1.发明所属或直接应用的技术领域

本发明的领域是一种小分子的双链寡聚核苷酸与一种制造基因药物的方法和配方。

2.最为接近的现有技术状况

市场背景

自从2002年11月在广东省开始爆发流行的严重急性呼吸道综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，也称为非典型性肺炎(Atypical pneumonia)，在 短短几个月的时间内，疫情已经波及28个国家和地区，并且已经引起世界各国政府 和人民的高度重视和密切关注。根据世界卫生组织(WHO)的报告，截至2003年6 月26日全世界SARS患者累计为8456人，累计死亡人数为809名。中国是这次 SARS发病最严重的国家，至今大陆患者累计为4884人，累计死亡人数为235名。

SARS流行不但给中国和其它国家人民的身心健康带来了严重灾难，而且还严重 影响发病地区乃至全球的经济发展。一些外国经济学家估计东亚各国和地区为 SARS付出的代价为：中国22亿美元，香港17亿美元，印尼4亿美元，南韩20亿 美元，马来西亚6.6亿美元，菲律宾2.7亿美元，新加坡9.5亿美元，台湾8.2亿美 元，越南1500万，日本11亿美元。估计的未对通货坡膨胀进行调整的损失是106 亿美元。最终亚洲地区的损失大约在500亿美元左右，而全球因SARS遭受的损失 将超过1500亿美元。由于SARS灾难，中国2003年的经济增长率将降低0.1到0.5 个百分点，若疫情持续半年以上，GDP将减少1％。幸运的是，中国上下已充分认识 到了此疾病的严重性和危害性。党和国家主要领导人已将监控SARS的扩散和防治 列为党和政府工作的重点之重点。胡锦涛总书记强调要毫不松懈地加强SARS防治 工作，采取果断措施，依靠科学，控制疫病蔓延。

SARS是由一种新发现的冠状病毒(也称为SARS病毒)引起的严重急性呼吸 道综合症。根据世界卫生组织的最近统计数据，SARS患者的死亡率可能高达10- 15％。目前仍然缺乏治疗SARS的特效药物和预防SARS的疫苗。为了尽快控制 SARS的疫情，中国政府已经调动了大量的人力、物力和财力。例如，中央政府已 经决定投资20亿人民币用来防治SARS和迅速改善中国的疾病监测和医疗保健系 统。同时，中国政府迅速组织了科研攻关，快速研究和开发早期诊断试剂、防治药 物和疫苗，并取得了一定的进展。在短短的几周内，中国国家食品、药品管理局 (即中国的SDA)极快速地批准了两个抗SARS的新药(这两个抗SARS的新药都是 利用基因工程技术合成的干扰素类药物)。由于这两种新药刚刚进入临床试验，其 临床防治效果有待观察。

技术背景

自从世界卫生组织今年3月12日向全球发出SARS警报后，中国、香港、德国、 加拿大、法国、美国、日本、荷兰、英国和新加坡10个国家和地区的13个实验室 对SARS的病因进行了专门的研究，科学家们16日在日内瓦举行的会议上一致确定 变种冠状病毒就是SARS的病原体。世界卫生组织负责SARS研究的首席科学家克 劳斯、施托尔说，病原体的发现“非常重要”，这使科学家能够集中研究病毒，开 发疫苗和新药、或者筛选现有药物。在短短的3-4个月的时间内，对SARS的病因 学、临床特征和流行病学特征的研究就取得了进展。Peiris等在Lancet(2003， 362：9365)上指出SARS与一种新的从未在人类或动物中发现过的冠状病毒相关。 研究人员采用经典的病毒培养法、血清学技术和现代分子基因技术，检测和确定了 香港50例SARS病人的发病原因。相反，那些患有其他呼吸系统疾病的病人中，无 一例病人的呼吸道标本含有冠状病毒的RNA。再者，来自献血者的200份血清标本 中也没有发现抗这种新冠状病毒的抗体。这个结果强有力地支持了亚特兰疾病预防 和控制中心(CDC)和多伦多的研究人员所报告的病因关系推断，他们也从SARS 病人中分离出了一种新的冠状病毒。在顯微镜下，這種病毒的横切面呈現3條恍如 皇冠的剌狀物。「冠状病毒」因而得名。

