包含表达IL-12的慢病毒载体的组合物及其使用方法
阅读：2发布：2020-07-14
专利汇可以提供包含表达IL-12的慢病毒载体的组合物及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且该 专利 申请 一般涉及癌症的 治疗 ，更具体地涉及表达IL-12的假型化的慢病毒用于治疗癌症的用途。，下面是包含表达IL-12的慢病毒载体的组合物及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种包含靶向树突细胞的慢病毒载体颗粒的组合物，其中所述颗粒包含含有编码IL-12的多核苷酸序列的慢病毒载体基因组，所述组合物用于治疗癌症的用途，其中所述组合物经瘤内给予。
2.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述IL-12是单链IL-12(scIL-12)。
3.如权利要求2所述用途的组合物，其中所述sclL-12包含p35-L-p40。
4.如权利要求2所述用途的组合物，其中所述sclL-12包含p40-L-p35。
5.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒包含选择性结合至表达DC-SIGN的树突细胞的修饰的甲病毒E2糖蛋白。
6.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒包括含辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分。
7.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述治疗进一步包括经瘤内给予佐剂。
8.如权利要求7所述用途的组合物，其中所述佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性或水包油乳液制剂。
9.如权利要求7所述用途的组合物，其中包含慢病毒载体颗粒的组合物还包含吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性制剂。
10.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒以单剂量给予。
11.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒产生在前48小时期间产生的约0.1μg至1μg/1E10载体基因组的IL-12水平，如体外转导测定所测量。
12.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述治疗进一步包括调节性T细胞消耗。
13.如权利要求12所述用途的组合物，其中所述调节性T细胞消耗包括全身给予环磷酰胺或抗CD25抗体。
14.如权利要求13所述用途的组合物，其中所述全身给予环磷酰胺或抗CD25抗体在瘤内注射包含慢病毒载体的组合物之前。
15.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述治疗进一步包括给予编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒。
16.一种产品，其包含：(a)第一组合物，靶向树突细胞的慢病毒载体颗粒，其包含含有编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组；和(b)包含编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒的第二组合物；用于在对象中治疗癌症的方法中，其中所述第一组合物经瘤内给予，并且所述第二组合物通过不同的途径给予。
17.如权利要求16所述的产品，其中所述第二组合物经皮内、皮下或肌内给予。
18.如权利要求16所述的产品，其中所述第一组合物和所述第二组合物同时给予。
19.如权利要求16所述的产品，其中所述第一组合物和所述第二组合物依次给予。
20.一种慢病毒载体颗粒，其包括：包含辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和包含编码IL-23的序列的慢病毒载体基因组。
21.一种慢病毒载体颗粒，其包括：
a.包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少
80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和
b.包含编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组。
22.如权利要求21所述的慢病毒载体颗粒，其中所述IL-12是单链IL-12(scIL-12)。
23.如权利要求22所述的慢病毒载体颗粒，其中所述sclL-12包含p35-L-p40。
24.如权利要求22所述的慢病毒载体颗粒，其中所述sclL-12包含p40-L-p35。
25.如权利要求21所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体基因组还包含编码抗原的序列。
26.如权利要求25所述的慢病毒载体颗粒，其中所述抗原是肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
27.如权利要求26所述的慢病毒载体颗粒，其中所述肿瘤相关抗原选自：前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1,前列腺特异性膜抗原,PRAME；BAGE；RAGE,NY-ESO-1,SAGE,HAGE,GAGE,Plu-1,HASH-1,HasH-2,Cripto,Criptin,MART-1/Melan-A,gp100,gp75,mda-7,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关蛋白,p53,Ras,c-Myc,A-Raf,B-Raf,和C-Raf,MAGE-A1,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A6,MAGE-A10,MAGE-A12,MART-1,BAGE,DAM-6,-10,GAGE-
1,GAGE-2,GAGE-8,GAGE-3,GAGE-4,GAGE-5,GAGE-6,GAGE-7B,NA88-A,MART-1,MC1R,Gp100,PSM,TRP-1,TRP-2,ART-4,CAMEL,CEA,Cyp-B,hTERT,hTRT,iCE,MUC1,MUC2,PRAME,P15,RU1,RU2,SART-1,SART-3,维尔姆斯肿瘤抗原(WT1),AFP,β-连环蛋白/m,胱冬酶-8/m,CEA,CDK-
4/m,ELF2M,GnT-V,G250,HSP70-2M,HST-2,KIAA0205,MUM-1,MUM-2,MUM-3,肌球蛋白/m,SART-2,TRP-2/INT2,707-AP,膜联蛋白II,CDC27/m,TPI/mbcr-abl,BCR-ABL,干扰素调节因子4(IRF4),ETV6/AML,LDLR/FUT,Pml/RAR,肿瘤相关的钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2,表皮生长因子受体(EGFR和EGFRvIII),血小板衍生的生长因子受体(PDGFR),血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR),整合素连接激酶(ILK),STAT3,STAT5,STAT6,HIF-1,HIF-
2,核因子-κB(NF-κB),Notch1-4,c-Met,雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR),WNT,PMSA,PR-3,MDM2,间皮素,肾细胞癌–5T4,SM22-α,碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250),STEAD,TEL/AML1,GD2,蛋白酶3,hTERT,肉瘤易位断点,EphA2,ML-IAP,EpCAM,ERG(TMPRSS2ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,细胞周期蛋白B1,聚唾液酸,MYCN,RhoC,GD3,岩藻糖基GM1,间皮素,PSCA,sLe,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GLoboH,NY-BR-1,RGs5,SART3,STn,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,SSX2,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白,TIE2,Page4,MAD-CT-1,FAP,MAD-CT-2,和fos相关抗原1。
28.一种治疗对象的癌症的方法，其包括向对象给予有效量的包含权利要求21的慢病毒载体颗粒的组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其还包括向对象给予有效量的包含编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体的组合物。
30.如权利要求29所述的方法，其中权利要求21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体同时给予。
31.如权利要求29所述的方法，其中权利要求21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体在不同的时间依次给予。
32.如权利要求29所述的方法，其中权利要求21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体通过不同的途径给予。
33.如权利要求29所述的方法，其中权利要求21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体在不同位点给予。
34.如权利要求29所述的方法，其中权利要求21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体通过相同途径在不同位点给予。
35.如权利要求28所述的方法，其中所述慢病毒载体颗粒经瘤内给予。
36.如权利要求29所述的方法，其中权利要求21的慢病毒载体颗粒经瘤内给予，并且所述第二慢病毒载体通过不同途径在不同位点同时给予。
37.一种治疗对象的癌症的方法，其包括向对象给予有效量的包含权利要求25的慢病毒载体颗粒的组合物。
38.如权利要求28所述的方法，其中所述方法进一步包括瘤内给予TLR4激动剂。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述TLR4激动剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性或水包油乳液制剂。
40.如权利要求35所述的方法，其中包含慢病毒载体颗粒的组合物还包含吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性制剂。
41.如权利要求35所述的方法，其中所述慢病毒载体颗粒以单剂量给予。
42.如权利要求35所述的方法，其中所述慢病毒载体颗粒产生低水平的IL-12。
43.如权利要求42所述的方法，其中，如在体外转导测定中所测量的，低水平的IL-12为在前48小时期间产生的约0.1μg至1μg/lE10载体基因组。
44.如权利要求37所述的方法，其中所述慢病毒载体颗粒经瘤内给予。
45.如权利要求21-27中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其用于治疗人或动物对象的方法中。
46.包含如权利要求21所述的慢病毒载体颗粒和编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒的组合物。
47.一种治疗或预防性疫苗，其包含权利要求25所述的慢病毒载体颗粒和药学上可接受的赋形剂。
包含表达IL-12的慢病毒载体的组合物及其使用方法
技术领域
[0002] 背景
