尿激酶原改构体、制备方法、药物组合物和用途以及编码基因、含有基因的载体和转化细胞
专利汇可以提供尿激酶原改构体、制备方法、药物组合物和用途以及编码基因、含有基因的载体和转化细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程领域，提供了一种新的尿激酶原改构体，其分子结构为在N端顺序引入tPA的K2区 片段 与尿激酶原的P区，该分子还包括KGD与RGDS短肽。经纯化的该尿激酶原改构体，与 原型 的尿激酶原相比，溶解血栓的活能更高，特异性更强，同时兼具血小板聚集抑制作用。，下面是尿激酶原改构体、制备方法、药物组合物和用途以及编码基因、含有基因的载体和转化细胞专利的具体信息内容。
1.一种尿激酶原改构体，其分子结构为
(i)在N端顺序引入tPA的K2区片段与尿激酶原的P区，该分子还包括KGD与RGDS 短肽；
(ii)在(i)的氨基酸序列中，经过替换、缺失或增加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质， 且与上述尿激酶原改构体具有相同的功能，或者衍生物在N端有一个附加的蛋氨 酸残基，或带有一个或几个糖甙侧链。
2.如权利要求1尿激酶原改构体，在该分子的各个结构域之间还包括连接区，该连接区长 度在10个到20个氨基酸之间。
3.一种用于溶栓的药用组合物，由权利要求1或2所述的尿激酶原改构体和适合药用的载 体组成。
4.权利要求3的组合物在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。
5.编码权利要求1的尿激酶原改构体的核酸分子，其序列为：
(i)编码权利要求1所述的氨基酸序列的核酸分子；
(ii)针对不同表达体系的偏爱密码子，根据该尿激酶原改构体的氨基酸序列而设计的 重组DNA分子。
6.含有权利要求5的核酸分子的表达载体。
7.如权利要求6的表达载体，其中所述载体为真核表达载体。
8.权利要求7的载体转染宿主细胞形成的细胞株。
9.如权利要求8所述的细胞株，其中所述的宿主细胞是CHO细胞。
10.一种制备权利要求1的尿激酶原改构体的制备方法，该方法包括将权利要求5的DNA分 子装入适当的载体，转染一种适当的宿主细胞，培养该细胞，表达并分离纯化该改构体。
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及尿激酶原(prourokinase，简称pro-UK)的改构 体，该改构体的制备方法，含有该改构体的药物组合物及用途，以及该改构体编码基因，含 有其基因的载体，含有该载体的转化细胞。
背景技术
1979年，Husain等首次从尿中纯化出尿激酶原(US Patent No.4381346，1979)。尿激酶原又 称单链尿型纤溶酶原激活剂(single chain urine-type plasminogen activator，简称scu-PA)由411 个氨基酸组成，是一种分子量为50～54Kda(其差异可能与生产的细胞与纯化方法不同，从而 导致糖基化水平差异所致)的单链蛋白质分子。天然pro-UK为碱性糖蛋白，含有12对二硫 键，其前体分子含有由20个氨基酸残基组成的疏水信号肽。pro-UK等电点为8.9-9.05，比活 性一般认为是1-1.3×105IU/mg，测定方法主要有溶解圈法(徐康森等，.尿激酶质量标准的研 究.药检工作通讯，1979；9：241；高丽华等，尿激酶原测定方法的改进及对CL-11G细胞表达尿 激酶原水平稳定性的观察.生物技术通讯，1997；8：94)和S2444底物比色法(Winkler M.E.& Blaber M.(1986)Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichea coli.Biochemistry25(5)：4041-14))。Pro-UK与尿激酶具有相同的抗原决定簇， 可与尿激酶抗体反应。
成熟的proUK按其功能分为三个蛋白结构域：表皮生长因子结构域(EGF domain，简称E 区)，环柄结构域(Ktingle domain，简称K区)和蛋白水解酶结构域(protease domain，简称P区)。 E区：由第5-49位氨基酸残基组成，其序列与人表皮生长因子高度同源，富含半胱氨酸，在 氨基酸残基11和19、13和31、33和42间各有一对二硫键，其中12-32位的氨基酸负责与 细胞表面特异性受体结合，特别是Asn22，Asn27，His29，Trp30残基具有不可替代的作用。K区： 由第50-136位氨基酸组成，因其三维结构折叠成一个环柄状结构而得名。有3对二硫键，其 位置分别在50和130、71和113、102和126残基间。纤溶酶原(plasminogen，简称plg)、组 织型纤溶酶原激活剂(简称t-PA)、凝血酶原和脂蛋白α中也存在Kringle区。该区的功能主 要与同纤维蛋白结合有关，通过分析凝血组分中K区域结构与功能，推测该区可能参与蛋白 与蛋白之间的相互作用，但具体功能尚不清楚。P区：由第159-411位氨基酸组成，位于pro-UK 梭基端，该区内共有5对二硫键，构成一个丝氨酸蛋白酶催化中心。其中His204，Asp255，Ser356 构成该酶的活性中心，Asn302为糖基化位点。突变实验表明：Ile159的存在不仅决定双链UK 衍生物的活性，而且也决定单链pro-UK的活性。Lys300对pro-UK的高催化活性具有重要作 用。环柄结构域与蛋白水解酶结构域之间是包括激活位点Lys158-Ile159在内的连接肽段，当 pro-UK在纤溶酶的作用下Lys158-Ile159键的肽链断裂变为双链UK后，靠Cys148-Cys279间的二 硫键的连接形成稳定的二级结构。
