多纳(modrenal)、阿霉素脂质体(myocet)、奈达铂、纽拉斯塔(neulasta)、纽米伽(neumega)、纽普根(neupogen)、尼鲁米特(nilutamide)、诺瓦得士(nolvadex)、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸奥坦西隆、奥拉普雷德(orapred)、奥沙利铂、紫杉醇(paclitaxel)、泼尼松磷酸钠制剂(pediapred)、培门冬酶、聚乙二醇干扰素、喷司他汀、N-膦酰基乙酰天门冬氨酸(PALA)、溶链菌、盐酸毛果芸香、吡柔比星、光神霉素、卟吩姆钠、松龙苯芥、脱氢皮质(甾)醇、强的松、普雷马林、甲基苄肼、普罗克瑞(procrit)、雷替曲塞、利比、铼-186依替膦酸盐、利妥昔单抗、罗扰素-A、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱(salagen)、善宁、沙莫司亭、甲基环己亚硝脲、西佐喃、索布佐生、甲基强的松龙溶胶、链佐星、氯化锶-89、左甲状腺素钠、它莫西芬、坦索洛新、他索纳明、睾内酯(tastolactone)、泰索帝(taxoter)、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮(testred)、硫嘌呤、噻替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬(toremifen)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托消安(teosulfan)、维生素A酸、甲氨蝶呤、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、双羟酸曲普瑞林、UFT、尿苷、戊柔比星、维司农、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、长春瑞滨、维鲁利秦、ADR-529右旋丙亚胺(zinecard)、净司他丁苯马聚合物、枢复宁、ABI-007、阿卡比芬(acolbifen)、干扰素γ-1b、阿菲尼塔克(affinitak)、氨喋呤、阿佐昔芬(arzoxifen)、阿索匹利尼(asoprisnil)、阿他美坦(atamestane)、阿曲生坦、阿瓦斯汀(avastin)、BAY 43-9006(索拉非尼)、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙氯地孕酮、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、dSLIM、度他雄胺、埃替卡林(edotecarin)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林凝胶移植物、钬-166 DOTMP、伊班膦酸、γ干扰素、内含子-聚乙二醇、伊沙匹隆(ixabepilone)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanine)、L-651582、兰瑞肽、拉索昔芬(lasofoxifen)、利泊(libra)、洛那法尼(lonafarnib)、米普昔芬(miproxifen)、米诺膦酸盐(minodronate)、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、诺司达(neovastat)、诺拉曲塞、奥利美生(oblimersen)、onko-TCS、奥西姆(osidem)、紫杉醇聚谷氨酸(paclitaxel polyglutamate)、帕米膦酸二钠、PN-401、QS-21、夸西泮、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶(ranpirnas)、13-顺式-网状红细胞酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、特罗凯(tarceva)、塔西普瑞辛(taxoprexin)、胸腺素-α-1、噻唑羧胺核苷、替吡法尼
(tipifarnib)、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬(toremifen)、反式MID-107R、伐司朴达、伐普肽、瓦他拉尼(vatalanib)、维替泊芬、长春氟宁(vinflunin)、Z-100、唑来膦酸以及上述的组合组成的群组。
15.根据权利要求6所述的构建体,其中所述亲和试剂为单体。
16.根据权利要求6所述的构建体,其中所述亲和试剂为蛋白质。
17.根据权利要求16所述的构建体,其中所述蛋白质包含至少一种非天然氨基酸。
18.根据权利要求16或17所述的构建体,其中所述蛋白质为噬菌体中的蛋白质。
19.根据权利要求16或17所述的构建体,其中所述蛋白质为治疗性蛋白质。
20.根据权利要求6所述的构建体,其中所述亲和试剂是合成的抗体结构域。
21.根据权利要求1至5中任一项所述的构建体,其中所述亲和试剂选自由设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、HEL4 Vh结构域(Predator)、葡萄球菌蛋白A(Affibody)的Z结构域、原型“7kDa DNA结合物”蛋白质家族(Affitin)、水化合物结合模(CBD结构域)、胱氨酸结小蛋白(knottin)、纤连蛋白III型结构域(单体,Adnectin)、γ-B-结晶蛋白(Affilin)、胱抑素(Affimers)、三螺旋线圈结构域(Alhabodies)、脂质运载蛋白结构域(Anticalins)、各种膜受体的结构域(Avimers)、Fyn(Fynomers)的SH3结构域、Kunitz结构域肽及其组合组成的群组。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的构建体,其中所述连接体为聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲)(“PHF”)、聚羟基烷基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(“MPC”)或选自以下的结构:
其中:
m为0至10;
n为1至100;
每个p独立地为0、1、2、3或4;
q为0、1或2;
r为1或2;
E为NH或CHR10;
G为O、CH2、CHOH、CHNH2、CHCOOH或CHSO3H;
R10为OH、NH2或COOH;和
每个R11独立地为H、OH、NH2或COOH。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的构建体,其中每种活性酶独立地选自由质酶、SnapTag、HaloTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶、细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域、碱性磷酸酶、蛋白-酪氨酸-磷酸酶、23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体、葡萄糖苷酶、N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶、N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶、卤代烷脱卤酶突变体、HNH核酸内切酶、切口核酸内切酶、明胶酶B、明胶酶A、基质分解素、脂肪酸酰胺水解酶、酯酶、细胞色素P450、甲硫氨酸氨肽酶及其组合组成的群组。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含角质酶,并且所述第一端的所述官能团包含对硝基苯膦酸酯。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含SnapTag,并且所述第一末端的所述官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。
26.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含HaloTag,并且所述第一末端的所述官能团包含α-氯烷
27.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶,并且所述第一末端的所述官能团包含克拉维酸或其衍生物
28.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含糖苷酶,并且所述第一末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
29.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶,并且所述第一末端的所述官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。
30.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且所述第一末端的所述官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。
31.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域,并且所述第一末端的所述官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂
32.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
33.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
34.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含
23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体,并且所述第一末端的所述官能团包含同源RNA序列。
35.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶,并且所述第一末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
36.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含N-
6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶,并且所述第一末端的所述官能团包含腺苷或其衍生物。
37.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶,并且所述第一末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
38.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶,并且所述第一端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
39.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由卤代烷烃、卤代芳烃化合物或其衍生物组成的群组的官能团。
40.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶,并且所述第一末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。
41.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含切口核酸内切酶,并且所述第一末端的所述官能团包括同源DNA切口位点。
42.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶B,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
43.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶A,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
44.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含基质分解素,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
45.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶,并且所述第一末端的所述官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。
46.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含酯酶,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
47.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
48.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体,其中所述第一融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨肽酶,并且所述第一末端的所述官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含角质酶,并且所述第二末端的所述官能团包含对硝基苯膦酸酯。
50.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含
6
SnapTag,并且所述第二末端的所述官能团包含O-苄基鸟嘌呤。
51.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含HaloTag,并且所述第二末端的所述官能团包含α-氯代烷烃。
52.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶,并且所述第二末端的所述官能团包含克拉维酸或其衍生物。
53.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含糖苷酶,并且所述第二末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
54.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶,并且所述第二末端的所述官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。
55.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且所述第二末端的所述官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。
56.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域,并且所述第二末端的所述官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。
57.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
58.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
59.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含
23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体,并且所述第二末端的所述官能团包含同源RNA序列。
60.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶,并且所述第二末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
