1.一种用于治疗与个体基因中的深内含子突变相关的疾病或疾患的组合物，所述组合
物包含工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关
(Cas)(CRISPR-Cas)系统，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)Cas蛋白，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
2.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的疾病或疾患的组合物，所述组合
物包含编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
3.权利要求1或2的组合物，其中与深内含子突变相关的疾病或疾患为：无纤维蛋白原
血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张
症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、先天性糖基化
异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征(Gitelman 
syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)、同型胱
氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II型、多微小轴空病
(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-
Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel syndrome)、斯蒂克
勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔纳综合征(Werner 
syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述深内含子突变是表1中呈现的深内含子突
变。
5.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的眼部疾病或疾患的组合物，所述
组合物包含编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—
CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
6.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的眼部疾病或疾患的组合物，所述
组合物包含工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)Cas蛋白，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
7.权利要求5或6的组合物，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦、视神经萎缩、视网膜
色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher 
syndrome)或X连锁视网膜色素变性。
8.权利要求5-7中任一项的组合物，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子突
变。
9.权利要求5-8中任一项的组合物，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
10.权利要求5-9中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA和第二引导RNA引导序列与
中心体蛋白290kDa(CEP290)基因的深内含子突变的侧翼的靶DNA序列的相反链杂交。
11.权利要求5-10中任一项的组合物，其中所述深内含子突变是c.2991+1655A>G突变。
12.权利要求5-11中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:41、SEQ 
ID NO:45、SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:47的序列的DNA编码。
13.权利要求5-12中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:19、SEQ 
ID NO:50、SEQ ID NO:51、或SEQ ID NO:52的序列的DNA编码。
14.权利要求5-13中任一项的组合物，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:42、SEQ 
ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、或SEQ ID NO:49的序列的DNA编码。
15.权利要求5-14中任一项的组合物，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:20、SEQ 
ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:53、或SEQ ID NO:54的序列的DNA编码。
16.权利要求10-15中任一项的组合物，其中所述CEP290是人CEP290。
17.权利要求10-16中任一项的组合物，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中列出的
序列的深内含子突变。
18.权利要求1-17中任一项的组合物，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪接供体
位点下游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
19.权利要求1-18中任一项的组合物，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪接受体
位点上游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
20.权利要求1-19中任一项的组合物，其中所述深内含子突变在核酸中引入剪接供体
位点或剪接受体位点。
21.权利要求1-20中任一项的组合物，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
22.权利要求21的组合物，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌(treptococcus pyogenes)
Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)
Cas9蛋白或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白。
23.权利要求21或22的组合物，其中对Cas9进行密码子优化以便在真核细胞中表达。
24.权利要求23的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
25.权利要求23或24的组合物，其中所述真核细胞是人类细胞。
26.权利要求1-25中任一项的组合物，其中所述CRISPR-Cas系统进一步包含一个或多
个核定位信号(NLS)。
27.权利要求26的组合物，其中所述Cas蛋白包含一个或多个NLS。
28.权利要求26或27的组合物，其中所述NLS是SV40大T抗原中的C端序列。
29.权利要求28的组合物，其中所述NLS包括序列PKKKRKV(SEQ ID NO:26)或
PKKKRKVEDPKKKRKVD(SEQ ID NO:27)。
30.权利要求1-29中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA与
反式激活cr(tracr)序列融合。
31.权利要求30的组合物，其中所述tracr序列包含由SEQ ID NO:25编码的核苷酸序
列。
32.权利要求2-4和6-31中任一项的组合物，其中在真核细胞中表达编码所述第一引导
RNA、所述第二引导RNA和所述Cas蛋白的核酸。
33.权利要求2-4和6-32中任一项的组合物，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导
RNA和/或所述Cas蛋白的核酸与一个或多个调控元件可操作连接。
34.权利要求33的组合物，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA与RNA聚合酶
III启动子可操作连接。
35.权利要求34的组合物，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6、7SK或H1启动子。
36.权利要求33-35中任一项的组合物，其中编码所述Cas蛋白的核酸与RNA聚合酶II启
动子可操作连接。
37.权利要求36的组合物，其中所述RNA聚合酶II启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期
启动子、源自CMV启动子的最小启动子片段(minCMV启动子)、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、EF1α启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG)启动子、视杆细胞视蛋白启动子、视锥细胞视蛋白启动子、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白基因
(IRBP)启动子。
38.权利要求1、3-5或7-31的组合物，其中所述CRISPR-Cas系统与脂质、阳离子脂质、脂
质体、聚阳离子或增强核酸和/或蛋白质的细胞摄取的药剂复合。
39.权利要求2-4和6-37中任一项的组合物，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导
RNA或所述Cas蛋白中的一者或多者的核酸位于所述系统的相同或不同载体上。
40.权利要求39的组合物，其中所述载体是质粒。
41.权利要求39或40的组合物，其中所述载体与递送系统复合。
42.权利要求41的组合物，其中所述载体与脂质、阳离子脂质、脂质体、聚阳离子或增强
核酸的细胞摄取的药剂复合。
43.权利要求29的组合物，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载
体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
44.权利要求43的组合物，其中所述载体是重组腺病毒载体。
45.权利要求44的组合物，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、
11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型。
46.权利要求44或45的组合物，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒
血清型5的变体。
47.权利要求43的组合物，其中所述载体是重组慢病毒载体。
48.权利要求47的组合物，其中所述重组慢病毒载体源自用水疱性口炎病毒(VSV)、淋
巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的慢病毒。
49.权利要求43的组合物，其中所述载体是rHSV载体。
50.权利要求49的组合物，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
51.权利要求43的组合物，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
52.权利要求51的组合物，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导RNA或所述Cas蛋
白中的一者或多者的核酸的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
53.权利要求52的组合物，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导RNA或所述Cas蛋
白中的一者或多者的核酸的侧翼为两个AAV ITR。
54.权利要求52或权利要求53的组合物，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、
AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR。
55.权利要求52-54中任一项的组合物，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
56.权利要求52-55中任一项的组合物，其中所述载体是自身互补型载体。
57.权利要求43的组合物，其中所述载体被衣壳包裹在病毒颗粒中。
58.权利要求57的组合物，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组腺病毒载体的重组腺
病毒颗粒。
59.权利要求58的组合物，其中所述重组腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、
19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
60.权利要求58或59的组合物，其中所述重组腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺
病毒血清型5衣壳的变体。
61.权利要求57的组合物，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组慢病毒载体的重组慢
病毒颗粒。
62.权利要求61的组合物，其中所述重组慢病毒颗粒包含用水疱性口炎病毒(VSV)、淋
巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的衣壳。