在SARS这种疾病被确认后的几个月内，来自北京、香港、加拿大和美国的科学 家分别在4月13，16和17日宣告SARS病毒的基因排序已经完成。这一成果已经 显著地用于证断和治疗SARS传染病。在美国数以千计的人已被检测是否感染 SARS传染病。同时，SARS病毒的基因排序已开始被用于此疾病分子机制的研究和 菌苗及药物的研制和筛选。BBC报告说从不同地区病患者取得SARS病毒样本显示 SARS病毒的基因组序列并不完全相同，存在着一定的差异，不同SARS病毒的基 因差异可高达15个硷基。一些文章已报道SARS病毒能够发生突变，这给研发特异 地抗SARS病毒的疫苗带来了困难。

英国《泰晤士报》25日透露，美国生物医药机构在研究非典方面取得了重大成 果，世界上第一种非典特效药可在几个月内就能用于临床治疗。美国国家医疗协会 表示，他们正在对美国俄勒冈州的AVI生物制药公司提供的对抗非典的新药进行分 析论证。初期分析表明，这种新药能够有效杀死引起非典病症的冠状病毒。该制药 机构负责人丹尼斯·布尔格博士也乐观地称，只要权威机构能在接下来的两周内肯 定这种新药疗效的话，他们就会将新药立即投入临床应用，在几个月内把新药送到 各国的非典患者手中。AVI公司介绍说，这种药物的作用原理是通过生化反应，阻 止非典冠状病毒基因的复制繁衍过程，其效果非常明显。具体来说，这种新药使用 了一种名叫“反义疗法”的新技术，能够有效攻击传染性肝炎病毒、西尼罗河病毒 和非典冠状病毒等的核糖核酸基因单链。由于这些病毒在人体内都是依靠核糖核酸 转运自身基因信息来合成蛋白质，因此新药中含有与病毒基因排列相互补的核糖核 酸单链，能阻止上述病毒关键致病部分在人体细胞内进行复制，从而阻止病症的发 生和恶化。

布尔格博士打了一个比方：“大家想象一下有一条拉链，SARS病毒核糖核酸单 链就是这条拉链中的一半，只要我们找到一条能和SARS病毒核糖核酸单链完全吻 合的核糖核酸单链，就能彻底中和病毒的毒性。”此外，基因测试结果表明，该药 物在作用于SARS病毒部分的同时，并不会影响人体细胞内正常核糖核酸转运复制 的过程。

中国科学院上海生命科学研究院院长裴钢16日宣布：经过这个研究院多个研究所的 联合攻关，研究人员成功克隆了SARS病毒中的S、M、N、E及RNA聚合酶、 (3CL)蛋白水解酶等6种主要蛋白基因，并在病毒重要蛋白质基因的表达、分离、纯 化实验中，获得了SARS病毒中E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶三种蛋白的表达 样品，表达样品已进行药物虚拟筛选。

据研究人员介绍：E蛋白是小的包膜相关蛋白，在冠状病毒的自我组装过 程中起至关重要的作用；N蛋白是冠状病毒中一种重要的结构蛋白、含有其它冠状 病毒N蛋白中不存在核转移的信号序列，研究推测SARS病毒在侵入宿主细胞以后 是通过这个核转移信号序列进入到细胞核中，并与宿主DNA整合发挥其生物学作 用；(3CL)蛋白水解酶与SARS病毒的复制密切相关，是抗SARS病毒药物筛选的理 想靶点。

上海生命科学研究院的研究人员说，他们对SARS病毒6种蛋白基因的克隆成功， 和三种蛋白表达样品的获得，对深入开展SARS病毒的生物学功能研究，进一步认 清SARS的可恶面目，为寻找抗SARS的疫苗和药物，具有重大推进作用。

科学家们对于研究发现“非典”病毒基因出现差异并不感到意外，因为“非典”病 毒是一种RNA病毒，它们在进行自我复制时发生的变异通常多于DNA病毒的变 异。然而，这种病毒的变异并没有一些人所估计的那么大。在考察的14种“非典” 病毒中，研究人员发现了129种基因变异，其中16种反复出现。