61.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含N-
6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶,并且所述第二末端的所述官能团包含腺苷或其衍生物。
62.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶,并且所述第二末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
63.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶,并且所述第二末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
64.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由卤代烷、卤代芳族化合物或其衍生物组成的群组的官能团。
65.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶,并且所述第二末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。
66.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含切口核酸内切酶,并且所述第二末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。
67.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶B,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
68.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶A,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
69.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含基质分解素,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
70.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶,并且所述第二末端的所述官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。
71.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含酯酶,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
72.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
73.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体,其中所述第二融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨基肽酶,并且所述第二末端的所述官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。
74.一种方法,其包含:
(a)将包含亲和试剂和活性酶的第一融合蛋白与包含在第一末端对不可逆地抑制所述第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团的连接体接触,从而在所述第一末端将所述第一融合蛋白与所述连接体偶联,并且
(b)将包含亲和试剂和活性酶的第二融合蛋白与所述连接体的第二末端接触,所述连接体的所述第二末端包含对不可逆地抑制所述第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,从而在搜索第二末端将所述第二融合蛋白与所述连接体偶联。
75.根据权利要求74所述的方法,其中步骤(a)和(b)顺序执行。
76.根据权利要求74所述的方法,其中步骤(a)和(b)同时进行。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶不同。
78.根据权利要求74至76中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶相同。
79.根据权利要求74至78中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂不同。
80.根据权利要求74至78中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂相同。
81.根据权利要求74至80中任一项所述的方法,其中每个亲和试剂独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体、蛋白质及其组合组成的群组。
82.根据权利要求81所述的方法,其中所述亲和试剂为抗体或其片段。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述抗体或其片段选自由轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)、重链恒定结构域(CH1)及其组合组成的群组。
84.根据权利要求82或权利要求83所述的方法,其中所述第一融合蛋白抗体或其片段是嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的方法,其中所述抗体或其片段包含曲妥珠单抗或其片段。
86.根据权利要求82至85中任一项所述的方法,其中所述抗体或其片段选自由阿达木单抗、阿仑单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、英西单抗、卡罗单抗、英夫利昔单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、若莫单抗、奥马珠单抗、达利珠单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗、依决洛单抗、吉姆单抗奥佐米星、戈利木单抗、赛妥珠单抗、依库珠单抗、优斯它单抗、帕尼单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、瑞西巴库单抗、托珠单抗、本妥昔单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、雷莫卢单抗、维多珠单抗、奥比妥珠单抗、培布利珠单抗、雷尼珠单抗、帕妥珠单抗、狄诺塞麦单抗、卡妥索单抗、戈利木单抗、司妥昔单抗、那他珠单抗、帕尼单抗和狄诺塞麦单抗组成的群组。
87.根据权利要求81所述的方法,其中所述亲和试剂为小分子。
88.根据权利要求87所述的方法,其中所述小分子为药物。
89.根据权利要求88所述的方法,其中所述小分子选自由阿地白介素、阿仑膦酸、苜蓿酮、阿利维A酸、别嘌呤醇、别嘌醇钠、阿洛西、六甲蜜胺、氨鲁米特、左旋天冬酰胺酶、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安泽梅特、安然爱斯普、阿格拉宾、三氧化二砷、阿诺新、5-氮杂胞苷、咪唑硫嘌呤、卡介苗或泰斯-卡介苗、苯丁抑制素、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、贝沙罗汀、硫酸博莱霉素、溴尿苷、硼替佐米、博莱霉素、白消安、降血钙素、坎帕斯、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡索地司、头孢烯酮、西莫白介素、柔红比星、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋门冬酰胺酶、克拉屈滨、氯甲双磷酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、地塞米松、地塞米松磷酸盐、去雌激素、地尼白介素-毒素连接体、德博美德罗、地洛瑞林、右丙亚胺、道诺霉素、二乙基己烯雌酚,2′,2′-二氟脱氧胞苷、大扶康、多西他奇、脱氧氟尿苷、阿霉素、屈大麻酚、DW-166HC、艾加尔德、埃立特克、埃伦斯、埃漫德、表阿霉素、促红细胞生成素α、红细胞生成素针剂、依铂、盐酸左旋米唑和5-氟尿嘧啶制剂、雌二醇制剂、雌二醇、雌氮芥磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、羟基磷酸、凡毕复、依托泊苷、法倔唑、法斯通、非格司亭、非那司提、弗拉格汀、氟尿苷、氟康唑、氟达拉宾、氟达拉宾磷酸盐、5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸酯、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟羟甲基睾丸素、氟他胺、六甲基三聚氰胺、福美坦、福司他滨、福莫司汀、氟维司群、伽玛伽、吉西他滨、吉姆单抗、格列卫、卡氮芥糯米纸胶囊剂、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、托泊替康、氢化可通、赤羟腺嘌呤、羟基脲、己酸羟孕酮、替伊莫单抗、去甲氧基柔红霉素、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白细胞介素-2、基因内区A、易瑞沙、依立替康、凯特瑞、香菇多糖硫酸盐、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、亮丙瑞林醋酸盐、左旋咪唑、左亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂、环己亚硝脲、氯尼达明、屈大麻酚、二氯甲基二乙胺、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、左旋溶肉瘤素、梅尼斯特、
6-巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、美特维克、米替福新、二甲胺四环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、莫多纳、阿霉素脂质体、奈达铂、纽拉斯塔、纽米伽、纽普根、尼鲁米特、诺瓦得士、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸奥坦西隆、奥拉普雷德、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松磷酸钠制剂、培门冬酶、聚乙二醇干扰素、喷司他汀、N-膦酰基乙酰天门冬氨酸(PALA)、溶链菌、盐酸毛果芸香碱、吡柔比星、光神霉素、卟吩姆钠、松龙苯芥、脱氢皮质(甾)醇、强的松、普雷马林、甲基苄肼、普罗克瑞、雷替曲塞、利比、铼-186依替膦酸盐、利妥昔单抗、罗扰素-A、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱、善宁、沙莫司亭、甲基环己亚硝脲、西佐喃、索布佐生、甲基强的松龙溶胶、链佐星、氯化锶-89、左甲状腺素钠、它莫西芬、坦索洛新、他索纳明、香豆素内酯、泰索帝、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托消安、维生素A酸、甲氨蝶呤、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、UFT、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、长春瑞滨、维鲁利秦、ADR-529右旋丙亚胺、净司他丁苯马聚合物、枢复宁、ABI-007、阿卡比芬、干扰素γ-1b、阿菲尼塔克、氨喋呤、阿佐昔芬、阿索匹利尼、阿他美坦、阿曲生坦、阿瓦斯汀、BAY43-9006(索拉非尼)、CCI-779、CDC-
501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙氯地孕酮、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、dSLIM、度他雄胺、埃替卡林、依氟鸟氨酸、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶移植物、钬-166DOTMP、伊班膦酸、γ干扰素、内含子-聚乙二醇、伊沙匹隆、钥孔血蓝蛋白、L-
651582、兰瑞肽、拉索昔芬、利泊、洛那法尼、米普昔芬、米诺膦酸盐、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、诺司达、诺拉曲塞、奥利美生、onko-TCS、奥西姆、紫杉醇聚谷氨酸、帕米膦酸二钠、PN-401、QS-21、夸西泮、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶、13-顺式-网状红细胞酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、特罗凯、塔西普瑞辛、胸腺素-α-1、噻唑羧胺核苷、替吡法尼、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬、反式MID-107R、伐司朴达、伐普肽、瓦他拉尼、维替泊芬、长春氟宁、Z-100、唑来膦酸以及上述的组合组成的群组。
90.根据权利要求81所述的方法,其中所述亲和试剂为单体。
91.根据权利要求81所述的方法,其中所述亲和试剂为蛋白质。
92.根据权利要求91所述的方法,其中所述蛋白质包含至少一种非天然氨基酸。
93.根据权利要求91或92所述的方法,其中所述蛋白质为噬菌体中的蛋白质。
94.根据权利要求91或92所述的方法,其中所述蛋白质为治疗性蛋白质。
95.根据权利要求81所述的方法,其中所述亲和试剂是合成的抗体结构域。
96.根据权利要求74至80中任一项所述的方法,其中所述亲和试剂选自由设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、HEL4 VH结构域(Predator)、葡萄球菌蛋白A(Affibody)的Z结构域、原型“7kDa DNA结合物”蛋白质家族(Affitin)、碳水化合物结合模块(CBD结构域)、胱氨酸结小蛋白(knottin)、纤连蛋白III型结构域(单体,Adnectin)、γ-B-结晶蛋白(Affilin)、胱抑素(Affimers)、三螺旋线圈结构域(Alhabodies)、脂质运载蛋白结构域(Anticalins)、各种膜受体的结构域(Avimers)、Fyn(Fynomers)的SH3结构域、Kunitz结构域肽及其组合组成的群组。
97.根据权利要求74至96中任一项所述的方法,其中所述连接体为聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲醛)(“PHF”)、聚羟基烷基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(“MPC”)或选自以下的结构:
其中:
m为0至10;
n为1至100;
每个p独立地为0、1、2、3或4;
q为0、1或2;
r为1或2;
E为NH或CHR10;
G为O、CH2、CHOH、CHNH2、CHCOOH或CHSO3H;
R10为OH、NH2或COOH;和
每个R11独立地为H、OH、NH2或COOH。
98.根据权利要求74至97中任一项所述的方法,其中每种活性酶独立地选自由角质酶、SnapTag、HaloTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶、细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域、碱性磷酸酶、蛋白-酪氨酸-磷酸酶、23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体、葡萄糖苷酶、N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶、N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶、卤代烷脱卤酶突变体、HNH核酸内切酶、切口核酸内切酶、明胶酶B、明胶酶A、基质分解素、脂肪酸酰胺水解酶、酯酶、细胞色素P450、甲硫氨酸氨肽酶及其组合组成的群组。