[0005] 白细胞介素-12是一种对免疫系统具有多种生物学效应的异二聚细胞因子。它由两个亚基p35和p40组成，这两个亚基都是分泌活性形式的IL-12，p70所必需的。白细胞介素-12作用于树突细胞(DC)，导致抗原呈递和成熟的增加，这可以允许启动对肿瘤特异性抗原的T细胞响应。它还驱动DC分泌IL-12，产生正反馈机制来放大响应。一旦起始响应，IL-12即在引导免疫系统朝向Th1细胞因子概况、诱导CD4+T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)并导致CD8+细胞毒性T细胞响应中发挥基础作用(参见例如Cancer Immunol Immunother(2014)63:419–435)。然而，IL-12也是一种强促炎细胞因子，其导致其他细胞因子的分泌，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，其(与IFN-γ组合)是CD4+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)发展的先决条件(Sasiain，M.C，等(1998)Clinical and experimental immunology 114:196-203)。此外，IL-12可通过诱导IFNγ和其他细胞因子而促进先天性免疫细胞如巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的活化。然后这种活化导致这些细胞分泌IL-12并使先天和获得性的响应进一步放大(Portielje,J.E.,等,(2003)Cancer Immunol Immunother 52:133-144.)。然而，高水平的IL-12以及因此的IFNγ也与拮抗分子(如IL-10)的诱导和IL-12下游的信号分子(如STAT4)的消耗有关(Portielje,J.E.,等(2003)Clin Cancer Res 9:76-83；Sacco,S.,等(1997)Blood 90:4473-4479；Leonard,J.P.,等(1997)Blood 90:2541-2548.)。
[0006] 已经在一些白血病小鼠模型中显示了直接注射重组IL-12(Masztalerz,A.,等,(2003)Cancer Immunol Immunother 52:235-242；Zagozdzon,R.,等(1998)Int J Cancer 77:720-727；Tatsumi,T.,等(2001)Cancer research 61:7563-7567；Nastala,C.L.,等(1994)J Immunol 153:1697-1706；Dunussi-Joannopoulos,K.,等,(1999)Blood 94:4263-
4273.)。尽管采用这种方法的初始人体试验不具太大前景(Atkins,M.B.,等(1997)Clin Cancer Res 3:409-417；Kang,W.K.,等(2001)Human gene therapy 12:671-684；
Mazzolini,G.,等(2005)J Clin Oncol 23:999-1010；Dohnal,A.M.,等,(2007)
Cytotherapy 9:755-770.)。创新的基因治疗策略可加速癌症预防性免疫治疗的发展。
发明内容
4273.)。尽管采用这种方法的初始人体试验不具太大前景(Atkins,M.B.,等(1997)Clin Cancer Res 3:409-417；Kang,W.K.,等(2001)Human gene therapy 12:671-684；
Mazzolini,G.,等(2005)J Clin Oncol 23:999-1010；Dohnal,A.M.,等,(2007)
Cytotherapy 9:755-770.)。创新的基因治疗策略可加速癌症预防性免疫治疗的发展。
发明内容
[0007] 本发明的一个方面提供慢病毒载体颗粒，其包含：a)包含辛德毕斯(Sindbis)病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和b)包含编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组。在本文所述的慢病毒载体颗粒的某些实施方式中，IL-12是单链IL-12(scIL-12)。在本文所述的慢病毒载体的某些实施方式中，sclL-12包含p35-L-p40。在本文所述的慢病毒载体颗粒的某些实施方式中，sclL-12包含p40-L-p35。在本文所述的慢病毒载体颗粒的其他实施方式中，慢病毒载体基因组还包含编码抗原的序列。就此而言，抗原是肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。在某些实施方式中，肿瘤相关抗原选自：前列腺酸性磷酸酶,前列腺特异性抗原,NKX3.1,前列腺特异性膜抗原,PRAME；BAGE；RAGE,NY-ESO-1,SAGE,HAGE,GAGE,Plu-1,HASH-1,HasH-2,Cripto,Criptin,MART-1/Melan-A,gp100,gp75,mda-7,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关蛋白,p53,Ras,c-Myc,A-Raf,B-Raf,和C-Raf,MAGE-A1,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A6,MAGE-A10,MAGE-A12,MART-1,BAGE,DAM-6,-10,GAGE-1,GAGE-2,GAGE-8,GAGE-3,GAGE-
4,GAGE-5,GAGE-6,GAGE-7B,NA88-A,MART-1,MC1R,Gp100,PSM,TRP-1,TRP-2,ART-4,CAMEL,CEA,Cyp-B,hTERT,hTRT,iCE,MUC1,MUC2,PRAME,P15,RU1,RU2,SART-1,SART-3,维尔姆斯肿瘤抗原(WT1),AFP,β-连环蛋白/m,胱冬酶-8/m,CEA,CDK-4/m,ELF2M,GnT-V,G250,HSP70-
2M,HST-2,KIAA0205,MUM-1,MUM-2,MUM-3,肌球蛋白/m,SART-2,TRP-2/INT2,707-AP,膜联蛋白II,CDC27/m,TPI/mbcr-abl,BCR-ABL,干扰素调节因子4(IRF4),ETV6/AML,LDLR/FUT,Pml/RAR,肿瘤相关的钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2,表皮生长因子受体(EGFR和EGFRvIII),血小板衍生的生长因子受体(PDGFR),血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR),整合素连接激酶(ILK),STAT3,STAT5,STAT6,HIF-1,HIF-2,核因子-κB(NF-κB),Notch1-4,c-Met,雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR),WNT,PMSA,PR-3,MDM2,间皮素(mesothelin),肾细胞癌–5T4,SM22-α,碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250),STEAD,TEL/AML1,GD2,蛋白酶
3,hTERT,肉瘤易位断点,EphA2,ML-IAP,EpCAM,ERG(TMPRSS2ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,细胞周期蛋白B1,聚唾液酸,MYCN,RhoC,GD3,岩藻糖基GM1,间皮素(mesothelian),PSCA,sLe,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GLoboH,NY-BR-1,RGs5,SART3,STn,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,SSX2,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白(legumain),TIE2,Page4,MAD-CT-1,FAP,MAD-CT-2,和fos相关抗原1。
4,GAGE-5,GAGE-6,GAGE-7B,NA88-A,MART-1,MC1R,Gp100,PSM,TRP-1,TRP-2,ART-4,CAMEL,CEA,Cyp-B,hTERT,hTRT,iCE,MUC1,MUC2,PRAME,P15,RU1,RU2,SART-1,SART-3,维尔姆斯肿瘤抗原(WT1),AFP,β-连环蛋白/m,胱冬酶-8/m,CEA,CDK-4/m,ELF2M,GnT-V,G250,HSP70-
2M,HST-2,KIAA0205,MUM-1,MUM-2,MUM-3,肌球蛋白/m,SART-2,TRP-2/INT2,707-AP,膜联蛋白II,CDC27/m,TPI/mbcr-abl,BCR-ABL,干扰素调节因子4(IRF4),ETV6/AML,LDLR/FUT,Pml/RAR,肿瘤相关的钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2,表皮生长因子受体(EGFR和EGFRvIII),血小板衍生的生长因子受体(PDGFR),血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR),整合素连接激酶(ILK),STAT3,STAT5,STAT6,HIF-1,HIF-2,核因子-κB(NF-κB),Notch1-4,c-Met,雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR),WNT,PMSA,PR-3,MDM2,间皮素(mesothelin),肾细胞癌–5T4,SM22-α,碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250),STEAD,TEL/AML1,GD2,蛋白酶
3,hTERT,肉瘤易位断点,EphA2,ML-IAP,EpCAM,ERG(TMPRSS2ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,细胞周期蛋白B1,聚唾液酸,MYCN,RhoC,GD3,岩藻糖基GM1,间皮素(mesothelian),PSCA,sLe,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GLoboH,NY-BR-1,RGs5,SART3,STn,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,SSX2,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白(legumain),TIE2,Page4,MAD-CT-1,FAP,MAD-CT-2,和fos相关抗原1。
[0008] 本发明的另一个方面提供了治疗对象癌症的方法，包括给予对象有效量的包含本文所述慢病毒载体的组合物，所述慢病毒载体例如包含下述部分的慢病毒载体颗粒：a)包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和b)包含编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组。在某些实施方式中，所述方法还包括向所述对象给予包含编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体的有效量的组合物。在某些实施方式中，同时给予表达IL-12和第二慢病毒载体的慢病毒载体颗粒。在另一个实施方式中，表达IL-12的慢病毒载体颗粒和第二慢病毒载体在不同的时间依次给予。在其他实施方式中，如本文所述的表达IL-12的慢病毒载体颗粒和第二慢病毒载体通过不同途径给予。在其他实施方式中，如本文所述的表达IL-12的慢病毒载体颗粒和第二慢病毒载体在不同位点给予。在其他实施方式中，如本文所述的表达IL-12的慢病毒载体颗粒和第二慢病毒载体通过相同途径在不同位点给予。在另一实施方式中，本文所述的表达IL-12的慢病毒载体颗粒经瘤内给予。在一个实施方式中，TLR4激动剂联合本文所述的慢病毒载体颗粒经瘤内给予。在某些实施方式中，TLR4激动剂在与表达IL-12的慢病毒载体颗粒相同的组合物内经瘤内给予。在其他实施方式中，TLR4激动剂与表达IL-12的慢病毒载体颗粒同时经瘤内给予，但以单独分开的组合物给予。在给予TLR4激动剂的那些实施方式中，TLR4激动剂可以是水性制剂中或水包油乳液制剂中的吡喃葡萄糖基脂质A。在某些实施方式中，本文所述的表达IL-12的慢病毒载体颗粒经瘤内给予，并且第二慢病毒载体在不同的位点并通过不同的途径同时给予。
