大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用
阅读：520发布：2023-01-14
专利汇可以提供大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了大丽轮枝菌ΔVdKu70 缺陷 突变体菌株及其应用。本发明构建携带Ku70基因同源重组DNA 片段 的基因敲除载体，通过农杆菌介导的大丽轮枝菌的遗传转化，从大量的转化子中筛选获得一株缺失Ku70基因的ΔVdKu70缺陷突变体菌株，其 微 生物 保藏编号为：CGMCC No.10107。本发明获得的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株与野生型的形态特征和致病 力 基本一致，对UV处理更加敏感；采用本发明大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株作为背景菌株进行基因打靶，其打靶效率比野生型菌株提高了40％到60％。本发明为大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因等方面的研究提供了背景菌株。，下面是大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用专利的具体信息内容。
1.一株大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)ΔVdKu70缺陷突变体菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10107。
2.权利要求1所述的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株作为背景菌株在基因打靶中的用途。
3.权利要求1所述的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株在研究大丽轮枝菌侵染机制中的用途。
4.权利要求1所述的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株在研究大丽轮枝菌与寄主共存机理中的用途。
5.权利要求1所述的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株在研究大丽轮枝菌病程关键基因功能中的用途。
6.一种利用权利要求1所述的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株进行基因打靶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建携带靶基因同源重组DNA片段的基因敲除载体，转化农杆菌；(2)利用农杆菌介导法转化权利要求1所述的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株；(3)筛选转化子，鉴定，即得。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)采用In-Fusion克隆技术构建靶基因同源重组DNA片段。
大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及大丽轮枝菌突变体菌株，尤其涉及大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，本发明还涉及所述大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株作为背景菌株在大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因的研究等方面中的应用，属于大丽轮枝菌突变体菌株的构建及应用领域。
背景技术
[0002] 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种真菌病害，寄主范围非常广泛，能侵染棉花、番茄、亚麻、马铃薯、番茄、黄瓜、烟草、辣椒和茄子等两百多种经济作物，危害极其严重且药剂难于防治，成为作物生产发展的瓶颈。随着大丽轮枝菌小种VdLs.17基因组序列的成功测序(klosterman S.,Subbarao K.,Kang S.et al.Comparative Genomics Yields Insights into Niche Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens.PLoS Pathogens,2011,Vol.7(NO.7))，并公布在了Broad Institute上，对大丽轮枝菌致病基因的研究和入侵过程中的分子机理的研究提供了有利的基因资源。然而，大丽轮枝菌入侵机制的研究还停留在初步阶段，病程相关基因的研究甚少。因此，利用“反向基因组学”研究大丽轮枝菌的致病机制显得更加重要。采用“反向基因组学”研究大丽轮枝菌致病基因的功能，主要是通过基因打靶获得相关基因的突变体分析基因功能。