99.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含角质酶,并且所述第一端的所述官能团包含对硝基苯膦酸酯。
100.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含SnapTag,并且所述第一末端的所述官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。
101.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含HaloTag,并且所述第一末端的所述官能团包含α-氯烷烃。
102.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶,并且所述第一末端的所述官能团包含克拉维酸或其衍生物。
103.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含糖苷酶,并且所述第一末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
104.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶,并且所述第一末端的所述官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。
105.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且所述第一末端的所述官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。
106.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域,并且所述第一末端的所述官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。
107.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
108.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
109.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含
23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体,并且所述第一末端的所述官能团包含同源RNA序列。
110.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶,并且所述第一末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
111.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含N-
6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶,并且所述第一末端的所述官能团包含腺苷或其衍生物。
112.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶,并且所述第一末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
113.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶,并且所述第一末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
114.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体,并且所述第一末端的所述官能团包括选自由卤代烷烃、卤代芳烃化合物或其衍生物组成的群组的官能团。
115.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶,并且所述第一末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。
116.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包括切口核酸内切酶,并且所述第一末端的所述官能团包括同源DNA切口位点。
117.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶B,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
118.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶A,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
119.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含基质分解素,并且所述第一末端的所述官能团包含选自环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合的官能团。
120.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶,并且所述第一末端的所述官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。
121.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含酯酶,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由膦酸酯,氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
122.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s,并且所述第一末端的所述官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
123.根据权利要求74至98中任一项所述的方法,其中所述第一融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨肽酶,并且所述第一末端的所述官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。
124.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含角质酶,并且所述第二末端的所述官能团包含对硝基苯膦酸酯。
125.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含SnapTag,并且所述第二末端的所述官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。
126.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含HaloTag,并且所述第二末端的所述官能团包含α-氯代烷烃。
127.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶,并且所述第二末端的所述官能团包含克拉维酸或其衍生物。
128.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含糖苷酶,并且所述第二末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
129.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶,并且所述第二末端的所述官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。
130.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且所述第二末端的所述官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。
131.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域,并且所述第二末端的所述官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。
132.据据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
133.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
134.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含
23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体,并且所述第二末端的所述官能团包含同源RNA序列。
135.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶,并且所述第二末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。
136.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶,并且所述第二末端的所述官能团包含腺苷或其衍生物。
137.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶,并且所述第二末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
138.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶,并且所述第二末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
139.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由卤代烷、卤代芳族化合物或其衍生物组成的群组的官能团。
140.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶,并且所述第二末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。
141.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含切口核酸内切酶,并且所述第二末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。
142.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶B,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
143.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶A,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
144.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含基质分解素,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
145.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶,并且所述第二末端的所述官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。
146.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含酯酶,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
147.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s,并且所述第二末端的所述官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
148.根据权利要求74至124中任一项所述的方法,其中所述第二融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨基肽酶,并且所述第二末端的所述官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。
149.根据权利要求74至148中的任一项所述方法制备的构建体。
150.一种方法,包含给需要的患者施用权利要求1至73或149中任一项所述的构建体。
151.根据权利要求1至73或149中任一项所述的构建体作为有需要的患者的药物的用途。
152.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有乳腺癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含曲妥珠单抗或其片段。
153.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有吸入性炭疽,并且所述构建体的至少一个抗体或其片段包含瑞西巴库单抗或其片段。
154.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有类湿性关节炎或全身性幼年特发性关节炎,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含托珠单抗或其片段。
155.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有霍奇金淋巴瘤或全身性间变性大细胞淋巴瘤,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含本妥昔单抗或其片段。
156.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有选自由慢性淋巴细胞白血病、滤泡性非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、类风湿性关节炎和复发缓解性多发性硬化组成的群组的疾病,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含奥法木单抗或其片段。
157.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有系统性红斑狼疮,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含贝利木单抗或其片段。
158.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有胃或胃-食管结合部腺癌或转移性非小细胞癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含雷莫芦单抗或其片段。
159.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有溃疡性结肠炎或克罗恩病,并且所述构建体的至少一个抗体或其片段包含维多珠单抗或其片段。
160.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有慢性淋巴细胞白血病或滤泡性淋巴瘤,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含奥比妥珠单抗或其片段。
161.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有黑素瘤或转移性非小细胞肺癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含培布利珠单抗或其片段。
162.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有黄斑变性,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含雷尼珠单抗或其片段。