[0009] 本发明的另一个方面提供了治疗对象癌症的方法，包括向对象给予有效量的组合物，所述组合物包含表达IL-12的本文所述的慢病毒载体颗粒，并且其中所述慢病毒载体基因组还包含编码抗原的序列。在某些实施方式中，慢病毒载体颗粒经瘤内给予。在具体的实施方式中，慢病毒载体颗粒以单剂量给予。在另一实施方式中，慢病毒载体颗粒产生低水平的IL-12。就此而言，如在体外转导测定中所测量的，低水平的IL-12为在前48小时期间产生的约0.1μg至1μg/lE10载体基因组。
[0010] 本发明的其他方面包括如本文所述的表达IL-12的慢病毒载体颗粒，其用于治疗人或动物对象的方法中。
[0011] 本发明的另一个方面提供组合物，其包含：a)包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和b)包含编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组；与编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒组合。
[0012] 本发明的另一个方面提供产品，其包含：a)包含慢病毒载体的第一组合物，其中所述颗粒包含：1)包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和2)包含编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组；和b)包含编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒的第二组合物；用于通过瘤内给予第一组合物和通过不同途径给予第二组合物来治疗对象的癌症的方法中。在一个实施方式中，第二组合物经皮内、皮下或肌内给予。在另一实施方式中，第一组合物和第二组合物同时给予。在另一实施方式中，第一组合物和第二组合物依次给予。
[0013] 本发明的另一方面提供包含药学上可接受的赋形剂和慢病毒载体颗粒的治疗性或预防性疫苗，所述慢病毒载体颗粒包含：a)包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和b)包含编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组；并且其中慢病毒载体基因组还包含编码抗原的序列。
[0014] 本发明的另一个方面提供了治疗对象癌症的方法，包括向对象给予有效量的包含慢病毒载体颗粒的组合物，所述慢病毒载体颗粒包含含有编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组；其中包含所述慢病毒载体颗粒的组合物经瘤内给予；并且其中慢病毒载体颗粒在前48小时期间产生约0.1μg至1μg/lE10载体基因组的低水平IL-12，如体外转导测定中所测量。在某些实施方式中，治疗还包括调节性T细胞消耗。在该方面，调节性T细胞消耗可以包括全身给予环磷酰胺或用消耗调节性T细胞的试剂例如抗体来治疗。示例性此类抗体是抗CD25抗体。在某些实施方式中，环磷酰胺或抗CD25抗体的全身给予在肿瘤内注射包含慢病毒载体的组合物之前进行。
[0015] 本文所述的任何治疗癌症的方法可以与调节性T细胞消耗例如全身给予环磷酰胺或消耗调节性T细胞的试剂(例如抗体，例如抗CD25抗体)组合。
[0016] 本发明的另一方面提供了慢病毒载体颗粒，其包含：a)包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和b)包含编码IL-23的序列的慢病毒载体基因组。附图说明
[0017] 图1A和图1B显示了VP02/IL-12与VP02/NY-ESO-1的共递送增强了抗NY-ESO-1 CD8 T细胞响应。
[0018] 图2A和图2B显示VP02/IL-12与VP02/hCAIX的共递送增强了抗hCAIX CD8 T细胞响应。
[0019] 图3A和图3B显示VP02/IL-12的共递送显著增强了由慢病毒载体VP02/NY-ESO-1诱导的针对NY-ESO-1的抗原特异性CD8 T细胞响应。
[0020] 图4A和图4B显示VP02/IL-12的共递送显著增强了由慢病毒载体VP02/NY-ESO-1诱导的针对NY-ESO-1的抗原特异性CD4 T细胞响应。
[0021] 图5A、图5B、图5C和图5D显示甚至低剂量的VP02/IL-12(1E9vg剂量)与临界免疫原性剂量的LV305(1E9vg)的共同给予增强了CD8和CD4响应。
[0022] 图6显示共同给予VP02/IL12增强了高剂量VP02/hCAIX的治疗活性，但差异不显著。
[0023] 图7A和图7B显示，通过与VP02/IL-12混合，低剂量LV305介导的抗肿瘤功效显著增强，并且抗肿瘤功效与NY-ESO-1-特异性CD8 T细胞的量级相关(图7B)。
[0024] 图8A和图8B显示在启动免疫后，VP02/IL-23能够显著增强PBMC中LV305诱导的CD8 T细胞响应(图8B)。
[0025] 图9A和图9B显示在B16F10足垫鼠肿瘤模型中瘤内注射LV/IL-12的抗肿瘤功效。图9A显示肿瘤生长曲线，图9B显示整合(LV703)和整合缺陷(LV704，也称为VP02)慢病毒载体的存活曲线。
[0026] 图10A和图10B显示在B16F10胁部鼠肿瘤模型中瘤内注射LV/IL-12的抗肿瘤功效。图10A显示肿瘤生长曲线，图10B显示整合(LV703)和整合缺陷(LV704，也称为VP02)慢病毒载体的存活曲线。
[0027] 图11A和图11B显示在P815鼠肿瘤模型中瘤内注射LV/IL-12的抗肿瘤功效。图11A显示肿瘤生长曲线，图11B显示整合(LV703)和整合缺陷(LV704，也称为VP02)慢病毒载体的存活曲线。
[0028] 图12A和图12B显示在CT26胁部鼠肿瘤模型中瘤内注射LV/IL-12的抗肿瘤功效。图12A显示肿瘤生长曲线，图12B显示整合(LV703)和整合缺陷(LV704，也称为VP02)慢病毒载体的存活曲线。
[0029] 图13A和图13B显示在4T1鼠肿瘤模型中瘤内注射LV/IL-12的抗肿瘤功效。图13A显示肿瘤生长曲线，图13B显示整合(LV703)和整合缺陷(LV704，也称为VP02)慢病毒载体的存活曲线。
[0030] 图14A和图14B显示在A20鼠肿瘤模型中瘤内注射LV/IL-12的抗肿瘤功效。图14A显示肿瘤生长曲线，图14B显示整合(LV703)和整合缺陷(LV704，也称为VP02)慢病毒载体的存活曲线。
[0031] 图15A和图15B显示当与混合在一起的rNY-ESO-1+GLA-SE共同给予并在尾巴根部经皮下给予时，VP02/IL-12的添加显著增加NY-ESO-1 Ag-特异性CD4 T细胞响应。图15A显示细胞因子阳性CD4 T细胞百分比，图15B显示总IFNγ CD4阳性T细胞百分比。
[0032] 图16A、图16B、图16C和图16D显示在实验中VP02/IL-12的添加显著增强CD8 T细胞响应(图16A和图16B)但降低CD4 T细胞响应(图16C和图16D)，使用重组乙肝表面抗原(rHBsAg)与GLA-SE相组合。
[0033] 图17A，17B，17C：在右侧足垫中用1×106B16F10黑素瘤细胞接种C57BL/6雌性小鼠(n＝8/组)。在第7天，在左侧脚垫中用1×106个黑素瘤细胞接种荷瘤小鼠。然后用整合LV/IL-12(LV703)或LV703/IL-12/RTmut或对照载体，IT±200μg抗-CTLA-4抗体或同种型对照腹膜内(IP)免疫小鼠。抗体每周给予一次，直到研究结束。17A，个体肿瘤生长；17B个体远隔肿瘤生长；17C，生存比例。
[0034] 图18A，18B，18C：在右胁中用1×105B16F10黑素瘤细胞接种C57BL/6雌性小鼠(n＝8/组)。在第7天，在左胁中用1×105个黑素瘤细胞接种荷瘤小鼠。然后用LV703/IL-12或LV703/IL-12/RTmut或对照载体，IT±200μg抗-CTLA-4抗体或同种型对照腹膜内(IP)免疫小鼠。抗体每周给予一次，直到研究结束。18A，个体肿瘤生长；18B个体远隔肿瘤生长；18C，生存比例。
[0035] 图19A，19B，19C，19D：用1×105个4T1乳腺癌细胞在右侧第4个乳房脂肪垫内原位接种BALB/c雌性小鼠(n＝10/组)。在第7天，荷瘤小鼠在左侧第4个乳房脂肪垫内原位接种1×105个4T1乳腺癌细胞。然后用LV 703/IL-12或对照载体，IT±GLA，IT±200μg抗-CTLA-4抗体或同种型对照腹膜内(IP)免疫小鼠。在肿瘤内给予之前，首剂GLA是5μg GLA-AF，与LV703/IL-12混合。随后剂量的肿瘤内GLA为每周给予5μg GLA-SE。19A，原发性个体肿瘤生长；19B，在具有额外的远隔肿瘤的动物中原发性个体肿瘤生长；19C，个体远隔肿瘤生长；19D，生存比例。
[0036] 图20A和20B是显示用瘤内LV703/IL-12处理的小鼠中IFNγ和IL-12的血浆水平的图。
[0037] 图21图示了用LV703/IL-12经静脉(i.t.)处理的小鼠中的个体肿瘤大小(B16F10胁部模型)和不同细胞类型的消耗：(21A)：CD8 T细胞消耗；(21B)：CD4 T细胞消耗；(21C)：NK细胞消耗；(21D)：CD8+CD4消耗和CD8、CD4+NK消耗；(21E)：CD8+NK和CD4+NK消耗。
具体实施方式
[0038] 本公开提供了通过给予编码IL-12的慢病毒载体来治疗癌症的方法和组合物。在某些实施方式中，慢病毒载体是靶向树突细胞(DC)的慢病毒载体，所述树突细胞表达IL-12。在具体的实施方式中，慢病毒载体颗粒包含源自辛德毕斯病毒E2的包膜糖蛋白变体和含IL-12的编码序列的基因组以及任选的其他组分。与参考辛德毕斯病毒株HR相比，糖蛋白变体显示与硫酸乙酰肝素的结合降低。包膜糖蛋白促进由慢病毒载体颗粒感染树突细胞。
如本文所用，“促进”感染与促进转导相同，是指包膜糖蛋白单独作用或与其他分子一起作用，推动或增强假型化的逆转录病毒或慢病毒颗粒以受体介导的方式进入靶细胞。
如本文所用，“促进”感染与促进转导相同，是指包膜糖蛋白单独作用或与其他分子一起作用，推动或增强假型化的逆转录病毒或慢病毒颗粒以受体介导的方式进入靶细胞。
[0039] 通常，慢病毒载体颗粒由含有一起编码产生功能载体颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体和/或整合元件的细胞系产生。这些慢病毒载体颗粒通常不具有复制能力，即它们仅能够进行单轮感染。最经常地，稳定整合到生产者细胞染色体中的多个质粒载体或个体表达盒用于分离产生慢病毒载体颗粒的各种遗传组分，然而，可以使用具有所有慢病毒组分的单一质粒载体。在一个实例中，包装细胞系用含有病毒载体基因组的一种或多种质粒(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列)、编码病毒酶促和结构组分(例如gag和pol)的至少一种质粒和编码包膜糖蛋白的至少一种质粒转染。在某些实施方式中，包膜蛋白是虫媒病毒包膜糖蛋白。在其他实施方式中，包膜蛋白来自与用于基因组的病毒异源的病毒(例如包膜糖蛋白来源于不同于慢病毒载体的病毒)。病毒颗粒穿过细胞膜并包含核心，该核心通常包含两种RNA基因组，其含有感兴趣序列和包膜糖蛋白，例如靶向树突细胞的虫媒病毒包膜。当虫媒病毒糖蛋白是辛德毕斯病毒E2糖蛋白时，与参考菌株HR相比，糖蛋白被工程改造以减少与硫酸乙酰肝素的结合。与HR E2糖蛋白序列相比，这通常涉及至少一个氨基酸改变。
[0040] 不希望受理论限制，认为病毒颗粒与细胞表面的结合诱导胞吞作用，使病毒进入内涵体，触发膜融合，并使病毒核心进入胞质溶胶。对于利用整合慢病毒载体颗粒的某些实施方式，在产物逆转录并迁移到细胞核后，病毒基因组整合到靶细胞基因组中，将感兴趣序列整合到靶细胞的基因组中。然而，为了减少插入诱变的机会并促进特定抗原的瞬时表达，其他实施方式利用整合缺陷型慢病毒载体颗粒，其不整合到靶细胞基因组中，而是从附加体表达一种或多种感兴趣序列。无论何种途径，受感染的细胞随后表达感兴趣序列，例如IL-12和任选的抗原和/或刺激分子。当包括抗原时，该抗原可以被树突细胞处理并呈递给T和B细胞，产生抗原特异性免疫应答。只要树突细胞能够刺激抗原特异性免疫应答，就不需要上述特定途径。