[0003] 真菌的基因打靶已有几十年的历史，目前实现多数真菌内源核基因的精确打靶还比较困难，究其原因是真菌体细胞内同源重组频率非常低下，远低于非同源末端连接(二者比例为1：10000～1：000)，以至于外源基因进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组中。
[0004] 大丽轮枝菌野生型菌株基因打靶效率非常低，很难实现基因的精确打靶，严重妨碍了大丽轮枝菌入侵机制和与寄主共存机理的研究。因此，获得大丽轮枝菌Ku基因的缺陷突变体，有效提高大丽轮枝菌基因打靶效率成为亟待需要解决的问题。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一株缺失Ku70基因的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)ΔVdKu70缺陷突变体菌株，该突变体菌株能够显著提高基因打靶的效率，实现靶基因的精确打靶，应用于大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及致病关键靶基因的研究等方面。
[0006] 本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明首先公开了一株缺失Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株。本发明采用In-Fusion克隆技术构建Ku70基因的同源重组DNA片段并克隆至pGKO2载体上，构建基因敲除载体pGKO-Hyg-Ku70，转化农杆菌AGL-1，用于大丽轮枝菌的遗传转化。通过同源重组和大量的转化子筛选，最终从205个转化子中筛选获得一株敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991ΔKu70-1。
[0008] 本发明将获得的敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10107；分类命名为：大丽轮枝菌Verticillium dahliae。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年12月02日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0009] 目前实现多数真菌内源核基因的精确打靶还比较困难，原因是真菌体细胞内同源重组频率非常低下，远低于非同源末端连接(二者比例为1：10000～1：000)，以至于外源基因进入细胞后，绝大多数会借助非同源末端连接途径随机插入基因组中；再考虑到对受体细胞的转化率(通常1％～5％)，借助同源重组成功打靶只得依赖大量受体细胞的使用，这导致前期转化和后期筛选繁重耗时，超出通常可承受范围，阻碍基因打靶(Krappmann S.Gene targeting in filamentous fungi:the benefits of impaired repair.The Mycologist,2007,(1):25-29.)。近年来，农杆菌介导的遗传转化在大丽轮枝菌中的成功应用，极大地提高了转化效率，为大丽轮枝菌的基因敲除奠定了基础。
[0010] 大丽轮枝菌基因敲除主要包括载体构建、农杆菌介导转化、转化子筛选和分子鉴定4个步骤，其中转化子筛选是一个技术难点。借助同源重组成功的在野生型菌株中实现基因打靶十分困难，因为打靶效率非常低，远远低于5％，比如：在米曲霉(Aspergillus sojae)和酱油曲霉(A.oryzae)中是1％(Takahashi T.,Masuda T.,Koyama Y.Enhanced gene targeting frequency in ku70and ku80disruption mutants of Aspergillus sojae and Aspergillus oryzae.Molecular Genet Genomics,2006,275:460-470.)；在稻瘟病菌中仅为1.18％(林春花，郑服丛.稻瘟菌MgORP1基因敲除突变株的构建及其表型分析.微生物学报,2008,48(9):1160-1167.)。
[0011] 本发明结果表明，借助同源重组成功的在野生型大丽轮枝菌中实现基因打靶效率更低，仅为0.48％。本发明共挑取到抗潮霉素的转化子205个，PCR检测仅有1个转化子没Hyg有扩增到Ku70基因，本发明将该没有扩增到Ku70基因的转化子命名为ΔVdKu70 。PCR检Hyg
测和Southern-blot杂交试验确定，在获得的ΔVdKu70 转化菌株中，潮霉素的表达盒已成功的整合并取代了VdKu70基因，表明本发明成功获得一株敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991ΔKu70-1。