63.权利要求57的组合物，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组HSV载体的重组HSV颗
粒。
64.权利要求63的组合物，其中所述重组HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2病毒颗粒。
65.权利要求57的组合物，其中所述病毒颗粒是包含重组AAV载体的重组AAV病毒颗粒。
66.权利要求65的组合物，其中所述重组AAV病毒颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型
衣壳。
67.权利要求65或66的组合物，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、
AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、嵌合
AAV1/AAV2、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
68.权利要求65-67中任一项的组合物，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同
的AAV血清型。
69.权利要求65-67中任一项的组合物，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同
的AAV血清型。
70.权利要求65-69中任一项的组合物，其中所述重组AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、
AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳。
71.权利要求70的组合物，其中所述AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳
包含酪氨酸突变或乙酰肝素结合突变。
72.权利要求65-71中任一项的组合物，其中所述rAAV载体包含AAV2ITR。
73.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的疾病或疾患的方法，所述方法
包括向所述个体施用治疗有效量的包含工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重
复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的组合物，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)Cas蛋白，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
74.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的疾病或疾患的方法，所述方法
包括向所述个体施用治疗有效量的包含编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回
文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸的组合物，所述系统包
含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
75.权利要求73或74的方法，其中与深内含子突变相关的疾病或疾患为：无纤维蛋白原
血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张
症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、先天性糖基化
异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征(Gitelman 
syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)、同型胱
氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II型、多微小轴空病
(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-
Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel syndrome)、斯蒂克
勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔纳综合征(Werner 
syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
76.权利要求73-75中任一项的方法，其中所述深内含子突变是表1中呈现的深内含子
突变。
77.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的眼部疾病或疾患的方法，所述
方法包括向所述个体施用治疗有效量的包含工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回
文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的组合物，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)Cas蛋白，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
78.一种用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的眼部疾病或疾患的方法，所述
方法包括向所述个体施用治疗有效量的包含编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔
短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸的组合物，所述系
统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与所述深内
含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
79.权利要求77或78的方法，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦、视神经萎缩、视网
膜色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher 
syndrome)或X连锁视网膜色素变性。
80.权利要求77-79中任一项的方法，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子
突变。
81.权利要求73-80中任一项的方法，其中所述个体是哺乳动物。
82.权利要求81的方法，其中所述哺乳动物是人。
83.权利要求77-82中任一项的方法，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
84.权利要求77-83中任一项的方法，其中将所述组合物施用至所述个体的眼睛。
85.权利要求84的方法，其中所述施用是视网膜下或玻璃体内施用。
86.权利要求77-85中任一项的方法，其中所述第一引导RNA和第二引导RNA引导序列与
中心体蛋白290kDa(CEP290)基因的深内含子突变的侧翼的靶DNA序列的相反链杂交。
87.权利要求77-86中任一项的方法，其中所述深内含子突变是c.2991+1655A>G突变。
88.权利要求77-87中任一项的方法，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:41、SEQ 
ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的序列的DNA编码。
89.权利要求77-88中任一项的方法，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:19、SEQ 
ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的DNA编码。
90.权利要求77-89中任一项的方法，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:42、SEQ 
ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的序列的DNA编码。
91.权利要求77-90中任一项的方法，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:20、SEQ 
ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的序列的DNA编码。
92.权利要求86-91中任一项的方法，其中所述CEP290是人CEP290。
93.权利要求86-92中任一项的方法，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中列出的序
列的深内含子突变。
94.权利要求73-93中任一项的方法，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪接供体位
点下游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
95.权利要求73-94中任一项的方法，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪接受体位
点上游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
96.权利要求73-95中任一项的方法，其中所述深内含子突变在核酸中引入剪接供体位
点或剪接受体位点。
97.权利要求73-96中任一项的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
98.权利要求97的方法，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌(treptococcus pyogenes)
Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)
Cas9蛋白或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白。
99.权利要求97或98的方法，其中对Cas9进行密码子优化以便在真核细胞中表达。
100.权利要求99的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
101.权利要求99或100的方法，其中所述真核细胞是人类细胞。
102.权利要求73-101中任一项的方法，其中所述CRISPR-Cas系统进一步包含一个或多
个核定位信号(NLS)。
103.权利要求102的方法，其中所述Cas蛋白包含一个或多个NLS。
104.权利要求102或103的方法，其中所述NLS是SV40大T抗原中的C端序列。
105.权利要求102-104中任一项的组合物，其中所述NLS包括序列PKKKRKV(SEQ ID NO:
26)或PKKKRKVEDPKKKRKVD(SEQ ID NO:27)。
106.权利要求73-105中任一项的方法，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA
与反式激活cr(tracr)序列融合。
107.权利要求106的方法，其中所述tracr序列包含由SEQ ID NO:25编码的核苷酸序
列。
108.权利要求73-107中任一项的方法，其中在真核细胞中表达所述第一引导RNA、所述
第二引导RNA和所述Cas蛋白。
109.权利要求74-76和78-108中任一项的方法，其中编码所述第一引导RNA、所述第二
引导RNA和/或所述Cas蛋白的核酸与一个或多个调控元件可操作连接。
110.权利要求109的方法，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA与RNA聚合酶
III启动子可操作连接。
111.权利要求110的方法，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6、7SK或H1启动子。
112.权利要求109-111中任一项的方法，其中编码所述Cas蛋白的核酸与RNA聚合酶II
启动子可操作连接。
113.权利要求112的方法，其中所述RNA聚合酶II启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期
启动子、源自CMV启动子的最小启动子片段(minCMV启动子)、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、EF1α启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG)启动子、视杆细胞视蛋白启动子、视锥细胞视蛋白启动子、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白基因
(IRBP)启动子。
114.权利要求73、75-77和79-107中任一项的方法，其中所述CRISPR-CAS系统与脂质、
阳离子脂质、脂质体、聚阳离子或增强核酸的细胞摄取的药剂复合。
115.权利要求74-76和78-114中任一项的方法，其中编码所述第一引导RNA、所述第二
引导RNA或所述Cas蛋白中的一者或多者的核酸位于所述系统的相同或不同载体上。
116.权利要求115的方法，其中所述载体是质粒。
117.权利要求115或116的方法，其中所述载体与递送系统复合。
118.权利要求117的方法，其中所述载体与脂质、脂质体、聚阳离子或增强核酸的细胞
摄取的药剂复合。
119.权利要求115的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载
体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
120.权利要求119的方法，其中所述载体是重组腺病毒载体。
121.权利要求120的方法，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、
11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型。
