技术领域
[0001] 本
发明涉及党参寡糖的分离纯化方法及应用。
背景技术
[0002] 党参作为最受欢迎的传统中药之一,具有补中益气、健脾益
肺的功效;糖类是党参中重要的组分,包括多糖、低聚糖和单糖;目前对党参糖类物质的结构及活性研究主要集中在党参多糖;党参自古以味甜者为“佳”。《百草镜》中记载“党参……总以净软壮实味甜者佳“。《药笼小品》中记载“西产为上,体糯味甜、嚼之少渣者佳”。目前研究较多的党参多糖是没有甜味的;党参的主要甜味来源单糖和低聚糖的研究甚少。那么“佳”仅仅指的是口感佳还是同时也指疗效佳呢?
现有技术中并未记载。
发明内容
[0003] 为了解决现有技术中的问题,本发明提供了党参寡糖的分离纯化方法及应用。本
申请发明人提出假说:党参味甜者“佳”不仅仅指的是口感佳,同时也指疗效佳。且低聚糖应该具有免疫增强作用。
[0004] 本申请提供党参寡糖的制备方法,将党参进行醇提,收集药渣,将药渣进行
水提后浓缩,将得到的浓缩液进行醇沉,收集上清液并减压浓缩,得到党参粗寡糖RCPO,将党参粗寡糖RCPO进行纯化,得到党参寡糖。
[0005] 作为优选,将党参粗粉和50-95%
乙醇混合,回流提取2次,每次0.5-1小时,收集药渣,在收集的药渣中加入8-12倍重量的水,煎煮3次,每次30-60分钟,收集并合并水提液,将水提液减压浓缩至1/4-1/2体积,得浓缩液;在浓缩液中加乙醇至终浓度为50-80%进行醇沉,收集上清液;将上清液减压浓缩,得到RCPO,将RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化,得到PCPO。
[0006] 作为优选,所述将RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化的具体方法为:将RCPO溶于水中,上Sephadex G-25纯化,蒸馏水洗脱,洗脱流速为1mL/min,以
苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度,以试管号为横坐标,糖含量为纵坐标,作曲线,根据曲线合并洗脱液,减压浓缩至快干,用少量水从浓缩瓶中溶出后,置于-80℃
冰箱中4h,
冷冻干燥24h即得。
[0007] 本申请提供上述党参寡糖在制备体内免疫调节活性的制剂中的应用。
[0008] 作为优选,党参寡糖在制备通过MAPK
信号通路调节免疫活性的制剂中的应用。
[0009] 本申请提供上述党参寡糖在制备体外免疫调节活性的制剂中的应用。
[0010] 作为优选,党参寡糖在制备调节巨噬细胞免疫活性的制剂中的应用。
[0011] 作为优选,党参寡糖在制备通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性的制剂中的应用。
[0012] 本申请发明人通过实验发现,党参寡糖CPO在体内可以通过MAPK信号通路调节免疫活性,也可以通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性。可以用来制备相应的制剂。
附图说明
[0013] 附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成
说明书的一部分,与本发明的
实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0014] 图1为党参寡糖的提取分离方法。
[0015] 图2为党参寡糖的结构解析。
[0017] 图4为党参寡糖PCPO的体内免疫调节活性实验结果。
[0018] 图5为党参寡糖PCPO对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫调节活性实验结果。
[0019] 图6为党参寡糖PCPO调节巨噬细胞免疫活性的机制。
具体实施方式
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