测和Southern-blot杂交试验确定，在获得的ΔVdKu70 转化菌株中，潮霉素的表达盒已成功的整合并取代了VdKu70基因，表明本发明成功获得一株敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991ΔKu70-1。
[0012] 表型特征分析结果表明，ΔVdku70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1在以蔗糖、木糖、果胶质、半乳糖、淀粉为碳源的Czapek培养基上的生长能力与野生型基本一致，没有显著的不同；其产孢能力与野生型相比也没有显著的变化，产孢量基本一致；但ΔVdKu70突变体菌株Vd991ΔKu70-1对UV处理更加敏感，经过UV照射的ΔVdku70缺陷突变体菌株的存活孢子基本不存在。ΔKu70缺陷突变体菌株对UV照射变得更加敏感有可能的原因是Ku70蛋白在真菌微生物中维持着丝粒长度起着重要的作用(Boulton S.,Jackson S.Identification of a Saccharomyces cerevisiae Ku80homologue:roles in DNA double strand break rejoining and in telomeric maintenance.Nucleic Acids Research,1996,24:4639–4684.)，ΔKu70缺陷菌株缺少Ku70蛋白导致DNAs修复机制受到损伤而难以完成自身的修复，使其对UV照射变得更加敏感。
[0013] 致病力实验结果表明，ΔVdku70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1的致病力与野生型比较没有显著的变化，接种相同浓度ΔVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株的孢子悬浮液后的本生烟植株的感病症状基本一致；而ΔVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株感病本生烟植株中真菌生物量也没有显著差异，都是在根中真菌的生物量最高，其次是在茎中(根基部往上1cm处)，在叶中的生物量最低。
[0014] 从形态学和致病力角度分析，本发明获得的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1可作为基因打靶的背景菌株应用于基因打靶。
[0015] 本发明还公开了一种利用所述大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1进行基因打靶的方法，包括以下步骤：
[0016] (1)构建携带靶基因同源重组DNA片段的基因敲除载体，转化农杆菌；(2)利用农杆菌介导法转化所述大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株；(3)筛选转化子，鉴定，即得。
[0017] 其中，步骤(1)采用In-Fusion克隆技术构建靶基因同源重组DNA片段。由于本发明获得的ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1已经具有潮霉素的抗性，因此，在构建靶基因的同源重组DNA片段时选择其它抗性基因取代待敲除的靶基因，例如遗传霉素(neomycin)抗性基因表达盒。
[0018] ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1的基因打靶效率评估实验结果表明，大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株的基因打靶效率相比野生型提高了40％到60％，显著提高了基因打靶的效率，精确的实现了特定靶基因的改造。
[0019] 本发明获得的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株能够应用于大丽轮枝菌的基因打靶、研究大丽轮枝菌侵染机制、与寄主共存机理以及研究大丽轮枝菌病程关键基因的功能等，为利用“反向基因组学”研究大丽轮枝菌病程关键基因和侵染机制提供了一株高效基因打靶的遗传背景菌株。
[0020] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0021] 本发明敲除了大丽轮枝菌非同源末端连接的主要蛋白--Ku70蛋白，获得ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1，其与野生型相比形态特征和致病力基本一致，但对UV处理变得更加敏感，显著提高同源重组的频率，实现了靶基因的精确打靶，为大丽轮枝菌病程机制的研究等提供了一株高效的基因打靶菌株。
[0022] 本发明所涉及到的术语定义
[0023] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0024] 术语“基因打靶”意指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
