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凝血酶原时间的测定方法、测定用 试剂及其制造方法

阅读：5发布：2020-11-17

专利汇可以提供凝血酶原时间的测定方法、测定用试剂及其制造方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供可抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动的凝血酶原时间测定用试剂、其制造方法及凝血酶原时间的测定方法。本发明提供含有组织因子和表面活性剂，[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量 (μg)]的值是0.013～0.05μmol/μg的凝血酶原时间测定用试剂；凝血酶原时间测定用试剂的制法，其包括使含有组织因子和表面活性剂，[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量(μg)]的值是0.013～0.05μmol/μg的水溶液冷冻干燥而得到冷冻干燥物的工序；以及凝血酶原时间的测定方法，其包括使至少凝血酶原时间测定用试剂和血液试样接触而得到测定试样的工序及对测定试样的凝血酶原时间进行测定的工序。，下面是凝血酶原时间的测定方法、测定用试剂及其制造方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.凝血酶原时间测定用试剂，其
含有组织因子和表面活性剂，且
式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg，其中
式(I)：[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量(μg)]。
2.权利要求1所述的试剂，其中上述表面活性剂是非离子性表面活性剂。
3.权利要求1所述的试剂，其中上述非离子性表面活性剂是烷基葡萄糖苷型表面活性剂或酰基烷基葡萄糖胺型表面活性剂。
4.权利要求3所述的试剂，其中上述烷基葡萄糖苷型表面活性剂是烷基的碳原子数为6～10的烷基葡萄糖苷化合物。
5.权利要求3所述的试剂，其中上述酰基烷基葡萄糖胺型表面活性剂是烷酰基的碳原子数为7～9的烷酰甲基葡萄糖胺化合物。
6.权利要求1所述的试剂，其中上述组织因子是重组组织因子。
7.权利要求6所述的试剂，其中上述重组组织因子是重组人组织因子。
8.权利要求1所述的试剂，其还含有钙离子。
9.权利要求1所述的试剂，其还含有磷脂。
10.权利要求1所述的试剂，其中上述试剂是冷冻干燥物或上述冷冻干燥物溶解于溶剂的溶液。
11.凝血酶原时间测定用试剂的制造方法，其包括使含有组织因子和表面活性剂、且式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的水溶液冷冻干燥而得到冷冻干燥物的工序，其中式(I)：[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量(μg)]。
12.权利要求11所述的制造方法，其还包括使上述冷冻干燥物溶解于溶剂的工序。
13.权利要求11所述的制造方法，其中上述表面活性剂是非离子性表面活性剂。
14.权利要求11所述的制造方法，其中上述组织因子是重组组织因子。
15.权利要求11所述的制造方法，其还包括将组织因子和表面活性剂混合而得到式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的上述水溶液的工序，其中
式(I)：[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量(μg)]。
16.凝血酶原时间的测定方法，其包括：
(a)使至少权利要求1所述的凝血酶原时间测定用试剂和血液试样接触而得到测定试样的工序、及
(b)对测定试样的凝血酶原时间进行测定的工序。

说明书全文

凝血酶原时间的测定方法、测定用试剂及其制造方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及凝血酶原时间测定用试剂、其制造方法及凝血酶原时间的测定方法。【背景技术】

[0002] 凝血酶原时间测定用试剂，例如，由进行组织因子、磷脂和含表面活性剂的缓冲液的混合、及从得到的混合物的表面活性剂的除去等制造(参照例如，美国专利第2004/086953号说明书)。凝血酶原时间测定用试剂，通常为了保存、输送等而在冷冻干燥状态下保存。另外，冷冻干燥状态的凝血酶原时间测定用试剂在使用时在再溶解于适宜的溶剂的状态下使用。
【发明内容】

[0003] 【发明要解决的技术课题】

[0004] 但是，在含有组织因子的凝血酶原时间测定用试剂中，凝血酶原时间的测定值在所述凝血酶原时间测定用试剂的冷冻干燥前后有变动。

[0005] 本发明提供可抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动的凝血酶原时间测定用试剂、其制造方法及凝血酶原时间的测定方法。