Pro-UK基因全长为6387bp，位于第10号染色体上，含有10个内含子，11个外显子，外 显子II主要编码proUK信号肽序列，外显子IV编码表皮生长因子-类结构域，外显子V和VI编 码kringle区，外显子VII-XI编码丝氨酸蛋白酶结构域。Pro-UK基因可转录成2.4kb的成熟 mRNA，初始翻译产物为前pro-UK，含有由20个氨基酸残基组成的信号肽序列，细胞分泌 时将信号肽除去即产生成熟pro-UK。
天然Pro-UK分子为糖蛋白，其糖基化位点在Asn302上。Pro-UK在体内主要受肝细胞膜 上的特异性受体所介导，并在肝细胞溶酶体中被降解，血中半衰期大约8分钟。研究表明， 非糖基化的pro-UK被纤溶酶(plasmin)活化的能力比糖基化pro-UK强，其催化活性也比糖 基化pro-UK强，但非糖基化在血浆中较之糖基化更不稳定，容易降解。目前认为，糖基化影 响酶活性的原因可能是Asn302所处位置与pro-UK被活化的位点(Lys158-Ile159)和酶活性中心 比较接近。
pro-UK属于丝氨酸蛋白酶家族，是纤溶酶原激活剂的一种，其溶栓机理是将没有活性的 纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，纤溶酶具有降解血块中交联纤维蛋白的能力，以溶解血栓。 Pro-UK激活纤溶酶原的过程可概括为三步反应：pro-UK内在酶活性催化少量纤溶酶原变为 纤溶酶；产生的少量的纤溶酶催化pro-UK转变为UK；3)UK催化纤溶酶原产生大量的纤溶 酶。
Pro-UK具有特异的溶血栓作用，它只作用于已被纤维蛋白吸附的纤溶酶原而不作用于血 液循环中游离的纤溶酶原。因此Pro-UK溶栓时不易造成全身纤溶酶原和纤维蛋白原降解和耗 竭，避免系统性出血等副作用发生。Pro-UK本身对纤维蛋白的亲和性很弱，对于其选择性地 溶解纤维蛋白的机制目前还没有一致意见。
尿激酶原已经由基因重组技术制得[Homes et al，1985；Winkler et al，1986；Nolli et al，1989；Nelles et al，1987；李风知等，1991；Satoh et al，1993；Satoh et al，1996；徐杨等，1993； Weaver et al，1994]，在体内外表现出溶解纤维蛋白的作用。自从1986年Collen等(Collen D.，et al.Coronary thrombolysis in patients with acute myocardial infarction by intravenous infusion of synergic thrombolytic agents.Am Heart J.112(5)：1083-4.)首次采用pro-UK溶栓治疗6名心梗病 人以来，已有大量临床试验证实其可以在临床上用于血栓性疾病的治疗。
t-PA也具有特异的溶血栓作用。t-PA由527个氨基酸组成，分子量70,000是一种糖蛋 白，属丝氨酸蛋白酶类。单链的t-PA可被纤溶酶在R275-I276处切开成为双链t-PA。N-端 一段称为重链(或A链)，C端一段称为轻链(或B链)。A链由四个结构域组成：(1)指型区(F 区)：包括残基1-43，与粘连蛋白的指型区同源；(2)表皮生长因子区(EGF区或E区)：包括 残基50-84，与人类表皮生长因子同源；(3)环柄区(Kringle)1：包括残基92-172，与纤溶酶 原中环柄区同源；(4)环柄区(Kringle)2：包括残基180-265。B链与丝氨酸蛋白酶同源，又 称蛋白水解酶区(P区)，其活性中心由H322，D371，S478组成。t-PA对纤维蛋白具有强亲和性， 在纤维蛋白不存在时，t-PA只是很弱的激活剂，但纤维蛋白能显著增加t-PA对纤溶酶原的 活化速率，增加t-PA和纤溶酶原复合物的稳定性，使纤溶酶只在纤维蛋白表面产生，从而特 异溶解血栓中的纤维蛋白。
RGDS序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)和KGD(赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序 列，是存在于一类天然物质(去整合素)上的寡肽序列，通过该特异性位点可以特异性地和 抑制血小板上GP IIb/IIIa受体结合，GP IIb/IIIa是活化的血小板膜上的糖蛋白，是介导血小 板引起的血栓形成中的核心分子。因此，RGDS和KGDW寡肽可以抑制血小板功能，抑制 血栓形成。实验证明含有RGDS和KGDW序列的天然和人工合成寡肽能够显著抑制血小板 的聚集反应。(Ruoslahiti E，et al.New perspective in cell adhesion，RGD and integrins.Science， 1987，154：367-382；Scarborough RM，et al.Barbouri：a GP IIb-IIIa-specific integrin antagonist from the venom of Sistrurus m.Barbouri.J.Biol.Chem.1991，266，15，9359-9362.)