有科学家指出，这些基因变异可能使研制“非典”病毒疫苗的努力复杂化，耗时 长，就像HIV病毒疫苗的研制一样。但是，沙夫纳博士指出，有理由充满信心。他 说，尽管脊髓灰质炎病毒在世界各地存在基因差异，但是为之研制的疫苗“在全世 界都管用”。可以说，麻疹疫苗也是如此。他认为，“非典”病毒的情况更像脊髓 灰质炎和麻疹病毒，而不是像HIV病毒。

3.发明的目的及要解决的问题

SARS是由一种新发现的冠状病毒(也称为SARS病毒)引起的严重急性呼吸道综 合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，也称为非典型性肺炎(Atypical pneumonia)，在短短几个月的时间内，疫情已经波及31个国家和地区，并且已经引起 世界各国政府和人民的高度重视和密切关注。根据世界卫生组织的最近统计数据， SARS患者的死亡率可能高达10-15％。目前仍然缺乏治疗SARS的特效药物和预防 SARS的疫苗。为了尽快控制SARS的疫情，世界各国调动了大量的人力、物力和 财力。例如，中国中央政府已经决定投资20亿人民币用来防治SARS和迅速改善中 国的疾病监测和医疗保健系统。同时，中国政府也迅速组织了科研攻关，快速研究 和开发早期诊断试剂、防治药物和疫苗，并取得了一定的进展。在短短的几周内， 中国国家食品、药品管理局(即中国的SDA)极快速地批准了两个抗SARS的新药 (这两个抗SARS的新药都是利用基因工程技术合成的干扰素类药物)。由于这两 种新药刚刚进入临床试验，其临床防治效果有待观察。

本发明集RNA干扰技术、人体基因库搜索技术、生物计算机信息技术、脂质体技术 和基因工程技术为一体，来研发和配制一种天然的基因药物。本发明的两个主要目 的在于：

提供实用而系统的方法。这些方法涉及研制抗SARS病毒基因药物的的过程，它们 包括怎样筛选、预测、鉴定、合成、配制和组装一种天然的基因药物，以及怎样治 疗动物和人的SARS病毒性感染的相应方案。其中，特别推荐一种预测和精选高效 的、短小的干扰性双链或单链寡聚核苷酸的简便方法。

描述抗SARS病毒的基因药物的有效成份的配制，特别是19-25个核苷酸长的双链 寡聚核苷酸。siRNA的结构特征含有一个或数个CGG基序的双链寡聚核苷酸。特异 的siRNA分子能与其同源的SARS病毒核酸相互作用，从而抑制相应的RNA分子 的表达，SARS病毒基因的复制和SARS病毒颗粒的形成。

本发明亦详尽地阐述抗SARS病毒基因药物的药效成份，也进一步地提供治疗和预 防非典的方法。非典可通过给予不同剂量和不同型式的本发明所说的一种或数种19- 25核苷酸长的双链寡聚核苷酸，达到治疗和预防的目的。

本发明要解决的问题主要包括基因药物的特异性，高效性和稳定性。本发明的基因 药物是天然存在于活细胞内的siRNA分子，它是一种短小的双链的寡聚核苷酸，具 有极高的特异性和高效性。当多种具有不同功能的siRNA分子与其他的辅助成份组 装成基因药物时，这些基因药物与其他的生物药物相比，能够展现出下述多种优 点：

●全新的设计和研制理论：细胞内存在着一种天然的抗病毒的基因免疫系统。这 一系统中的效应成份可在体外通过生物工程的方法加以放大和增强，然后将其 输回生物体内。它能特异并高效地灭活那些同源的病毒基因。本发明的效应成 份中的序列型式CGG或它们的衍生序列是设计和精选高效的siRNA分子作为 基因药物的重要指标。

●较短的新药研发周期：借助计算机对核酸分子的一级和二级结构的分析和对 SARS病毒基因组学的研究，精选特定的SARS病毒RNA序列中的保守的部分 作为基因药物的靶子，而其同源的序列作为基因药物的活性成份。这一新的研 发战略能够大大地减少用于研究一种药物分子的化学和物理性能的时间，和找 出它在靶分子上的作用位点的时间。