[0006] 【解决课题的技术方案】

[0007] 本发明的一个侧面包括含有组织因子和表面活性剂、且式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的凝血酶原时间测定用试剂，其中式(I)：[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量(μg)]。

[0008] 本发明的别的侧面包括凝血酶原时间测定用试剂的制造方法，其包括使含有组织因子和表面活性剂，式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的水溶液冷冻干燥而得到冷冻干燥物的工序。

[0009] 本发明的另一侧面包括凝血酶原时间的测定方法，其包括(a)将前述的凝血酶原时间测定用试剂和血液试样混合而得到测定试样的工序、及(b)对测定试样的凝血酶原时间进行测定的工序。

[0010] 【发明效果】

[0011] 由本发明可提供可抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动的凝血酶原时间测定用试剂、其制造方法及凝血酶原时间的测定方法。【附图说明】

[0012] 【图1】是说明试剂盒的构成的图。

[0013] 【实施方式】

[0014] 【1.凝血酶原时间测定用试剂】

[0015] 本实施方式涉及的凝血酶原时间测定用试剂(以下，被简称为“试剂”)含有组织因子和表面活性剂。本实施方式涉及的试剂是用于基于现有技术公知的测定原理，测定由组织因子相关的外源性凝固活化机理的凝血酶原时间的试剂。在本实施方式涉及的试剂中，式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg，其中式(I)：[表面活性剂量(μmol)/总蛋白质量(μg)]。

[0016] 在式(I)中，“表面活性剂量(μmol)”是指本实施方式涉及的试剂中的表面活性剂的含量。另外，“总蛋白质量(μg)”是指在本实施方式涉及的试剂中的总蛋白质的含量。再者，总蛋白质是指包括后述的组织因子和来源于组织因子的供给源的动物种的混杂蛋白质。

[0017] 冷冻干燥的前后的凝血酶原时间的测定值的变动被认为是因为以下的机理。以往的试剂通常含组织因子、磷脂、表面活性剂和从所述组织因子的供给源的动物种不可避免地混入的混杂蛋白质。从而，在冷冻干燥前的试剂中，通常，几乎全部表面活性剂与组织因子及混杂蛋白质缔合而形成微团。另外，表面活性剂的一部分不与组织因子及混杂蛋白质缔合，形成仅由表面活性剂构成的微团。但是，当将以往的试剂在冷冻干燥后再溶解于溶剂中时，认为不与组织因子及混杂蛋白质缔合的表面活性剂与磷脂缔合而抑制磷脂的原本的功能的表达。因此，当使用以往的试剂时，在冷冻干燥前后，凝血酶原时间的测定值变动。

[0018] 一方面，在本实施方式涉及的试剂中，对于总蛋白质量调整表面活性剂量至满足式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg。从而认为，在本实施方式涉及的试剂中，由于不与组织因子及混杂蛋白质缔合的表面活性剂的量降低，从而抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动。

[0019] 组织因子是促凝血酶原激酶(也被称为“凝血因子的第III因子”)。作为组织因子，可举出天然来源的组织因子及重组组织因子。在本实施方式涉及的试剂中，优选重组组织因子。这是因为原料的筹备容易，稳定供给及批间的性能的差小，测定结果的再现性优良。

[0020] 作为天然来源的组织因子，例如，可使用由惯用的方法，从各种的动物种的脑、胎盘等单离的组织因子等。作为动物种，例如，可举出人、兔、牛、猴等，但不特别限定，在这些的动物种之中，从更确切测定人的凝血酶原时间的观点来看，优选人。