尽管尿激酶原和t-PA是具有纤维蛋白专一性的溶栓剂，溶栓效果较好而出血副作用较小， 但在医药生产与临床治疗中，研制活性更高、安全性更大、靶向性更好、再梗率更低、体内 半衰期更长的溶栓药物，将是长期而持久的课题。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明旨在提供一种新的、高活性、高溶栓特异性且兼有血小板聚集抑制作用的尿激酶 原的改构体。
发明内容
本发明还进一步包括含有上述该尿激酶原改构体或改构体衍生物的药用组合物，该药用 组合物由上述该尿激酶原改构体或改构体衍生物与适于药用的载体相混合而成。这一药用组 合物可以用于溶解人和动物的血栓，在临床上用于血栓性疾病的治疗，如心肌梗死、脑梗死、 视网膜血管栓塞、下肢静脉栓塞、肺栓塞等。
本发明另外又包括一种DNA分子，例如，一种重组DNA分子，该分子编码上述的尿激 酶原改构体或改构体衍生物，或者针对不同表达体系的偏爱密码子，根据该尿激酶原改构体 或改构体衍生物的氨基酸序列而设计的重组DNA分子。本发明还包括含有上述DNA分子的 重组载体，以及用上述的载体转化的细胞。该载体和宿主细胞可以是任何通用的和已经商品 化的表达载体和宿主细胞，既可以是原核表达系统，如大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系 统等的表达载体和宿主细胞，也可以是真核表达系统，如酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达 系统和哺乳动物细胞表达系统等的表达载体和宿主细胞(萨姆布鲁斯(Sambrool，J.)等著， 黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8：1605)。
本发明还包括一种制备本文中描述的尿激酶原改构体或改构体衍生物的方法，该方法包 括将编码一种改构型尿激酶原的DNA分子转化一种细胞，培养该细胞，以及表达该改构体， 并分离该改构体(蛋白)。
有益效果
这些新分子形成的化合物，以前从未在自然界中发现过，这是本发明的目的所在。这些 尿激酶原改构体具有特异的血栓溶解作用，可有效地替代尿激酶原。试验表明它们和尿激酶 原相比，具有更高的纤溶活性，更好的溶栓特异性，另外，还兼有抗血小板聚集的作用。因 此，在临床使用时，可以减少用药量，减少出血和再梗塞等副作用发生。
附图说明
尿激酶原改构体M2的结构示意图
具体实施方式
以下结合实施例具体对本发明进行具体说明。
实施例1
尿激酶原改构体M2基因的构建(核苷酸和氨基酸序列分别见序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)
1.t-PA K2区构建
根据文献(Pennica，D.，et al.Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E.coli.Nature 301(5897)，214-221(1983).)，K2区全序列为：
GTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAG
TCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACAC
AGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGG
AATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGA
CGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCT
分三段合成K2模板：
第一段：
AAGTGGATATCATGTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCAC
AGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTGCCG TGGAATTCCATGAT
上游引物为：5’-GGATATCATGTGCTACTTTGGGAA-3’酶切位点为EcoRV
下游引物为：5’-AAGAATTCCACGGGAGGCAGGA-3’酶切位点为EcoRI
第二段：
TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAAC
CGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCATGCATCCAC
上游引物为：5’-GGAATTCAATGATCCTGATAG-3’酶切位点为EcoRI
下游引物为：5’-TCCGGCAGTAGTTGTGTTTG-3’酶切位点为HpaII
第三段：
TGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGC
CCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACACAACTACTGCCGGAAT
上游引物为：5’-TGCCGGAATCCTGATGGGGAT-3’酶切位点为HpaII
下游引物为：5’-AATGCATGAGGGCACATCACAGT-3’酶切位点为NsiI