163.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有乳腺癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含帕妥珠单抗或其片段。
164.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有选自由骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移和骨巨细胞瘤组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含狄诺塞麦单抗或其片段。
165.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有恶性腹水,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含卡妥索单抗或其片段。
166.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有选自由类风湿性关节炎、屑病关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含戈利木单抗或其片段。
167.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有选自由转移性肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和卡斯特曼病组成的群组的疾病,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含司妥昔单抗或其片段。
168.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有多发性硬化症或克罗恩病,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含那他珠单抗或其片段。
169.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有结肠直肠癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含帕尼单抗或其片段。
170.根据权利要求150所述的方法或权利要求151所述的用途,其中所述患者患有选自由骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移和骨巨细胞瘤组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含狄诺塞麦单抗或其片段。
171.根据权利要求1至73或149中任一项所述的构建体作为诊断的用途。

说明书全文

融合蛋白构建体

技术领域

[0001] 本公开一般涉及融合蛋白构建体及其制备和使用方法。更具体地,本公开涉及精确限定的融合蛋白构建体,其包含通过模合成制备的并且通过连接体偶联的至少第一融合蛋白和第二融合蛋白。

背景技术

[0002] 生物药物,特别是单克隆抗体(mAb)和包含抗体片段的药物在制药工业中很受关注,因为其具有特异性靶向循环中或细胞表面的疾病相关蛋白的能。下一代抗体疗法,即那些显示出增强的治疗潜力的抗体疗法,已经通过增加抗体效价、附着增加细胞毒性和半衰期的效应分子以及使用引导免疫系统清除目标的方式来产生。然而,这些分子通常难以高产率地且具有合成灵活性的生产,使得期望的功能被系统优化。
[0003] 例如,具有扩展功能的当前抗体格式必须针对稳定性或功能进行费力地优化,因为它们具有必须同时表达的多个域。目前的化学方法需要反应性基酸工程或使用预先存在的反应性氨基酸侧链将有效负载附接到抗体支架上。在许多情况下,这些反应的产物产生产品的异质群体。这种直接氨基酸修饰也可能不稳定或对母体分子的药理学性质造成有害影响(例如增加的疏性、聚集性、免疫原性等)。因此,必须花大量的精力来选择合适的位置来连接有效载荷
[0004] 此外,目前的抗体技术不能生产出几何形状(例如,环状分子、结构域之间距离可变的分子等)、取向、化学计量和化合价可以在传统多肽工程所能实现的范围之外得到系统控制的支架。生产技术的这种限制对当前格式可以研究的治疗空间造成了巨大的限制。目前的蛋白质工程方法局限于天然多肽折叠/肽连接体的固有库,以获得期望的构建体。因此,使用传统的工程方法无法制备可能具有更高功效的非天然格式。此外,由于毒性限制或表达宿主的代谢特征,一些效应分子不能在一个培养系统中一起有效地产生。另外,随着分子复杂性的增加,较大分子的正确折叠、组装和纯化变得更加困难,从而降低了产量并增加了成本。
[0005] 此外,抗体分子的工业生产通常需要在真核宿主中表达抗体或抗体样片段,与原核宿主相比,真核宿主的抗体或抗体样片段没有那么稳健,并且降低了产物产率,导致相对于可在原核宿主中表达的抗体或类似抗体片段而言更高的操作成本。
[0006] 因此,本领域需要一种成本有效的制备具有高分子量的下一代抗体治疗剂的方法,该方法能够简单地通过组合相对少量的构建块来创建抗体样药物的多样化库,该抗体样药物具有可变的化合价态、几何构型、效应功能和化学计量。发明内容
[0007] 本公开的一个方面提供了包含第一融合蛋白、第二融合蛋白和连接体的构建体,其中所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含亲和试剂和活性酶,所述连接体包括在第一末端对不可逆地抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的第一官能团,和在第二末端特异性地不可逆抑制第二融合蛋白活性酶的第二官能团。
[0008] 本公开的另一个方面提供了一种方法,包括(a)将包括亲和试剂和活性酶的第一融合蛋白与包括在第一末端对不可逆地抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团的连接体接触,从而在第一末端将所述第一融合蛋白与所述连接体偶联,以及(b)将包含亲和试剂和活性酶的第二融合蛋白与所述连接体的第二末端接触,所述连接体的第二末端包含在第二末端对不可逆地抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,从而在第二末端将所述第二融合蛋白与所述连接体偶联。
[0009] 本公开的另一个方面提供了通过本公开的方法制备的构建体。
[0010] 本公开的另一个方面提供了一种方法,包括向有需要的患者施用本公开的构建体。本公开的其它方面提供了本公开所述的构建体作为药物和/或诊断的用途。
[0011] 通过阅读以下详细描述,其他方面和优点对于本领域普通技术人员将是显而易见的。虽然构建体及其制造和使用方法可以有各种形式的实例,但是下文的描述包括具体的实施方案,应当理解,本公开是说明性的,并不旨在将本发明限制于本发明所述的具体实施方案。附图说明
[0012] 图1显示了曲妥珠单抗F(ab)(TFab)融合基因/蛋白质构建体。
[0013] 图2显示了纯化的TFab-质酶和TFab-SnapTag融合物的SDS-PAGE凝胶。
[0014] 图3显示了二价构建体的SDS-PAGE凝胶。
[0015] 图4显示了曲妥珠单抗和融合蛋白构建体B-13的细胞活力测定数据。
[0016] 图5是小鼠体内B-13构建体的血清浓度随时间变化的曲线图。
[0017] 图6显示了B-13给药对具有BT 474肿瘤异种移植物的小鼠的影响的结果。A)用载体治疗4周以上的动物肿瘤体积进展,B13每天2.5和5mg/kg,阿霉素(dox)每周2次,每次剂量为2.5mg/kg。在第28天,载体与阿霉素(p=.0002)和载体与两个B13治疗组(p=.0001)的肿瘤体积有显著差异。B)四个治疗组中动物的总体重测量。载体和阿霉素(p=.0116)之间的总体重有显著差异,但是载体和B13处理在2.5mg/kg(p=.2237)或5mg/kg(p=.4297)之间无显著差异。C)四个治疗组中动物的器官重量。各组间器官重量无显著差异(p=0.9493)。在图表板7.0中使用双向ANOVA计算P值。

具体实施方式

[0018] 本文提供了构建体以及制备和使用所述构建体的方法。所述构建体包含第一融合蛋白、第二融合蛋白和连接体,其中所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含亲和试剂和活性酶,并且所述连接体包括在第一末端对不可逆地抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的第一官能团,和在第二末端对不可逆地抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的第二官能团。在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶不同。在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶相同。在实施方案中,所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂不同。在实施方案中,所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂相同。任选地,在实施方案中,每个亲和试剂独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体、蛋白质及其组合组成的群组。
[0019] 亲和试剂与活性酶融合蛋白的构建体
[0020] 本发明的构建体包括亲和试剂和通过连接体连接的活性酶的融合蛋白。
[0021] 如本文所用,除非另有说明,“亲和试剂”是指对所需靶表现出亲和性的部分,例如,结合治疗系统中的靶表位和/或结合或识别生物传感器系统中的分析物的能力。亲和试剂的实例包括但不限于抗体或其片段、小分子、单体和蛋白质。
[0022] 如本文所用,除非另有说明,“活性酶”是指包含活性位点残基的酶,所述活性位点残基可以偶联至对不可逆地抑制活性位点残基具有特异性的官能团。
[0023] 如本文所用,除非另有说明,“蛋白质”是指天然存在的多肽、包含天然和/或非天然氨基酸的多肽、噬菌体中的蛋白质、治疗性蛋白质和合成或天然衍生的抗体结构域。
[0024] 本文所用的“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物。多肽在本领域是已知的,并且包括但不限于抗体、酶、结构多肽和激素。本公开的多肽可以是天然存在的或非天然存在的。
[0025] 天然存在的多肽包括但不限于存在于自然界中的生物活性多肽(包括抗体),或者可以通过例如化学合成或重组表达技术以自然界中发现的形式产生。天然存在的多肽还包括脂蛋白和翻译后修饰的蛋白质,例如但不限于糖基化蛋白质。
[0026] 预期用于本公开的方法和组合物中的抗体包括但不限于体内或体外识别和结合靶分子的抗体。
[0027] 本公开预期的结构多肽包括但不限于肌动蛋白、微管蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白。
[0028] 本公开预期的非天然存在的多肽包括但不限于合成多肽,以及本文定义的天然存在或非天然存在的多肽的片段、类似物和变体。非天然存在的多肽还包括具有D-氨基酸、修饰的、衍生的或非天然存在的D-或L-构型氨基酸和/或拟肽单元作为其结构一部分的蛋白质或蛋白质物质。术语“蛋白质”通常指大的多肽。术语“肽”通常指短多肽。
[0029] 非天然存在的多肽例如使用自动多肽合成仪制备,或者使用重组表达技术制备,所述重组表达技术使用编码所需多肽的修饰多核苷酸。
[0030] 如本文所用,多肽的“片段”是指小于全长多肽或蛋白质表达产物的多肽或蛋白质的任何部分。
[0031] 如本文所用,“类似物”是指两种或更多种多肽中的任何一种,它们的结构基本相似,并且具有相同的生物活性,但对整个分子或其片段具有不同程度的活性。基于涉及一个或多个氨基酸对其他氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加而产生的一个或多个突变,类似物的氨基酸序列的组成不同。基于被取代的氨基酸和取代它的氨基酸的物理化学或功能相关性,取代可以是保守的或非保守的。
[0032] 如本文所用,“变体”是指多肽、蛋白质或其类似物,其被修饰以包含通常不是分子一部分的额外化学部分。这些部分可以调节,例如但不限于,分子的溶解度、吸收和/或生物半衰期。《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》(1980)中公开了能够介导这种效应的部分。将这些部分偶联到分子上的方法在本领域中是众所周知的。
[0033] 抗体及其片段或衍生物,包括但不限于Fab′片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fc片段、一个或多个互补决定区(CDR)片段、单个重链、单个轻链、二聚重链和轻链(与完整抗体中发现的异四聚重链和轻链相反,单链抗体(scAb)、人源化抗体(以及以人源化抗体的方式修饰但所得抗体与非人类物种中的抗体更接近的抗体)、螯合重组抗体(CRAB)、双特异性抗体和多特异性抗体以及本领域已知的其它抗体衍生物或片段。
[0034] 在上述方面的实施方案中,所述构建体的至少一个抗体或其片段包括曲妥珠单抗或其片段、拉西巴卡单抗(raxibacamab)或其片段、托珠单抗或其片段、本妥昔单抗或其片段、奥法木单抗或其片段、贝利木单抗或其片段、雷莫卢单抗或其片段、维多珠单抗或其片段、奥比妥珠单抗或其片段、培布利珠单抗或其片段、雷尼珠单抗或其片段、帕妥珠单抗或其片段、狄诺塞麦单抗或其片段、卡妥索单抗或其片段、戈利木单抗或其片段、司妥昔单抗或其片段、那他珠单抗或其片段、帕尼单抗或其片段、狄诺塞麦单抗或其片段,以及上述的组合。
[0035] 在实施方案中,连接体为聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷、聚磷腈、聚乙烯-共-来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲)(“PHF”)、聚羟基烷基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰基-2′-乙基三甲基磷酸铵(“MPC”)或选自以下的结构:
[0036]
[0037] 其中:m为0至10;n为1至100;每个p独立地为0、1、2、3或4;q为0、1或2;r为1或2;E为10 10 11
NH或CHR ;G为O、CH2、CHOH、CHNH2、CHCOOH或CHSO3H;R 为OH、NH2或COOH,并且每个R 独立地为H、OH、NH2或COOH。
[0038] 在实施方案中,每个活性酶独立地选自由角质酶、SnapTag、HaloTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶、细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域、性磷酸酶、蛋白-酪氨酸-磷酸酶、23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体、葡萄糖苷酶、N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶、N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶、卤代烷脱卤酶突变体、HNH核酸内切酶、切口核酸内切酶、明胶酶B、明胶酶A、基质分解素、脂肪酸酰胺水解酶、酯酶、细胞色素P450、甲硫氨酸氨肽酶及其组合组成的群组。在实施方案中,每个活性酶独立地选自由角质酶、卤代烷脱氢酶HaloTag、突变型O6-烷基嘌呤DNA烷基转移酶、SnapTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶及其组合组成的群组。在实施方案中,每个活性酶独立地选自由角质酶、卤代烷脱氢酶HaloTag、突变型O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶、SnapTag及其组合组成的群组。