[0021] 重组组织因子，例如，可由在基因重组生物内表达保持编码期望的动物种的组织因子的cDNA等得到。另外，重组组织因子也可为市售的重组组织因子。在重组组织因子之中，从更确切测定人的凝血酶原时间的观点来看，优选基因重组人组织因子。作为编码组织因子的cDNA，可举出编码人组织因子的cDNA(GenBank登录编号：NM_001993)、编码牛组织因子的cDNA(GenBank登录编号：NM_173878)等，但不特别限定。基因重组生物，例如，通过向宿主导入保持编码组织因子的cDNA的载体等得到。作为载体，例如，可举出杆状病毒载体ABv及BEVS等，但不特别限定。载体可根据宿主适宜选择。作为宿主，例如，可举出蚕虫体、Sf9、Sf21等的昆虫细胞等，但不特别限定。向宿主导入载体可由根据载体的种类的方法进行。载体是病毒载体时，向宿主导入病毒载体可通过向宿主感染从病毒载体得到的重组病毒进行。表达的重组组织因子，例如，可通过进行以下的操作等从基因重组生物取得。首先，破碎基因重组生物而得到破碎液。将得到的破碎液供于离心分离而得到含重组组织因子的级分。接下来，可使得到的级分增溶而得到含重组组织因子的溶液。

[0022] 作为表面活性剂，可举出非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。在这些表面活性剂之中，由于可更确实地抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动，优选非离子表面活性剂。再者，在本说明书中，“表面活性剂”是指后述的磷脂以外的化合物。

[0023] 作为非离子表面活性剂，例如，可举出烷基葡萄糖苷型表面活性剂、酰基烷基葡萄糖胺型表面活性剂、醚型表面活性剂、醚酯型表面活性剂、酯型表面活性剂等，但不特别限定。这些的非离子表面活性剂可单独使用，也可将2种以上混合使用。在这些的非离子表面活性剂之中，从更确实地抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动的观点来看，优选烷基葡萄糖苷型表面活性剂及酰基烷基葡萄糖胺型表面活性剂。

[0024] 作为烷基葡萄糖苷型表面活性剂，例如，可举出烷基的碳原子数为6～10的烷基葡萄糖苷化合物等，但不特别限定。作为烷基的碳原子数为6～10的烷基葡萄糖苷化合物，例如，可举出己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷等，但不特别限定。这些的烷基葡萄糖苷型表面活性剂可单独使用，也可将2种以上混合使用。

[0025] 作为酰基烷基葡萄糖胺型表面活性剂，例如，可举出烷酰基的碳原子数为7～9的烷酰甲基葡萄糖胺化合物等，但不特别限定。作为烷酰基的碳原子数为7～9的烷酰甲基葡萄糖胺化合物，例如，可举出n-庚酰-N-甲基-D-葡萄糖胺、n-辛酰-N-甲基-D-葡萄糖胺、n-壬酰-N-甲基-D-葡萄糖胺、n-癸酰-N-甲基-D-葡萄糖胺等，但不特别限定。这些的酰基烷基葡萄糖胺型表面活性剂可单独使用，也可将2种以上混合使用。

[0026] 在本实施方式涉及的试剂中的组织因子的含量，从确保作为凝固时间测定用试剂的活性的观点来看，优选为4.0×10-5W/V％(0.4μg/mL)以上、更优选为5.0×10-5W/V％(0.5μg/mL)以上，从抑制批间差的观点来看，优选为7.0×10-5W/V％(0.7μg/mL)以下，更优选为6.0×10-5W/V％(0.6μg/mL)以下。

[0027] 在本实施方式涉及的试剂中，式(I)的值，从抑制冷冻干燥前后的凝固时间的变动的观点来看，优选为0.013μmol/μg以上、更优选为0.015μmol/μg以上，从抑制冷冻干燥前后的凝固时间的变动的观点来看，优选为0.05μmol/μg以下，更优选为0.025μmol/μg以下。本实施方式涉及的试剂含有组织因子及表面活性剂至满足式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg。从而，由本实施方式涉及的试剂可抑制在所述试剂的冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动。在本实施方式涉及的试剂中的表面活性剂的含量[μmol]，例如，可由{(组织因子原料中的表面活性剂浓度[W/V％]×10[g/mL])÷表面活性剂分子量[g/mol]}×(凝固时间测定用试剂中的组织因子浓度[μg/mL]/组织因子原料中的组织因子浓度[μg/mL])×凝固时间测定用试剂的容量[mL]÷106求出。另外，在本实施方式涉及的试剂中的总蛋白质的含量可由双金鸡宁酸蛋白质定量法(BCA法)求出。再者，组织因子原料是含在凝固时间测定用试剂的制造中使用的组织因子的原料。组织因子原料，通常，除了组织因子之外，还含有表面活性剂。