122.权利要求120或121的方法，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病
毒血清型5的变体。
123.权利要求119的方法，其中所述载体是重组慢病毒载体。
124.权利要求123的方法，其中所述重组慢病毒载体源自用水疱性口炎病毒(VSV)、淋
巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的慢病毒。
125.权利要求119的方法，其中所述载体是rHSV载体。
126.权利要求125的方法，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
127.权利要求119的方法，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
128.权利要求127的方法，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导RNA或所述Cas蛋
白中的一者或多者的核酸的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
129.权利要求128的方法，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导RNA或所述Cas蛋
白中的一者或多者的核酸的侧翼为两个AAV ITR。
130.权利要求128或129的方法，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、
AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR。
131.权利要求128-130中任一项的方法，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
132.权利要求127-131中任一项的方法，其中所述载体是自身互补型载体。
133.权利要求119的方法，其中所述载体被衣壳包裹在病毒颗粒中。
134.权利要求133的方法，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹腺病毒载体的重组腺病毒
颗粒。
135.权利要求134的方法，其中所述重组腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、
19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
136.权利要求135的方法，其中所述重组腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒
血清型5衣壳的变体。
137.权利要求133的方法，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组慢病毒载体的重组慢
病毒颗粒。
138.权利要求137的方法，其中所述重组慢病毒颗粒包含用水疱性口炎病毒(VSV)、淋
巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的衣壳。
139.权利要求133的方法，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组HSV载体的重组HSV颗
粒。
140.权利要求139的方法，其中所述重组HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2病毒颗粒。
141.权利要求133的方法，其中所述病毒颗粒是包含重组AAV载体的重组AAV病毒颗粒。
142.权利要求141的方法，其中所述重组AAV病毒颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型
衣壳。
143.权利要求141或142的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、
AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、嵌合
AAV1/AAV2、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
144.权利要求141-143中任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同
的AAV血清型。
145.权利要求141-143中任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同
的AAV血清型。
146.权利要求141-145中任一项的方法，其中所述重组AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、
AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳。
147.权利要求146的方法，其中所述AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳
包含酪氨酸突变或乙酰肝素结合突变。
148.权利要求141-147中任一项的方法，其中所述rAAV载体包含AAV2 ITR。
149.权利要求73-148中任一项的方法，其中所述组合物是药物组合物。
150.权利要求1-72中任一项的组合物用于治疗与个体核酸中的深内含子突变相关的
疾患的用途。
151.权利要求1-72中任一项的组合物在制造用于治疗与个体核酸中的深内含子突变
相关的疾患的药物中的用途。
152.权利要求150或151的用途，其中与深内含子突变相关的疾病或疾患为：无纤维蛋
白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管
扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、先天性糖
基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征(Gitelman 
syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)、同型胱
氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II型、多微小轴空病
(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-
Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel syndrome)、斯蒂克
勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔纳综合征(Werner 
syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
153.权利要求150-152中任一项的用途，其中所述深内含子突变是表1中呈现的深内含
子突变。
154.权利要求150-153中任一项的用途，其中与所述深内含子突变相关的疾病或疾患
是眼部疾病。
155.权利要求154的用途，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦、视神经萎缩、视网膜
色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher 
syndrome)或X连锁视网膜色素变性。
156.权利要求154或155的用途，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子突变。
157.权利要求150-156中任一项的用途，其中所述个体是哺乳动物。
158.权利要求157的用途，其中所述哺乳动物是人。
159.权利要求154-158中任一项的用途，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
160.权利要求154-159中任一项的用途，其中将所述组合物配制为用于施用至所述个
体的眼睛。
161.权利要求160的用途，其中将所述施用安排为视网膜下或玻璃体内施用。
162.权利要求154-161中任一项的用途，其中所述第一引导RNA和第二引导RNA引导序
列与中心体蛋白290kDa(CEP290)基因的深内含子突变的侧翼的靶DNA序列的相反链杂交。
163.权利要求154-162中任一项的用途，其中所述深内含子突变是c.2991+1655A>G突
变。
164.权利要求154-163中任一项的用途，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:41、
SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的序列的DNA编码。
165.权利要求154-164中任一项的用途，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:19、
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的DNA编码。
166.权利要求154-165中任一项的用途，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:42、
SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的序列的DNA编码。
167.权利要求154-166中任一项的用途，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:20、
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的序列的DNA编码。
168.权利要求162-167中任一项的用途，其中所述CEP290是人CEP290。
169.权利要求162-168中任一项的用途，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中列出
的序列的深内含子突变。
170.权利要求150-169中任一项的用途，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪接供
体位点下游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
171.权利要求150-170中任一项的用途，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪接受
体位点上游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
172.权利要求150-171中任一项的用途，其中所述深内含子突变引入剪接供体位点或
剪接受体位点。
173.一种包含权利要求1-72中任一项的组合物的试剂盒。
174.一种用于在权利要求73-149中任一项的方法中使用的试剂盒，其中所述试剂盒包
含权利要求1-73中任一项的组合物。
175.权利要求173或174的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括使用说明书。
176.一种包含病毒载体的病毒颗粒，其中所述病毒载体包含编码工程改造的、非天然
存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核
酸，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与个体核酸
中的深内含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
177.权利要求176的病毒颗粒，其中个体核酸中的所述深内含子突变与下列疾病相关：
无纤维蛋白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调
毛细血管扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、
先天性糖基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征
(Gitelman syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak 
syndrome)、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶
缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II
型、多微小轴空病(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红
斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel 
syndrome)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔
纳综合征(Werner syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
178.权利要求176或177的病毒颗粒，其中个体核酸中的所述深内含子突变是表1中呈
现的深内含子突变。
179.权利要求176-178中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒用于治疗患有下列疾
病的个体：无纤维蛋白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异
常Ia型、先天性糖基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry 
disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特
曼综合征(Gitelman syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s 
ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-
Pudlak syndrome)、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病