●较低的药物研发成本：研究一个新药和与其靶分子之间的相互作用常常需要高 额的研究经费和大量的研究时间，快速的计算机运算方法和公共的基因数据库 的免费使用，将能明显地降低研发新型的基因药物的成本。

●极高的特异性：本发明能够筛选出特定mRNA序列中的最具潜能的靶片段，用 其同源的siRNA作为基因药物。它们通过经典的Watson-Crick碱基配对的原理 相互识别和作用。再者，选出的片段只被相同基因家属的成员所共有，而与其 它基因家属的成员仅有极少的相似性，从而使药物的特异性得到充分的保证。

●极低的毒副效应：本发明的基因药物中的主要活性成份是一种天然的核酸片 段，它存在于从低等动物到人体的细胞中。由于其高特异性和高效性，使其用 量明显地低于其它的药物。显然，其毒副作用也远远地低于其它的药物。

●较高的稳定性：本发明的siRNA分子是一种双链寡聚核苷酸，能够与一些蛋白 质和其他小分子相互作用，有比其它单链的核酸如cDNA有好得多的稳定性。 它能有效地抵抗核酸酶的降解，易与一些蛋白质形成稳定的复合物。其某些碱 基也易于修饰，用于增强抗核酸酶的性能。

●多种用途：本发明的基因药物是一种不同类型、不同剂量和多种siRNA分子的 混合物。它们能够根据病人的具体情况和疾病的严重程度加以调整，并可制成 不同型式的制剂，用于不同的途经，将会开创为每一病人诊病开药的新时代。

●高效性：能高效地打断相应的mRNA分子并能同时灭活数种不同的致病基因是 本发明基因药物的一个特点，这一方法学上的突破尤其适用于病毒感染的治疗 和预防。

●高抗突变性：根据数学概率论的原理，一个核苷酸的突变在一短小的序列中发 生的可能率必将大大地小于在一段很长的序列中的概率。SARS病毒能发生突 变，这为研发抗SARS病毒的疫苗带来了一定的困难。

4.发明的具体技术方案

从外源性的病毒、细菌和真菌的感染，到内源性的癌症、高血脂症、高血压、老年 痴呆症和其他一些遗传性病症都表明，人体内不正常的基因表达是引起许多疾病的 主要原因。外来SARS病毒基因在人体细胞内的复制和表达，造成了SARS病毒的 大量繁殖，最终导致细胞的死亡和病情的恶化。防治SARS最重要的目的就是着力 去发现各种科学的并行之有效的方法，来阻止这些不正常的基因表达，以便有效地 控制疾病的发展与传播，直至最终完全彻底地杀灭病毒和治愈SARS。

技术水平----国际生物科技前沿

美国《科学》杂志连续两年将有关siRNA的发现评定为2001和2002年的十大科 技成就之一；在2001年RNA干扰技术于纳米电子学之后名列第二，而小RNA在 2002年却勇夺第一。有关siRNA的基础研究和产业开发已排它性地成为世界各国在 生物科技领域抢占的一个最重要的制高点。自从1998年发现RNA干扰(RNAi)这 个现象至今几年内它已经变得很清楚：这个过程的自然功能是一种古老的生物基因 组的系统，它被用来对抗诸如转座子、病毒等可运动的遗传物质的侵犯，调控细胞 内基因表达的时空性，传播性和多样性。RNAi，这种最古老、最多能的细胞水平的 调整系统经过千万年的选择和进化，乃保存在从植物、真菌、昆虫、蛙类、鸟类、 大鼠、小鼠、猴一直到人类的细胞中。这些大自然提呈给人们的证据充分说明了这 个细胞水平的免疫系统的重要。显然，如果通过体外的途经来增强和放大细胞内的 这一基因免疫系统的监控能力，人类就能更有效地去抑制靶细胞中那些外来基因 (SARS病毒基因)的表达。用于治疗那些现有的药物和方法不能治疗的病毒性感 染如SARS，以造福于全人类。

