专利汇可以提供一种DC细胞的快速制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及细胞制备领域,具体地说是一种DC细胞的快速制备方法,本发明同 现有技术 相比,将制备时间由现有技术的7-9天缩短至3天;将DC细胞的活 力 由现有技术的68-75%提高至88-95%,纯度由现有技术的60-65%提高至80-90%;采用本发明方法制备的DC细胞具有完全成熟表型,表达趋化因子CCR7,分泌高浓度IL-12细胞因子并有效促进T 细胞增殖 。,下面是一种DC细胞的快速制备方法专利的具体信息内容。
1.一种DC细胞的快速制备方法,其特征在于:依次完成如下步骤: 步骤一:在3毫升淋巴细胞分离液中以每分钟1毫升的速度加入5毫升全血,保持淋巴细胞分离液液面不被冲破,在室温状态下,采用300g离心力,离心20分钟,离心过程中提速及减速均不带刹车; 步骤二:用滴管吸取云雾层,加入0.9%的生理盐水30毫升洗涤一次,在室温状态下,采用
300g离心力,离心5分钟,弃上清; 步骤三:用30毫升预冷的分选缓冲液重悬细胞,计数细
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胞数,在4摄氏度状态下,采用300g离心力,离心10分钟,弃上清; 步骤四:每1х10 个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液、10微升 Fc受体阻断试剂和10微升生物素抗体混合液,
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进行混匀,混匀后,置于温度为4摄氏度的冰箱内,10分钟后取出; 步骤五:每1х10 个细胞加入30微升预冷的分选缓冲液和20微升抗生物素微磁珠,进行混匀,混匀后,置于温度为4摄氏度的冰箱内,15分钟后取出; 步骤六:加入1-2微升预冷的分选缓冲液,在4摄氏度状态下,采用300g离心力,离心10分钟,弃上清,加入500微升预冷的分选缓冲液重悬细胞; 步骤七:MS柱置于磁架上,加入500微升预冷的分选缓冲液,待液体完全流干后,加入
500微升细胞悬液,收集流出的细胞,该流出的细胞即为CD14+的单核细胞; 步骤八:待液体完全流干后,加入500微升预冷的分选缓冲液洗柱,重复两次; 步骤九:计数收集的细胞数量,在4摄氏度状态下,采用300g离心力,离心10分钟,弃上清; 步骤十:用DC细胞培
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养基调节细胞浓度至0.5-0.6x10 个/毫升,将细胞悬液铺入6孔板中,每孔3毫升; 步骤十一:将6孔板置于温度为37摄氏度,二氧化碳浓度为5%的孵箱内,培养48小时后,补充加入诱导DC细胞成熟的混合因子; 步骤十二:继续培养24小时后,检测细胞数量、细胞活力、细胞表型及功能。
2.根据权利要求1所述的一种DC细胞的快速制备方法,其特征在于:所述的步骤二中,所述的云雾层为单个核细胞层。
3.根据权利要求1所述的一种DC细胞的快速制备方法,其特征在于:所述的步骤十中,所述的DC细胞培养基为GT551无血清培养基加入1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和500 U/mL白细胞介素4 。
4.根据权利要求1所述的一种DC细胞的快速制备方法,其特征在于:所述的步骤十一中,所述的诱导DC细胞成熟的混合因子为1000 U/mL肿瘤坏死因子、10000 U/mL白细胞介素1、1000 U/mL干扰素r、1微摩尔/升前列腺素E2、500 ng/mL CD40L、10 ng/mL 脂多糖、
2.5微克/毫升 R848。
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