[0026] 图1为VdKu70蛋白和其它已经获得Ku蛋白缺陷的突变体的真菌的Ku70蛋白的系统进化树；
[0027] 图2为利用潮霉素抗性基因表达盒构建VdKu70敲除突变体；其中，A：通过同源重组获得VdKu70敲除突变体的过程；B，C：PCR检测分析VdKu70敲除突变体；其中，B：是以Hyg-J-F/Hyg-J-R引物检测，在野生型中没有获得潮霉素1.6kb的片段，在突变体菌株中获得了1.6kb的片段；C：利用Ku70-J-F/Ku70-J-R引物检测，在野生型中获得1.8kb的VdKu70基因的片段，在突变体没有获得1.8kb的VdKu70基因的片段；D，E：分别用VdKu70基因的探针(D)和Hyg基因的探针(E)杂交突变体和野生型的基因组经Kpn I酶切后Southern-blot杂交检测；其中，Vd-wt为野生型菌株；Vd-ΔKu70为ΔVdKu70突变体菌株Vd991ΔKu70-1；
[0028] 图3为转化子的筛选实验；其中，A：获得的转化子；B：转化子的PCR检测；
[0029] 图4为ΔVdKu70突变体和野生型菌株的形态学表型特征；其中，ΔKu70为ΔVdKu70突变体菌株Vd991ΔKu70-1；A-E：ΔVdKu70突变体相比较野生型在不同碳源上的生长表型；A：果胶质，B：半乳糖，C：木糖，D：淀粉，E：蔗糖；F：ΔVdKu70突变体和野生型菌株的产孢量比较；
[0030] 图5为ΔVdKu70突变体菌株的UV照射实验；其中，ΔKu70为ΔVdKu70突变体菌株Vd991ΔKu70-1；
[0031] 图6为ΔVdKu70突变体和野生型菌株侵染本生烟实验；其中，Vd-wt为野生型菌株；VdΔKu70为ΔVdKu70突变体菌株Vd991ΔKu70-1；A：蘸根法接种ΔVdKu70突变体和野生型菌株的本生烟病程曲线；B：本生烟植株被侵染12天以后，25ng的本生烟DNA中的大丽轮枝菌DNA的实时定量分析。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0033] 1、菌株和质粒
[0035] 根癌农杆菌AGL1、质粒pGKO2、pUC-Hyg、pCAM-neo(中国农业科学院农产品加工研究所戴小枫惠赠)。
[0036] 2、培养基
[0037] LB用于大肠杆菌培养；YEB用于农杆菌液体培养；CM、PDA、Czapek培养基用于大丽轮枝菌的培养；MM和IM(Hooykaas P，Roobol C，Schilperoort R.Regulation of the transfer of Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens.Microbiology，1979，110(1):99-109.)用于转化农杆菌的培养。
[0038] 实施例1大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体的获得与鉴定
[0039] 1、实验方法
[0040] 1.1基因敲除质粒pGKO-Hyg-Ku70的构建
[0041] Ku70基因的同源重组DNA片段构建采用In-Fusion(Frandsen R.,Frandsen M,Giese H.Targeted gene replacement in fungal pathogens via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[M]//Plant Fungal Pathogens.Humana Press,2012:17-45.)克隆技术。以质粒pUC-Hyg为模板，以Hyg-F/Hyg-R为引物(引物名称和序列见表1)，扩增长度为1.8kb的潮霉素抗性基因盒。以大丽轮枝菌基因组为模板，分别以Ku70-5F/Ku70-5R和Ku70-3F/Ku70-3R为引物，引物Ku70-5R/Ku70-3F 5'端的16bp含有与Hyg-F/R互为反向互补的接头，引物Ku70-5F/Ku70-3R 5'端的16bp含有与pGKO2(经EcoR I和Hind III线性化的片段)两段互为反向互补的接头，PCR扩增长度分别为0.8kb和1.1kb的Ku70基因(VDAG_10247.1Broad Institute)上下游DNA片段，获得末端含有相应互为反向互补序列的3个PCR产物。通过 HD Cloning Kit User Manual(Clontech，USA)将3个片段整合到pGKO2载体上，构建载体pGKO-Hyg-Ku70。1.2农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化
[0042] 电击法将基因敲除质粒pGKO-Hyg-Ku70转化到农杆菌AGL-1中，用于大丽轮枝菌的遗传转化。转化方法参照Mullins等(Mullins E.,Chen X,Romaine P,et al.Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology,2001,91(2):173-180.)的方法进行。