分别PCR扩增上述三段序列，扩增产物经回收纯化后，用相应酶进行酶切，酶切产物回 收纯化后连接。连接产物经灭活后，以之为模板用第一条上游引物和第三条下游引物为引物 进行PCR扩增，扩增产物即为t-PA K2区。回收纯化后与pGEM-Teasy载体连接，转化E.coli DH5α。
2.ProUK-P区构建
根据文献报道(Jacobs，P.，et al.Molecular cloning，sequencing，and expression in Escherichia coli of human preprourokinase cDNA.DNA 4(2)，139-146(1985).)，ProUK-P区序列(上下游各 含部分非P区编码序列)为：
GCATGACTGCGCAGATGGAAAAAAGCCCTCCTCTCCTCCAGAAGAATTAAAATTTC
AGTGTGGCCAAAAGACTCTGAGGCCCCGCTTTAAGATTATTGGGGGAGAATTCACC
ACCATCGAGAACCAGCCCTGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTC
TGTCACCTACGTGTGTGGAGGCAGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCA
CACACTGCTTCATTGATTACCCAAAGAAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCT
CAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAGATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATC
CTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCTCACCACAACGACATTGCCTTGCT
GAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCA
TCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACAAGCTGTGAGATCACTG
GCTTTGGAAAAGAGAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAGCTGAAAATGACTG
TTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTACGGCTCTGAA
GTCACCACCAAAATGCTATGTGCTGCTGACCCCCAATGGAAAACAGATTCCTGCCA
GGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACTG
GAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACG
AGAGTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCT
GGCCCTCTGAGGGTCCCCAGGGAGGAAACGGGCACCACCCGCTTTCTTGCTGGTTG
TCATTTTTGCAGTAGAGTCATCTCCATCAGCTGTAAGAAGAGACTGGGAAGATAGGC
TCTGCACAGATGGATTTGCCTGTGGCACCACCAGGGTGAACGACAATAGC
化学合成ProUK-P区编码序列，并在其5’端加上酶切位点为NsiI，3’端加上酶切位点为 XbaI。NsiI/XbaI双酶切，酶切产物回收纯化后与pGEM-Teasy载体连接，转化E.coli DH5α。
3.KGD+RGDS导肽的构建
基因合成含KGD+RGDS序列的双链DNA片断，作为导肽模板：
GAAGCTTCGCGGCGACAGCAAGGGTGACTGGGATATCC
上游、下游酶切位点分别HindIII和EcoRV。
4.M2的构建
用HimdIII和EcoRV双酶切Teasy-KGD+RGDS获得KGD+RGDS区，用EcoRV和NsiI 双酶切Teasy-K2获得K2区，用NsiI和XbaI双酶切Teasy-P获得P区，用HindIII和XbaI双 酶切表达载体pcDNA3.1(+)，回收纯化，酶切产物连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，改 构体M2构建完成。
实施例2
含尿激酶原改构体M2在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
1.t-PA K2区构建：按实施例1的方法进行。
2.ProUK-P区构建：按实施例1的方法进行。
3.Signal+KGD+RGDS导肽区的构建
合成含Signal+KGD+RGDS序列的单链DNA片断，作为导肽模板
GAAGCTTATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCCTGCTTCTCTGCGTCCTGGTCCTGAGCG
ACTCCAAAGGCCGCGGCGACAGCAAGGGTGACTGGGATATCC
上游引物为：5’-GAAGCTTATGAGAGCCCTGCTG-3’酶切位点为HindIII
下游引物为：5’-AGATATCCCAGTCACCCTTGCT-3’酶切位点为EcoRV