技术特点：

本项目集当今世界上最高新尖的严新生命科技、RNA干扰技术、人体基因库搜索 技术、生物计算机信息技术、脂质体技术和基因工程技术为一体，来研发和配制一 系列的基因药物。这些天然的基因药物与其它的生物药品和现有的基因治疗如“反 义疗法”技术不同，其降解基因产物的效益大约是“反义疗法”的数十倍乃至上百 倍。此外，它有下述诸特点：

·治疗理论新颖，

·治标又治本，

·安全、无毒副效应

·天然的活性成份

·针对性配方

·科技制药、可信可靠

技术内容：

(一)鉴定与疾病有关的mRNA分子

科学家们已经破译了SARS病毒的基因排序和鉴定了关键的功能基因如：RNA指导 的RNA多聚酶，3C-样的蛋白酶，PLP蛋白酶，解旋酶，M，E，S，和N蛋白等。 现有不同SARS病毒株的基因都能在基因库中查到。当这些遗传功能RNA分子被用 作治疗靶位时，与之同源的小片段RNA将是最有效的药物。对这些药物与靶分子之 间能够通过Watson-Crick碱基配对的原理相互识别和作用。这是我们能深入地探讨 药物的作用机制和快速地研制有效的新药的理论基础。

SARS病毒是一种正性单链的RNA分子。其RNA就是一种相当独特的靶点，因为 它不但是具有携带基因信息功用而且能够直接作为mRNA，所以，它是一种双特性 的生物分子。同时，mRNA也是一个从基因到蛋白的重要桥梁，守卫着遗传信息的 正常进行。以RNA为靶点的siRNA基因药物，是mRNA中一小片段的同源性双链 寡聚核苷酸。被设计的每一个双链寡聚核苷酸分子都能与靶向SARS病毒RNA和其 mRNA的特异性区域相互作用，抑制靶向RNA编码的蛋白质的产生。我们设计的 寡聚核苷酸都有潜在的高选择性治疗剂的高效功能。通过对疾病形成早期阶段的干 预，基因药物能够防止致病蛋白的产生，如上述的一些功能蛋白。

本发明所涉及的核酸分子包括但不局限于mRNA分子，它们是：

●编码RNA指导的RNA多聚酶的mRNA，

●编码3C-样的蛋白酶的mRNA，

●编码PLP1/2蛋白酶的mRNA，

●编码解旋酶的mRNA，

●编码N核蛋白的mRNA，

●编码M膜蛋白的mRNA，

●编码S蛋白的mRNA，

●编码E蛋白的mRNA，

●编码TRS的序列，

(二)设计与选择抗SARS病毒的siRNA

虽然siRNA分子能特异地与一个或多个同源的核酸相互作用，具有较高的稳定性和 有效性，但本发明的宗旨主要在于抑制那些基因组的RNA分子的功能，从而能够防 范和治疗SARS病毒性感染。具体方法见本人以前的专利(0114117.1)

本发明所涉及的抗SARS病毒的siRNA分子，它们是：

●抗RNA指导的RNA多聚酶的mRNA的siRNA，

●抗3C-样的蛋白酶的mRNA的siRNA，

●抗PLP1/2蛋白酶的mRNA的siRNA，

●抗解旋酶的mRNA的siRNA，

●抗N核蛋白的mRNA的siRNA，

●抗M膜蛋白的mRNA的siRNA，

●抗S蛋白的mRNA的siRNA，

●抗E蛋白的mRNA的siRNA，

●抗TRS的序列的siRNA。

这些siRNA分子中的绝大多数含有一个或数个CGG基序，CGG基序的位置可处于 siRNA分子中的任何部位如从第负3到第正22核苷酸。具体代表的80个siRNA分 子的核苷酸序列见本专利申请的核苷酸序列部分。SiRNA可以用化学合成法和生物 合成法获得；SiRNA的化学合成法参见我们的另一个发明专利(1)。生物合成法系指 用基因工程的方法将一段能形成siRNA的DNA片断插入一种生物载体如质粒或病 毒，这些含有siRNA的DNA片断的重组质粒或病毒能够在细胞中稳定而长期地表 达相应的siRNA分子。