(mucupolysaccaridosis)II型、多微小轴空病(multi-minicore disease)、肌营养不良、神
经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-
δ-转氨酶缺乏症、系统性红斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel syndrome)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼
疮、结节性硬化症、维尔纳综合征(Werner syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁
低磷血症。
180.一种包含病毒载体的病毒颗粒，其中所述病毒载体包含编码工程改造的、非天然
存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核
酸，所述系统包含
a)第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与眼部疾病
或疾患相关个体的核酸中的深内含子突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交，和
b)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
其中所述Cas蛋白在位于所述深内含子突变侧翼的位点处切割靶DNA分子，从而切除包
含所述深内含子突变的靶DNA部分。
181.权利要求180的病毒颗粒，其中所述眼部疾病或疾患是莱伯先天性黑朦、视神经萎
缩、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征
(Usher syndrome)或X连锁视网膜色素变性。
182.权利要求180或181的病毒颗粒，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子
突变。
183.权利要求180-182中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒用于治莱伯先天性黑
朦、视神经萎缩、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher syndrome)或X连锁视网膜色素变性。
184.权利要求180-183中任一项的病毒颗粒，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
185.权利要求180-184中任一项的病毒颗粒，其中所述第一引导RNA和第二引导RNA引
导序列与中心体蛋白290kDa(CEP290)核酸的深内含子突变的侧翼的靶DNA序列的相反链杂
交。
186.权利要求180-185中任一项的病毒颗粒，其中所述深内含子突变是c.2991+1655A>
G突变。
187.权利要求180-186中任一项的病毒颗粒，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:
41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的序列的DNA编码。
188.权利要求180-187中任一项的病毒颗粒，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:
19、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的DNA编码。
189.权利要求180-188中任一项的病毒颗粒，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:
42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的序列的DNA编码。
190.权利要求180-189中任一项的病毒颗粒，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:
20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的序列的DNA编码。
191.权利要求185-190中任一项的病毒颗粒，其中所述CEP290是人CEP290。
192.权利要求185-191中任一项的病毒颗粒，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中
列出的序列的深内含子突变。
193.权利要求176-192中任一项的病毒颗粒，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪
接供体位点下游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
194.权利要求176-193中任一项的病毒颗粒，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪
接受体位点上游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
195.权利要求176-194中任一项的病毒颗粒，其中所述深内含子突变在核酸中引入剪
接供体位点或剪接受体位点。
196.权利要求176-195中任一项的病毒颗粒，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
197.权利要求196的病毒颗粒，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌(treptococcus 
pyogenes)Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)
Cas9蛋白或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白。
198.权利要求196或197的病毒颗粒，其中对Cas9进行密码子优化以便在真核细胞中表
达。
199.权利要求198的病毒颗粒，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
200.权利要求198或199的病毒颗粒，其中所述真核细胞是人类细胞。
201.权利要求176-200中任一项的病毒颗粒，其中所述CRISPR-Cas系统进一步包含一
个或多个核定位信号(NLS)。
202.权利要求201的病毒颗粒，其中所述Cas蛋白包含一个或多个NLS。
203.权利要求201或202的病毒颗粒，其中所述NLS是SV40大T抗原中的C端序列。
204.权利要求201-203中任一项的病毒颗粒，其中所述NLS包括序列PKKKRKV(SEQ ID 
NO:26)或PKKKRKVEDPKKKRKVD(SEQ ID NO:27)。
205.权利要求176-204中任一项的病毒颗粒，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引
导RNA与反式激活cr(tracr)序列融合。
206.权利要求205的病毒颗粒，其中所述tracr序列包含由SEQ ID NO:25编码的核苷酸
序列。
207.权利要求176-206中任一项的病毒颗粒，其中在真核细胞中表达所述第一引导
RNA、所述第二引导RNA和所述Cas蛋白。
208.权利要求176-207中任一项的病毒颗粒，其中所述第一引导RNA、所述第二引导RNA
和/或编码所述Cas蛋白的核酸与一个或多个调控元件可操作连接。
209.权利要求208的病毒颗粒，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA与RNA聚
合酶III启动子可操作连接。
210.权利要求209的病毒颗粒，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6、7SK或H1启动子。
211.权利要求208-210中任一项的病毒颗粒，其中编码所述Cas蛋白的核酸与RNA聚合
酶II启动子可操作连接。
212.权利要求211的病毒颗粒，其中所述RNA聚合酶II启动子是巨细胞病毒(CMV)立即
早期启动子、源自CMV启动子的最小启动子片段(minCMV启动子)、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子
(TTR)、TK启动子、四环素应答启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、EF1α启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG)启动子、视杆细胞视蛋白启动子、视锥细胞视蛋白启
动子、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子或光感受器间类视黄醇结合
蛋白基因(IRBP)启动子。
213.权利要求176-212的病毒颗粒，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组
腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
214.权利要求213的病毒颗粒，其中所述载体是重组腺病毒载体。
215.权利要求214的病毒颗粒，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、
19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型。
216.权利要求214或215的病毒颗粒，其中所述重组腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型
2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、
41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
217.权利要求216的病毒颗粒，其中所述重组腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺
病毒血清型5衣壳的变体。
218.权利要求213的病毒颗粒，其中所述载体是重组慢病毒载体。
219.权利要求218的病毒颗粒，其中所述重组慢病毒载体源自用水疱性口炎病毒
(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的慢病毒。
220.权利要求218或219的病毒颗粒，其中所述重组慢病毒颗粒包含用水疱性口炎病毒
(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的衣壳。
221.权利要求213的病毒颗粒，其中所述载体是rHSV载体。
222.权利要求221的病毒颗粒，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
223.权利要求221或222的病毒颗粒，其中所述重组HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2病
毒颗粒。
224.权利要求213的病毒颗粒，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
225.权利要求224的病毒颗粒，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导RNA或所述
Cas蛋白中的一者或多者的核酸的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
226.权利要求225的病毒颗粒，其中编码所述第一引导RNA、所述第二引导RNA或所述
Cas蛋白中的一者或多者的核酸的侧翼为两个AAV ITR。
227.权利要求225或226的病毒颗粒，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、
AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR。
228.权利要求224-227中任一项的病毒颗粒，其中所述AAV ITR是AAV2ITR。
229.权利要求224-228中任一项的病毒颗粒，其中所述载体是自身互补型载体。
230.权利要求224-229中任一项的病毒颗粒，其中所述重组AAV病毒颗粒包含来自进化
枝A-F的AAV血清型衣壳。
231.权利要求224-230中任一项的病毒颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、
AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、嵌合AAV1/AAV2、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
232.权利要求225-231中任一项的病毒颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自
相同的AAV血清型。
233.权利要求225-231中任一项的病毒颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自
不同的AAV血清型。
234.权利要求224-233中任一项的病毒颗粒，其中所述重组AAV病毒颗粒包含AAV1、
AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳。
235.权利要求234的病毒颗粒，其中所述AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10
衣壳包含酪氨酸突变或乙酰肝素结合突变。
236.权利要求224-235中任一项的病毒颗粒，其中所述rAAV载体包含AAV2 ITR。
237.权利要求176-236中任一项的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒在药物制剂中。
238.一种生成与核酸中的深内含子突变相关的眼部疾病的体外模型的方法，所述方法
包括
a)向真核细胞中引入编码CRISPR-Cas系统的核酸，其中所述CRISPR-Cas系统包含
i)靶向所述核酸中的内含子的靶DNA序列的单一引导RNA，
ii)编码Cas蛋白的核苷酸序列，
iii)包含同源定向修复(HDR)模板的单链寡核苷酸，所述模板包含在预期的内含子突