PCR扩增产物即为Signal+KGD+RGDS导肽。扩增产物回收纯化后与pGEM-Teasy载体 连接，转化E.coli DH5α。
4.pcDNA-M2质粒的构建
用HindIII和EcoRV双酶切Teasy-Signal+KGD+RGDS获得Signal+KGD+RGDS区，用 EcoRV和NsiI双酶切Teasy-K2获得K2区，用NsiI和XbaI双酶切Teasy-P获得P区，用HindIII 和XbaI双酶切表达载体pcDNA3.1(+)，回收纯化，酶切产物连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，获得pcDNA-M2质粒。
5.pTSL-M2的构建
人工合成dhfr基因全序列
根据GeneBank序列号：NM_010049，查得dhfr基因全序列为：
ATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAG
AACGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGA
CCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACCTGG
TTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGA
GAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTT
AAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAG
GCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTCAGACTCTTTGTGACA
AGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATAT
AAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCA
AGTATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAA
人工合成该序列，并在序列的5’端加入EcoRV酶切位点，3’端加入PstI酶切位点。
以pGL3-enhancer为模板，设计引物，分别合成启动子与polyA序列
引物设计如下：
启动子引物：5’-GGAGCTCTGTCAGTTAGGGTGTGGAAA-3’酶切位点为SacI
5’-GGATATCGCCTCCTCACTACTTCTGGA-3’酶切位点为EcoRV
polyA序列引物：5’-GCTGCAGCGTGTAATTCTAGAGTCGG-3’酶切位点为PstI
5’-GAGATCTTACCACATTTGTAGAGGTTTT-3’酶切位点为BglII
以pEGFP-1为模板，设计引物，合成SV40增强子
增强子引物为：5’-GAGATCTGCTGTGGAATGTGTGTCAG-3’酶切位点为BglIl
5’-GGAGCTCTACAAATGTGGTAAAATCGA-3’酶切位点为SacI
分别PCR扩增合成增强子、启动子与polyA序列，纯化PCR产物，将这三段DNA与dhfr 基因序列分别以相应的酶双酶切，酶切产物回收纯化后，克隆入Teasy载体，经DNA序列测 定与预期相符。将此重组的Teasy载体以BglII酶切，酶切产物回收后与BglII线性化的 pcDNA-M2质粒共同连接，连接产物转化E.coli DH5α，至此，改构体M2的表达载体-- pTSL-M2构建完成。
6.CHO-dhfr-细胞表达改构体M2
利用endo-free质粒大提试剂盒，大量提取高纯度无内毒素的pTSL-M2质粒，以磷酸钙沉 淀转染法稳定转染CHO-dhfr-细胞，用含2×10-8M的氨甲喋呤(MTX)的选择培养基进行dhfr 和MTX双重筛选，获得稳定细胞克隆，根据目的蛋白的活性检测，从细胞克隆中筛选得到高 效表达的CHO细胞。经SDS-PAGE电泳鉴定，该细胞表达的尿激酶原改构体M2的分子量为 48kd左右，其表达水平可达到25pg/cell/d。将该CHO细胞株进行转瓶培养，收获的发酵液经 离子交换色谱、凝胶色谱与亲和色谱法纯化后，低温冻干成蛋白粉，4℃保存。此即为尿激酶 原改构体M2的纯品。
endo-free质粒大提试剂盒购自德国QIAGEN公司，质粒提取方法按照该试剂盒使用说明 进行。磷酸钙沉淀转染方法参照《动物细胞培养---基本技术指南》的方法进行(R.I.弗雷谢 尼著，章静波徐存拴等译，动物细胞培养---基本技术指南(第4版)，北京，科学出版社，2004， 9)。
实施例3
利用昆虫杆状病毒表达系统表达改构体M2
将改构体M2基因克隆入昆虫杆状病毒表达载体pFast-BacHTa中，经脂质体Superfect介 导转染Sf9昆虫细胞，收获培养基上清，通过偶联抗尿激酶原抗体的亲和层析柱亲和层析后， 脱盐浓缩，冻干获得纯化的尿激酶原改构体M2蛋白粉。经SDS-PAGE电泳鉴定，Sf9昆虫细 胞表达的尿激酶原改构体M2的分子量与预期相符。