(三)检查所预测的siRNA分子的特异性

在这部分，有必要搞清楚哪些高保守区域不但被同一基因家族的不同成员所共有， 而且不被其它的基因家族所共享。如一个抗RNA指导的RNA多聚酶的mRNA的 siRNA，它与SARS基因家族的不同成员都有100％的同源性，但与人体基因家族的不 同成员却没有任何同源性，或与人体基因家族的少数成员的同源性不超过75％。对 此，一个分析序列的方法是先将这一序列分成不同的段，而这些不同的段属于不同 的基因家族，它们在进化上，结构上，或功能上是相关的，并保留着它们共有的特 征或型式。现已知道高度保守的DNA序列一定涉及到某一种重要的功能，而这一序 列的型式可用来区别家族的成员和非成员间的差异。结合序列型式的发现运算法和 严格的多序列排列程式，可以提供一种有效的方法来鉴定反映家族间差异的序列和 家族内共有的区域。最后，这种只存在于一种基因内的恒定的序列型式将被用作本 发明中选择基因药物的活性成份的基础。 为了检出同源的DNA序列，可用BLAST和FASTA搜索引擎来检索与它们相匹配 的数据库，如Genebank，Swiss-port EMBL。这些数据库都经过专门的整理和良好的 组织，具有目前所有发表的核苷酸序列，检索非常方便。但至今仍不可能只依靠一 个数据库中的注释来查到同一基因的所有的同源序列。近来最有效的方法是，取出 同一基因家族的某一成员，作为的提问序列，然后开启相应的计算程式，与数据库 中的每一序列加以比较，最终得到所有的同源序列。

(四)检查所预测的siRNA分子对其RNA靶子的可接近性

本发明提出RNA中的高保守序列，特别是干环状结构可用作为一个重要的识别标 志，它不但可以被用来鉴定RNA中一些易接近的靶子序列，也可被用来筛选DNA 基因组中编码RNA干扰序列的小RNA基因。因为RNA干扰序列必须含有一段反 向互补序列，本发明使用现有的计算机软件方法如折叠排序法(FOLDALIGN)和 其它能够预测RNA的干环状结构的特殊计算机软件在SARS病毒基因组信息库中搜 索具有干环状结构的RNA分子片段和SARS病毒各种mRNA的二级结构。此外， 其他多种方法也是有用的，如计算机寻找具有小分子RNA所共有的特怔性的结构， 微阵列测定在基因间和它们的内含子区内的互补序列，和一些调节蛋白的结合序 列。继而，在人体基因组信息库中搜索是否存在着相应的同源性核苷酸的片段是精 选特异的siRNA分子的模板的一个关键的步骤。

(五)检查所预测的siRNA分子的免疫刺激性

现已了解到一些寡聚核苷酸能引起非特异性的免疫刺激，如三个以上的GGGG---核苷 酸序列，这些序列能够引起免疫问题。此外，含有嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶的核苷酸 序列能够非特异性地激活B细胞。所以，在siRNA的设计与选择中，应该避免 这些序列。

(六)修饰所预测的siRNA分子

天然的siRNA分子的末端核苷酸可经化学修饰，改变它们的分子结构和空间取向， 从而在保留天然的siRNA分子的生物学功能的基础上，又获得siRNA分子的更高地 抗RNA核酸酶的能力。这样，修饰过的siRNA分子比天然的siRNA分子有更高的 效益，如在生物体内和细胞内的代谢周期延长。

(七)siRNA分子的双向特异性和协同性

siRNA分子的双向特异性系指一个siRNA分子能够特异的灭活和抑制二个不同的 mRNA分子。SARS病毒含有二条能指导多种蛋白合成的RNA分子和一个领头序 列，SARS病毒这些特征为我们设计多功能的siRNA分子提供了必要的条件。此 外，本发明也联合使用一个以上的siRNA分子(见图5)，使siRNA基因药物抑制 SARS病毒复制，合成和组装的能力大大提高。

(八)基因药物的形态

基因药物可配制成不同的形态，如：水剂、粉剂、油剂、药膏、药片、药丸、 药水、胶剂、雾化剂、皮下包埋块。传统的药效载体、水化物、粉或油状物或其它 形状也许是必需的或希望的。口服药的成份和配制包括粉状物、颗粒状物、微粒子 状、钠粒子状的混合物、水状或非水状的悬浮液，胶囊，药片或微小药丸。此外， 增厚剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散剂或结合剂也许是需要的或要求的。