变侧翼的同源臂和原型间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)；和
b)分离包含组入所述核酸中的突变的细胞。
239.权利要求238的方法，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪接供体位点下游约
1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
240.权利要求238或239的方法，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪接受体位点上
游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
241.权利要求238-240中任一项的方法，其中所述深内含子突变在核酸中引入剪接供
体位点或剪接受体位点。
242.权利要求238-241中任一项的方法，其中所述PAM包含突变以避免单链寡核苷酸被
细胞中表达的Cas蛋白切割。
243.权利要求238-242中任一项的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
244.权利要求243的方法，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌(treptococcus pyogenes)
Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)
Cas9蛋白或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白。
245.权利要求243或244的方法，其中对Cas9进行密码子优化以便在真核细胞中表达。
246.权利要求238-245中任一项的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
247.权利要求246的方法，其中所述真核细胞是人类细胞。
248.权利要求238-247中任一项的方法，其中所述真核细胞是眼部细胞。
249.权利要求248的方法，其中所述眼部细胞是视网膜细胞。
250.权利要求238-249中任一项的方法，其中所述CRISPR-Cas系统进一步包含一个或
多个核定位信号(NLS)。
251.权利要求250的方法，其中所述Cas蛋白包含一个或多个NLS。
252.权利要求250或251的方法，其中所述NLS是SV40大T抗原中的C端序列。
253.权利要求250-252中任一项的方法，其中所述NLS包括序列PKKKRKV(SEQ ID NO:
26)或PKKKRKVEDPKKKRKVD(SEQ ID NO:27)。
254.权利要求238-253中任一项的方法，其中所述单一引导RNA与反式激活cr(tracr)
序列融合。
255.权利要求254的方法，其中所述tracr序列包含由SEQ ID NO:25编码的核苷酸序
列。
256.权利要求238-255中任一项的方法，其中所述单一引导RNA和/或编码所述Cas蛋白
的核酸和所述单链寡核苷酸与一个或多个调控元件可操作连接。
257.权利要求256的方法，其中所述单一引导RNA与RNA聚合酶III启动子可操作连接。
258.权利要求257的方法，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6、7SK或H1启动子。
259.权利要求256-258中任一项的方法，其中编码所述Cas蛋白的核酸和/或所述单链
寡核苷酸与RNA聚合酶II启动子可操作连接。
260.权利要求259的方法，其中所述RNA聚合酶II启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期
启动子、源自CMV启动子的最小启动子片段(minCMV启动子)、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、EF1α启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG)启动子、视杆细胞视蛋白启动子、视锥细胞视蛋白启动子、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白基因
(IRBP)启动子。
261.权利要求238-260中任一项的方法，其中编码所述单一引导RNA、所述Cas蛋白或所
述单链寡核苷酸中的一者或多者的核酸位于所述系统的相同或不同载体上。
262.权利要求238-261中任一项的方法，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦、视神经
萎缩、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征
(Usher syndrome)或X连锁视网膜色素变性。
263.权利要求262的方法，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子突变。
264.权利要求262或263的方法，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
265.权利要求262-264中任一项的方法，其中所述单一引导RNA靶向中心体蛋白290kDa
(CEP290)基因的内含子序列。
266.权利要求262-265中任一项的方法，其中所述引入的深内含子突变是c.2991+
1655A>G突变。
267.权利要求262-266中任一项的方法，其中所述单一引导RNA由包含SEQ ID NO:1和
SEQ ID NO:2的序列的DNA编码。
268.权利要求262-267中任一项的方法，其中所述单链寡核苷酸包含SEQ ID NO:3的序
列。
269.权利要求262-268中任一项的方法，其中所述CEP290是人CEP290。
270.权利要求269的方法，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中列出的序列的深内
含子突变。
271.一种用于切割细胞中的靶核酸的方法，包括向所述细胞递送有效量的组合物，所
述组合物包含：
a)编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第
一引导RNA和所述第二引导RNA与突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交；和
b)Cas表达盒，其包含
i)编码Cas蛋白的核苷酸序列，和
ii)第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；
其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA
部分；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述
Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
272.一种治疗与个体核酸中的突变相关的疾病或疾患的方法，其包括向所述个体施用
治疗有效量的组合物，所述组合物包含：
a)编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第
一引导RNA和所述第二引导RNA与突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交；和
b)Cas表达盒，其包含
i)编码Cas蛋白的核苷酸序列，和
ii)第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；
其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA
部分；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述
Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
273.一种治疗与个体核酸中的突变相关的眼部疾病或疾患的方法，其包括向所述个体
施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：
a)编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第
一引导RNA和所述第二引导RNA与突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交；和
b)Cas表达盒，其包含
i)编码Cas蛋白的核苷酸序列，和
ii)第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；
其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA
部分；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述
Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
274.权利要求271-273中任一项的方法，其中所述Cas表达盒进一步包含：
iii)第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白在所述第一和所述第二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而
与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
275.权利要求274的方法，其中所述第一引导RNA与所述第一引导RNA靶位点和所述第
二引导RNA靶位点杂交。
276.权利要求274的方法，其中所述第二引导RNA与所述第一引导RNA靶位点和所述第
二引导RNA靶位点杂交。
277.权利要求274的方法，其中所述第一引导RNA与所述第一引导RNA靶位点杂交，并且
所述第二引导RNA与所述第二引导RNA靶位点杂交。
278.权利要求271-277中任一项的方法，其中Cas表达盒进一步包含与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列可操作连接的多腺苷酸化(polyA)序列。
279.权利要求278的方法，其中所述polyA序列是SV40 polyA序列。
280.权利要求278或279的方法，其中通过所述Cas蛋白切割所述第一或所述第二引导
RNA靶位点中断了编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与所述polyA序列之间的可操作连接。
281.权利要求278-280中任一项的方法，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于
编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与所述polyA序列之间。
282.权利要求271-281中任一项的方法，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与编码一
个或多个核定位信号(NLS)的核苷酸序列可操作连接，使得从所述Cas表达盒表达的所述
Cas蛋白与所述一个或多个NLS框内融合。
283.权利要求282的方法，其中编码所述一个或多个NLS的核苷酸序列位于编码所述
Cas蛋白的核苷酸序列与多腺苷酸化(polyA)序列之间。
284.权利要求283的方法，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于编码所述一个
或多个NLS的核苷酸序列与所述polyA序列之间。
285.权利要求282-284中任一项的方法，其中所述一个或多个NLS包括SV40大T抗原中
的C端序列。
286.权利要求282-285中任一项的方法，其中所述一个或多个NLS包括序列PKKKRKV
(SEQ ID NO:26)或PKKKRKVEDPKKKRKVD(SEQ ID NO:27)。
287.权利要求271-286中任一项的方法，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和/或所
述Cas表达盒与一个或多个调控元件可操作连接。
288.权利要求287的方法，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与启动子可操作连接。
289.权利要求287或288的方法，其中通过所述Cas蛋白切割所述第一或所述第二引导
RNA靶位点中断了所述调控元件与编码所述Cas蛋白的核苷酸序列之间的可操作连接。
290.权利要求288或289的方法，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于启动子
与编码所述Cas蛋白的核苷酸序列之间。
291.权利要求271-273中任一项的方法，其中所述Cas表达盒进一步包含：
iii)第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导
RNA靶位点杂交，并且其中所述第二引导RNA靶位点邻近对Cas蛋白特异的原型间隔序列毗
邻基序(PAM)；
其中通过Cas蛋白切割所述第一引导RNA靶位点中断了所述调控元件与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列之间的可操作连接；
其中通过Cas蛋白切割所述第二引导RNA靶位点中断了编码所述Cas蛋白的核苷酸序列
与所述polyA序列之间的可操作连接；并且
其中在表达所述Cas蛋白和切割所述靶DNA序列后，所述Cas蛋白在所述第一和所述第
二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的
表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
292.权利要求271-273中任一项的方法，其中所述Cas表达盒进一步包含：
iii)第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导
RNA靶位点杂交；
其中所述第一引导RNA靶位点位于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列和与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列可操作连接的启动子之间；