[0028] 本实施方式涉及的试剂还含有钙离子。在本实施方式涉及的试剂中的钙离子的量只要是使第VII因子活化，对于使凝固反应进行适宜的量即可。在本实施方式涉及的试剂中的钙离子的量，通常，从抑制血浆中的柠檬酸钠浓度的变动的影响的观点来看，优选为14mM以上、更优选为20mM以上，从确保作为试剂的稳定性的观点来看，优选为30mM以下，更优选为25mM以下。

[0029] 本实施方式涉及的试剂还含有磷脂。磷脂促进血液的凝固反应。磷脂是在分子结构中有磷酸酯部位的脂质。在本实施方式涉及的试剂中，磷脂通常形成有磷脂层的脂质体。磷脂可为天然来源磷脂，也可为合成磷脂。作为天然来源磷脂，例如，可举出来源于兔、牛、猪、鸡、人等的动物、大豆等的植物的磷脂等，但不特别限定。作为来源于动物的磷脂，例如，可举出来源于兔脑、牛脑、卵黄、人胎盘等的磷脂等，但不特别限定。作为磷脂，具体而言，例如，可举出磷脂酰乙醇胺化合物、磷脂酰胆碱化合物、磷脂酰丝氨酸化合物等的甘油磷脂等，但不特别限定。作为磷脂酰乙醇胺化合物，例如，可举出任选有取代基的磷脂酰乙醇胺等，但不特别限定。作为磷脂酰胆碱化合物，例如，可举出任选有取代基的磷脂酰胆碱等，但不特别限定。作为磷脂酰丝氨酸化合物，例如，可举出任选有取代基的磷脂酰丝氨酸等，但不特别限定。作为取代基，例如，可举出碳原子数8～20的酰基等，但不特别限定。作为碳原子数8～20的酰基，例如，可举出月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基等，但不特别限定。这些取代基可在不妨碍血液的凝固反应的范围内适宜选择。

[0030] 作为任选有取代基的磷脂酰胆碱，例如，可举出磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱等的酰基的碳原子数为8～20的二酰基磷脂酰胆碱等，但不特别限定。作为任选有取代基的磷脂酰乙醇胺，例如，可举出磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等的酰基的碳原子数为8～20的二酰基磷脂酰乙醇胺等，但不特别限定。作为任选有取代基的磷脂酰丝氨酸，例如，可举出磷脂酰丝氨酸、二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸等的酰基的碳原子数为8～20的二酰基磷脂酰丝氨酸等，但不特别限定。在这些的磷脂之中，由于有效率地进行血液的凝固反应，优选磷脂酰乙醇胺化合物、磷脂酰胆碱化合物及磷脂酰丝氨酸化合物，更优选二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺及二油酰磷脂酰丝氨酸。这些的磷脂可单独使用，也可将2种以上混合使用。

[0031] 在本实施方式中的磷脂的含量，从确保适宜的正常凝固时间及国际灵敏度指数〔ISI(international sensitivity index)〕的观点来看，优选为5×10-5W/V％(50μg/mL)以上、更优选为1×10-4W/V％(100μg/mL)以上，从确保适宜的正常凝固时间及ISI的观点来看，优选为2.5×10-4W/V％(250μg/mL)以下。再者，正常凝固时间是指正常血浆的凝固时间。

[0032] 在本实施方式涉及的试剂中，组织因子与脂质体的磷脂层缔合。另外，在本实施方式涉及的试剂中，脂质体的磷脂层通常被认为是脂质双层。再者，在本实施方式涉及的试剂中，组织因子通常被认为在贯通磷脂层的状态下与磷脂层缔合。

[0033] 本实施方式涉及的试剂，从稳定保持所述试剂中所含的磷脂、组织因子及钙离子的观点来看，可还含缓冲液。作为缓冲液，例如，可举出4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸〔HEPES〕缓冲液、Tris缓冲液等，但不特别限定。缓冲液的pH只要是对于稳定保持本实施方式涉及的试剂中所含的磷脂、组织因子及钙离子适宜的pH即可。缓冲液的pH，从稳定保持磷脂及组织因子的观点来看，优选为pH7.25以上、更优选为pH7.4以上，从稳定保持磷脂及组织因子的观点来看，优选为pH7.6以下。在缓冲液中的缓冲成分的浓度通常只要在25～75mM等的缓冲作用的活动的范围内即可。