[0043] 1.3转化子筛选
[0044] 挑取转化子，放在含有潮霉素抗性的PDA培养基中再次筛选培养。将生长出的转化子转入液体CM中培养震荡7d(25℃，200r/min)，收集菌丝，提取总基因组DNA。使用引物Ku70-J-F/Ku70-J-R进行PCR筛选验证。
[0045] 1.4ΔVdKu70缺陷突变体的确定
[0046] 最初筛选到的突变体在含有潮霉素抗性的PDA培养基继代培养3代以后，转入液体CM中培养震荡7d(25℃，200r/min)，收集菌丝，提取总基因组DNA。使用引物Ku70-J-F/Ku70-J-R进行PCR验证；然后进行Southern分析验证(Tzima A.,Paplomatas E.,Tsitsigiannis D.,et al.The G proteinβsubunit controls virulence and multiple growth-and development-related traits in Verticillium dahliae.Fungal Genetics and Biology,2012,49(4):271-283.)。大约20μg的单个突变体的DNA经KpnI酶切后，转移到尼龙膜上，利用地高辛(DIG)标记的900bp的探针[利用DIG-dUTPs(DIG Labeling and Detection kit,Roche)，引物Ku70H-up/Ku70H-dn或Hyg H-up/Hyg H-dn，以野生型大丽轮枝菌的基因组或质粒pUC-Hyg为模板进行PCR扩增获得]进行杂交。
[0047] 1.5表型特征分析
[0048] ΔVdKu70缺陷菌株的生长和形态学特征分析主要从菌落的直径和产孢量两个方面分析。
[0049] 菌落的直径的测量：制备2×106孢子/mL的野生型菌株与ΔVdKu70突变体菌株的孢子悬浮液，各吸取2ul的孢子悬浮液滴在不同的碳源[蔗糖(30g/L)、木糖(10g/L)、果胶质(10g/L)、半乳糖(10g/L)、淀粉(17g/L)](Tzima A.et al.,2011)的Czapek真菌培养基中心位置，培养到3天、6天、9天、12天、15天时，测量其菌落的大小和观察其形态区别与变化。
[0050] 产孢量的测定：制备2×106孢子/mL的野生型菌株与ΔVdKu70突变体菌株的孢子悬浮液，取2.0μL滴加于PDA培养基中心位置，封口并置于恒温培养箱25℃培养7天后，统计孢子数(Tzima A.et al.,2012)。
[0051] 1.6UV-照射试验
[0052] 制备103孢子/mL的野生型菌株与ΔVdKu70突变体菌株的孢子悬浮液，吸取40ul均匀的涂在PDA培养基上，分别暴露于紫外灯照射10秒、15秒、20秒、25秒、30秒，封口并置于恒温培养箱25℃培养5天后，统计菌落数。
[0053] 1.7致病性试验和qPCR确定植物体内真菌的生物量
[0054] 将灭菌处理的烟草种子栽培在无菌的环境下，待幼苗长至五到七片真叶时，用已6
准备好的10孢子/ml的ΔVdKu70缺陷突变体菌株与野生型菌株孢子悬浮液各自接种两组烟草幼苗，每组设置三小组(十棵幼苗)重复，十二天以后观察植株的感病状况并统计植株的病情指数。
准备好的10孢子/ml的ΔVdKu70缺陷突变体菌株与野生型菌株孢子悬浮液各自接种两组烟草幼苗，每组设置三小组(十棵幼苗)重复，十二天以后观察植株的感病状况并统计植株的病情指数。
[0055] 分析寄主内大丽轮枝菌的生物量的变化，用被接菌并感病的本生烟植株的根、茎、叶作为qPCR真菌生物量检测的材料，提取DNA，以本生烟的actin(引物见表1)基因作为内参，真菌的histones 3(引物见表1)基因作为真菌生物量的检测基因，检测感病本生烟中真菌的生物量(Tzima A.et al.,2012)。
[0056] 表1 引物名称及序列
[0057]
[0058]
[0059] 2、实验结果
[0060] 2.1大丽轮枝菌Ku70蛋白的同源性分析
[0061] 为了确定非同源末端连接机制是否影响基因打靶的效率，本发明分析了VdKu70基因的ORF序列，结果表明，VdKu70基因的ORF序列与其它真菌的Ku70基因有较高的相似性。序列的多重比较和进化树分析表明，VdKu70蛋白与其他已经报道的提高打靶效率的真菌物种存在比较高的相似性，相似度在47％到82％之间(图1)。
[0062] 2.2基因敲除质粒pGKO-Hyg-Ku70的构建
[0063] 检测结果表明，本发明成功构建了载体pGKO-Hyg-Ku70(图2A)。
[0064] 2.3转化子的筛选与大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体的获得
[0065] 本发明共挑取到抗潮霉素的转化子205个(图3A)，分别提取基因组总DNA，用引物对Ku70-J-F/Ku70-J-R进行PCR扩增检测，结果，仅有1个转化子没有扩增到Ku70基因(图3B)，将该转化子命名为ΔVdKu70Hyg，推测其可能是敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，本发明对其进行三代继代培养后再进行验证。