偶联抗尿激酶原抗体的亲和层析柱由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，转染方 法参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁斯(Sambrool，J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验 指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8)。
实施例4
尿激酶原改构体M2的表达载体的构建、宿主菌株的获得、表达、纯化和鉴定(原核)
将M2基因序列克隆入原核表达载体pKK233-2质粒中，用氯化钙法分别转化至大肠杆菌 JA221后，以IPTG诱导，小规模表达尿激酶原改构体，收集细胞提取物经SDS-PAGE电泳 初步测定表达量，从中筛选表达量高的菌株作为工程菌。经SDS-PAGE电泳鉴定，该工程菌 表达的尿激酶原改构体M2蛋白的分子量大约为46kd。由于目的蛋白在菌体内以无活性的包 含体形式存在，参照文献(Winkler ME & Blaber M，Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichia coli.1986，Biochemistry 15；25(14)：4041-4045.)提供的方法予以体外变复性，从1升培养基中可获得300000单位的 活性尿激酶原改构体M2。
表达载体的构建、宿主菌株的获得与蛋白表达等方法参照《分子克隆实验指南》(萨姆布 鲁斯(Sambrool，J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社， 2002，8)。
实施例5
尿激酶原改构体M2的溶栓活性和尿激酶原的溶栓活性的对比例
纤维蛋白平板法：
参照2005版中国药典尿激酶活性测定方法，先用0.1mol/LPBS(pH7.4)配制1.4％琼脂糖， 水浴煮溶，取11ml与11ml37℃预热的牛纤维蛋白原(2mg/ml)与0.45ml(10u/ml)，37℃预热的 牛凝血酶混合，倒入24孔板盖上，凝后打孔，孔径3mm，分别加入10μl/孔径尿激酶标准品 (5U，10U，20U，40U共四孔)与待测样品，37℃6-18h。根据绘制的标准曲线，计算待测样品 的活性。
气泡法测定参照2005版中国药典尿激酶活性测定方法。
根据纤维平板法与气泡法测得尿激酶原改构体M2蛋白的体外纤溶活性为2000IU/106细 胞，而同时处理的尿激酶原的体外纤溶活性为1000IU/106细胞。
实施例6
尿激酶原改构体M2血小板聚集抑制实验
具体试验操作根据文献(Jia LG，et al.，Function of disintegrin-like/cysteine-rich domains of atrolysin A.Inhibition of platelet aggregation by recombinant protein and peptide antagonists.J Biol Chem.1997，16；272(20)：13094-102)进行，诱导剂ADP的浓度为5mmol/L，样品对血小板 聚集的抑制率＝(溶剂对照最大聚集率-样品最大聚集率)/溶剂最大聚集率×100％。抗血小板 聚集试验表明，尿激酶原改构体M2蛋白抑制50％血小板聚集的半抑制常数IC50为11.2μmol/L， 而天然尿激酶原几乎没有血小板聚集抑制性。可见尿激酶原改构体M2蛋白与天然尿激酶原相 比，具有明显的血小板聚集抑制性。
实施例7
含尿激酶原改构体M2的药物组合物及其治疗血栓性疾病的用途
将实施例2中获得的CHO细胞株表达的尿激酶原改构体M2经离子交换色谱、凝胶色谱 与亲和色谱法纯化，将纯化产物加入保护剂、赋形剂后冻干成蛋白粉，制成粉针剂，4℃低温 保存。
1.重组人尿激酶原改构体M2对小型猪冠脉内血栓的溶解作用
将中国试验小型猪直接用电刺激冠状动脉造成动脉内膜损伤，逐渐形成冠脉内血栓。用 不同剂量重组人尿激酶原改构体M2进行溶栓治疗，用冠状动脉病理切片分析溶栓效果，测定 心外膜电图、血清生化学肌酸激酶、出血和凝血时间、纤溶酶原等指标观察溶栓作用。结果 发现，重组人尿激酶原改构体M240000IU/kg、80000IU/kg、160000IU/kg三个剂量组与对照 组相比均能明显缩小冠脉血栓横切面积，减轻心肌缺血程度和范围，缩小梗塞区。同时与重 组人组织型纤溶酶原激活剂和重组人尿激酶原进行了比较，结果显示：相同剂量(80000IU/kg) 的三种药物对冠脉血栓的溶解作用、对心肌缺血和心肌梗塞及相关生化指标的改善效果相似， 但重组人尿激酶原改构体M2的出血副作用明显低于重组人组织型纤溶酶原激活剂，且起效更 快，同时重组人尿激酶原改构体M2的作用随剂量增加而增强。
2.重组人尿激酶原改构体M2对金黄地鼠肺栓塞和静脉血栓的溶解作用
在金黄地鼠肺栓塞动物模型中，将受试动物分成7组，每组10只。于栓子注入体内形成 肺栓塞后10min开始给药，采用先静脉推注总剂量的10％(体积0.1ml，推注时间1min)，剩 余90％静脉恒速输注(体积0.9ml，输注时间为1h)。对照组给予生理盐水，受试药3个剂量 组给予注射用重组人尿激酶原改构体M2，剂量分别为1、3、8×104IU/kg，3个阳性药对照 组分别给予注射用尿激酶(UK)、注射用重组人尿激酶原、重组组织型纤溶酶原激活剂，相应 的剂量分别为8×104、8×104IU/kg和1mg/kg。上述各组每只动物给药总体积均为1ml。120min 处死动物。试验结束后取心、肺测量残余血凝块放射性，按下式计算溶栓百分数：