[0041] 病毒颗粒可以给予于对象以提供预防或治疗效果。感兴趣序列的产物通常是单链IL-12(sclL-12)或其他形式的IL-12，并且还可以包括致病剂或患病细胞(例如肿瘤细胞)的抗原，以及或另外的免疫调节分子，例如细胞因子。在树突细胞感染和产物表达后，表达IL-12，并且在除了IL-12之外还从载体表达抗原的那些实施方式中，针对该抗原产生免疫应答并且由表达的IL-12产物加强该免疫应答。免疫应答可以是体液免疫应答或细胞免疫应答或两者。
[0042] A.病毒载体包膜
[0043] 本文所述的病毒载体通常用来自异源病毒的包膜蛋白假型化(pseudotyped)。在某些实施方式中，病毒载体用VSVg包膜糖蛋白假型化。在其他实施方式中，病毒载体可用衍生自异源HIV(例如HIV-2)或其他异源逆转录病毒如猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或梅迪/维斯纳(maedi/visna)病毒的包膜糖蛋白进行假型化。
[0044] 在具体的实施方式中，本文所述的病毒载体用衍生自虫媒病毒的包膜糖蛋白假型化。节肢动物传播的病毒(虫媒病毒)是通过感染的节肢动物载体如蚊子传播给宿主如人、马或鸟的病毒。虫媒病毒进一步分为病毒亚科，包括甲病毒和黄病毒，它们具有正极性的单链RNA基因组和含有糖蛋白的包膜。例如，登革热病毒、黄热病病毒和西尼罗河病毒属于黄病毒科，辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒是甲病毒科成员(Wang等J.Virol.66,4992(1992))。辛德毕斯病毒的包膜包括两种跨膜糖蛋白(Mukhopadhyay等Nature Rev.Microbio.3,13(2005))：据信，E1负责融合，E2负责细胞结合。辛德毕斯病毒包膜糖蛋白已知可以假型化其他逆转录病毒，包括肿瘤逆转录病毒和慢病毒。
[0045] 如上所述，虫媒病毒包膜糖蛋白可用于假型化基于慢病毒的载体基因组。“假型”、“假型化”或“假型化的”慢病毒是具有由不同于慢病毒基因组的病毒编码的一种或多种包膜糖蛋白的慢病毒颗粒。如本文所述，可以修饰、突变或工程化包膜糖蛋白。
[0046] 辛德毕斯病毒和其他甲病毒包膜纳入到病毒颗粒膜的脂质双层中，并且通常包括两种糖蛋白E1和E2的多个拷贝。每个糖蛋白都有膜跨越区；E2具有约33残基的胞质结构域，而E1的胞质尾部非常短(约2个残基)。E1和E2都在膜跨越区域内或附近附着有棕榈酸。E2最初被合成为前体蛋白，其被弗林蛋白酶或其他Ca2+依赖性丝氨酸蛋白酶切割成E2和称为E3的小糖蛋白。位于编码E2和E1的序列之间的是编码称为6K的蛋白质的序列。E3和6K是信号序列，其分别用于将E2和E1糖蛋白转位至膜中。在辛德毕斯病毒基因组中，辛德毕斯包膜蛋白的编码区包括编码E3，E2，6K和E1的序列。如本文所用，虫媒病毒的“包膜”至少包括E2，并且还可以包括E1、6K和E3。辛德毕斯病毒株HR的包膜糖蛋白的示例性序列如WO2011/011584的SEQ ID No.17所示。其他虫媒病毒的包膜糖蛋白序列可以在例如GenBank中找到。例如，编码登革病毒糖蛋白的序列可以在登录号GQ252677(以及GenBank中的其他登录号)以及NCBI的病毒变异数据库(GenBank登录号和病毒变异数据库通过参考包膜糖蛋白序列而纳入)中找到，编码委内瑞拉马脑炎病毒包膜糖蛋白的序列可以在登录号NP 040824(通过参考包膜糖蛋白序列而纳入)中找到。
[0047] 虽然树状细胞上的甲病毒，特别是辛德毕斯病毒，的细胞受体迄今尚未明确鉴定，但一种受体似乎是DC-SIGN(Klimstra等，J Virol 77：12022,2003)。术语“附着”，“结合”，“靶向”等的使用可互换使用，并不意味着指示辛德毕斯病毒包膜糖蛋白与细胞组分之间相互作用的机制。DC-SIGN(树突细胞特异性ICAM-3(细胞间粘附分子3)-吞噬非整合素；也称为CD209)是能够快速结合并内吞物质的C型凝集素样受体(Geijtenbeek,T.B.,等.Annu.Rev.Immunol.22:33-54,2004)。E2似乎通过DC-SIGN将病毒靶向树突细胞。如本文所示，相比不表达DC-SIGN的同基因细胞，表达DC-SIGN的细胞通过用辛德毕斯病毒E2假型化的病毒载体颗粒更好地进行转导(好至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍)。E2糖蛋白如何促进病毒感染的机制似乎涉及DC-SIGN，可能通过直接结合至DC-SIGN或导致构象改变或一些其他机制。不管实际的机制如何，E2的靶向对于表达DC-SIGN的细胞(即树突细胞)是优先的。
[0048] 辛德毕斯病毒似乎也通过硫酸乙酰肝素结合细胞(Klimstra等,J Virol 72:7357,1998；Burmes和Griffin,J Virol 72:7349,1998)。因为在大多数细胞类型的表面上发现硫酸乙酰肝素和其他细胞表面葡糖胺聚糖，所以希望减少硫酸乙酰肝素和辛德毕斯包膜糖蛋白之间的相互作用。这可以通过减少辛德毕斯病毒包膜与硫酸乙酰肝素的结合或增加辛德毕斯病毒包膜与树突细胞的结合(例如增加亲合力)或两者来实现。结果，与其他分子的非特异性结合减少，所述分子通过其他细胞类型表达并且即使包膜对DC-SIGN特异也可能发生，并且改变的特异性可用于避免不希望的副作用，例如可能降低所需免疫应答的副作用或与其他细胞类型的脱靶转导相关的副作用。作为替代或除了表达DC-SIGN的细胞的相对特异性转导的优点之外，用辛德毕斯病毒包膜E2糖蛋白假性化的病毒颗粒可提供相比用糖蛋白如VSVG假型化的病毒颗粒的其他优点。这些优点的实例包括减少补体介导的裂解和/或减少的神经元细胞靶向，这两者都被认为与给予VSV-G假型化的病毒颗粒有关。
[0049] 在各种示例中，慢病毒载体颗粒特异性结合至表达DC-SIGN的细胞并且具有与硫酸乙酰肝素的降低或消除的结合。也就是说，辛德毕斯病毒包膜E2糖蛋白可以被修饰以将病毒相对于其他细胞类型优先引导至表达DC-SIGN的树突细胞。基于从结构研究和分子模拟以及其他研究获得的信息，设计和生成包膜蛋白(尤其是E2和E1糖蛋白)的变体序列，使得糖蛋白保持其作为包膜蛋白的功能，但具有所需的结合特异性、亲合性、或结合水平。可以为每个糖蛋白创建候选变体序列，并使用下述方法或本领域已知的其他方法分析以鉴定具有最期望特征的包膜糖蛋白。
[0050] 与SEQ ID NO：1相比，辛德毕斯E2的某些变体序列在残基160处具有至少一个氨基酸改变。残基160缺失或变成谷氨酸以外的氨基酸。改变最通常是至少一个氨基酸的取代，但是可选地可以是一个或多个氨基酸的添加或缺失。优选地，任何其他氨基酸数量少且不包含可能危及安全性的抗原表位(例如血凝素标签序列)。当有两个或多个改变时，它们可以是相同类型(例如取代)或不同类型(例如取代和缺失)。多种改变可以散布或连续地位于蛋白质序列中。用于本发明的E2糖蛋白的示例性变体在WO201101584中描述，并且包括本文提供的序列表中的SEQ ID NO：3-15和本文所述的变体中的任何一个。
[0051] 首先，变体序列在约残基50至约残基180的区域中包含至少一个氨基酸改变。在该区域内的是涉及结合硫酸乙酰肝素的氨基酸。通过减少E2的净正电荷，可以减少与硫酸乙酰肝素的静电相互作用，导致与硫酸乙酰肝素的结合降低。该区域中的候选带正电荷的氨基酸包括残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、139、148、149、159处的赖氨酸和残基65、92、128、137、157、170、172处的精氨酸(Bear等，Virology 347：183-190,2006)。至少数个这些氨基酸直接参与E2与硫酸乙酰肝素的结合。通过缺失赖氨酸或精氨酸或用中性或带负电的氨基酸取代赖氨酸或精氨酸，可以减少净正电荷。例如，这些赖氨酸和精氨酸中的一种或多种可以被谷氨酸或天冬氨酸取代。某些实施方式具有赖氨酸70、76或159中的至少一个取代。在E2被表达为带有E3的多蛋白的情况下，位于天然E3/E2切割位点附近的赖氨酸得以维持-即识别序列和切割位点不变。或者，将天然内肽酶切割位点序列替换为不同内肽酶的识别序列。
[0052] E2的某些变体也以积极影响与树突细胞的结合的方式进行修饰。存在于参照HR序列中残基160处的谷氨酸的改变可改善与树突细胞的结合(参见Gardner等，J Virol 74,11489,2000)。发现在某些变体中存在改变，例如残基160的缺失或残基160的取代。在特定的变体中，用不带电荷的氨基酸取代Glu，在其他变体中用非酸性氨基酸取代Glu。通常，Glu160被小氨基酸或脂肪族氨基酸之一代替，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
[0053] 其他变体包含两个或更多个氨基酸改变。通常在这些变体中，改变之一是Glu160，其余改变是跨越残基约50至约180的区域中的一个或多个赖氨酸和精氨酸的改变。某些变体包括用将Glu160改变为非酸性残基或缺失，以及用非碱性氨基酸改变赖氨酸70、赖氨酸76或赖氨酸159中的一个或多个。一些特定变体包含Glu160变为Gly，Lys 70变为Glu和Lys
159变为Glu；Glu 160变为Gly，Lys 70、76和159变为Glu；Glu 160和Lys 70缺失和159变为Glu；Glu 160缺失和Lys 70、76和159变为Glu。
159变为Glu；Glu 160变为Gly，Lys 70、76和159变为Glu；Glu 160和Lys 70缺失和159变为Glu；Glu 160缺失和Lys 70、76和159变为Glu。
[0054] 在某些情况下，E2蛋白首先表达为与至少E3融合或与前导序列融合的多聚蛋白。无论前导序列是E3还是其他序列，病毒包膜中的E2都应该不含E3或其他前导序列。换句话说，E2优选不是E3/E2融合蛋白(例如称为SVGmu的E3/E2融合蛋白)。在某些实施方式中，E2表达为E3-E2-6K-E1多蛋白的一部分。辛德毕斯病毒天然地将E2表达为多蛋白的一部分，并且E3/E2、E2/6K和6K/E1的连接区具有被内肽酶识别和切割的序列。通常，E3/E2连接被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样丝氨酸内肽酶在第65和66位残基之间切割。弗林蛋白酶对由两个氨基酸分开的成对精氨酸残基具有特异性。为了维持弗林蛋白酶对E3/E2的切割，残基62-66(RSKRS；SEQ ID NO：26)应保持两个氨基酸分离的精氨酸残基，和丝氨酸残基。或者，可以使用不同的切割序列来代替E3/E2弗林蛋白酶切割序列或任何其他切割序列。可针对内肽酶纳入识别和切割位点，所述内肽酶包括但不限于天冬氨酸内肽酶(例如组织蛋白酶D，凝乳酶，HIV蛋白酶)，半胱氨酸内肽酶(菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，钙蛋白酶)，金属内肽酶(例如胶原酶，嗜热菌蛋白酶)，丝氨酸内肽酶(例如胰凝乳蛋白酶，因子IXa，因子X，凝血酶，胰蛋白酶)，链激酶。这些酶的识别和切割位点序列是众所周知的。
[0055] E2中不同于已经提到的那些的氨基酸也可能被改变。通常，变体E2序列将与参照E2序列具有至少80％的序列氨基酸相同性，或者其可以具有至少82％，至少85％，至少87％，至少90％，至少92％，至少95％或至少98％的序列相同性。变体糖蛋白应该表现出生物功能，例如促进具有含E2的包膜的病毒颗粒感染树突细胞的能力。实验已经鉴定了包膜糖蛋白的区域，这些区域似乎在病毒装配、细胞表面附着和感染的各个方面具有重要作用。
产生变体时，可以使用以下信息作为指导。E2的胞质尾部-大约残基408至415-对于病毒组装是重要的(West等，J Virol 80:4458-4468,2006；8)。其他区域参与形成二级结构(大约残基33-53)；并且参与运输和蛋白质稳定性(大约残基86-119)(Navaratmarajah等，J Virol 363：124-147,2007；)。变体可保留跨越膜的区域的疏水特征，大约残基370-380。该变体可以保留N-连接的糖基化位点残基NIT(残基196-198)和NFT(残基318-320)中的一种或两种，并且可以保留一种或多种经棕榈酰化的位点(C-396，C416和C417)(Strauss和Strauss Microbiol Rev 58,491-562,1994；499-509页)。另一方面，E2的许多区域可能被改变而没有有害的事件。例如，在E2的许多不同位置插入转座子仍然导致活病毒
(Navaratmarajah，同上)。