(九)给药途径

本发明的有效成份或配伍包括21-23个核苷酸长的双链寡聚核苷酸，即21-23nt siRNA，21-23nt RNA，或21-23nt DNA。除了双链寡聚核苷酸外，其它的有关成份 包括药效上接受的载体，或其它常用来增强和促进药物吸收的辅助成份。给药途径 包括但不局限于下述诸种：

(1)外用：包括眼和鼻，

(2)吸入：包括气管内、口腔内、过皮或皮外的乳化剂或雾化剂。

(3)口服

(4)注射或点滴：包括静脉内、动脉内、皮下、腹腔内或肌肉内等。

(5)颅内给药：鞘膜内、脑室内。

(十)基因药物的用法

有关治疗配伍和有关给药次数的研究已有大量的报告，剂量的大小取决于疾病 的严重程度、顺应性和病人的健康状态。治疗过程可从几天到几星期、几月、几年 或直到疾病被治愈或明显缓解，理想的剂量尺度可以通过度量药物在人体内的分布 和积累的情况来决定。专家们通常易于决定理想的剂量。

理想的剂量也许会随着具体不同的双链寡聚核苷酸的相对效能的变化而改变，通常 根据EC50S来估价。因为EC50S在为什么内外的动物模式研究中是一种可靠的指 标，一般来说，siRNA分子的剂量范围为5ng～200mg/kg体重，此剂量可以每天一 次或数次或每周一次或数次、每月一次或数次、每年一次或数次。专家们通常能够 根据测定所给药物在人体内的逗留时间，药物在体液或组织中的浓度来决定给药的 次数和频率。随着成功的治疗后，对病人进行维持治疗以防止疾病的复发也是常常 需要的。此时，一个维持量的双链寡聚核苷酸是必要的，通常剂量范围是5ng～ 200mg/kg体重，此剂量可以每天一次或数次或每周一次或数次、每月一次或数次、 每年一次或数次给予病人。最佳剂量范围是5ug～5mg/kg体重/天。

4.同现有技术相比所具有的优点

1).SARS是由一种新发现的冠状病毒(也称为SARS病毒)引起的严重急性呼吸道 综合症。到目前为止，世界上尚无有效的抗SARS病毒的药物。

2).天然抗病毒小分子物质：siRNA是天然存在于植物、真菌和动物细胞内的小分子 物质，它不但对正常基因调控有重要作用，而且是生命体内天然的抗病毒感染的基 因免疫系统。

3).作用机理比较清楚：大量实验研究表明siRNA是通过与其序列互补的RNA结合 并引起RNA链的断裂，从而抑制相应蛋白质的合成。因此，其作用机理比较清楚。

4).特异性很高：特异性问题是药物研究中最重要的问题之一。目前临床上使用的许 多药物，如抗病毒药物，就是因为缺乏特异性而引起毒性和很多副作用。但是， siRNA只与其序列互补的RNA结合并引起RNA链的断裂，即只作用于它特异的 “靶点”。本研究中，我们设计和合成的siRNA只作用于SARS病毒的RNA，而 对人体细胞的RNA没有影响，因此特异性很高。

5).无明显毒性和副作用：迄今为止，所有体外和体内的研究结果都表明有效剂量 (0.1-10ug/Kg)的siRNA对体外培养的细胞和实验动物没有明显的毒性和副作用，因 此siRNA是一类十分安全的药物。

6).高抗突变性：SARS病毒能够发生突变，这给研发特异地抗SARS病毒的疫苗带 来了困难。而siRNA基因药物却有较高的抗突变性。

7).广泛的应用：siRNA是当今生物医学研究领域最热门的课题之一，从基础研究 到药物开发，都广泛使用siRNA干扰技术。而且，siRNA干扰技术已经成功地运用 于以下方面：