其中所述第二引导RNA靶位点位于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列和与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列可操作连接的polyA序列之间；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一和所述第二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而
与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
293.权利要求288-292中任一项的方法，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA
与RNA聚合酶III启动子可操作连接。
294.权利要求293的方法，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6、7SK或H1启动子。
295.权利要求288-294中任一项的方法，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与RNA聚
合酶II启动子可操作连接。
296.权利要求295的方法，其中所述RNA聚合酶II启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期
启动子、源自CMV启动子的最小启动子片段(minCMV启动子)、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、EF1α启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG)启动子、视杆细胞视蛋白启动子、视锥细胞视蛋白启动子、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白基因
(IRBP)启动子。
297.权利要求272-296中任一项的方法，其中所述突变是深内含子突变。
298.权利要求297的方法，其中个体核酸中的所述深内含子突变与下列疾病相关：无纤
维蛋白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细
血管扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、先天
性糖基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征
(Gitelman syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak 
syndrome)、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶
缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II
型、多微小轴空病(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红
斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel 
syndrome)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔
纳综合征(Werner syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
299.权利要求297或298的方法，其中个体核酸中的所述深内含子突变是表1中呈现的
深内含子突变。
300.权利要求297-299中任一项的方法，其中所述方法用于治疗患有下列疾病的个体：
无纤维蛋白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调
毛细血管扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、
先天性糖基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征
(Gitelman syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak 
syndrome)、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶
缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II
型、多微小轴空病(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红
斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel 
syndrome)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔
纳综合征(Werner syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
301.权利要求272-297中任一项的方法，其中所述疾病或疾患是选自下组各项的眼部
疾病或疾患：莱伯先天性黑朦、视神经萎缩、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher syndrome)和X连锁视网膜色素变性。
302.权利要求301的方法，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
303.权利要求297的方法，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子突变。
304.权利要求272-303中任一项的方法，其中所述个体是哺乳动物。
305.权利要求304的方法，其中所述哺乳动物是人。
306.权利要求273-305中任一项的方法，其中将所述组合物施用至所述个体的眼睛。
307.权利要求306的方法，其中所述施用是视网膜下或玻璃体内施用。
308.权利要求272-307中任一项的方法，其中所述第一和所述第二引导RNA与中心体蛋
白290kDa(CEP290)基因的深内含子突变的侧翼的靶DNA序列的相反链杂交。
309.权利要求308的方法，其中所述深内含子突变是c.2991+1655A>G突变。
310.权利要求272-309中任一项的方法，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:41、
SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的序列的DNA编码。
311.权利要求272-309中任一项的方法，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:19、
SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的DNA编码。
312.权利要求272-311中任一项的方法，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:42、
SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的序列的DNA编码。
313.权利要求272-312中任一项的方法，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:20、
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的序列的DNA编码。
314.权利要求308-313中任一项的方法，其中所述CEP290是人CEP290。
315.权利要求308-314中任一项的方法，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中列出
的序列的深内含子突变。
316.权利要求297-315中任一项的方法，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪接供
体位点下游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
317.权利要求297-316中任一项的方法，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪接受
体位点上游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
318.权利要求297-317中任一项的方法，其中所述深内含子突变在核酸中引入剪接供
体位点或剪接受体位点。
319.权利要求271-318中任一项的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
320.权利要求319的方法，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌(treptococcus pyogenes)
Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)
Cas9蛋白或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白。
321.权利要求319或320的方法，其中对Cas9进行密码子优化以便在真核细胞中表达。
322.权利要求321的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
323.权利要求321或322的方法，其中所述真核细胞是人类细胞。
324.权利要求271-323中任一项的方法，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导RNA
与反式激活cr(tracr)序列融合。
325.权利要求324的方法，其中所述tracr序列包含由SEQ ID NO:25编码的核苷酸序
列。
326.权利要求271-325中任一项的方法，其中在真核细胞中表达所述第一引导RNA、所
述第二引导RNA和所述Cas蛋白。
327.权利要求271-326中任一项的方法，其中所述CRISPR-CAS系统与脂质、阳离子脂
质、脂质体、聚阳离子或增强核酸的细胞摄取的药剂复合。
328.权利要求271-327中任一项的方法，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和所述
Cas表达盒位于相同或不同的载体上。
329.权利要求328的方法，其中所述载体是质粒。
330.权利要求328或329的方法，其中所述载体与递送系统复合。
331.权利要求330的方法，其中所述载体与脂质、脂质体、聚阳离子或增强核酸的细胞
摄取的药剂复合。
332.权利要求328的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载
体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
333.权利要求332的方法，其中所述载体是重组腺病毒载体。
334.权利要求333的方法，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、
11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型。
335.权利要求333或334的方法，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病
毒血清型5的变体。
336.权利要求332的方法，其中所述载体是重组慢病毒载体。
337.权利要求336的方法，其中所述重组慢病毒载体源自用水疱性口炎病毒(VSV)、淋
巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的慢病毒。
338.权利要求332的方法，其中所述载体是rHSV载体。
339.权利要求338的方法，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
340.权利要求332的方法，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
341.权利要求340的方法，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和所述Cas表达盒位于
不同的rAAV载体上。
342.权利要求340或341的方法，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和/或所述Cas表
达盒的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
343.权利要求342的方法，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和/或所述Cas表达盒
的侧翼为两个AAV ITR。
344.权利要求342或343的方法，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、
AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR。
345.权利要求342-344中任一项的方法，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
346.权利要求340-345中任一项的方法，其中所述载体是自身互补型载体。
347.权利要求332的方法，其中所述载体被衣壳包裹在病毒颗粒中。
348.权利要求347的方法，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹腺病毒载体的重组腺病毒
颗粒。
349.权利要求348的方法，其中所述重组腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、
19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
350.权利要求348或349的方法，其中所述重组腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或