产生变体时，可以使用以下信息作为指导。E2的胞质尾部-大约残基408至415-对于病毒组装是重要的(West等，J Virol 80:4458-4468,2006；8)。其他区域参与形成二级结构(大约残基33-53)；并且参与运输和蛋白质稳定性(大约残基86-119)(Navaratmarajah等，J Virol 363：124-147,2007；)。变体可保留跨越膜的区域的疏水特征，大约残基370-380。该变体可以保留N-连接的糖基化位点残基NIT(残基196-198)和NFT(残基318-320)中的一种或两种，并且可以保留一种或多种经棕榈酰化的位点(C-396，C416和C417)(Strauss和Strauss Microbiol Rev 58,491-562,1994；499-509页)。另一方面，E2的许多区域可能被改变而没有有害的事件。例如，在E2的许多不同位置插入转座子仍然导致活病毒
(Navaratmarajah，同上)。
[0056] 在某些实施方式中，可将标签肽掺入E3、6K或E1蛋白质中。出于某些目的，可将标签并入E2中，但标签不适用于向人类患者给予的产品。可以使用短序列(例如5-30个氨基酸)的标签肽来帮助检测包膜表达及其在病毒颗粒中的存在。.为了检测的目的，标签序列通常可以被抗体或化学品检测到。标签的另一用途是便于病毒颗粒的纯化。含有标签结合伴侣的底物可用于吸收病毒。病毒的洗脱可以通过用从结合伴侣置换标签的部分进行处理来实现，或者当标签序列与可剪切序列连接时，用合适的内肽酶处理将方便地允许病毒释放。(参见例如凯杰(Qiagen)目录，因子Xa蛋白酶系统)。出于安全目的，在动物对象中使用病毒颗粒通常需要去除标签肽。如果标签未被移除，则可能发生对该标签的免疫应答。
[0057] 合适的标签包括但不限于FLAG(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：28)(美国专利号4,703,004)，其抗体可商购，几丁质结合蛋白，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽-S-转移酶，聚组氨酸(美国专利号4,569,794)，硫氧还蛋白，HA(血凝素)-标签等。聚组氨酸可被吸附到含有结合的金属离子(例如镍或钴)的亲和介质上，并用低pH培养基洗脱。
[0058] 可以评估病毒颗粒以确定纳入到靶向树突细胞的病毒中的包膜糖蛋白的特异性。例如，骨髓细胞的混合群可以从对象获得并在体外培养。或者，可以获得并使用表达或不表达DC-SIGN的同基因细胞系。可以将重组病毒给予于骨髓细胞或同基因细胞系的混合群，并且可以在培养的细胞中测定掺入病毒中的报道基因的表达。某些实施方式可以采用有限稀释分析，其中将混合的细胞群分成单独的部分，然后将其分别与减少量的病毒一起孵育(例如，各部分中2倍更低、5倍更低、10倍更低的病毒)。在一些实施方式中，混合细胞群中感染细胞的至少约50％，更优选至少约60％，70％，80％或90％，还更优选至少约95％是表达DC-SIGN的树突细胞。在某些实施方式中，感染的树突细胞与感染的非树突细胞(或非DC-SIGN表达细胞)的比率为至少约2：1，至少约3：1，至少约4：1，至少约5：1，至少约6：1，至少约7：1，至少约8：1，至少约9：1，至少约10：1，至少约20：1，至少约30：1，至少约40：1，至少约50：1，至少约100：1，至少约200：1，至少约500：1，至少约1000：1，至少约5000：1，至少约10,000：1或更多。对于有限稀释，在较高稀释度(即较低量)的输入病毒中通常可见更大的选择性。
[0059] 假型化的病毒颗粒的活性可以通过多种技术中的任何一种来确定。例如，测量感染性效率(IU，感染单位)的优选方法是将病毒颗粒给予细胞并测量载体基因组中编码的产物的表达。任何可以分析的产品都可以使用。一种便利类型的产品是荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)。实施例中示例了GFP和测定。可以使用的其他产品包括在细胞表面表达的蛋白质(例如，通过抗体结合检测)，酶等。为了检测IL-12，可以使用IL-12检测测定(例如，ELISA)或生物功能测定(参见例如，实施例1)。当产品包含抗原并且细胞是树突细胞时，可以通过确定抗原特异性免疫应答来评估感染性/活性。此外，有可能确定哺乳动物的副作用。也可以(例如)在如下所述的细胞培养中直接测试特异性靶向树突细胞的能力。
[0060] 还可以制备病毒颗粒并测试其选择性和/或其促进靶细胞膜穿透的能力。具有含未修饰糖蛋白的包膜的病毒颗粒可用作对照供于比较。简言之，表达包膜糖蛋白受体的细胞使用标准感染测定法被病毒感染。在指定的时间后，例如感染48小时后，可以收集细胞，并且可以通过例如流式细胞术确定被病毒感染的细胞的百分比。选择性可以通过计算被病毒感染的细胞百分比来评分。类似地，变体包膜糖蛋白对病毒滴度的影响可以通过被包含变体包膜的病毒感染的细胞百分比除以被包含相应野生型(未修饰的)包膜糖蛋白的病毒感染的细胞百分比来定量。特别合适的变体将具有选择性和感染滴度的最佳组合。一旦选择变体，可以进行病毒浓度测定以确认这些病毒可以被浓缩而不损害活性。收集病毒上清液并通过超速离心浓缩。病毒滴度可以通过病毒原液的有限稀释和表达包膜糖蛋白受体的细胞的感染来确定，度量如上所述的病毒表达的产物的表达。
[0061] 慢病毒载体颗粒进入靶细胞是另一种类型的活性评估。BlaM-Vpr(β-内酰胺酶Vpr)融合蛋白已用于评估HIV-1病毒穿透；BlaM和辛德毕斯病毒包膜糖蛋白例如E1或E2/E1融合蛋白的融合物可用于评估包膜蛋白在促进融合和穿入靶细胞中的功效。病毒颗粒可以通过例如用包含病毒元件，BlaM-Vpr，和目的变体包膜(和亲和分子，若适用)的一种或多种载体瞬时转染包装细胞来制备。所得病毒可用于感染表达分子的细胞，靶向分子(或亲和分子)在不存在或存在游离结合抑制剂(例如抗体)的情况下特异性结合。然后可以用不依赖CO2的培养基洗涤细胞并加载CCF2染料(Aurora生物科学公司)。在室温孵育以完成切割反应后，可以通过多聚甲醛固定细胞并通过流式细胞术和显微镜分析细胞。蓝色细胞的存在表明病毒穿入胞质；当加入封闭抗体时，可以预期存在更少的蓝色细胞(Cavrois等，Nat Biotechnol 20：1151-1154,2002；)。
[0062] 为了研究穿透是否依赖于低pH并且鉴定具有所需pH依赖性的包膜糖蛋白，可以在感染步骤添加改变pH的NH4Cl或其他化合物(NH4Cl将中和内涵体的酸性区室)。在NH4Cl的情况下，蓝色细胞的消失将表明病毒的穿透是低pH依赖性的。另外，为了证实活性是pH依赖性的，可以将溶血粘附剂例如氯化铵、氯喹、球菌霉素、巴弗洛霉素A1、莫能菌素、黑曲霉素等加入孵育缓冲液中。这些试剂提高了内涵体区室内的pH值(例如，Drose和Altendorf,J.Exp.Biol.200,1-8,1997)。这些试剂的抑制作用将揭示pH对病毒融合和进入的作用。展示不同促融合分子的病毒之间的不同进入动力学可以进行比较并且选择最适合的用于特定应用。
[0063] 基于PCR的进入测定可用于监测病毒DNA合成的逆转录和测量动力学，作为病毒进入动力学的指示。例如，将包含特定包膜蛋白分子的病毒颗粒与经过工程改造以表达或天然表达该包膜蛋白分子的合适结合伴侣(受体)的靶细胞例如293T细胞、DC或其他细胞一起孵育。立即或在一段时间增量后(以使感染发生)，去除未结合的病毒并分析细胞的等分试样中的病毒核酸。从这些等分试样中提取DNA并进行扩增分析，通常在半定量测定中，用LTR特异性引物引发。LTR特异性DNA产物的出现表明病毒成功进入。
[0064] B.慢病毒载体基因组
[0065] 病毒载体颗粒包含基因组，其包含编码IL-12例如sclL-12的序列以及任选地一个或多个其它感兴趣序列。可以包括其他序列，例如允许基因组被包装到病毒颗粒中的序列和在转导靶细胞后促进感兴趣序列表达的序列。基因组可以源自基于慢病毒基因组的大量合适的、可用的载体中的任何一种，包括那些针对人类基因治疗应用而鉴定的载体，例如Pfeifer和Verma(Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177-211,2001；)。为了简单起见，该基因组也被称为“病毒载体基因组”或“载体基因组”。
[0066] 1.骨架
[0067] 合适的慢病毒载体基因组包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和梅迪/维斯纳(maedi/visna)病毒的基因组。慢病毒的理想特征是它们能够感染分裂和非分裂细胞，不必使靶细胞分裂(或刺激靶细胞分裂)。通常，基因组和包膜糖蛋白将基于不同的病毒，使得所得病毒载体颗粒被假型化。载体基因组的安全特征理想地被并入。安全特征包括自灭活LTR和整合缺陷型基因组/颗粒。示例性载体描述于WO2011/011584中，并且此类载体可用于本发明的实施方式中用于表达感兴趣的序列，包括IL-12，其他免疫刺激分子，细胞因子和感兴趣抗原。
[0068] 在一些示例性实施方式中，病毒载体基因组包含来自慢病毒基因组(例如HIV-1基因组或SIV基因组)的序列。病毒基因组构建体可以包含来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体地可以包含来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的经灭活的或自灭活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可能是来自HIV，SIV，FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
[0069] 载体基因组可包含经灭活的或自灭活3'LTR(Zufferey等，J Virol 72:9873,1998；Miyoshi等，J Virol 72:8150,1998；)。自灭活载体通常具有来自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列的缺失，其在载体整合过程中被复制到5'LTR中。在一个示例中，3'LTR的U3元件含有其TATA盒、Sp1、NF-κB位点和增强子序列的缺失。由于自灭活3'LTR，在进入和逆转录后产生的前病毒将包含灭活的5'LTR。其基本原理是通过降低载体基因组动员的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。自灭活3'LTR可以通过本领域已知的任何方法构建。
[0070] 任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以用病毒构建体中的启动子序列，如异源启动子序列，替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒滴度。增强子序列也可以包括在内。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个示例中，使用CMV增强子/启动子序列(US 5385839和US 5168062)。
[0071] 在某些实施方式中，通过将慢病毒载体基因组构建为整合缺陷型来使插入型诱变的风险最小化。可以采用多种方法来产生非整合/整合缺陷型载体基因组。这些方法需要将突变构建到pol基因的整合酶组分中，从而其编码具有失活的整合酶的蛋白质。载体基因组本身可以被修饰以通过例如突变或缺失两个附着位点之一或两者或经由缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤道(PPT)非功能来防止整合。此外，还有非遗传方法；这些包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学试剂。这些方法不是相互排斥的，也就是说，一次可以使用其中的多于一种。例如，整合酶和附着位点都可以是非功能性的，或者整合酶和PPT位点可以是非功能性的，或者附着位点和PPT位点可以是非功能性的，或者它们都可以是非功能性的。