特异而又高效抑制艾滋病病毒的复制和繁殖

特异而又高效抑制乙型肝炎病毒的复制和繁殖

特异而又高效抑制丙型肝炎病毒的复制和繁殖

特异而又高效抑制脊髓灰质炎病毒的复制和繁殖

特异而又高效抑制疱疹病毒的复制和繁殖

抑制肿瘤细胞的生长(抗癌)

8).制药公司的巨额投资：在美国和其它发达国家，已经有许多大制药公司投资巨额 从事siRNA的研究和开发工作。最近，世界上有多个制药公司也正在开展有关 siRNA抗SARS病毒的工作。由此可见siRNA抗SARS病毒基因药物的应用前景。

当然，这同时也反映了该领域竞争性很强。

9).据报道，美国的AVI生物制药公司的初步研究结果表明“反义(anti-sense)” 技术在体外可明显抑制SARS病毒的复制和繁殖，这项研究成果可能很快进入临床 试验。由于“反义(anti-sense)”技术作用的“靶点”也是SARS病毒RNA，这与 我们设计的siRNA很相似。但是，对其它病毒(如艾滋病病毒和肝炎病毒)的研究 结果表明，siRNA干扰技术抗病毒的效果一般都比“反义(anti-sense)”技术强几 十甚至上百倍。此外，我们的对照试验表明，siRNA抗病毒的效果要比反义(anti- sense)技术和多肽封闭病毒受体技术强许多倍。

6.有关说明和附图

共5幅附图和5条附图说明。

图1.RNA-依赖的RNA多聚酶siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。

图2.解旋酶siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。

图3.核蛋白-N siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。

图4.蛋白水解酶siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。

图5蛋白水解酶和核蛋白-N siRNAs对SARS病毒BJ01株的协同抑制或杀灭效应。

7.发明的实施例子及最佳实施方案

病毒株：北京病人肺组织分离的SARS病毒BJ01株的第五代。

将SARS病毒BJ01株用DMEM培养液10被连续稀泽为10-10。将不同稀泽度的病 毒液接种到已长成单层的Vero-E6细胞的96孔培养板内，每孔0.1ml，每个浓度3 孔。同时设正常细胞对照。置37℃，5％CO2培养箱中培养，连续7天每天观察细 胞的形态和数目的变化。试验重复三次，按照REED-MUENCH方法计算SARS病 毒BJ01株的半数感染计量(TCID50)。

用无RNA酶的无菌水将siRNA配置成浓度为：20umol/ml，然后用脂质体技术将 siRNA转染进Vero-E6细胞，脂质体与siRNA之比为1-3ul/l-3ug。转染后6小时， 用半数感染计量的SARS病毒BJ01株对Vero-E6细胞进行攻击。同时设正常细胞、 脂质体、SARS病毒BJ01株和无靶siRNA对照。置37℃，5％CO2培养箱中培养， 连续7天每天观察细胞的形态和数目的变化，试验重复二到三次。结果如下：

实例1RNA-依赖的RNA多聚酶siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效 应。

见图1。SiRNA序列是：CAUCAUCCGG UGAUGCUAC dTdT。

结果表明：抗RNA-依赖的RNA多聚酶的siRNA能够抑制或杀灭大约50％的SARS 病毒。

实例2解旋酶siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。见图2。

SiRNA序列是：UAGUGUAUA CGGCAUGCUC dTdT

抗解旋酶的siRNA能够抑制或杀灭大约70％的SARS病毒。

实例3核蛋白-N siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。见图3。

SiRNA序列是：GUGCGU GCAGACGGUU CGU dAdC

抗核蛋白-N的siRNA能够抑制或杀灭大约95％的SARS病毒。

实例4蛋白水解酶siRNA对SARS病毒BJ01株的抑制或杀灭效应。见图4。

SiRNA序列是：CGU AGUCGCGGUA AUUCAA dTdT

抗蛋白水解酶的siRNA能够抑制或杀灭大约90％的SARS病毒。

实例5蛋白水解酶和核蛋白-N siRNAs对SARS病毒BJ01株的协同抑制或杀灭效 应。见图5。抗核蛋白-N和蛋白水解酶的siRNA的联合使用能够抑制或杀灭100％ 的SARS病毒。

8.参考文献

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9.核苷酸序列

<110>殷勤伟和殷勤业

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<130>01144177.1

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