[0039] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶不同。在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶相同。在实施方案中,所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂不同。在实施方案中,所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂相同。任选地,在实施方案中,每个亲和试剂独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体、蛋白质及其组合组成的群组。
[0040] 在实施方案中,通过常规合成化学技术将活性酶附接到亲和试剂上,形成亲和试剂和活性酶的融合蛋白。在某些情况下,当亲和试剂包含蛋白质或抗体时,通过表达编码亲和试剂和活性酶的多核苷酸序列来产生融合蛋白。在一些方面,本公开提供包含可操作地连接到启动子的多核苷酸的载体。在又一些方面,本公开提供包含载体的宿主细胞。在一些实施方案中,所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在进一步的实施方案中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在相关的实施方案中,所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在更进一步的实施方案中,所述宿主细胞是酵母细胞。在又一些方面,提供一种本文公开的融合蛋白的生产方法,该方法包含在适于诱导多肽表达的条件下培养本文所述的宿主细胞的步骤。在相关实施方案中,分离多肽。
[0041] 亲和试剂
[0042] 本公开的构建体包括融合蛋白,所述融合蛋白包含为融合蛋白提供功能性的亲和试剂。因此,可以组装包含具有精确定义的结构和功能的第一融合蛋白和第二融合蛋白的构建体。通过亲和试剂赋予所述融合蛋白的功能性的实例包括但不限于,在循环中或细胞表面上增强疾病相关蛋白的靶向性、增强的细胞毒性、免疫调节、药物递送、用作造影剂、用作诊断剂或上述的组合。
[0043] 所述第一亲和试剂和所述第二亲和试剂可以相同或不同。每个亲和试剂可以独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体、蛋白质及其组合组成的群组。
[0044] 在实施方案中,所述亲和试剂包含抗体或其片段。抗体或其片段可以选自由轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)、重链恒定结构域(CH1)及其组合组成的群组。所述抗体或其片段可以是嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。抗体或其片段的实例包括但不限于,曲妥珠单抗或其片段、拉西巴卡或其片段、托珠单抗或其片段、本妥昔单抗或其片段、奥法木单抗或其片段、贝利木单抗或其片段、雷莫卢单抗或其片段、维多珠单抗或其片段、奥比妥珠单抗或其片段、培布利珠单抗或其片段、雷尼珠单抗或其片段、帕妥珠单抗或其片段、狄诺塞麦单抗或其片段、卡妥索单抗或其片段、戈利木单抗或其片段、司妥昔单抗或其片段、那他珠单抗或其片段、帕尼单抗或其片段和狄诺塞麦单抗或其片段。
[0045] 在实施方案中,所述亲和试剂包括小分子。所述小分子可以是药物。小分子药物的实例包括但不限于,阿地白介素、阿仑膦酸、苜蓿酮(alfaferone)、阿利维A酸、别嘌呤醇、别嘌醇钠、阿洛西、六甲蜜胺、氨鲁米特、左旋天冬酰胺酶、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安泽梅特(anzmet)、安然爱斯普、阿格拉宾、三氧化二砷、阿诺新、5-氮杂胞苷、咪唑硫嘌呤、卡介苗或泰斯-卡介苗(tice-BCG)、苯丁抑制素、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、贝沙罗汀、硫酸博莱霉素、溴尿苷、替佐米、博莱霉素、白消安、降血素、坎帕斯(campath)、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡索地司、头孢烯酮(cefesone)、西莫白介素、柔红比星、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋冬酰胺酶、克拉屈滨、氯甲双磷酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、地塞米松、地塞米松磷酸盐、去雌激素(delestrogen)、地尼白介素-毒素连接体(denileukin diftitox)、德博美德罗(depomedrol)、地洛瑞林、右丙亚胺、道诺霉素、二乙基己烯雌酚,2′,2′-二氟脱氧胞苷、大扶康、多西他奇、脱氧氟尿苷、阿霉素、屈大麻酚、DW-166HC、加尔德(eligard)、埃立特克(elitek)、埃伦斯(ellence)、埃漫德(emend)、表阿霉素、促红细胞生成素α、红细胞生成素针剂(epogen)、依铂、盐酸左旋米唑和5-氟尿嘧啶制剂(ergamisol)、雌二醇制剂(estrace)、雌二醇、雌氮芥(estramustine)磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、羟基磷酸、凡毕复(etopophos)、依托泊苷、法倔唑、法斯通(farstone)、非格司亭、非那司提、弗拉格汀(fligrastim)、氟尿苷、氟康唑、氟达拉宾(fludarabin)、氟达拉宾磷酸盐、5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸酯、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟羟甲基睾丸素、氟他胺、六甲基三聚氰胺、福美坦、福司他滨(fosteabine)、福莫司汀、氟维司群、伽玛伽(gammagard)、吉西他滨、吉姆单抗、格列卫、卡氮芥糯米纸胶囊剂(gliadel)、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、托泊替康、氢化可通、赤羟腺嘌呤(erythro-hydroxynonyladenine)、羟基脲、己酸羟孕酮、替伊莫单抗、去甲氧基柔红霉素
(idarubicin)、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白细胞介素-2、基因内区A、易瑞沙、依立替康、凯特瑞、香菇多糖硫酸盐、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、亮丙瑞林醋酸盐、左旋咪唑、左亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂(levoxyl)、环己亚硝脲、氯尼达明、屈大麻酚、二氯甲基二乙胺、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、左旋溶肉瘤素、梅尼斯特(menest)、6-巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、美特维克、米替福新、二甲胺四环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、莫多纳(modrenal)、阿霉素脂质体(myocet)、奈达铂、纽拉斯塔(neulasta)、纽米伽(neumega)、纽普根(neupogen)、尼鲁米特(nilutamide)、诺瓦得士(nolvadex)、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸奥坦西隆、奥拉普雷德(orapred)、奥沙利铂、紫杉醇(paclitaxel)、泼尼松磷酸钠制剂(pediapred)、培门冬酶、聚乙二醇干扰素、喷司他汀、N-膦酰基乙酰天门冬氨酸(PALA)、溶链菌、盐酸毛果芸香碱、吡柔比星、光神霉素、卟吩姆钠、松龙苯芥、脱氢皮质(甾)醇、强的松、普雷马林、甲基苄肼、普罗克瑞(procrit)、雷替曲塞、利比、铼-186依替膦酸盐、利妥昔单抗、罗扰素-A、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱(salagen)、善宁、沙莫司亭、甲基环己亚硝脲、西佐喃、索布佐生、甲基强的松龙溶胶、链佐星、氯化锶-89、左甲状腺素钠、它莫西芬、坦索洛新、他索纳明、睾内酯(tastolactone)、泰索帝(taxoter)、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮(testred)、硫鸟嘌呤、噻替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬(toremifen)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托消安(teosulfan)、维生素A酸、甲氨蝶呤、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、双羟酸曲普瑞林、UFT、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、长春瑞滨、维鲁利秦、ADR-529右旋丙亚胺(zinecard)、净司他丁苯马聚合物、枢复宁、ABI-
007、阿卡比芬(acolbifen)、干扰素γ-1b、阿菲尼塔克(affinitak)、氨喋呤、阿佐昔芬(arzoxifen)、阿索匹利尼(asoprisnil)、阿他美坦(atamestane)、阿曲生坦、阿瓦斯汀(avastin)、BAY 43-9006(索拉非尼)、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙氯地孕酮、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、dSLIM、度他雄胺、埃替卡林(edotecarin)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶移植物、钬-166 DOTMP、伊班膦酸、γ干扰素、内含子-聚乙二醇、伊沙匹隆(ixabepilone)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanine)、L-651582、兰瑞肽、拉索昔芬(lasofoxifen)、利泊(libra)、洛那法尼(lonafarnib)、米普昔芬(miproxifen)、米诺膦酸盐(minodronate)、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、诺司达(neovastat)、诺拉曲塞、奥利美生(oblimersen)、onko-TCS、奥西姆(osidem)、紫杉醇聚谷氨酸(paclitaxel polyglutamate)、帕米膦酸二钠、PN-401、QS-21、夸西泮、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶(ranpirnas)、13-顺式-网状红细胞酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、特罗凯(tarceva)、塔西普瑞辛(taxoprexin)、胸腺素-α-1、噻唑羧胺核苷、替吡法尼
(tipifarnib)、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬(toremifen)、反式MID-107R、伐司朴达、伐普肽、瓦他拉尼(vatalanib)、维替泊芬、长春氟宁(vinflunin)、Z-100、唑来膦酸以及上述的组合组成的群组。
[0046] 在实施方案中,所述亲和试剂包含蛋白质。在实施方案中,所述蛋白质选自由天然蛋白质、天然氨基酸、非天然氨基酸、噬菌体中的蛋白质、治疗性蛋白质、合成抗体结构域以及前述的组合组成的群组。在实施方案中,所述蛋白质选自由非天然氨基酸、噬菌体中的蛋白质、治疗性蛋白质、合成抗体结构域以及前述的组合组成的群组。
[0047] 在实施方案中,所述亲和试剂选自由由设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、HEL4Vh结构域(Predator)、葡萄球菌蛋白A(Affibody)的Z结构域、原型“7kDa DNA结合物”蛋白质家族(Affitin)、水化合物结合模块(CBD结构域)、胱氨酸结小蛋白(knottin)、纤连蛋白III型结构域(单体,Adnectin)、γ-B-结晶蛋白(Affilin)、胱抑素(Affimers)、三螺旋线圈结构域(Alhabodies)、脂质运载蛋白结构域(Anticalins)、各种膜受体的结构域(Avimers)、Fyn(Fynomers)的SH3结构域、Kunitz结构域肽及其组合组成的群组。
[0048] 活性酶
[0049] 本公开的融合蛋白包括活性酶,所述活性酶可以与对不可逆地抑制存在于连接体上的活性酶具有特异性的官能团偶联。因此,包含第一融合蛋白和具有精确限定结构的第二融合蛋白的构建体可以使用选择性偶联至融合蛋白活性酶中活性位点残基的合成连接体通过模块化方法进行组装。
[0050] 所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶可以相同或不同。每种活性酶可独立地选自由角质酶、SnapTag、HaloTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶、细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域、碱性磷酸酶、蛋白-酪氨酸-磷酸酶、23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体、葡萄糖苷酶、N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶、N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶、卤代烷脱卤酶突变体、HNH核酸内切酶、切口核酸内切酶、明胶酶B、明胶酶A、基质分解素、脂肪酸酰胺水解酶、酯酶、细胞色素P450、甲硫氨酸氨肽酶及其组合组成的群组。
[0051] 在实施方案中,每种活性酶独立地选自由角质酶、HaloTag、SnapTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶及其组合组成的群组。在实施方案中,每种活性酶独立地选自由由角质酶、HaloTag、SnapTag及其组合组成的群组。
[0052] 在实施方案中,所述活性酶是I型DNA拓扑异构酶的迁移率类(MOB)松弛酶结构域。I型DNA拓扑异构酶的MOB松弛酶结构域是共价附接到位于也编码松弛酶蛋白的移动性质粒内的小同源转移(oriT)DNA序列的酶。这些酶在特定的核苷酸残基处切割oriTDNA序列,并且在切割点共价附接到oriTDNA序列。I型DNA拓扑异构酶的MOB松弛酶结构域可以用家族来表征,其中每个家族成员都有相似的结构和机制。已知I型DNA拓扑异构酶家族的MOB松弛酶结构域的实例包括MOBF、MOBH、MOBQ、MOBC、MOBP和MOBV。每个松弛酶家族成员的oriT序列对每个松弛酶蛋白序列来源的移动性质粒是特异性的。松弛酶家族及其相关质粒的已知实例包括但不限于,MOBF家族:pF、pR100、pR388、pWWO、pMFLV02、pREB5、pREC1和pNAC3;MOBH家族:
pR27、pCAR1、pSXT、pIP1202、pMOL28和pPNAP01;MOBC家族:pCloDF13、p23023、pCRY、pAD1、pSKU146.2、pLM7和pSt0;MOBQ家族:pRSF1010、pPRO2、pTi、pAt、pGOX3、pWCFS103、pBM300、pCAUL01、pTB3、pKJ50和pRF;MOBP家族:pRP4、pEST4011、pBI1063、pR64、pET46、pACRY04、pRAS3、pVirD2pTi、pColE1、pRA3、pVT745、pCP13、pFMC、pRP4、pR64、pK、pRAY、pCH4、pET35、pNP40、pCF10、pVir、pBOT3502、pMD136、pCIZ2、pS194、pSK639和pRJ9;以及MOBV家族:
pMV158、pE194、pUB110、pBBR1、pTn5520、pTn4555、pIncU和pIncX,其中下标“p”代表质粒。
[0053] 连接体
[0054] 连接体包括至少第一末端和第二末端。所述连接体进一步在第一末端包括对不可逆抑制融合蛋白具有特异性的第一官能团。所述连接体进一步在第二末端包括对不可逆抑制融合蛋白具有特异性的第二官能团。