[0072] 如上所述，一种方法是制造和使用非功能性整合酶。整合酶涉及切割病毒双链钝末端DNA并将两端连接到染色体靶位点的两条链中的5'-磷酸酯。整合酶有三个功能结构域：N-末端结构域，其含有锌结合基序(HHCC)，中央结构域核心包含催化核心和保守的DD35E基序(HIV-1中的D64，D116，E152)，和具有DNA结合特性的C末端结构域。引入整合酶的点突变足以破坏正常功能。已经构建和表征了许多整合酶突变(参见，Philpott和Thrasher，Human Gene Therapy 18：483,2007；Apolonia,提交至伦敦大学学院的理论(Thesis submitted to University College London),2009年4月,82-97页；Engelman等J Virol 69:2729,1995；Nightingale等Mol Therapy,13:1121,2006；)。编码整合酶蛋白的序列可以缺失或突变以使蛋白质灭活，优选不显著损害逆转录酶活性或核靶向，从而仅防止前病毒整合入靶细胞基因组。可接受的突变可以减少整合酶催化、链转移、与att位点的结合、与宿主染色体DNA的结合以及其他功能。例如，HIV或SIV整合酶残基35处的单个天冬氨酸至天冬酰胺的取代完全消除了病毒DNA整合。整合酶的缺失通常限于C端域。缺失残基235-288的编码序列产生有用的非功能性整合酶(Engelman等，J Virol 69:2729,1995)。作为进一步的示例，可以产生突变，例如Asp64(针对HIV-1的残基编号，来自其他慢病毒或逆转录病毒的整合酶的相应残基编号可由本领域技术人员容易地确定)(例如D64E，D64V)，Asp116(例如D116N)，Asn120(例如N120K)，Glu152，Gln148(例如Q148A)，Lys156，Lys159，Trp235(例如，W235E)，Lys264(例如K264R)，Lys266(例如K266R)，Lys273(例如K273R)。可以构建其他突变并测试整合，转基因表达和任何其他期望的参数。这些功能的测定是众所周知的。可通过多种技术中的任何技术产生突变，包括核酸序列的化学合成和定点诱变。可以进行一个突变或者可以在整合酶中存在多于一个这些突变。例如，整合酶可在两个氨基酸，三个氨基酸，四个氨基酸等处具有突变。
[0073] 替代性或联合性地，利用整合酶突变体，U3和U5中的附着位点(att)也可以被突变。整合酶与这些位点结合，并且3'末端二核苷酸在载体基因组的两端被切割。CA二核苷酸位于3'末端的凹陷处；处理需要CA，核苷酸的突变阻断向宿主染色体的整合。CA二核苷酸的A是整合的最关键的核苷酸，并且基因组两端的突变将产生最佳结果(Brown等，J Virol 73：9011(1999))。在一个示例中，每端的CA被改为TG。在其他示例中，每端的CA在一端改为TG，在另一端改为GT。在其他示例中，缺失每端的CA；在其他示例中，CA的A在每个末端被缺失。
[0074] 整合也可以通过位于3'LTR附近的聚嘌呤道(PPT)(WO2009/076524；)的突变或缺失来抑制。PPT是约15个核苷酸的多嘌呤序列，其可以用作正链DNA合成的引物结合位点。在这种情况下，PPT的突变或缺失靶向逆转录过程。不希望受到机制的影响，通过突变或缺失PPT，线性DNA的产生从根本上减少并且基本上仅产生1-LTR DNA环。整合需要线性双链DNA载体基因组，在其缺乏的情况下整合基本上被消除。如上所述，可以通过突变或缺失使PPT失去功能。通常，约15nt的PPT整体缺失，尽管在一些实施方式中，可制备更短的14nt，13nt，12nt，11nt，10nt，9nt，8nt，7nt，6nt，5nt，4nt，3nt和2nt的缺失。当进行突变时，通常发生多重突变，特别是在PPT的5'半部分中(McWilliams等人，J Virol 77:11150,2003)，尽管前四个碱基中的单和双突变仍然减少转录。在PPT的3'末端产生的突变通常具有更显著的效果(Powell和Levin J Virol 70：5288,1996)。
[0075] 产生载体基因组非整合的这些不同方法可以单独使用或组合使用。可以使用多种方法来通过冗余机制构建容错(fail-safe)载体。因此，可以将PPT突变或缺失与att位点突变或缺失组合或与整合酶突变组合，或者可以将PPT突变或缺失与att位点突变或缺失以及整合酶突变组合。类似地，att位点突变或缺失和整合酶突变可以相互组合或与PPT突变或缺失相组合。
[0076] 2.调节元件
[0077] 如本文所讨论的，病毒载体基因组包含编码IL-12的序列和任选的期望在靶细胞中表达的一种或多种其他感兴趣核酸。为了简单起见，术语“感兴趣核酸”(SOI)用于表示IL-12，并且在某些实施方式中，是指一种或多种其他感兴趣序列(例如一种或多种其他免疫刺激分子，细胞因子或一种或多种抗原)。通常，感兴趣序列位于5'LTR和3'LTR序列之间。此外，编码IL-12的序列和任何其它感兴趣序列优选与其它遗传元件(例如包括启动子或增强子的转录调节序列)形成功能性关系，从而以特定方式调节感兴趣序列的表达。在某些情况中，有用的转录调节序列是那些在时间和空间上都对活性高度调节的序列。可用于调节组分表达的表达控制元件是本领域已知的，并且包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子或其它调节元件。
[0078] 感兴趣的序列和任何其它可表达序列通常与内部启动子/增强子调节序列功能性相关。“内部”启动子/增强子位于病毒载体构建体中5'LTR和3'LTR序列之间，并且可操作地连接感兴趣的序列。内部启动子/增强子可以是任何启动子、增强子或已知以功能性关系的方式增强基因表达的启动子/增强子组合。“功能性关系”和“可操作地连接”非限制性地表示，就启动子和/或增强子而言，序列处于正确的位置和方向，当启动子和/或增强子与正确分子接触时，感兴趣的序列将会被表达。
[0079] 内部启动子/增强子的选择是基于感兴趣的序列所需的表达模式以及已知启动子/增强子的特殊性质。因此，内部启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括泛素启动子(US 5510474；WO 98/32869,),CMV(Thomsen等,PNAS 81:659,1984；US 5168062,),β-肌动蛋白(Gunning等1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:
4831-4835,)和pgk(参见例如,Adra等1987 Gene 60:65-74；Singer-Sam等1984 Gene 32:
409-417；和Dobson等1982 Nucleic Acids Res.10:2635-2637,)。
4831-4835,)和pgk(参见例如,Adra等1987 Gene 60:65-74；Singer-Sam等1984 Gene 32:
409-417；和Dobson等1982 Nucleic Acids Res.10:2635-2637,)。
[0080] 或者，该启动子可以是组织特异性启动子。在一些优选实施方式中，启动子是靶细胞特异性启动子。例如，启动子可以来自由树突细胞表达的任何产物，包括CD11c，CD103，TLR，DC-SIGN，BDCA-3，DEC-205，DCIR2，甘露糖受体，Dectin-1，Clec9A，MHC II类。此外，可以选择启动子以允许感兴趣序列的诱导型表达。用于诱导型表达的许多系统是本领域已知的，包括四环素响应系统，lac操纵子-阻遏物系统，以及对多种环境或生理变化响应的启动子，包括对热休克、金属离子，如金属硫蛋白启动子，对干扰素、缺氧、类固醇，如孕酮或糖皮质激素受体启动子，对辐射，如VEGF启动子。启动子的组合也可用于获得感兴趣基因的所需表达。普通技术人员将能够基于生物体或感兴趣的靶细胞中所需的基因表达模式来选择启动子。
[0081] 病毒基因组可以包含至少一个RNA聚合酶II或III响应性启动子。可以将该启动子可操作地连接至感兴趣的序列，并且也可以连接至终止序列。此外，可以纳入超过一个RNA聚合酶II或III启动子。RNA聚合酶II和III启动子为本领域普通技术人员熟知。合适范围的RNA聚合酶III启动子可在例如Paule和White,Nucleic Acids Research.,28卷,1283-1298页(2000)中找到。RNA聚合酶II和III启动子还包括任何合成的或工程改造的DNA片段，其可以指导RNA聚合酶II或III转录下游RNA编码序列。此外，RNA聚合酶II或III(Pol II或III)启动子或用作病毒载体基因组部分的启动子可以是诱导型的。本发明所述方法可以使用任何合适的诱导型Pol II或III启动子。特别适合的Pol II或III启动子包括四环素响应启动子，在Ohkawa和Taira,Human Gene Therapy,11卷,577-585页(2000)和Meissner等Nucleic Acids Research,29卷,1672-1682页(2001)中提供。
[0082] 病毒构建体中可能还存在内部增强子以增强感兴趣的基因的表达。例如，可以使用CMV增强子(Boshart等，Cell,41:521,1985；)。哺乳动物基因组中和病毒基因组(如HIV、CMV)中许多增强子已经被鉴定和表征(参见GenBank)。增强子可与异源启动子联用。本领域普通技术人员将能够根据所需表达模式选择适当的增强子。
[0083] 病毒载体基因组通常含有被靶细胞识别的启动子，其可操作地连接到感兴趣序列、病毒组分和本文所述的其他序列。启动子是由允许RNA聚合酶结合并发生转录的核酸序列形成的表达控制元件。启动子可以是诱导型，组成型，时间活性或组织特异性的。诱导型启动子的活性由存在或不存在生物或非生物因素来诱导。诱导型启动子可以成为基因工程中有用的工具，因为它们可操作地连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段、其生产或特定组织中打开或关闭。诱导型启动子可以分组为化学调节的启动子和物理调节的启动子。典型的化学调节的启动子包括但不限于醇调节的启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子)，四环素调节的启动子(例如四环素响应性启动子)，类固醇调节的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体(GR)的启动子，基于人雌激素受体(ER)的启动子，基于蛾蜕皮激素受体的启动子和基于类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)，金属调节的启动子(例如基于金属硫蛋白基因的启动子)和发病机理相关的启动子(例如基于拟南芥和玉米病原体相关(PR)蛋白的启动子)。典型的物理调节的启动子包括但不限于温度调节的启动子(例如热休克启动子)和光调节的启动子(例如大豆SSU启动子)。其他示例性启动子在其他地方描述，例如，在2009年5月18日访问的Patent Lens网站的“用于调节基因表达的启动子(Promoters used to regulate gene expression)”中。
[0084] 本领域技术人员将能够根据具体情况选择合适的启动子。许多不同的启动子在本领域中是众所周知的，用于将启动子可操作地连接到待表达的基因的方法也是众所周知的。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于在包装细胞和靶细胞中指导表达。然而，异源启动子是优选的，因为与天然启动子相比，它们通常允许更高的转录和更高产量的所需蛋白质。
[0085] 启动子可以获自例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)等病毒的基因组。启动子还可以是例如异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，热休克启动子或通常与天然序列相关的启动子，条件是这种启动子与靶细胞相容。在一个实施方式中，启动子是病毒表达系统中天然产生的病毒启动子。在一些实施方式中，启动子是树突细胞特异性启动子。树突细胞特异性启动子可以是，例如，CD11c启动子。
[0086] 通过将增强子序列插入载体可以增加转录。增强子通常是DNA的顺式作用元件，通常长约10-300bp，作用于启动子以增加其转录。现在已知哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中的许多增强子序列。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在抗原特异性多核苷酸序列的5'或3'位置剪接入载体，但优选位于启动子的5'位点。
[0087] 表达载体还可以含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这些序列通常在真核或病毒DNA或cDNA的5'(偶尔在3')非翻译区中发现，并且是本领域公知的。