[0021] 本申请发明人从党参主产地采集药典中规定的三个党参品种共40批:党参(其中甘肃省产区10批、山西长治地区10批)、素花党参(甘肃文县产区10批)、川党参(四川省天宁地区10批),通过测定不同品种和不同产区党参的多糖和粗寡糖的得率可知,各地党参粗寡糖(RCPO)的含量在13.83-33.92g/100g范围之间,说明寡糖部分也是党参中的重要组分。比较同一产地的党参不同提取物的体外抗氧化活性可知(图3),在0.00-5.00mg/mL浓度范围内,在药典规定的三个品种党参中的各提取物的DPPH自由基清除活性强弱依次是:党参粗寡糖(RCPO)>党参水提取物(CPWE)>党参多糖(CPP),即在不同品种党参的各提取物中,党参粗寡糖(RCPO)的体外抗氧化活性最强。
[0022] 其中,党参寡糖的提取分离方法为:
[0023] 将党参粗粉和50-95%乙醇混合,回流提取2次,每次0.5-1小时,分别收集滤液和药渣,将滤液减压浓缩,得到党参醇提取物(CPEE);在收集的药渣中加入8-12倍重量的水,煎煮3次,每次30-60分钟,收集并合并水提液,将水提液减压浓缩至1/4-1/2体积,得浓缩液;将浓缩液分为两部分,一部分浓缩液再次减压浓缩,得到党参水提取物(CPWE);另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为50-80%进行醇沉,将沉淀冷冻干燥,得到党参多糖(CPP);将上清液减压浓缩,得到粗党参低聚糖(RCPO)。
[0024] 将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化,纯化条件为:取适量RCPO溶于少量水中,上2.6×70cm的Sephadex G-25纯化,蒸馏水洗脱,洗脱流速为1mL/min,每管收集5mL;以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度,以试管号为横坐标,糖含量为纵坐标,作曲线,根据曲线合并洗脱液,50℃、60r/min减压浓缩至快干,用少量水从浓缩瓶中溶出后,置于-80℃冰箱中4h,冷冻干燥24h后即得到精制党参低聚糖,标记为PCPO,得率为40-87.3%。
[0025] 实施例1
[0026] 本申请发明人从党参主产地采集药典中规定的三个党参品种共40批:党参(其中甘肃省产区10批、山西长治地区10批)、素花党参(甘肃文县产区10批)、川党参(四川省天宁地区10批),通过测定不同品种和不同产区党参的多糖和粗寡糖的得率可知,各地党参粗寡糖(RCPO)的含量在13.83-33.92g/100g范围之间,说明寡糖部分也是党参中的重要组分。比较同一产地的党参不同提取物的体外抗氧化活性可知(图3),在0.00-5.00mg/mL浓度范围内,在药典规定的三个品种党参中的各提取物的DPPH自由基清除活性强弱依次是:党参粗寡糖(RCPO)>党参水提取物(CPWE)>党参多糖(CPP),即在不同品种党参的各提取物中,党参粗寡糖(RCPO)的体外抗氧化活性最强。
[0027] 其中,党参寡糖的提取分离方法为:
[0028] 将党参粗粉和95%乙醇混合,回流提取2次,每次1小时,分别收集滤液和药渣,将滤液减压浓缩,得到党参醇提取物(CPEE);在收集的药渣中加入10倍重量的水,煎煮3次,每次45分钟,收集并合并水提液,将水提液减压浓缩至1/4体积,得浓缩液;将浓缩液分为两部分,一部分浓缩液再次减压浓缩,得到党参水提取物(CPWE);另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为80%进行醇沉,将沉淀冷冻干燥,得到党参多糖(CPP);将上清液减压浓缩,得到粗党参低聚糖(RCPO)。
[0029] 将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化,纯化条件为:取适量粗党参低聚糖RCPO溶于少量水中,上2.6×70cm的Sephadex G-25纯化,蒸馏水洗脱,洗脱流速为1mL/min,每管收集5mL;以苯酚硫酸法在490nm下测定吸光度,以试管号为横坐标,糖含量为纵坐标,作曲线(图2A),根据曲线合并洗脱液,50℃、60r/min减压浓缩至快干,用少量水从浓缩瓶中溶出后,置于-80℃冰箱中4h,冷冻干燥24h后即得到精制党参低聚糖,标记为PCPO,得率为87.3%。