[0034] 本实施方式涉及的试剂可还含助剂。作为助剂，例如，可举出防腐剂、抗氧化剂、赋形剂等，但不特别限定。作为防腐剂，例如，可举出叠氮化钠等，但不特别限定。作为抗氧化剂，例如，可举出丁基羟基苯甲醚等，但不特别限定。作为赋形剂，例如，可举出丙氨酸、蔗糖、甘露糖醇等，但不特别限定。

[0035] 本实施方式涉及的试剂可为冷冻干燥物，也可为冷冻干燥物溶解于溶剂的溶液。

[0036] 再者，本实施方式涉及的试剂可为由2种试剂构成的，也可为由1种试剂构成的。当本实施方式涉及的试剂由2种试剂构成时，所述试剂，例如，可由含组织因子、磷脂和表面活性剂的第1试剂，及含钙离子的第2试剂构成。在第1试剂中，组织因子和磷脂作为组织因子和由磷脂形成的脂质体的聚集体含在所述第1试剂中。

[0037] 本实施方式涉及的试剂可作为封入容器的试剂盒提供。本实施方式涉及的试剂盒的一例示于图1。图1中所示的试剂盒10含本实施方式涉及的放入试剂21的容器22、附带文书31和箱41。试剂21含脂质体200及组织因子210的聚集体101、未图示的表面活性剂和未图示的钙离子。脂质体200由磷脂201构成。在脂质体200的磷脂层202中，在组织因子210贯通的状态下缔合。在本实施方式中，在试剂盒10中，例如，也可含稀释用的水系溶剂、对照血浆等。水系溶剂可从在血液凝固能的临床检查中通常使用的水系溶剂适宜选择。作为水系溶剂，例如，可举出水、生理盐水等，但不特别限定。作为对照血浆，例如，可举出正常血浆等，但不特别限定。附带文书31含使用试剂盒10进行凝血酶原时间的测定的操作顺序等的记载。箱41收容放入试剂21的容器22和附带文书31。再者，图1中所示的试剂盒由1种试剂21构成，但也可为封入2种试剂各自不同的容器的试剂盒。另外，在图1中，磷脂201可为1种磷脂，也可为2种以上的磷脂的混合物。

[0038] 【2.凝血酶原时间测定用试剂的制造方法】

[0039] 本实施方式涉及的凝血酶原时间测定用试剂的制造方法(以下，也被简称为“试剂的制造方法”)包括使含有组织因子和表面活性剂，式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的水溶液冷冻干燥而得到冷冻干燥物的工序(以下，被简称为“工序(A)”)。

[0040] 在工序(A)之前，将组织因子和表面活性剂混合至式(I)的值成0.013～0.05μmol/μg而得到水溶液。组织因子及表面活性剂与在前述的凝血酶原时间测定用试剂中使用的组织因子及表面活性剂同样。组织因子通常作为与缓冲液等的溶剂混合的水溶液使用。水溶液的式(I)的值，从抑制冷冻干燥前后的凝固时间的变动的观点来看，优选为0.013μmol/μg以上、更优选为0.015μmol/μg以上，从抑制冷冻干燥前后的凝固时间的变动的观点来看，优选为0.05μmol/μg以下，更优选为0.025μmol/μg以下。

[0041] 在凝血酶原时间测定用试剂中，通常，含有组织因子和表面活性剂的水溶液含由磷脂构成的脂质体。此时，在工序(A)中，预先，使用磷脂形成有磷脂层的脂质体。具体而言，首先，通过从磷脂-氯仿溶液使氯仿蒸发，使磷脂的薄膜形成。接下来，使得到的磷脂的薄膜在适宜的缓冲液中膨润而使有磷脂双层的脂质体形成。由此，得到含有脂质体的液。在含有脂质体的液中的磷脂的浓度可根据凝血酶原时间测定用试剂的用途适宜设定。在工序(A)中，也可根据需要，对于得到的含有脂质体的液实施挤出机处理而使脂质体的粒径均一化。在挤出机处理中，可使用有对于得到期望的粒径的第1脂质体适宜的孔径的膜。在工序(A)中，接下来，将含组织因子及表面活性剂的混合液和含有脂质体的液混合。由此，得到组织因子及脂质体的聚集体和表面活性剂的混合液。再者，磷脂与在前述的凝血酶原时间测定用试剂中使用的磷脂同样。