[0088] 病毒载体基因组还可以包含其他遗传元件。可以包括在构建体中的元件的类型不受任何限制，并且可以对其进行选择以获得特定结果。例如，可以包括促进靶细胞中病毒基因组进入核的信号。这种信号的一个示例HIV-1 cPPT/CTS信号(DNA侧翼)。此外，可以包括有助于表征靶细胞中前病毒整合位点的元件。例如，构建体中可以包括tRNA琥珀抑制子序列。病毒基因组构建体中也可以包括来自例如鸡β-球蛋白的绝缘子序列。由于甲基化和异染色质化作用，该元件降低在靶细胞中使整合的前病毒沉默的可能性。此外，绝缘子可以使内部增强子、启动子和外源基因免受染色体上整合位点周围DNA的正向或负向位置效应的影响。此外，载体基因组可以包括设计成增强感兴趣的基因表达的一个或多个遗传元件。例如，可将土拨鼠肝炎病毒响应元件(WRE)置于构建体中(Zufferey等1999.J.Virol.74:3668-3681；Deglon等2000.Hum.Gene Ther.11:179-190,)。
[0089] 病毒载体基因组通常以可转染到包装或生产者细胞系中的质粒形式构建。质粒通常包含用于在细菌中复制质粒的序列。这样的质粒为本领域熟知。此外，包括原核生物复制起点的载体也可以包括其表达赋予可检测或选择性标志物例如耐药性的基因。典型的细菌耐药性产品是赋予氨苄青霉素或四环素抗性的产品。
[0090] 含有本文所述的一种或多种组分的质粒可以使用本领域公知的标准技术容易地构建。为了分析以确认构建的质粒中的正确序列，可以将质粒在大肠杆菌中复制，纯化，并通过限制性内切酶消化进行分析或通过常规方法确定其DNA序列。
[0091] 也可以使用构建用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，使得宿主细胞积累表达载体的许多拷贝，继而合成高水平的由表达载体中的抗原特异性多核苷酸编码的多肽。参见Sambrook等，同上，16.17-16.22页。适于多肽表达的其他载体和方法在本领域中是公知的，并且容易适应具体情况。
[0092] 使用本文提供的教导，本领域技术人员将认识到，可通过用包含编码报道蛋白的基因的载体转染包装细胞并使用合适的技术(例如测量来自绿色荧光蛋白缀合物的荧光)测量表达来测试特定表达系统的功效。合适的报道基因在本领域中是众所周知的。
[0093] 3.感兴趣序列的类型
[0094] 本文所述的逆转录病毒载体编码IL-12和任选的其他感兴趣序列，包括但不限于免疫刺激分子，细胞因子，趋化因子，感兴趣抗原，检查点抑制剂等。
[0095] 编码IL-12的多核苷酸序列是本领域已知的并可在公共数据库中获得。如本领域普通技术人员容易理解的，IL-12是对免疫系统具有多种生物学作用的异二聚细胞因子。它由两个亚基p35和p40组成，这两个亚基都是分泌活性形式的IL-12，p70所必需的。在一个实施方式中，IL-12序列(表达盒)包含指导IL-12多肽表达的多核苷酸。可以使用包括已知IL-12分子的变体和衍生物的任何IL-12多肽，其中变体和衍生物保留IL-12活性。可以使用本领域已知的测定法(例如，如实施例1中所述)测量IL-12活性。在一个实施方式中，IL-12是人IL-12。在另一实施方式中，IL-12是鼠IL-12。在一个实施方式中，多核苷酸包含IL-12亚基p35和p40的序列，由允许从单一转录物表达多个转基因的IRES序列分隔。在具体的实施方式中，本文所述的载体编码单链IL-12(scIL-12)。在这方面，单链融合蛋白可以以任一方向编码IL-12亚基，并且在某些实施方式中可以包括2个亚基之间的接头，例如p35-L-p40或p40-L-p35。“接头”是接合或连接其他肽或多肽的肽，例如约2至约150个氨基酸的接头。多种接头中的任一种在本领域中是已知的并且可以在本文中使用(参见例如Adv Drug Deliv Rev.2013年10月；65(10):1357-69)。在某些实施方式中，接头是弹性蛋白接头。
[0096] 其他感兴趣序列也可以包含在本文所述的病毒载体中。因此，就此而言，感兴趣序列不受任何限制，并且包括普通技术人员希望在靶细胞中转录并表达的任何核酸。该产品可以是蛋白质或核酸。感兴趣序列可以编码蛋白质或核酸分子，包括siRNA、微小RNA、自互补双链RNA(其中互补区长度大于约20个核糖核苷酸)或与信息RNA互补的RNA，其中互补(反义)RNA与信息RNA的结合阻断其翻译成蛋白质的能力。在一些情况下，感兴趣序列可以编码抗原，其中针对该抗原的免疫应答是期望的。具体而言，需要来自诸如HIV，HSV，HCV，HPV，疟疾或结核病的试剂的感染性疾病抗原和肿瘤抗原。
[0097] 在某些情况下，目的序列可以是编码下调分子表达的感兴趣的小抑制RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)的基因。例如，编码siRNA或微小RNA的基因可用于下调细胞中负调节物的表达，包括抑制树突细胞活化或成熟的那些。siRNA和微小RNA是本领域众所周知的(Fire等，Nature 391:806,1998；还参见，应用生物系统的“RNA干扰来源”(“The RNA Interference Resource”of Applied Biosystems),Trang等,Oncogene增刊2:S52,2008；Taganov,K.,等2007.Immunity 26:133-137；Dahlberg,J.E.和E.Lund.2007.Sci.STKE
387:pe25；Tiemann和Rossi,EMBO Mol Med 1:142,2009)。或者，感兴趣序列可编码自互补双链RNA，其中互补区域长度大于约20个核糖核苷酸，或编码大于约20个核糖核苷酸长度的反义RNA。本领域普通技术人员将会理解，siRNA，miRNA，dsRNA和反义RNA分子可以从RNA聚合酶III启动子表达，或者可以是从RNA聚合酶II启动子转录的非编码RNA的组分。
387:pe25；Tiemann和Rossi,EMBO Mol Med 1:142,2009)。或者，感兴趣序列可编码自互补双链RNA，其中互补区域长度大于约20个核糖核苷酸，或编码大于约20个核糖核苷酸长度的反义RNA。本领域普通技术人员将会理解，siRNA，miRNA，dsRNA和反义RNA分子可以从RNA聚合酶III启动子表达，或者可以是从RNA聚合酶II启动子转录的非编码RNA的组分。
[0098] 此外，感兴趣序列包括编码IL-12的序列，并且还可以包括编码多于一种产物的序列。在一些构型中，待递送的序列可包含编码下述的多个基因：至少一种蛋白质，至少一种siRNA，至少一种微小RNA，至少一种dsRNA或至少一种反义RNA分子或其任何组合。例如，待递送的序列可以包括IL-12和编码一种或多种抗原的一种或多种基因，其中针对该抗原的免疫应答是期望的。一个或多个抗原可与单一疾病或病症相关联，或者其可与多种疾病和/或病症相关联。在一些情况下，可以将编码免疫调节蛋白的基因与编码抗原(针对该抗原的免疫应答是期望的)的基因一起包含在内，并且该组合可以引发并调节免疫应答至期望的方向和幅度。因此，在某些实施方式中，载体可以包含编码IL-12的序列，编码抗原的序列和编码免疫调节蛋白的序列。该产物可以作为初始融合产物产生，其中编码序列与一个启动子具有功能性关系。或者，产物可以分开编码，并且各编码序列与启动子为功能性关系。启动子可以相同或不同。
[0099] 如他处所述，在某些实施方式中，本文所述的病毒载体包含编码IL-12的序列和编码与疾病或病症相关的一种或多种抗原的感兴趣序列。与疾病或病症相关的任何抗原可以使用本文所述的病毒颗粒递送至树突细胞。与疾病或病症相关的抗原是经鉴别的。与许多疾病和病症有关的抗原在本领域中是众所周知的。可预先知道抗原与疾病或病症相关，或可通过本领域已知的任何方法鉴定。例如，患者所患癌症的类型的抗原可能是已知的，例如肿瘤相关抗原，或者可以通过本领域已知的多种方法中的任一种从肿瘤本身鉴定。
[0100] 肿瘤相关抗原对于多种癌症是已知的，包括例如肾细胞癌，前列腺癌，黑素瘤和乳腺癌。例如，在一些乳腺癌中，Her-2受体在癌细胞表面过表达。示例性的肿瘤抗原包括但不限于前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1,前列腺特异性膜抗原,PRAME；BAGE；RAGE,NY-ESO-1,SAGE,HAGE,GAGE,Plu-1,HASH-1,HasH-2,Cripto,Criptin,MART-1/Melan-A,gp100,gp75,mda-7,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关蛋白,p53,Ras,c-Myc,A-Raf,B-Raf,和C-Raf,MAGE-A1,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A6,MAGE-A10,MAGE-A12,MART-1,BAGE,DAM-6,-10,GAGE-1,GAGE-2,GAGE-8,GAGE-3,GAGE-4,GAGE-5,GAGE-6,GAGE-7B,NA88-A,MART-1,MC1R,Gp100,PSM,TRP-1,TRP-2,ART-4,CAMEL,CEA,Cyp-B,hTERT,hTRT,iCE,MUC1,MUC2,PRAME,P15,RU1,RU2,SART-1,SART-3,维尔姆斯肿瘤抗原(WT1),AFP,β-连环蛋白/m,胱冬酶-8/m,CEA,CDK-4/m,ELF2M,GnT-V,G250,HSP70-2M,HST-2,KIAA0205,MUM-1,MUM-2,MUM-3,肌球蛋白/m,SART-2,TRP-2/INT2,707-AP,膜联蛋白II,CDC27/m,TPI/mbcr-abl,BCR-ABL,干扰素调节因子4(IRF4),ETV6/AML,LDLR/FUT,Pml/RAR,肿瘤相关的钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2,表皮生长因子受体(EGFR和EGFRvIII),血小板衍生的生长因子受体(PDGFR),血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR),整合素连接激酶(ILK),STAT3,STAT5,STAT6,HIF-1,HIF-2,核因子-κB(NF-κB),Notch1-4,c-Met,雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR),WNT,PMSA,PR-3,MDM2,间皮素(Mesothelin),肾细胞癌–5T4,SM22-α,碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250),STEAD,TEL/AML1,GD2,蛋白酶3,hTERT,肉瘤易位断点,EphA2,ML-IAP,EpCAM,ERG(TMPRSS2 ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,细胞周期蛋白B1,聚唾液酸,MYCN,RhoC,GD3,岩藻糖基GM1,间皮素(mesothelian),PSCA,sLe,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GLoboH,NY-BR-1,RGs5,SART3,STn,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,SSX2,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白(legumain),TIE2,Page4,MAD-CT-1,FAP,MAD-CT-2,和fos相关抗原1。已经综述了许多肿瘤相关抗原(参见例如“T淋巴细胞识别的肿瘤抗原(Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes)，“Boon T，Cerottini JC，Vandeneynde B，Vanderbruggen P，Vanpel A，Annual Review Of Immunology 12：337-
365,1994；“T细胞识别的人类肿瘤抗原的列表(A listing of human tumor antigens recognized by T cells)”，Renkvist N,Castelli C,Robbins P F,Parmiani G.Cancer Immunology Immunotherapy 50:(1)3-15MAR 2001)。
365,1994；“T细胞识别的人类肿瘤抗原的列表(A listing of human tumor antigens recognized by T cells)”，Renkvist N,Castelli C,Robbins P F,Parmiani G.Cancer Immunology Immunotherapy 50:(1)3-15MAR 2001)。