[0066] 本发明利用潮霉素的表达盒取代VdKu70基因的ORF，产生可能的大丽轮枝菌ΔKu70缺陷突变体菌株(图2A)，突变体菌株获得潮霉素抗性。本发明通过两对引物Ku70-J-F/Ku70-J-R和Hyg-J-F/Hyg-J-R的PCR试验分析ΔVdKu70Hyg的转化菌株发现：在野生型的菌株中只能克隆到Ku70基因(图2C)，然而在ΔVdKu70Hyg转化菌株中没有克隆到Ku70基因，却可以克隆到Hyg基因(图2B)。
[0067] 分别以VdKu70基因和Hyg基因为探针对已被KpnI消化的野生型和ΔVdKu70Hyg转化菌株的基因组进行Southern-blot杂交分析，结果发现：在以VdKu70基因为探针的试验中，野生型的菌株中获得一条7.4kb的条带，而ΔVdKu70Hyg的突变菌株中没有获得条带(图2D)；然而在以Hyg基因为探针的试验中，ΔVdKu70Hyg的转化菌株中获得一条6.7kb的条带，而野生型菌株中没有获得条带(图2E)。
[0068] 本发明通过PCR和Southern-blot杂交试验确定：在获得的ΔVdKu70Hyg转化菌株中，潮霉素的表达盒已成功的整合并取代了VdKu70基因，表明本发明成功获得一株敲除了Ku70基因的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株，命名为Vd991ΔKu70-1。本发明将大丽轮枝菌ΔVdku70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10107。
[0069] 2.3ΔVdKu70缺陷突变体菌株的表型特征分析
[0070] 在获得大丽轮枝菌ΔVdku70缺陷突变体Vd991ΔKu70-1以后，本发明对其形态特征进行分析。通过观察和测量ΔVdku70缺陷突变体在不同碳源的Czapek培养基培养的菌落直径，结果发现：ΔVdku70缺陷突变体菌株在以蔗糖、木糖、果胶质、半乳糖、淀粉为碳源的Czapek培养基上的生长能力与野生型基本一样，没有显著的不同(图4A-E)。
[0071] 本发明还发现ΔVdku70缺陷突变体Vd991ΔKu70-1的产孢能力与野生型也没有显著的变化，产孢量基本一致(图4F)，表明ΔVdku70缺陷突变体菌株在生长和生殖过程中没有出现缺陷。
[0072] 本发明将ΔVdku70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1和野生型菌株曝露在UV-紫外灯一定时间，25℃培养5d后，观察发现：经过UV照射的ΔVdku70缺陷突变体菌株的存活孢子基本不存在，而野生型的孢子在随UV照射的时间越长，存活的孢子越来越少，在曝光30s时基本没有存活的孢子(图5)。
[0073] 综上研究结果表明，ΔVdku70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1在生长和生殖过程中没有出现缺陷，与野生型基本一样，从形态学分析是可以作为基因打靶的背景菌株，用于基因打靶。然而，本发明结果还发现非同源末端连接缺陷的突变体菌株对UV处理更加敏感，说明在孢子萌发阶段NHEJ是DSBs修复的一个重要的途径。
[0074] 2.4ΔVdku70缺陷突变体菌株的致病力实验
[0075] ΔVdku70缺陷突变体Vd991ΔKu70-1的致病力实验发现，其致病力与野生型比较6
没有显著的变化。本发明以本生烟作为大丽轮枝菌的寄主，接种相同浓度的孢子(5×10孢子/ml)悬浮液在第八天、第十天、第十二天以后观察，接种ΔVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株的本生烟植株的感病症状基本一致，没有明显的变化(图6A)。而ΔVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株感病本生烟植株中真菌生物量也没有显著差异，都是在根中真菌的生物量最高，其次是在茎中(根基部往上1cm处)，在叶中的生物量最低(图6B)。
没有显著的变化。本发明以本生烟作为大丽轮枝菌的寄主，接种相同浓度的孢子(5×10孢子/ml)悬浮液在第八天、第十天、第十二天以后观察，接种ΔVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株的本生烟植株的感病症状基本一致，没有明显的变化(图6A)。而ΔVdku70缺陷突变体菌株与野生型菌株感病本生烟植株中真菌生物量也没有显著差异，都是在根中真菌的生物量最高，其次是在茎中(根基部往上1cm处)，在叶中的生物量最低(图6B)。
[0076] 综上研究结果表明，ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1的致病力与野生型相比没有出现变化，从致病力角度分析是可以应用于基因打靶的背景菌株。