[0042] 凝血酶原时间测定用试剂是含钙离子的试剂时，含有组织因子和表面活性剂的水溶液含钙离子。此时，在工序(A)中，对于得到的混合液，还添加钙溶液而得到有期望的钙离子浓度的水溶液。作为钙溶液，例如，可举出氯化钙水溶液等，但不特别限定。在钙溶液中的钙离子的浓度可根据凝血酶原时间测定用试剂的用途等适宜设定。

[0043] 在含有组织因子和表面活性剂的水溶液中，也可根据需要，还添加稳定化剂等。

[0044] 在工序(A)中，其后，通过使水溶液冷冻干燥，得到凝血酶原时间测定用试剂。

[0045] 本实施方式涉及的试剂的制造方法也可还包括将冷冻干燥物溶解于溶剂中的工序。作为溶剂，例如，可举出HEPES缓冲液、Tris盐酸缓冲液、纯化水等，但不特别限定。溶解于溶剂中的冷冻干燥物的量可根据凝血酶原时间测定用试剂的用途等适宜设定。

[0046] 再者，在本实施方式涉及的试剂的制造方法中，将组织因子、磷脂及表面活性剂和钙离子混合而得到1种试剂之后，进行冷冻干燥。但是，也可使含组织因子、磷脂及表面活性剂的第1试剂，和含钙离子的第2试剂分别冷冻干燥。

[0047] 【3.凝血酶原时间的测定方法】

[0048] 本实施方式涉及的凝血酶原时间的测定方法(以下，也被简称为“测定方法”)包括(a)使至少前述的凝血酶原时间测定用试剂和血液试样接触而得到测定试样的工序、及(b)对测定试样的凝血酶原时间进行测定的工序。

[0049] 本实施方式涉及的测定方法，在1个侧面，包括(a1)将凝血酶原时间测定用试剂和血液试样混合而得到测定试样的工序、及(b1)对测定试样的凝血酶原时间进行测定的工序。此时，凝血酶原时间测定用试剂是含有组织因子、表面活性剂、磷脂和钙离子，式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的试剂。

[0050] 另外，本实施方式涉及的测定方法，在另一侧面，包括(a2)将凝血酶原时间测定用试剂和血液试样和钙盐混合而得到测定试样的工序、及(b2)对测定试样的凝血酶原时间进行测定的工序。此时，凝血酶原时间测定用试剂是含有组织因子、表面活性剂和磷脂，式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的试剂。

[0051] 再者，在本说明书中，“测定试样”是指至少血液试样、磷脂、表面活性剂和钙盐混合的混合物。

[0052] 作为血液试样，例如，可举出血液、从血液得到的血浆等，但不特别限定。在本实施方式涉及的测定方法中，作为血液试样，可使用从被检者的血液得到的血浆、对照血浆、它们的混合物等。血浆，例如，由不使血液溶血地供于离心分离而除去血细胞成分等得到。另外，在血液中，也可添加在血液凝固能的临床检查中通常使用的公知的抗凝固剂。作为抗凝固剂，例如，可举出柠檬酸钠等，但不特别限定。在本实施方式涉及的测定方法中，作为对照血浆，可使用正常血浆、精度管理用血浆等。正常血浆可为从健康者的血液得到的血浆，也可为市售的正常血浆。

[0053] 在工序(a)中，使至少凝血酶原时间测定用试剂和血液试样接触。凝血酶原时间测定用试剂和血液试样的接触时的温度只要是对于进行血液的凝固反应适宜的温度即可。接触时的温度优选为25～45℃、更优选为35～38℃。另外，接触时间优选为1～10分钟、更优选为3～5分钟。