腺病毒血清型5衣壳的变体。
351.权利要求347的方法，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组慢病毒载体的重组慢
病毒颗粒。
352.权利要求351的方法，其中所述重组慢病毒颗粒包含用水疱性口炎病毒(VSV)、淋
巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的衣壳。
353.权利要求347的方法，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组HSV载体的重组HSV颗
粒。
354.权利要求353的方法，其中所述重组HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2病毒颗粒。
355.权利要求347的方法，其中所述病毒颗粒是包含重组AAV载体的重组AAV病毒颗粒。
356.权利要求347或355的方法，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸位于第一重组
AAV病毒颗粒的第一rAAV载体上，并且其中所述Cas表达盒位于第二重组AAV病毒颗粒的第
二rAAV载体上。
357.权利要求355或356的方法，其中所述重组AAV病毒颗粒包含来自进化枝A-F的AAV
血清型衣壳。
358.权利要求355-357中任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、
AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、嵌合AAV1/AAV2、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
359.权利要求355-358中任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同
的AAV血清型。
360.权利要求355-358中任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同
的AAV血清型。
361.权利要求355-360中任一项的方法，其中所述重组AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、
AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳。
362.权利要求361的方法，其中所述AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳
包含酪氨酸突变或乙酰肝素结合突变。
363.权利要求355-362中任一项的方法，其中所述rAAV载体包含AAV2 ITR。
364.权利要求272-363中任一项的方法，其中所述组合物是药物组合物。
365.一种用于切割细胞中的靶核酸的组合物，其包含：
a)编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第
一引导RNA和所述第二引导RNA与突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交；和
b)Cas表达盒，其包含
i)编码Cas蛋白的核苷酸序列，和
ii)第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；
其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA
部分；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述
Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
366.一种治疗与个体核酸中的突变相关的疾病或疾患的组合物，所述组合物包含：
a)编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第
一引导RNA和所述第二引导RNA与突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交；和
b)Cas表达盒，其包含
i)编码Cas蛋白的核苷酸序列，和
ii)第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；
其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA
部分；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述
Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
367.一种治疗与个体核酸中的突变相关的眼部疾病或疾患的组合物，所述组合物包
含：
a)编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相
关(Cas)(CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第
一引导RNA和所述第二引导RNA与突变侧翼的靶DNA序列的相反链杂交；和
b)Cas表达盒，其包含
i)编码Cas蛋白的核苷酸序列，和
ii)第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；
其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA
部分；并且
其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述
Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
368.权利要求365-367中任一项的组合物，其中所述Cas表达盒进一步包含：
iii)第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导
RNA靶位点杂交；
其中所述Cas蛋白在所述第一和所述第二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而
与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
369.权利要求368的组合物，其中所述第一引导RNA与所述第一引导RNA靶位点和所述
第二引导RNA靶位点杂交。
370.权利要求368的组合物，其中所述第二引导RNA与所述第一引导RNA靶位点和所述
第二引导RNA靶位点杂交。
371.权利要求368的组合物，其中所述第一引导RNA与所述第一引导RNA靶位点杂交，并
且所述第二引导RNA与所述第二引导RNA靶位点杂交。
372.权利要求365-371中任一项的组合物，其中Cas表达盒进一步包含与编码所述Cas
蛋白的核苷酸序列可操作连接的多腺苷酸化(polyA)序列。
373.权利要求372的组合物，其中所述polyA序列是SV40polyA序列。
374.权利要求372或373的组合物，其中通过所述Cas蛋白切割所述第一或所述第二引
导RNA靶位点中断了编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与所述polyA序列之间的可操作连接。
375.权利要求372-374中任一项的组合物，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位
于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与所述polyA序列之间。
376.权利要求365-375中任一项的组合物，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与编码
一个或多个核定位信号(NLS)的核苷酸序列可操作连接，使得从所述Cas表达盒表达的所述
Cas蛋白与所述一个或多个NLS框内融合。
377.权利要求376的组合物，其中编码所述一个或多个NLS的核苷酸序列位于编码所述
Cas蛋白的核苷酸序列与多腺苷酸化(polyA)序列之间。
378.权利要求377的组合物，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于编码所述一
个或多个NLS的核苷酸序列与所述polyA序列之间。
379.权利要求376-378中任一项的组合物，其中所述一个或多个NLS包括SV40大T抗原
中的C端序列。
380.权利要求376-379中任一项的组合物，其中所述一个或多个NLS包括序列PKKKRKV
(SEQ ID NO:26)或PKKKRKVEDPKKKRKVD(SEQ ID NO:27)。
381.权利要求365-380中任一项的组合物，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和/或
所述Cas表达盒与一个或多个调控元件可操作连接。
382.权利要求381的组合物，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与启动子可操作连
接。
383.权利要求381或382的组合物，其中通过所述Cas蛋白切割所述第一或所述第二引
导RNA靶位点中断了所述调控元件与编码所述Cas蛋白的核苷酸序列之间的可操作连接。
384.权利要求382或383的组合物，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于启动
子与编码所述Cas蛋白的核苷酸序列之间。
385.权利要求365-384中任一项的组合物，其中所述Cas表达盒进一步包含：
iii)第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导
RNA靶位点杂交，并且其中所述第二引导RNA靶位点邻近对Cas蛋白特异的原型间隔序列毗
邻基序(PAM)；
其中通过Cas蛋白切割所述第一引导RNA靶位点中断了所述调控元件与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列之间的可操作连接；
其中通过Cas蛋白切割所述第二引导RNA靶位点中断了编码所述Cas蛋白的核苷酸序列
与所述polyA序列之间的可操作连接；并且
其中在表达所述Cas蛋白和切割所述靶DNA序列后，所述Cas蛋白在所述第一和所述第
二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的
表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
386.权利要求365-367中任一项的组合物，其中所述Cas表达盒进一步包含：
iii)第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导
RNA靶位点杂交；
其中所述第一引导RNA靶位点位于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列和与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列可操作连接的启动子之间；
其中所述第二引导RNA靶位点位于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列和与编码所述Cas蛋
白的核苷酸序列可操作连接的polyA序列之间；并且其中所述Cas蛋白在所述第一和所述第
二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的
表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。
387.权利要求382-386中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导
RNA与RNA聚合酶III启动子可操作连接。
388.权利要求387的组合物，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6、7SK或H1启动子。
389.权利要求382-388中任一项的组合物，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与RNA
聚合酶II启动子可操作连接。
390.权利要求389的组合物，其中所述RNA聚合酶II启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早
期启动子、源自CMV启动子的最小启动子片段(minCMV启动子)、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、EF1α启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG)启动子、视杆细胞视蛋白启动子、视锥细胞视蛋白启动子、β磷酸二酯酶(PDE)启动子、视网膜色素变性(RP1)启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白基
因(IRBP)启动子。
391.权利要求366-390中任一项的组合物，其中所述突变是深内含子突变。
392.权利要求391的组合物，其中个体核酸中的所述深内含子突变与下列疾病相关：无
纤维蛋白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛
细血管扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia型、先
天性糖基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特曼综合征
(Gitelman syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak 
syndrome)、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶
缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病(mucupolysaccaridosis)II
型、多微小轴空病(multi-minicore disease)、肌营养不良、神经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-δ-转氨酶缺乏症、系统性红
斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel 
syndrome)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼疮、结节性硬化症、维尔
纳综合征(Werner syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁低磷血症。
393.权利要求391或392的组合物，其中个体核酸中的所述深内含子突变是表1中呈现
的深内含子突变。
394.权利要求391-393中任一项的组合物，其中组合物方法用于治疗患有下列疾病的
个体：无纤维蛋白原血症、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、常染色体隐性多囊肾病、巴氏综合征(Barth syndrome)、β-地中海贫血、先天性无纤维蛋白原血症、先天性白内障面部畸形神经病综合征、先天性糖基化异常Ia
型、先天性糖基化异常II型、囊性纤维化、二氢蝶啶还原酶缺乏症、法布里病(Fabry 
disease)、家族性血小板疾病并急性髓性白血病倾向、范可尼贫血(Fanconi anemia)、吉特
曼综合征(Gitelman syndrome)、生长激素不敏感、弗里德赖希共济失调(Friedrich’s 
ataxia)、A型血友病、遗传性巨幼细胞性贫血1、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-
Pudlak syndrome)、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、马凡综合征(Marfan syndrome)、甲硫氨酸合成酶缺乏症、甲基丙二酸血症、线粒体三功能蛋白缺乏症、粘多糖病
(mucupolysaccaridosis)II型、多微小轴空病(multi-minicore disease)、肌营养不良、神
经纤维瘤病I型、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、眼白化病I型、鸟氨酸-
δ-转氨酶缺乏症、系统性红斑狼疮倾向、丙酸血症、横纹肌样瘤、施瓦茨-詹姆佩尔二氏综合征(Schwartz-Jampel syndrome)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、系统性红斑狼
疮、结节性硬化症、维尔纳综合征(Werner syndrome)、X-连锁高免疫球蛋白M血症或X连锁
低磷血症。
395.权利要求366-391中任一项的组合物，其中所述疾病或疾患是选自下组各项的眼
部疾病或疾患：莱伯先天性黑朦、视神经萎缩、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher syndrome)和X连锁视网膜色素变性。
396.权利要求395的组合物，其中所述眼部疾病是莱伯先天性黑朦。
397.权利要求391的组合物，其中所述深内含子突变是表2中呈现的深内含子突变。
398.权利要求366-397中任一项的组合物，其中所述个体是哺乳动物。
399.权利要求398的组合物，其中所述哺乳动物是人。
400.权利要求367-399中任一项的组合物，其中所述组合物用于施用至所述个体的眼
睛。
401.权利要求400的组合物，其中所述施用是视网膜下或玻璃体内施用。
402.权利要求367-401中任一项的组合物，其中所述第一和所述第二引导RNA与中心体
蛋白290kDa(CEP290)基因的深内含子突变的侧翼的靶DNA序列的相反链杂交。
403.权利要求402的组合物，其中所述深内含子突变是c.2991+1655A>G突变。
404.权利要求367-403中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:
41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的序列的DNA编码。
405.权利要求367-403中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA由包含SEQ ID NO:
19、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的序列的DNA编码。
406.权利要求367-405中任一项的组合物，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:
42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49的序列的DNA编码。
407.权利要求367-406中任一项的组合物，其中所述第二引导RNA由包含SEQ ID NO:
20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的序列的DNA编码。
408.权利要求402-407中任一项的组合物，其中所述CEP290是人CEP290。
409.权利要求402-408中任一项的组合物，其中所述CEP290包含在SEQ ID NO:23中列
出的序列的深内含子突变。
410.权利要求391-409中任一项的组合物，其中所述深内含子突变位于核酸的5'剪接
供体位点下游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
411.权利要求391-410中任一项的组合物，其中所述深内含子突变位于核酸的3'剪接
受体位点上游约1-10,000个核苷酸、约1-1000个核苷酸或约100-1000个核苷酸处。
412.权利要求365-411中任一项的组合物，其中所述深内含子突变在核酸中引入剪接
供体位点或剪接受体位点。
413.权利要求365-412中任一项的组合物，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
414.权利要求413的组合物，其中所述Cas9蛋白是酿脓链球菌(treptococcus 
pyogenes)Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白、嗜热链球菌
(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)
Cas9蛋白或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9蛋白。
415.权利要求413或414的组合物，其中对Cas9进行密码子优化以便在真核细胞中表
达。
416.权利要求415的组合物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
417.权利要求415或416的组合物，其中所述真核细胞是人类细胞。
418.权利要求365-417中任一项的组合物，其中所述第一引导RNA和/或所述第二引导
RNA与反式激活cr(tracr)序列融合。
419.权利要求418的组合物，其中所述tracr序列包含由SEQ ID NO:25编码的核苷酸序
列。
420.权利要求365-419中任一项的组合物，其中在真核细胞中表达所述第一引导RNA、
所述第二引导RNA和所述Cas蛋白。
421.权利要求365-420中任一项的组合物，其中所述CRISPR-CAS系统与脂质、阳离子脂
质、脂质体、聚阳离子或增强核酸的细胞摄取的药剂复合。
422.权利要求365-421中任一项的组合物，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和所
述Cas表达盒位于相同或不同的载体上。
423.权利要求422的组合物，其中所述载体是质粒。
424.权利要求422或423的组合物，其中所述载体与递送系统复合。
425.权利要求424的组合物，其中所述载体与脂质、脂质体、聚阳离子或增强核酸的细
胞摄取的药剂复合。
426.权利要求422的组合物，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒
载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
427.权利要求426的组合物，其中所述载体是重组腺病毒载体。
428.权利要求427的组合物，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、
3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型。
429.权利要求427或428的组合物，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺
病毒血清型5的变体。
430.权利要求426的组合物，其中所述载体是重组慢病毒载体。
431.权利要求430的组合物，其中所述重组慢病毒载体源自用水疱性口炎病毒(VSV)、
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的慢病毒。
432.权利要求426的组合物，其中所述载体是rHSV载体。
433.权利要求432的组合物，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
434.权利要求426的组合物，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
435.权利要求434的组合物，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和所述Cas表达盒位
于不同的rAAV载体上。
436.权利要求434或435的组合物，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和/或所述Cas
表达盒的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
437.权利要求436的组合物，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸和/或所述Cas表达
盒的侧翼为两个AAV ITR。
438.权利要求436或437的组合物，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、
AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR。
439.权利要求436-438中任一项的组合物，其中所述AAV ITR是AAV2ITR。
440.权利要求436-439中任一项的组合物，其中所述载体是自身互补型载体。
441.权利要求426的组合物，其中所述载体被衣壳包裹在病毒颗粒中。
442.权利要求441的组合物，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹腺病毒载体的重组腺病
毒颗粒。
443.权利要求442的组合物，其中所述重组腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、
6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、绵羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
444.权利要求442或443的组合物，其中所述重组腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳
或腺病毒血清型5衣壳的变体。
445.权利要求442的组合物，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组慢病毒载体的重组
慢病毒颗粒。
446.权利要求445的组合物，其中所述重组慢病毒颗粒包含用水疱性口炎病毒(VSV)、
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病病毒、RD114或其中的变体假型化的衣壳。
447.权利要求442的组合物，其中所述病毒颗粒是用衣壳包裹重组HSV载体的重组HSV
颗粒。
448.权利要求447的组合物，其中所述重组HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2病毒颗粒。
449.权利要求442的组合物，其中所述病毒颗粒是包含重组AAV载体的重组AAV病毒颗
粒。
450.权利要求442或449的组合物，其中编码所述CRISPR-Cas系统的核酸位于第一重组
AAV病毒颗粒的第一rAAV载体上，并且其中所述Cas表达盒位于第二重组AAV病毒颗粒的第
二rAAV载体上。
451.权利要求449或450的组合物，其中所述重组AAV病毒颗粒包含来自进化枝A-F的
AAV血清型衣壳。
452.权利要求449-451中任一项的组合物，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、
AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、嵌合AAV1/AAV2、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
453.权利要求449-452中任一项的组合物，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相
同的AAV血清型。
454.权利要求449-452中任一项的组合物，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不
同的AAV血清型。
455.权利要求449-454中任一项的组合物，其中所述重组AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、
AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣壳。
456.权利要求455的组合物，其中所述AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9和/或AAVrh10衣
壳包含酪氨酸突变或乙酰肝素结合突变。
457.权利要求449-456中任一项的组合物，其中所述rAAV载体包含AAV2ITR。
458.权利要求365-457中任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物。