[0055] 在实施方案中,所述连接体进一步包括含氮的C3-7杂环、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲醛)(“PHF”)、聚羟基烷基丙烯酸酯(例如甲基丙烯酸2-羟乙酯)、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(“MPC”)或其组合。例如,所述连接体可以包括聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、PHF、聚羟基烷基丙烯酸酯或MPC。
[0056] 在实施方案中,所述连接体包含选自的基团;
[0057] 其中:
[0058] m为0至10;
[0059] n为1至100;
[0060] 每个p独立地为0、1、2、3或4;
[0061] q为0、1或2;
[0062] r为1或2;
[0063] E为O、NH或CHR10;
[0064] G为O、CH2、CHOH、CHNH2、CHCOOH或CHSO3H;
[0065] R10为OH、NH2或COOH;和
[0066] 每个R11独立地为H、OH、NH2或COOH。
[0067] 在实施方案中,所述连接体包含 在一些实施方案中,E为O。在各种实施方案中,E为NH。在一些实施方案中,E为CHR10。例如,E可以包括CHOH、CHNH2、CHCOOH或CHSO3H。在这些实施方案中,m可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如,m可以为1、2、3、4或
5。在一些实施方案中,m为1、2或3。在各种实施方案中,n可以为1至50、1至40、1至30、1至20、
1至25、1至20、1至15、1至10或1至5。
[0068] 在实施方案中,所述连接体包括 在某些情况下,p为1、2或3(例如,1或2)。例如,所述连接体可以包括天冬氨酸、谷氨酸或γ-谷氨酸。在各种实施方案中,n可以为1至50、1至40、1至30、1至20、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5。
[0069] 在实施方案中,所述连接体包含 在某些情况下,p为0、1、2或3(例如,1或2)。在各种实施方案中,n可以为1至50、1至40、1至30、1至20、1至25、1至20、1至15、1至10或1至5。
[0070] 在实施方案中,所述连接体包含 在实施方案中,G为O。在G为O的实施方案中,每个R11可以独立地为H或OH。在实施方案中,G为CH2。在G为CH2的实施方案中,每个R11可以独立地为H或OH,只要至少一个R11为OH。在实施方案中,每个R11为OH。在G为CH2的各种实施方案中,每个R11可以独立地为H或NH2,只要至少一个R11为NH2。在G为CH2的各种实施方案中,每个R11可以独立地为H或COOH,只要至少一个R11为COOH。在实施方案中,G为CHOH。在G为CHOH的实施方案中,每个R11可以独立地为H或OH。在实施方案中,每个R11为OH。
在实施方案中,G为GHNH2。在G为CHNH2的实施方案中,每个R11可以独立地为H或NH2。在实施方案中,G为CHCOOH。在G为CHCOOH的实施方案中,每个R11可以独立地为H或COOH,只要至少一个R11为COOH。在这些实施方案中,n可以为1至50,1-40,1-30,1-20,1-25,1-20,1-15,1-10,或
1-5。
[0071] 在实施方案中,所述连接体包括含氮C3-7杂环(例如吡咯烷、哌啶、哌嗪)、聚亚烷基二胺(例如聚乙烯二胺、聚丙烯二胺、聚丁烯二胺)、带负电的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、γ-谷氨酸)或糖(例如单糖、多糖、肌醇或聚唾液酸)。
[0072] 在实施方案中,所述连接体包含聚亚烷基氧化物。所述聚亚烷基氧化物可以是直链或支链的。例如,所述连接体可以包括聚乙二醇(例如,PEG 40、PEG 100、PEG 150、PEG 200、PEG 300、PEG 2000)、聚丙二醇或聚丁二醇。聚亚烷基氧化物的分子量可以为约30至约
5000(例如约30至4500、约30至4000、约30至3500、约30至3000、约30至2500、约30至2000、约
30至1500、约30至1000、约46至1000、约46至750、约46至500、约46至250或约46至100)。在其一个或两个末端具有或不具有活性官能团的聚环氧乙烷间隔物在本领域是众所周知的,并且可通过例如Quanta BioDesign、PierceNet和SigmaAldrich购得。
[0073] 通过第一末端和第二末端的官能团,所述连接体与所述融合蛋白活性酶位点以高产率发生特异性反应,在温和条件下具有快速动力学,以提供至少二价抗体构建体。所述连接体末端的官能团可以是不可逆地抑制活性酶的任何官能团。
[0074] 官能团的实例包括但不限于对硝基苯基膦酸酯、O6-苄基鸟嘌呤、α-卤代烷或其衍生物、卤代芳化合物或其衍生物、β-内酰胺或其衍生物(例如克拉维酸或其衍生物)、苷元或其衍生物、异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物、同源oriT寡核苷酸序列、半胱氨酸活性ATP结合位点抑制剂、醌甲基化物或其衍生物、α-卤代膦酸或其前体或衍生物、甲酰色酮或其衍生物、同源RNA序列、腺苷或其衍生物、胞嘧啶或其衍生物、同源DNA切口位点、环硫乙烷或其衍生物、异羟肟酸或其衍生物、α-酮噁唑抑制剂或其衍生物、亲电类固醇、膦酸酯、氨基甲酸酯、芳香炔烃、贝洛拉尼或其衍生物,以及上述组合。
[0075] 在实施方案中,所述官能团选自由对硝基苯基膦酸酯、O6-苄基鸟嘌呤、α-卤代烷或其衍生物、卤代芳族化合物或其衍生物、β-内酰胺或其衍生物(例如克拉维酸或其衍生物)、苷元或其衍生物、异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物、同源oriT寡核苷酸序列及其组合组成的群组。在实施方案中,所述官能团选自由对硝基苯基膦酸酯、O6-苄基鸟嘌呤、α-卤代烷或其衍生物、卤代芳族化合物或其衍生物及其组合组成的群组。
[0076] 在实施方案中,所述官能团为同源oriT寡核苷酸序列。在前述实施方案的改进中,同源oriT寡核苷酸序列选自由5′-TTTGCGTAGTGTGTGGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:1);5′-TTTGCGTGGGGTGTGGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:2);5′-TTTGCGTAGGGTGTGGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:3);5′-CGCGCACCGAAAGGTGCGTATTGTCTATAGCCCAGATTTAAGGA-3′(SEQ ID NO:4);5′-CCATTTCTCGAAGAGAAACCGGTAAATGCGCCCT-3′(SEQ ID NO:5);5′-CACACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTTATACTTTA-3′(SEQ ID NO:6);5′ACGTTTCTGAACGAAGTGAAGAAACGTCTAAGTGCGCCCT-3′(SEQ ID NO:7)及其组合组成的群组。
[0077] 在实施方案中,所述融合蛋白活性酶为I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且所述官能团为同源oriT寡核苷酸序列。在实施方案中,(由每个松弛酶蛋白序列的移动质粒识别的)I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域/同源oriT寡核苷酸序列对选自由pR100/5′-TTTGCGTAGTGTGTGGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:1);pF/5′-TTTGCGTGGGGTGTGGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:2);TraIP307/5′-TTTGCGTAGGGTGTGGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:3);pR388/5′-CGCGCACCGAAAGGTGCGTATTGTCTATAGCCCAGATTTAAGGA-3′(SEQ ID NO:4);pR1162/5′-CCATTTCTCGAAGAGAAACCGGTAAATGCGCCCT-3′(SEQ ID NO:5);pMobMN199/5′-CACACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTTATACTTTA-3′(SEQ ID NO:6);pSC101/5′ACGTTTCTGAACGAAGTGAAGAAACGTCTAAGTGCGCCCT-3′(SEQ ID NO:7)及其组合组成的群组。
[0078] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含角质酶,并且第一末端的官能团包含对硝基苯基膦酸酯。
[0079] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含SnapTag,并且第一末端的官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。
[0080] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含HaloTag,并且第一末端的官能团包含α-氯烷烃。
[0081] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶,并且第一末端的官能团包含β-内酰胺或其衍生物。
[0082] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含糖苷酶,并且第一末端的官能团包含苷元或其衍生物。
[0083] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶,并且第一末端的官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。
[0084] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且第一末端的官能团包含同源的oriT寡核苷酸序列。
[0085] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域,并且第一末端的官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。
[0086] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶,并且第一末端的官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0087] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶,并且第一末端的官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0088] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体,并且第一末端的官能团包含同源RNA序列。
[0089] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶,并且第一末端的官能团包含苷元或其衍生物。
[0090] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶,并且第一末端的官能团包含腺苷或其衍生物。
[0091] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶,并且第一末端的官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
[0092] 在实施方案中,第一融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶,并且第一端的官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
[0093] 在实施方案中,第一融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体,并且第一末端的官能团包含选自由卤代烷烃、卤代芳烃化合物或其衍生物组成的群组的官能团。
[0094] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶,并且第一末端的官能团包含同源DNA切口位点。
[0095] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包括切口核酸内切酶,并且第一末端的官能团包括同源DNA切口位点。
[0096] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶B,并且第一末端的官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0097] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶A,并且第一末端的官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
[0098] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含基质分解素,并且第一末端的官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
[0099] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶,并且第一末端的官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。
[0100] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含酯酶,并且第一末端的官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0101] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s,并且第一末端的官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0102] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨肽酶,并且第一末端的官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。
[0103] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含角质酶,并且第二末端的官能团包含对硝基苯膦酸酯。
[0104] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含SnapTag,并且第二末端的官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。
[0105] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含HaloTag,并且第二末端的官能团包含α-氯代烷烃。
[0106] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶,并且第二末端的官能团包含β-内酰胺或其衍生物。
[0107] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含糖苷酶,并且第二末端的官能团包含苷元或其衍生物。
[0108] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶,并且第二末端的官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。