[0054] 凝血酶原时间测定用试剂是含有组织因子、表面活性剂、磷脂和钙离子的试剂时，在工序(a)中，与凝血酶原时间测定用试剂和血液试样的接触同时，在工序(b)中，测定测定试样的凝血酶原时间。测定试样的钙离子浓度通常是20～25mM。另外，测定试样的磷脂浓度通常是0.45～0.55mM。

[0055] 一方面，凝血酶原时间测定用试剂是含有组织因子、表面活性剂和磷脂，并且不含有钙离子的试剂时，在工序(a)中，首先，将凝血酶原时间测定用试剂和血液试样混合。接下来，使得到的混合物和钙盐接触。与混合物和钙盐的接触同时，在工序(b)中，测定测定试样的凝血酶原时间。此时，与混合物混合的钙盐的量只要是在测定试样中的钙离子浓度达20～25mM的量即可。

[0056] 再者，在工序(a)之前，只要将血液试样加温到对于进行凝固反应适宜的温度即可。此时，血液试样的加温温度，通常，优选为30～45℃、更优选为36～38℃。

[0057] 测定试样的凝血酶原时间可基于凝固信息研究。作为凝固信息，例如，可举出向测定试样照射光之时的透射光或散射光的变化、测定试样的粘度的变化等，但不特别限定。此时，测定试样的凝血酶原时间可由向测定试样照射光，监测透过测定试样的透射光或来自测定试样的散射光的变化，监测测定试样的粘度的变化等研究。

[0058] 在凝血酶原时间的测定中，使用在一般的凝血酶原时间的测定中使用的测定装置。作为测定装置，例如，可举出具备光学信息检测部的市售的血液凝固测定装置等，但不特别限定。作为测定装置的具体例，可举出Sysmex(株)制的商品名：CS-2000i、商品名：CS-2100i等。
【实施例】

[0059] 在下文中，各略语的含意如下所述。

[0060] <略语>

[0061] DOPE：二油酰磷脂酰乙醇胺

[0062] DOPC：二油酰磷脂酰胆碱

[0063] DOPS：二油酰磷脂酰丝氨酸

[0064] HEPES：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸〔4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid〕

[0065] 【实施例1～5及比较例1～5(1)重组人组织因子的调制】

[0066] 向蚕虫体感染整合了编码人组织因子的cDNA(GenBank登录编号：NM_001993)的重组杆状病毒。从感染起经过7天后，从蚕虫体提取表达蛋白质。表达蛋白质的提取根据以下的顺序进行。首先，将冷冻的蚕虫体在破碎用缓冲液〔组成：150mM 氯化钠、10mM苄脒、1mM氟化苯基甲基磺酰、1mM二硫苏糖醇、1mM乙二胺四醋酸、1mM二醇醚二胺四醋酸及20mMTris盐酸缓冲液(pH7.5)〕中破碎。将得到的破碎物供于100000×g、于4℃离心分离60分钟而回收沉淀级分。通过将沉淀级分使用提取用缓冲液A〔1质量％壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、150mM氯化钠及20mMTris盐酸缓冲液(pH8.0)〕或提取用缓冲液B〔1质量％n-壬酰-N-甲基-D-葡萄糖胺、150mM氯化钠及20mMTris盐酸缓冲液(pH8.0)〕增溶，得到实施例1～5及比较例1～5的组织因子原料液。将得到的组织因子原料液的组织因子浓度由ELISA法确定。另外，将组织因子原料液的总蛋白质浓度由BCA法确定。结果示于表1。

[0067] 将得到的组织因子原料液用缓冲液A〔组成：150mM氯化钠及25mM HEPES缓冲液(pH7.5)〕稀释至组织因子的浓度成50μg/mL，得到实施例1～5及比较例1～5的含有组织因子的液。将得到的含有组织因子的液的组织因子浓度由ELISA法确定。另外，将含有组织因子的液的总蛋白质浓度由BCA法确定。结果示于表1。

[0068] 【表1】

[0069]