并同时取甲状腺、肝、肾、尿液、血液、肌肉等组织测定其放射性，计算回收率。以溶解率 超过50％作为溶栓治疗有效之标准来判断各剂量组有效率。
在金黄地鼠静脉血栓模型中，将动物按体重随即分为7组，每组10只。松开结扎线30min(即 血栓形成60min)，经对侧颈外静脉开始给药，采用先静脉推注总剂量的10％(体积0.1ml，推 注时间1min)，剩余90％静脉恒速输注(体积0.9ml，输注时间为2h)。对照组给予生理盐水， 受试药3个剂量组给予重组人尿激酶原改构体M2，剂量分别为1、3、8×104IU/kg，3个阳 性药对照组分别给予注射用尿激酶(UK)、注射用重组人尿激酶原、重组组织型纤溶酶原激活 剂，相应的剂量分别为8×104、8×104IU/kg和1mg/kg。上述各组每只动物给药总体积均为 1ml。180min处死动物。溶栓百分数的计算方法同肺栓塞模型。
结果发现重组人尿激酶原改构体的溶栓作用与尿激酶原、tPA相当，但溶栓速度较尿激酶 原与tPA快。
3.重组人尿激酶原改构体M2对栓塞性脑卒中的治疗作用
采用颈内动脉注射自体全血凝块形成家兔和大鼠栓塞性脑卒中模型，应用放射性同位素 (99mTc)体外动态示踪技术和核磁共振影象方法，发现在家兔栓塞性脑卒中模型上，静脉给予 注射用重组人尿激酶原改构体M22.0、4.0、8.0×104IU/kg，能产生渐进性显著的溶栓作用， 其ED50为3.2×104IU/kg。重组人尿激酶原改构体M2(8×104IU/kg)溶栓速度较尿激酶、重 组组织型纤溶酶原激活剂(1mg/kg)快，溶栓效力亦更强，与重组人尿激酶原作用相当。重组 人尿激酶原改构体M2溶栓治疗过程中，脑出血程度和范围较尿激酶、重组组织型纤溶酶原激 活剂、重组人尿激酶原轻。
在大鼠栓塞性脑卒中模型上，静脉给予注射用重组人尿激酶原改构体M24、8、 16×104IU/kg，动物行为障碍明显改善，核磁共振检测显示脑病变体积和范围明显缩小，TTC 染色表明脑梗死体积和范围也明显缩小，常规组织病理学检查发现脑组织损伤严重程度有所 改善，未见明显脑出血。重组人尿激酶原改构体M2(8×104IU/kg)溶栓治疗后对脑组织的保 护作用效力与等剂量的尿激酶、重组人尿激酶原和重组组织型纤溶酶原激活剂(2mg/kg)相当， 但脑出血副反应较尿激酶和重组组织型纤溶酶原激活剂少。
4.重组人尿激酶原改构体M2对大鼠视网膜中央动脉血栓的溶解作用
采用光化学法引起视网膜中央动脉形成血栓，应用多普勒微循环血流仪测定视网膜相对流 量，发现静脉推注总剂量的10％与随后1小时静脉输注余量90％，重组人尿激酶原改构体(2.0、 4.0、8.0×104IU/kg)能明显溶解血栓，使栓塞的视网膜中央动脉出现再通，再通率分别为60％、 75％、90％，溶栓速度较尿激酶原(8.0×104IU/kg)、尿激酶(8.0×104IU/kg)与重组组织型纤溶 酶原激活剂(2mg/kg)快。
上述模板和引物采用DNA合成仪按说明书进行，序列测定采用自动核酸序列测定仪按说 明书进行。pGEM-Teasy载体、pGL3-enhancer质粒、pKK233-2质粒、菌株E.coli DH5α和JA221 购自Promega公司，所用酶和试剂购自Promega公司，pEGFP-1质粒购自Clonetech公司， 脂质体Superfect购自invitrogen公司。酶切和连接反应条件按说明书进行。PCR产物回收纯 化采用购自QIAGEN公司的QIAEX II Gel Extraction Kit试剂盒。PCR反应、电泳、感受态细 胞制备、转化等分子生物学方法采用《分子克隆实验指南》的方法进行(萨姆布鲁斯(Sambrool， J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8)。质粒 提取，采用上海生工试剂盒K192，按照使用说明进行。
核苷酸和氨基酸序列表
SEQ ID NO.1
cgcggcgaca gcaagggtga ctgggatatc atgtgctact ttgggaatgg gtcagcctac 60
cgtggcacgc acagcctcac cgagtcgggt gcctcctgcc tcccgtggaa ttcaatgatc 120
ctgataggca aggtttacac agcacagaac cccagtgccc aggcactggg cctgggcaaa 180
cacaactact gccggaatcc tgatggggat gccaagccct ggtgccacgt gctgaagaac 240
cgcaggctga cgtgggagta ctgtgatgtg ccctcatgca tgcatgactg cgcagatgga 300
aaaaagccct cctctcctcc agaagaatta aaatttcagt gtggccaaaa gactctgagg 360
ccccgcttta agattattgg gggagaattc accaccatcg agaaccagcc ctggtttgcg 420
gccatctaca ggaggcaccg ggggggctct gtcacctacg tgtgtggagg cagcctcatc 480
agcccttgct gggtgatcag cgccacacac tgcttcattg attacccaaa gaaggaggac 540
tacatcgtct acctgggtcg ctcaaggctt aactccaaca cgcaagggga gatgaagttt 600