[0077] 实施例2ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1的基因打靶效率的评估[0078] 1、实验方法
[0079] 1.1基因敲除质粒pGKO-neo-2-OdE2、pGKO-neo-Fre6、pGKO-neo-FreB的构建[0080] 本发明以遗传霉素基因表达盒2.6kb取代了1.8kb的潮霉素基因表达盒，以质粒pCAM-neo为模板，以neo-F/neo-R为引物(引物名称和序列见表1)，扩增长度为2.6kb的遗传霉素抗性基因表达盒。
[0081] 利用与实施例1同样的方法构建基因敲除质粒pGKO-neo-2-OdE2(VDAG_10018.)、pGKO-neo-Fre6(VDAG_09283.1)、pGKO-neo-FreB(VDAG_06616.1)(引物序列见表1)。
[0082] 1.2农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化
[0083] 电击法将基因敲除质粒pGKO-neo-2-OdE2、pGKO-neo-Fre6、pGKO-neo-FreB转化到农杆菌AGL-1中，再分别转化实施例1获得的大丽轮枝菌ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1(其微生物保藏编号为：CGMCC No.10107)和野生型菌株，转化方法同实施例1。
[0084] 2、实验结果
[0085] 为了评估ΔVdKu70缺陷突变体菌株的同源重组的频率，本发明选择感兴趣的三个潜在的毒素因子基因作为基因敲除的靶基因去分析ΔVdKu70缺陷突变体菌株的同源重组频率。这三个基因是Vd2-OdE2(2-oxoglutarate dehydrogenase E2)、VdFreB(ferric reductase transmembrane component 3precursor)、VdFre6(ferric reductase transmembrane component 6)。Vd2-OdE2是TCA循环一个关键酶，是酮戊二酸脱氢酶复合体的一部分，它与酮戊二酸脱氢酶和二氢硫辛酸脱氢酶亚基形成一个巨大的亚基核心，催化α-酮戊二酸生成琥珀酸辅酶A。VdFreB(ferric reductase transmembrane component3+
3precursor)是Fe 的吸收必需蛋白因子，它是细胞色素的一种，可以携带电子穿过细胞膜，而且它还是FAD依赖的脱氢酶可以催化分子氧转化成过氧化物从而成为杀菌剂的前
3+
体。VdFre6(ferric reductase transmembrane component 6)是Fe 还原酶的成分之一，
3+
催化细胞表面的Fe 还原必需的蛋白因子，而且还具有途径FAD和亚铁血红素的中间产物将电子从细胞色素转移到细胞外基质。由于本发明获得的ΔVdKu70缺陷突变体菌株已经具有潮霉素的抗性，因此选择遗传霉素(neomycin)抗性基因表达盒去分别取代Vd2-OdE2、VdFreB、VdFre6三个基因。
3precursor)是Fe 的吸收必需蛋白因子，它是细胞色素的一种，可以携带电子穿过细胞膜，而且它还是FAD依赖的脱氢酶可以催化分子氧转化成过氧化物从而成为杀菌剂的前
3+
体。VdFre6(ferric reductase transmembrane component 6)是Fe 还原酶的成分之一，
3+
催化细胞表面的Fe 还原必需的蛋白因子，而且还具有途径FAD和亚铁血红素的中间产物将电子从细胞色素转移到细胞外基质。由于本发明获得的ΔVdKu70缺陷突变体菌株已经具有潮霉素的抗性，因此选择遗传霉素(neomycin)抗性基因表达盒去分别取代Vd2-OdE2、VdFreB、VdFre6三个基因。
[0086] 本发 明 成 功构 建 了 基因 敲 除 质粒 pGKO-neo-2-OdE2、pGKO-neo-Fre6、pGKO-neo-FreB。
[0087] 结果表明，ΔVdKu70缺陷突变体菌株Vd991ΔKu70-1和野生型菌株的转化效率基本一致，没有明显变化。本试验从每个基因的转化菌株中随机挑选了80个遗传霉素抗性的转化子。通过PCR鉴定，确定了三个基因的同源重组率(表2)。结果发现：三个基因在野生型菌株中被失活的效率非常低，每个基因所挑选的转化子中都没有出现野生型的靶基因突变体；而在本发明首次获得的ΔVdKu70缺陷突变体菌株中都出现了三个基因被失活的突变体菌株，而且三个基因失活效率显著提高，提高幅度在40％到60％之间，能够实现特定靶基因的精确改造。
[0088] 表2 靶基因的失活效率
[0089]
[0090] 因此，本发明首次获得的ΔVdKu70缺陷突变体菌株实现了对大丽轮枝菌靶基因的精确改造，尤其对一些难以在野生型的菌株中实现基因打靶的病程关键基因显得更加重要，为利用“反向基因组学”研究大丽轮枝菌病程关键基因和侵染机制提供了一个高效基因打靶的遗传背景菌株。
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