[0030] 根据GC-MS,IR,ESI-MS,NMR等手段分析PCPO的结构。实验结果表明,三甲基
硅醚衍生化法结合GC-MS可知,PCPO的单糖组成为
葡萄糖和果糖(图2B),ESI-MS实验结果表明PCPO主要是由单糖、
二糖、三糖、四糖组成的混合物(图2C),IR实验结果表明PCPO含有糖类化合物的特征吸收(图2D),甲基化实验结合NMR实验结果表明PCPO的糖链的连接方式为terminal-α-D-Glcp,terminal-β-D-Fruf和→2)-β-D-Fruf-(1→(图2E,F,G,H)。
[0031] 图1为党参寡糖的提取分离方法。
[0032] 图2为党参寡糖的结构研究。
[0033] 图3为党参寡糖体外抗氧化活性初探。
[0034] 一、党参寡糖(PCPO)的体内免疫活性研究
[0035] 为了评价党参寡糖的体内免疫调节活性,本申请发明人检测了党参寡糖对环磷酰胺(CTX)诱导的免疫低下小鼠的免疫调节活性。昆明小鼠随机分为6个组,提供12h昼夜循环及常温环境,保证充足的
饲料及
饮用水,适应性培养7天后,空白对照组和模型组每天灌胃生理盐水,阳性对照组灌胃胸腺肽(10mg/kg),PCPO组分别灌胃高(150mg/kg)、中(100mg/kg)、低剂量(50mg/kg)的上述提取分离的党参寡糖,连续灌胃15天。第16-18天,所有小鼠(除了空白对照组的正常小鼠)
腹腔注射免疫
抑制剂CTX(40mg/kg),第19天处死小鼠,进行脏器指数、脾淋巴
细胞增殖活性、吞噬指数、迟发型变态反应、细胞因子测定和蛋白表达测定等实验,实验结果见图4。
[0036] 图4为党参寡糖PCPO的体内免疫调节活性实验结果。
[0037] 由图4的体内免疫实验结果可知,PCPO(50、100、150mg/kg/d)可显著提高环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的吞噬指数(图4A)、增强小鼠的迟发型变态反应程度(图4B);对抗环磷酰胺所致的小鼠胸腺指数、脾脏指数以及脾淋巴细胞增殖转化能
力的降低(图4C,4D);显著提高细胞因子(IL-2和IFN-γ)和NO的分
泌水平以及血清免疫球蛋白的含量(图4E,4F,
4G,4I),根据蛋白表达含量初步推测PCPO在体内可以通过MAPK信号通路调节免疫活性。
[0038] 二、党参寡糖(PCPO)对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫调节活性的影响
[0039] 为了研究党参寡糖(PCPO)对巨噬细胞RAW264.7细胞免疫调节活性的影响,本申请发明人进行了下述实验,实验过程为:
[0040] 采用MTT实验检测PCPO对RAW264.7细胞增殖作用的影响。调整对数生长期的RAW264.7细胞浓度为10×104个/ml,接种于96孔培养板内,每孔100μL。细胞贴壁后,加入100μL用培养基配制的各梯度浓度的PCPO(2.5,5.0,7.5和10mg/mL)。于
培养箱中培养24h后,每孔加入5mg/mL的MTT 10μL,继续培养4h后,小心吸去上清液后,每孔加入100μL DMSO,振荡后,用酶标仪于570nm处测吸光度(A)。
[0041] 采用传统的中性红实验方法检测PCPO对RAW264.7细胞吞噬作用的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞以50×104个/ml细胞浓度接种到96孔板上,每孔100ul,待细胞贴壁后,加入100ul不同浓度的PCPO(2.5,5.0,7.5和10mg/mL)和LPS(10ug/ml),对照组中加空白培养基,培养24h,加入0.075%的中性红生理盐水溶液(100ul/孔),放入培养箱中继续培养2h,培养结束后吸弃上清液,加入PBS洗涤4次,加入细胞裂解液(冰乙酸:乙醇=1:1,V/V),裂解2h,在570nm下测定吸光度。吞噬率%=A/B×100%,其中A和B分别为
给药组和对照组的吸光度值。
[0042] 采用Griess
试剂测定PCPO对RAW264.7细胞NO释放量的影响。取对数生长期的RAW264.7细胞以50×104个/ml细胞浓度接种到24孔板上,每孔500ul,待细胞贴壁后,加入100ul不同浓度的PCPO(2.5,5.0,7.5和10mg/mL)和LPS(10ug/ml),对照组中加空白培养基,培养24h,取上清液加入NO反应