[0109] 在实施方案中,其中所述第二融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域,并且第二末端的官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。
[0110] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域,并且第二末端的官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。
[0111] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶,并且第二末端的官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0112] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶,并且第二末端的官能团包含选自甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0113] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含23S rRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体,并且第二末端的官能团包含同源RNA序列。
[0114] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶,并且第二末端的官能团包含苷元或其衍生物。
[0115] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶,并且第二末端的官能团包含腺苷或其衍生物。
[0116] 在实施方案中,第二融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶,并且第二末端的官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
[0117] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶,并且第二末端的官能团包含胞嘧啶或其衍生物。
[0118] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体,并且第二末端的官能团包含选自由卤代烷、卤代芳族化合物或其衍生物组成的群组的官能团。
[0119] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶,并且第二末端的官能团包含同源DNA切口位点。
[0120] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含切口核酸内切酶,并且第二末端的官能团包含同源DNA切口位点。
[0121] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶B,并且第二末端的官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。
[0122] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶A,并且第二末端的官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0123] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含基质分解素,并且第二末端的官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0124] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶,并且第二末端的官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。
[0125] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含酯酶,并且第二末端的官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0126] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s,并且第二末端的官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。
[0127] 在实施方案中,所述第二融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨基肽酶,并且第二末端的官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。
[0128] 构建体的制备方法
[0129] 本公开的另一个方面提供了一种方法,包括(a)将包括亲和试剂和活性酶的第一融合蛋白与包括在第一末端对不可逆地抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团的连接体接触,从而在第一末端将所述第一融合蛋白与所述连接体偶联,以及(b)将包含亲和试剂和活性酶的第二融合蛋白与所述连接体的第二末端接触,所述连接体的第二末端包含在第二末端对不可逆地抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,从而在第二末端将所述第二融合蛋白与所述连接体偶联。
[0130] 如本文所用,除非另有说明,“偶联”(“coupled”、“couple”或“coupling”)包括共价键的形成,例如,通过共价键,融合蛋白可以不可逆地与连接体末端的官能团结合。
[0131] 这里公开的方法使用末端具有官能团的小分子连接体以模块化方式连接融合蛋白,所述小分子连接体在温和的反应条件下以快速动力学高收率地与活性酶特异性反应。
[0132] 本文公开的方法提供了一个或多个优点,例如,提供了一种方法,通过该方法可以以模块化方式产生出乎意料的多样化的治疗构建体群。此外,由于不需要在抗体支架上直接工程化/功能化活性氨基酸,因此使用本公开的构建体制备具有扩展功能的抗体形式是简单的。此外,所述融合蛋白和连接体偶联的温和、快速和位点特异性的性质允许不同的效应分子以精确的化学计量以高产率附接到抗体片段上,并且远离抗体样片段。此外,不能在具有抗体片段如毒素或糖基化蛋白质的同源宿主中表达的分子可以在各种生物体中表达,并以模块化方式附接到构建体上。模块化合成允许产生太大或复杂的分子,以至于不能使用标准蛋白质工程/表达来制备,因为这种方法需要多肽在培养物中表达为一条或多条链。
[0133] 化学链接模块化方法能够有效地产生精确定义的可变化学计量、取向和几何形状的蛋白质构建体。这些属性可以通过将多样性编码到连接体和/或通过改变融合蛋白与连接体的连接顺序来系统地改变。目前的蛋白质工程方法局限于天然多肽折叠/肽连接体的固有库,以获得期望的构建体。因此,使用传统的工程方法无法制备可能具有更高功效的非天然格式。
[0134] 最后,除了在抗体分子的工业生产中通常使用的真核宿主之外,较小抗体样片段的表达还能在原核宿主中表达。众所周知,原核生物的健壮性,以及通常是真核表达系统的5倍的产品产量,使得制造平台的成本更低。
[0135] 本公开的另一个方面提供了通过本公开的方法制备的构建体。
[0136] 在实施方案中,步骤(a)和(b)顺序执行(即,逐步执行)。在实施方案中,步骤(a)和(b)同时进行(即,一锅法)。每个亲和试剂和活性酶可以选自本文公开的任何亲和试剂和活性酶。所述连接体,包括第一端的官能团和第二端的官能团,可以选自本文公开的任何连接体和官能团。
[0137] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和第二融合蛋白活性酶是相同的,并且在所述连接体的第一末端对不可逆地抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团与在所述连接体的第二末端对不可逆地抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团相同,并且步骤(a)和(b)同时进行。
[0138] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和第二融合蛋白活性酶是相同的,并且在所述连接体的第一末端对不可逆抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团不同于在所述连接体的第二末端对不可逆抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,并且步骤(a)和(b)同时进行。
[0139] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和第二融合蛋白活性酶是不同的,并且在所述连接体的第一末端对不可逆抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团与在所述连接体的第二末端对不可逆抑制第二融合蛋白活性酶具有特异的官能团相同,并且步骤(a)和(b)顺序进行。
[0140] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和第二融合蛋白活性酶是不同的,并且在所述连接体的第一末端对不可逆抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团与在所述连接体的第二末端对不可逆抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团相同,并且步骤(a)和(b)同时进行。
[0141] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和第二融合蛋白活性酶不同,并且在所述连接体的第一末端对不可逆抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团不同于在所述连接体的第二末端对不可逆抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,并且步骤(a)和(b)同时进行。
[0142] 在实施方案中,所述第一融合蛋白活性酶和第二融合蛋白活性酶是不同的,并且在所述连接体的第一末端对不可逆抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团不同于在所述连接体的第二端对不可逆抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团,并且步骤(a)和(b)依次进行。
[0143] 本文公开的方法提供了一个或多个优点,例如允许分子量大于约100kDa、约150kDa、约200kDa、约250kDa和/或约300kDa的分子的可缩放制备,和/或简单地通过组合相对较少数量的构建块来创建具有可变的化合价、几何形状、效应功能和化学计量的多种抗体样药物库。
[0144] 步骤(a)和(b)可以在缓冲到生理pH的任何水溶液中进行,例如pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述第一融合蛋白、第二融合蛋白和连接体的浓度通常可以是任何浓度。通常选择的浓度,使得第一融合蛋白、第二融合蛋白和连接体完全溶于选择的溶剂中,而不形成饱和溶液。当所述连接体仅包含在第一末端和第二末端对不可逆地抑制酶具有特异性官能团时,所述第一融合蛋白、连接体与第二融合蛋白的相对浓度为至少约1∶1∶1,以提供对每个融合蛋白不可逆地抑制酶连接体末端具有特异性的一个官能团。
[0145] 在实施方案中,步骤(a)和(b)在环境温度下进行。温度不应高到使融合蛋白中存在的任何蛋白变性。
[0146] 在实施方案中,构建体可以在固体载体上制备。在实施方案中,步骤(a)和/或(b)的一种或多种组分可以提供在固体载体上。合适的固体载体是本领域公知的。
[0147] 使用构建体的方法
[0148] 本公开的另一个方面提供了一种方法,包括向有需要的患者施用本公开的构建体。本公开的又一个方面提供了本公开的构建体作为有需要的患者的药物的用途。本公开的另一个方面提供了本公开的构建体作为诊断的用途。
[0149] 在实施方案中,患者患有选自由乳腺癌、吸入性炭疽、类湿性关节炎、全身性幼年特发性关节炎、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、复发缓解性多发性硬化、系统性红斑狼疮、胃或胃食管连接腺癌、转移性非小细胞癌、溃疡性结肠炎、克罗恩病,黑色素瘤、黄斑变性、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、骨巨细胞瘤、恶性腹水、屑病性关节炎、强直性脊柱炎、转移性肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、结肠直肠癌以及上述组合组成的群组的病症或疾病。
[0150] 如本文所用,并且除非另有说明,“疾病”和“病症”可互换使用。
[0151] 在实施方案中,所述构建体的至少一个抗体或其片段包括曲妥珠单抗或其片段、拉西巴卡单抗或其片段、托珠单抗或其片段、本妥昔单抗或其片段、奥法木单抗或其片段、贝利木单抗或其片段、雷莫卢单抗或其片段、维多珠单抗或其片段、奥比妥珠单抗或其片段、培布利珠单抗或其片段、雷尼珠单抗或其片段、帕妥珠单抗或其片段、狄诺塞麦或其片段、卡妥索单抗或其片段、戈利木单抗或其片段、司妥昔单抗或其片段、那他珠单抗或其片段、帕尼单抗或其片段、狄诺塞麦或其片段,以及上述的组合。
[0152] 在实施方案中,患者患有乳腺癌,并且构建体的至少一种抗体或其片段包含曲妥珠单抗或其片段。
[0153] 在实施方案中,患者患有吸入性炭疽,并且构建体的至少一种抗体或其片段包含瑞西巴库单抗或其片段。
[0154] 在实施方案中,患者患有类风湿性关节炎或全身性幼年特发性关节炎,并且构建体的至少一种抗体或其片段包含托珠单抗或其片段。
[0155] 在实施方案中,患者患有霍奇金淋巴瘤或全身性间变性大细胞淋巴瘤,并且构建体的至少一种抗体或其片段包含本妥昔单抗或其片段。
[0156] 在实施方案中,患者患有选自由慢性淋巴细胞白血病、滤泡性非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、类风湿性关节炎和复发缓解性多发性硬化组成的群组的疾病,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含奥法木单抗或其片段。
[0157] 在实施方案中,患者患有系统性红斑狼疮,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含贝利木单抗或其片段。
[0158] 在实施方案中,患者患有胃或胃-食管结合部腺癌或转移性非小细胞肺癌,并且构建体的至少一种抗体或其片段包含雷莫芦单抗或其片段。
[0159] 在实施方案中,患者患有溃疡性结肠炎或克罗恩病,并且所述构建体的至少一个抗体或其片段包含维多珠单抗或其片段。
[0160] 在实施方案中,患者患有慢性淋巴细胞白血病或滤泡性淋巴瘤,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含奥比妥珠单抗或其片段。
[0161] 在实施方案中,患者患有黑素瘤或转移性非小细胞肺癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含培布利珠单抗或其片段或其片段。
[0162] 在实施方案中,患者患有黄斑变性,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含雷尼珠单抗或其片段。
[0163] 在实施方案中,患者患有乳腺癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含帕妥珠单抗或其片段。
[0164] 在实施方案中,患者患有选自由骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移和骨巨细胞瘤组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含狄诺塞麦单抗或其片段。