[0070] (2)含有脂质体的液的调制

[0071] 将25mg/mL DOPC-氯仿溶液86.8mL、25mg/mL DOPE-氯仿溶液18.6mL和25mg/mL DOPS-氯仿溶液18.6mL在瓶中混合，得到磷脂-氯仿溶液。接下来，一边使放入磷脂-氯仿溶液的茄型瓶在旋转蒸发器中旋转，一边使氯仿蒸发。由此，在茄型瓶的内壁面形成脂质体膜。将得到的脂质体膜用缓冲液A膨润，得到含脂质体的混合物。接下来，将得到的混合物用0.6μm的聚碳酸酯制膜过滤而使脂质体的粒径均一化，得到含有脂质体的液。

[0072] (3)组织因子向合成脂质体的再构成

[0073] 将(2)中得到的含有脂质体的液1550mL添加到缓冲液B〔组成：12.5mM氯化钙、0.1g/L丁基羟基苯甲醚及25mM HEPES缓冲液(pH7.5)〕1240mL中。将得到的混合液于37℃搅拌。确认混合液充分地搅拌之后，向混合液滴下(1)中得到的含有组织因子的液。将得到的混合物于37℃搅拌。在搅拌中，多次采集混合物的一部分。

[0074] 向采集的混合物添加氯化钙至氯化钙浓度成25.0mM，得到凝血酶原时间测定用试剂。接下来，求出在凝血酶原时间测定用试剂中的表面活性剂的含量(表面活性剂量)及在凝血酶原时间测定用试剂中的总蛋白质的含量(总蛋白质量)。表面活性剂量使用含有组织因子的液的组织因子浓度，由{(含有组织因子的液中的表面活性剂浓度[W/V％]×10[g/mL])÷表面活性剂分子量[g/mol]}×(凝血酶原时间测定用试剂中的组织因子浓度[μg/mL]/含有组织因子的液中的组织因子浓度[μg/mL])×凝血酶原时间测定用试剂的容量[mL]÷106求出。总蛋白质量由{含有组织因子的液中的表面活性剂浓度[μg/mL]×(凝血酶原时间测定用试剂中的组织因子浓度[μg/mL]/含有组织因子的液中的组织因子浓度[μg/mL])}×凝血酶原时间测定用试剂的容量[mL]求出。接下来，算出式(I)的值，其中式(I)：[表面活性剂量(μmol)/蛋白质量(μg)]。结果示于表2。

[0075] 使用得到的凝血酶原时间测定用试剂的一部分测定健康人混合血浆的凝血酶原时间。另外，将得到的凝血酶原时间测定用试剂的一部分放入容器，冷冻干燥。接下来，使冷冻干燥状态的凝血酶原时间测定用试剂再溶解于缓冲液B(冷冻干燥前的2倍量)。使用溶解后的凝血酶原时间测定用试剂测定健康人混合血浆的凝血酶原时间。在凝血酶原时间的测定中，使用全自动凝固测定器〔Sysmex(株)制、商品名：CS-5100〕。根据式(II)算出冷冻干燥前后的凝血酶原时间的差。

[0076] 式(II)：[冷冻干燥前后的凝血酶原时间的差]＝[使用冷冻干燥后使再溶解的凝血酶原时间测定用试剂之时的凝血酶原时间]-[使用冷冻干燥前的凝血酶原时间测定用试剂之时的凝血酶原时间]

[0077] 结果示于表2。

[0078] 【表2】

[0079]

[0080] 只要冷冻干燥前后的凝血酶原时间的差在1秒钟以内，就认为有实际的凝固时间的测定所要求的性能。从表2中所示的结果得知，当使用式(I)的值是0.0135～0.0472μmol/μg的实施例1～5的凝血酶原时间测定用试剂时，冷冻干燥前后的凝血酶原时间的差在1秒钟以内。从而得知，由含有组织因子和表面活性剂，式(I)的值是0.013～0.05μmol/μg的凝血酶原时间测定用试剂可抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动。

[0081] 【符号的说明】

[0082] 10：试剂盒

[0083] 21：试剂

[0084] 22：容器

[0085] 31：附带文书

[0086] 41：箱

[0087] 200：脂质体

[0088] 210：组织因子

[0089] 101：聚集体

[0090] 201：磷脂

[0091] 202：磷脂层

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