试剂盒中,560nm处测定吸光度。
[0043] PCPO对RAW264.7细胞的细胞因子TNF-α,IL-6释放量的影响采用ELISA试剂盒检测。取对数生长期的RAW264.7细胞以50×104个/ml细胞浓度接种到24孔板上,每孔500ul,待细胞贴壁后,加入100ul不同浓度的PCPO(2.5,5.0,7.5和10mg/mL)和LPS(10ug/ml),对照组中加空白培养基,培养24h,取上清液按照试剂盒要求测定细胞因子含量。
[0044] 为了Western blot实验分析,细胞总蛋白通过在冰上加入含有PSMF和混合
磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液来提取,蛋白浓度采用BCA试剂盒(索莱宝)按照说明书上的方法测定。对等量的
蛋白质通过10%的SDS-PAGE分离胶分离。
电泳后,将蛋白质
电子转移到甲醇活化后的PVDF膜上,然后将膜在室温下用5%
脱脂奶粉封闭2h,放入不同的
抗体(p48,Erk1/2,JNK)中4℃孵育过夜,洗涤膜后,在室温下用辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育1小时。膜最后用ECL
显色剂显色。使用image J
软件对条带进行分析。
[0045] 通过检测党参寡糖PCPO对巨噬细胞RAW264.7细胞活力、吞噬作用、NO释放量、细胞因子释放和蛋白表达的影响评价党参寡糖PCPO的体外免疫调节活性。实验结果见图4。
[0046] 图5为党参寡糖PCPO对巨噬细胞RAW265.7细胞免疫调节活性实验结果。
[0047] 实验结果表明,PCPO(2.5-10mg/ml)对RAW265.7细胞没有任何毒性作用,可以刺激RAW265.7细胞增殖(图5A),增强RAW265.7细胞的吞噬作用(图5B);增加NO、IL-6和TNF-α等细胞因子分泌量(图5C,5D,5E);下调P58,JNK和ERK1/2蛋白表达(图5F)。因此证实PCPO可以通过MAPK信号通路调节巨噬细胞免疫活性。
[0048] 图6为党参寡糖PCPO调节巨噬细胞免疫活性的机制。
[0049] 实施例2
[0050] 党参寡糖的提取分离方法为:
[0051] 将党参粗粉和50%乙醇混合,回流提取2次,每次0.5小时,分别收集滤液和药渣,将滤液减压浓缩,得到党参醇提取物(CPEE);在收集的药渣中加入12倍重量的水,煎煮3次,每次60分钟,收集并合并水提液,将水提液减压浓缩至1/2体积,得浓缩液;将浓缩液分为两部分,一部分浓缩液再次减压浓缩,得到党参水提取物(CPWE);另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为80%进行醇沉,将沉淀冷冻干燥,得到党参多糖(CPP);将上清液减压浓缩并和党参醇提取物合并,得到粗党参低聚糖(RCPO)。
[0052] 将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化,纯化条件与实施例1一致,得到精制党参低聚糖,标记为PCPO,得率为40%。
[0053] 实施例3
[0054] 党参寡糖的提取分离方法为:
[0055] 将党参粗粉和95%乙醇混合,回流提取2次,每次1小时,分别收集滤液和药渣,将滤液减压浓缩,得到党参醇提取物(CPEE);在收集的药渣中加入8倍重量的水,煎煮3次,每次30分钟,收集并合并水提液,将水提液减压浓缩至1/4体积,得浓缩液;将浓缩液分为两部分,一部分浓缩液再次减压浓缩,得到党参水提取物(CPWE);另一部分浓缩液加乙醇至体积终浓度为80%进行醇沉,将沉淀冷冻干燥,得到党参多糖(CPP);将上清液减压浓缩,得到粗党参低聚糖(RCPO)。
[0056] 将粗党参低聚糖RCPO进行Sephadex凝胶层析纯化,纯化条件与实施例1一致,得到精制党参低聚糖,标记为PCPO,得率为87%。
[0057] 最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。