[0165] 在实施方案中,患者患有恶性腹水,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含卡妥索单抗或其片段。
[0166] 在实施方案中,患者患有选自由类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含戈利木单抗或其片段。
[0167] 在实施方案中,患者患有选自由转移性肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和卡斯特曼病组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含司妥昔单抗或其片段。
[0168] 在实施方案中,患者患有多发性硬化症或克罗恩病,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含那他珠单抗或其片段。
[0169] 在实施方案中,患者患有结肠直肠癌,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含帕尼单抗或其片段。
[0170] 在实施方案中,患者患有选自由骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移和骨巨细胞瘤组成的群组的病症,并且所述构建体的至少一种抗体或其片段包含狄诺塞麦单抗或其片段。
[0171] 根据本公开的构建体、方法和用途可根据以下实施例更好地理解,这些实施例仅用于说明结构,而不旨在以任何方式限制其范围。
[0172] 实施例
[0173] 实施例1:曲妥珠单抗F(ab)结构域基因/蛋白质表达载体的构建
[0174] Genscript通过大肠杆菌密码子优化合成了编码来自单克隆抗体曲妥珠单抗(以下称为“TFab”)的F(ab)结构域(轻链可变VL-轻链恒定κ链CK和重链可变结构域VH-重链恒定结构域CH1)的基因。基于pASK-IBA 32(IBA生物科学),使用无限制PCR将以下八种双顺反子融合蛋白组装在四环素诱导型表达载体中:
[0175] 1.“N-端角质酶-VL融合”-5′-RBS1-ATG-角质酶-(EAAAK)2-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:8和9)
[0176] 2“. N端SnapTag-VL融合”-5′-RBS1-ATG-SnapTag-(EAAAK)2-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:10和11)
[0177] 3.“C-端角质酶-CK融合”-5′-RBS1-AFG-VLCK-(EAAAK)2-角质酶-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:12和13)
[0178] 4“. C端SnapTag-CK融合”-5′-RBS1-ATG-VLCK-(EAAAK)2-SnapTag-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:14和15)
[0179] 5.“N-端角质酶-VH融合”-5′-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-角质酶-(EAAAK)2-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:16和17)
[0180] 6“. N端SnapTag-VH融合”-5′-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-SnapTag-(EAAAK)2-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:18和19)
[0181] 7“.C-端角质酶-CH1融合”-5′-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-(EAAAK)2-角质酶-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:20和21)
[0182] 8.“C端SnapTag-CH1融合”-5′-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-(EAAAK)2-SnapTag-LVPRGS-HHHHHH-**-3′(SEQ ID NO:22和23)
[0183] 图1显示曲妥珠单抗F(ab)(TFab)融合基因/蛋白构建体。A)C-端重链融合。B)N-端重链融合。C)C-端轻链融合。D)N-端轻链融合。
[0184] 实施例2:蛋白质表达/纯化
[0185] 将编码实施例1的编码八种TFab融合蛋白的载体转化到Sbuffle大肠杆菌(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))中。将含有生长培养基(500mL 2xYT)、羧苄青霉素(200μg/mL)和大观霉素(50μg/mL)的表达培养物接种到装有适当表达盒的细胞储备过夜培养物(5mL)中。培养物在30℃下以250rpm的振荡生长,直至达到约0.8的光学分散(OD)。此时,将脱水四环素(aTc)以200ng/mL的最终浓度添加到培养物中,以诱导蛋白质表达。在表达阶段,将培养物保持在24℃下,以250rpm振荡14小时。
[0186] 表达后,通过离心法获得细胞,并使用35mL含DNA酶I的CelLytic B(Sigma Aldrich)和不合EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)通过化学破碎裂解细胞。通过离心清除细胞裂解物中的碎片,并将细胞裂解物加入到含有钴IMAC树脂(3mL床体积)的柱中。裂解物在4℃搅拌下在珠子上孵育1小时。此后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底洗涤珠子,然后用含有咪唑的缓冲液(20mL)洗脱产物。此后,首先在蛋白L柱(GE Healthcare)上纯化蛋白质洗脱物,然后通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)仪器在Superdex 200柱(GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱(SEC)。通过FPLC进行的所有色谱柱纯化都是根据制造商建议的方案进行的。在连接反应之前,将含有纯蛋白质产物的馏分汇集并浓缩在离心浓缩器中。
[0187] 图2显示了纯化的TFab角质酶和TFab-SnapTag融合物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶。轨道1和2分别显示角质酶(72kDa)和SnapTag(69kDa)N-端VH融合的计算分子量附近的波段。轨道3和4显示了来自C-端VH融合的波段。轨道5和6以及7和8分别显示了来自C-端CK和CH1融合的波段。
[0188] 因此,实施例1和2显示了本公开的包含亲和试剂(TFab)和活性酶(角质酶和/或SnapTag)的融合蛋白的制备。
[0189] 实施例3:用于连接角质酶-TFab融合蛋白与SnapTag-TFab融合蛋白的连接体的制备
[0190]
[0191] 根据下面所示的合成方案制备根据本公开的连接体,所述连接体在第一末端包含对硝基苯基膦酸酯,并且在第二末端包含O6-苄基鸟嘌呤,以及乙二醇和酰胺单元。
[0192] 1-氨基-N-(4-(((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苄基)-3,6,9,12,15,18-六氧二十一烷-21-酰胺(1)的制备.将Fmoc-21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧二十一烷酸(567mg,0.99mmo])溶于5mL THF中。向该溶液中加入DIC(149mg,183μL,1.18mmol),然后加入NHS(136mg,1.18mmol,反应在室温下搅拌过夜。在旋转蒸发器上除去溶剂,得到的黄色油再悬浮于5mL DMF中。向该溶液中加入(4-氨基甲基)-O6-苄基鸟嘌呤(266mg,0.99mmol),反应在室温下搅拌2天。此后,在N2流下过夜从反应中汽提DMF。然后用5mL 20%哌啶在甲醇中处理所得橙色油,并在室温下搅拌1小时。使用旋转蒸发器除去溶剂,并且得到的橙色油再悬浮在10mL H2O中。然后将该溶液离心以沉淀不溶物质,并通过Waters Delta 400 HPLC将澄清的上清液分5份施加到反相C18柱上。使用75%ACN的线性梯度在去离子超滤水(DIUF)+0.01%TFA中进行洗脱60分钟,以DIUF+0.01%TFA作为流动相,流速为10mL/min。然后用MALDI-MS分析20至35分钟的馏分。合并纯馏分,冷冻干燥,得到琥珀色油。(424mg,71%)[0193] 1-(4-4-((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)-3,25-二氧代-6,9,12,15,
18,21-六氧杂-2,24-重氮唑烷(diazaoctacosan)-28-甲酸(2)的制备.将化合物1(50mg,83μmol)溶解在2.5mL甲醇中,向该溶液中加入琥珀酸酐(8.3mg,83μmol)。反应完成后(MALDI-MS监测约30分钟),在旋转蒸发器上除去溶剂。然后将所得琥珀油通过胶色谱纯化,首先使用10∶1的CH2Cl2∶甲醇除去杂质,然后用甲醇洗脱得到胶状琥珀色固体。(42mg,72%)[0194] Modica,J.A.等人在《化学生物化学(Chembiochem)》中描述了中间体(3)17-(乙氧基(4-硝基苯氧基)磷酰基)-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-氨基氯化物的制备,2012年11月5日;13(16):2331-4,其全部内容通过引用并入本文。
[0195] 乙基(4-硝基苯基)(1-(4-((2-氨基-9H-嘌呤-6-基)氧基)甲基)苯基)-3,25,28-三氧杂-6,9,12,15,18,21,32,35,38,41,44-十一烷氧基-2,24,29-三氮杂环己烷-46-基)膦酸酯(4)的制备.化合物2(39mg,55μmol)溶解在1mL DMF中。向该溶液中加入PYBOP(34mg,58μmol),然后加入N-甲基吗啉(5.6mg,6.1μL,55μmol),在室温下搅拌反应30分钟。此后,将溶解在250μL DMF中的化合物3(29.3mg,55μmol)加入到混合物中,然后加入N-甲基吗啉(11.2mg,12.2μL,110μmol),并使搅拌反应过夜(约16h)。此后,使用DIUF将混合物稀释到
5mL,并且离心混合物以去除不溶性物质。然后将澄清的上清液通过Waters Delta 4000 HPLC注射到C18半制备级柱上,并使用75%ACN+0.1%TFA水溶液的线性梯度在70分钟内用DIUF+0.1%TFA作为流动相进行纯化。流速为10mL/min,以1/min的速率收集馏分,然后通过MALDI分析25至40分钟的馏分。将含有纯产品的混合物混合,冷冻至-80℃,冻干得到黄色油。然后使用上述程序对所述油进行另一轮HPLC纯化。此轮的纯馏分汇集、冷冻和冻干,得到淡黄色油(11mg,17%)。
[0196] 因此,实施例3显示了本公开的连接体的制备,所述连接体包含第一官能团,所述第一官能团在第一末端对不可逆地抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性,以及第二官能团,所述第二官能团在第二末端对不可逆地抑制第二融合蛋白反应具有特异性。
[0197] 实施例4:Di-TFab构建体组装
[0198] 将来自实施例2的等体积的角质酶-TFab融合(5μM)和SnapTag-TFab融合(5μM)和来自实施例3的角质酶-SnapTag连接体(5μM)在pH7.4的PBS中混合并使其反应4小时。反应后,通过尺寸排阻色谱法纯化产物。
[0199] 图5显示了制备的构建体的SDS-PAGE凝胶。从8个TFab和一个连接体的库中,可以产生16个二价类似物构建体。
[0200] 因此,实施例4显示了本公开的包含第一融合蛋白、第二融合蛋白和连接体的构建体库的制备,其中所述第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含亲和试剂和活性酶;并且所述连接体包含在第一末端对不可逆抑制第一融合蛋白活性酶具有特异性的第一官能团,以及在第二末端对不可逆抑制第二融合蛋白活性酶具有特异性的第二官能团。
[0201] 实施例5:细胞生长抑制试验
[0202] 曲妥珠单抗用于治疗HER2+乳腺癌。根据已建立的方案培养两种HER2(+++)细胞系(BT474,SKBR3),一种HER2(++)细胞系(MDA-MB-VII-135)和一种对照细胞系AT-431(HER2-),并且用浓度范围为4pM至4μM的曲妥珠单抗或实施例4中制备的一种二价曲妥珠单抗类似物剂量处理96小时。使用Alamar蓝试验(Life Technologies)确定该期后的活力。活力按未处理对照相比计算的百分比值。
[0203] 从这些实验中,一种被命名为B-13的构建体显示出与曲妥珠单抗相比最有利的细胞生长抑制和EC50值。用B-13与曲妥珠单抗再次进行细胞活力实验。图4显示了细胞活力测定数据,显示曲妥珠单抗和B-13对各种细胞系的相似细胞生长抑制作用。A)BT474细胞的生长抑制。B)SKBR3细胞的生长抑制。C)MDA-MB-135-VII细胞的生长抑制。D)对照实验,使用HER2(-)AT-431细胞,显示对曲妥珠单抗或B-13没有生长抑制。
[0204] 因此,实施例5显示了如何测定本公开的构建体库以用于生物学用途,例如细胞生长抑制。此外,实施例5显示了构建体在体外癌细胞活力测定中的细胞毒性。实施例3的融合蛋白构建体组装方法能够以一锅法的方式制备多功能抗体样治疗分子。
[0205] 实施例6:双TFab构建体的体内药代动力学
[0206] B-13构建体(2mg/mL)以IV丸剂的形式以10mg/kg的总剂量给药于SCID-米色小鼠。在给药后不同时间点从尾静脉抽取血样(约200μL)。对总共三只小鼠(n=3)进行治疗,并在每个时间点取样。通过标准曲线比较,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清中B13的浓度。如图5所示,绘制这些数据并拟合至两室(双指数)药代动力学模型,以产生0.22小时-1的消除速率常数和3.1小时的半衰期。
[0207] 因此,实施例6显示了本公开的融合蛋白构建体和本公开的构建体的药代动力学数据的体内应用。
[0208] 实施例7:施用B-13对携带BT474肿瘤异种移植物的小鼠的影响
[0209] 8周龄雌性SCID米色小鼠取自Charles River实验室,植入0.025mg并且90天释放的17β-雌二醇微丸(Innovative Research of America)。2天后,将2×106个BT474细胞重悬于100μl PBS中,并且以1∶1与基质胶混合原位接种于乳腺脂肪垫。一旦肿瘤体积达到约150立方毫米,20只动物被随机分成4个平均肿瘤体积相等的治疗组(n=5)。在第一组中,B13通过腹膜内(IP)注射给药,每周五次(周一至周五),持续4周,总共20次,剂量为5mg/kg-1;在第二组中,B13通过相同的途径和频率以2.5mg/kg的剂量施用。在第三组中,阿霉素(dox)通过IP注射,每周两次,总共8次剂量,持续4周,剂量为2.5mg/kg。对照组每周注射5次赋形剂(PBS+.004%(w/w)聚山梨醇酯20)。B13和dox溶液均配制在同一载体中。通过鲎阿米巴样细胞裂解物(LAL)测定法确定B13样品含有<1.0的内毒素单元(EU)/mL。每2天连续测量肿瘤尺寸,并使用公式V=(L×W2)/2计算体积,其中V=体积,L=长度,W=宽度。结果如图6所示。
[0210] B13在BT474小鼠异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤活性。此外,B13在本研究中使用的两种剂量下,没有显示出毒性的外在迹象。这与dox相反,dox治疗组显示出明显的体重减轻。
[0211] 前面的描述仅是为了清楚理解而给出的,不应该从中理解不必要的限制,因为在本发明范围内的修改对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
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