gaggtggaaa acctcatcct acacaaggac tacagcgctg acacgcttgc tcaccacaac 660
gacattgcct tgctgaagat ccgttccaag gagggcaggt gtgcgcagcc atcccggact 720
atacagacca tctgcctgcc ctcgatgtat aacgatcccc agtttggcac aagctgtgag 780
atcactggct ttgg aaaga gaattctacc gactatctct atccggagca gctgaaaatg 840
actgttgtga agctgatttc ccaccgggag tgtcagcagc cccactacta cggctctgaa 900
gtcaccacca aaatgctgtg tgctgctgac ccacagtgga aaacagattc ctgccaggga 960
gactcagggg gacccctcgt ctgttccctc caaggccgca tgactttgac tggaattgtg 1020
agctggggcc gtggatgtgc cctgaaggac aagccaggcg tctacacgag agtctcacac 1080
ttcttaccct ggatccgcag tcacaccaag gaagagaatg gcctggccct ctga 1134
SEQ ID NO.2
Arg Gly Asp Ser Lys Gly Asp Trp Asp Ile Met Cys Tyr Phe Gly Asn
1 5 10 15
Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser
20 25 30
Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala
35 40 45
Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys
50 55 60
Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn
65 70 75 80
Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Met His Asp
85 90 95
Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe
100 105 110
Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly
115 120 125
Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg
130 135 140
Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile
145 150 155 160
Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro
165 170 175
Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser
180 185 190
Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His
195 200 205
Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu
210 215 220
Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr
225 230 235 240
Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly
245 250 255
Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr
260 265 270
Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His
275 280 285
Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys
290 295 300
Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly
305 310 315 320
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu
325 330 335
Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro
340 345 350
Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His
355 360 365
Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
370 375
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