[0101] 抗原也可以是与感染性疾病相关的抗原，例如HIV/AIDS。抗原可以是，例如，gp120(Klimstra,W.B.,等2003.J Virol 77:12022-12032；Bernard,K.A.,等2000.Virology 276:93-103；Byrnes,A.P.,等1998.J Virol 72:7349-7356,)。其他示例性抗原包括但不限于：gag,pol,env,tat,nef和rev(Lieberman,J.等1997.AIDS Res Hum Retroviruses 13(5):383-392；Menendez-Arias,L.等1998.Viral Immunol 11(4):167-181,)。
[0102] 病毒抗原的实例包括但不限于腺病毒多肽，α病毒多肽，杯状病毒多肽，例如杯状病毒衣壳抗原，冠状病毒多肽，瘟热病毒多肽，埃博拉病毒多肽，肠道病毒多肽，黄病毒多肽，肝炎病毒(AE)多肽例如乙型肝炎核心或表面抗原或丙型肝炎病毒E1或E2糖蛋白，核心或非结构蛋白，疱疹病毒多肽例如单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白，免疫缺陷病毒多肽例如人类免疫缺陷病毒包膜或蛋白酶，感染性腹膜炎病毒多肽，流感病毒多肽例如A型流感血凝素，神经氨酸酶或核蛋白，白血病病毒多肽，马尔堡病毒多肽，正粘病毒多肽，乳头瘤病毒多肽，副流感病毒多肽，例如血凝素/神经氨酸酶，副粘病毒多肽，细小病毒多肽，瘟病毒多肽，皮诺病毒多肽，例如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，痘病毒多肽，例如牛痘病毒多肽，狂犬病病毒多肽，例如狂犬病病毒糖蛋白G，呼肠孤病毒多肽，逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
[0103] 细菌抗原的示例包括但不限于放线菌多肽，芽孢杆菌多肽，拟杆菌多肽，博德特氏菌属多肽，巴尔多氏球菌多肽，疏螺旋体多肽，例如布氏梭菌OspA，布鲁氏菌多肽，弯曲杆菌多肽，噬二氧化碳胞菌多肽，衣原体多肽，梭菌多肽，棒状杆菌多肽，柯克斯体多肽，嗜皮菌多肽，肠球菌多肽，埃利希氏菌多肽，埃希氏菌属多肽，弗朗西斯氏菌多肽，梭杆菌多肽，血巴尔通体多肽，嗜血杆菌多肽，例如流感嗜血杆菌b型外膜蛋白，螺杆菌多肽，克雷伯菌多肽，L-型细菌多肽，钩端螺旋体多肽，李斯特菌多肽，分枝杆菌多肽，支原体多肽，奈瑟氏球菌多肽，新立克次氏体多肽，诺卡氏菌多肽，巴氏杆菌多肽，消化球菌多肽，消化链球菌多肽，肺炎球菌多肽，变形菌多肽，假单胞菌多肽，立克次氏体多肽，罗卡利马体多肽，沙门氏菌多肽，志贺菌多肽，葡萄球菌多肽，链球菌多肽，例如化脓性链球菌M蛋白，密螺旋体多肽和耶尔森氏菌多肽，例如鼠疫耶尔森氏菌F1和V抗原。
[0104] 真菌抗原的示例包括但不限于：犁头霉菌多肽，支顶孢菌多肽，链格孢菌多肽，曲霉菌多肽，蛙粪霉菌多肽，离蠕孢菌多肽，芽生菌多肽，念珠菌多肽，孢子菌多肽，耳霉菌多肽，隐球菌多肽，弯孢菌多肽，表皮癣菌多肽，嗜热菌多肽，地霉菌多肽，组织胞浆菌多肽，马杜拉分支菌多肽，马拉色菌多肽，小孢霉菌多肽，丛梗孢菌多肽，被孢霉菌多肽，毛霉菌多肽，拟青霉菌多肽，青霉菌多肽，单胞瓶霉菌(Phialemonium)多肽，拟盘孢菌多肽，原囊藻多肽，假埃希氏菌多肽，假微结节菌(Pseudomicrodochium)多肽，腐霉菌多肽，鼻孢子菌多肽，根霉菌多肽，齿梗孢菌(Scolecobasidium)多肽，孢子丝菌(Sporothrix)多肽，匍柄霉菌(Stemphylium)多肽，毛癣菌多肽，丝孢酵母菌多肽和斑替木丝霉菌(Xylohypha)多肽。
[0105] 原生动物寄生虫抗原的示例包括但不限于：巴贝虫多肽，巴龙盲蝽多肽，贝斯诺虫多肽，隐孢子虫多肽，艾美球虫多肽，脑包内原虫多肽，内阿米巴虫多肽，贾第鞭毛虫多肽，哈蒙虫多肽，肝簇虫多肽，等孢球虫多肽，利什曼虫多肽，微孢子虫多肽，新孢子虫多肽，龙船草多肽，毛滴科五鞭虫多肽，疟原虫多肽，例如卵形疟原虫环子孢子(PfCSP)，子孢子表面蛋白2(PfSSP2)，肝脏状态抗原1的羧基末端(PfLSAI c-末端)和输出蛋白1(PfExp-1)，肺囊原虫多肽，肉孢子虫多肽，血吸虫多肽，泰勒虫多肽，弓形虫多肽和锥虫多肽。
[0106] 蠕虫寄生虫抗原的示例包括但不限于：棘唇线虫多肽，猫圆线虫多肽，钩虫多肽，管圆线虫多肽，蛔虫多肽，布鲁线虫多肽，仰口线虫多肽，毛细线虫多肽，夏柏特线虫多肽，古柏线虫多肽，齿线虫(Crenosoma)多肽，网尾线虫多肽，膨结线虫多肽，双瓣线虫多肽，裂头绦虫多肽，复孔绦虫多肽，恶丝虫多肽，龙线虫多肽，住肠线虫多肽，肺线虫(Filaroides)多肽，血矛线虫多肽，兔唇蛔多肽，罗阿丝虫多肽，曼森线虫多肽，缪勒线虫多肽，侏体吸虫多肽，板口线虫多肽，细颈线虫多肽，结节线虫多肽，盘尾丝虫多肽，后睾吸虫多肽，奥斯特线虫多肽，副丝虫多肽，并殖吸虫多肽，副蛔虫多肽，泡翼线虫多肽，原圆线虫多肽，狗尾草(Setaria)多肽，螺旋体多肽，迭宫绦虫多肽，冠丝虫多肽，粪线虫多肽，圆线虫多肽，吸吮线虫多肽，弓蛔虫多肽，弓首蛔虫多肽，旋毛虫多肽，毛样线虫多肽，毛首线虫多肽，钩线虫多肽和吴策线虫多肽。
[0107] 外寄生虫抗原的示例包括但不限于来自下述的多肽(包括保护性抗原以及过敏原)：跳蚤；蜱，包括硬蜱和软蜱；苍蝇，如蠓，蚊，沙蝇，黑蝇，马蝇，角蝇，鹿蝇，采采蝇，舌蝇，厩蝇，引起蝇蛆病的苍蝇和咬人蠓虫；蚂蚁；蜘蛛，虱子；螨虫；和蝽类，比如臭虫和锥蝽。
[0108] 一旦鉴定并选择了抗原，就鉴定编码所需抗原的序列。优选地，该序列包含cDNA。然后使用本领域已知的标准方法将序列克隆到病毒载体基因组中。
[0109] 在一些实施方式中，载体包括编码免疫调节分子的多核苷酸序列。示例性免疫调节分子包括多种细胞因子中的任何一种。本文所用“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的统称，其作用于另一细胞作为细胞间介导物。这类细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。考虑用于本文的其他免疫调节分子包括B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体(CD40L)，药物诱导型CD40(iCD40)等。在某些实施方式中，这些多核苷酸通常受控于一种或多种调控元件，其指导编码序列在树突细胞中的表达。
[0110] 在某些实施方式中，由本文所述的表达IL-12的载体编码的免疫调节分子是检查点抑制剂分子。免疫检验点指免疫系统的多个抑制性通路，其对于维持自身耐受性和调控免疫应答的持续时间和幅度十分重要。肿瘤将某些免疫检验点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是对肿瘤抗原有特异性的T细胞。(参见，例如，Pardoll,2012 Nature 12:252；Chen和Mellman 2013 Immunity 39:1)。本公开内容提供了编码免疫检查点抑制剂的载体。免疫检验点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何试剂。这类抑制剂可包括抗体或其抗原结合片段(其结合并阻断或抑制免疫检验点受体)或结合并阻断或抑制免疫检验点受体配体的抗体。可被靶向用于阻断或抑制的说明性免疫检验点分子包括但不限于，CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并表达在+所有NK、γδ和记忆CD8(αβ)T细胞上)、CD160(也称作BY55)和CGEN-15049。免疫检验点抑制剂包括这样的抗体或其抗原结合片段或其他结合蛋白，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。说明性免疫检验点抑制剂包括下述抗体的任一或其抗原结合片段：特姆单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)、抗-OX40、PD-L1单克隆抗体(抗-B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、尼莫单抗(Nivolumab)(抗-PD1抗体)、CT-
011(抗-PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗-PDL1抗体)、BMS-936559(抗-PDL1抗体)、MPLDL3280A(阿特珠单抗，抗-PDL1抗体)、MSB0010718C(抗-PDL1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗-CTLA-4检验点抑制剂)。
011(抗-PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗-PDL1抗体)、BMS-936559(抗-PDL1抗体)、MPLDL3280A(阿特珠单抗，抗-PDL1抗体)、MSB0010718C(抗-PDL1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗-CTLA-4检验点抑制剂)。
[0111] 可以包括编码可检测产物(通常是蛋白质)的序列以允许鉴定表达所需产物的细胞。例如，将荧光标志物蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)与感兴趣序列(例如，编码抗原的序列)一起纳入构建体中。在其他情况下，蛋白质可以被抗体检测到，或者蛋白质可以是作用于底物以产生可检测产物的酶，或是允许对转染或转导的靶细胞进行选择的产物，例如赋予耐药性，如潮霉素抗性。典型的选择基因编码赋予对下述耐受的蛋白质：适用于真核细胞的抗生素或其它毒素(例如新霉素，甲氨蝶呤，杀稻瘟菌素等本领域已知的)或其他补体营养缺陷，或者从培养基中扣除的关键营养素供应。可选择标志物可以任选地存在于单独的质粒上并通过共转染引入。
[0112] 可以使用一个或多个多顺反子表达单元，其包括所需的两个或更多元件(例如感兴趣序列，包膜分子，DC成熟因子)，用于在靶细胞中表达多个感兴趣序列或者用于在包装细胞中产生所需病毒所需的辅助蛋白的表达。多顺反子载体的使用减少了所需的核酸分子的总数，并因此避免了与来自多个载体基因组的协同表达相关的可能困难。在多顺反子载体中，待表达的各种元件与一个或多个启动子(和必要时的其他表达控制元件)可操作地连接。在一些构型中，多顺反子载体包含感兴趣序列，编码报道产物的序列和病毒元件。感兴趣序列包括IL-12，并且任选地还编码抗原，并且在某些实施方式中还可以包括额外的免疫刺激分子，检查点抑制剂或其他细胞因子。有时，多顺反子载体包含编码IL-12的基因，抗原，编码另一种免疫刺激分子的基因和病毒元件。
[0113] 在多顺反子表达载体中表达的各组分可以例如通过内部核糖体进入位点(IRES)元件或病毒2A元件分开，以允许来自相同启动子的各种蛋白质的分开表达。IRES元件和2A元件在本领域中是已知的(美国专利号4,937,190；de Felipe等2004.Traffic 5:616-626,)。在一个实施方式中，编码弗林蛋白酶切割位点序列(RAKR)的寡核苷酸(Fang等
2005.Nat.Biotech 23:584-590)连接来自马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)和手足口病病毒(FMDV)的2A样序列(Szymczak等2004.Nat.Biotechnol.22:589-
594)，用于分离多顺反子载体中的遗传元件。使用标准方法通过检测每种基因的表达可以容易地测试特定多顺反子载体的功效。
2005.Nat.Biotech 23:584-590)连接来自马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)和手足口病病毒(FMDV)的2A样序列(Szymczak等2004.Nat.Biotechnol.22:589-
594)，用于分离多顺反子载体中的遗传元件。使用标准方法通过检测每种基因的表达可以容易地测试特定多顺反子载体的功效。
[0114] 在某些实施方式中，当考虑多个感兴趣序列(例如，IL-12和一种或多种感兴趣的抗原和/或一种或多种其他免疫刺激分子和/或检查点抑制剂等)用于在靶细胞中表达时，可以使用多个载体，其中每种载体表达一种或多种感兴趣序列。在一个具体的实施方式中，一种逆转录病毒载体表达IL-12，并且可以实质上用作与任何一种或多种其他载体组合的佐剂载体。就此而言，一种逆转录病毒载体表达IL-12，并且单独的逆转录病毒载体可表达一种或多种感兴趣抗原，其中针对所述一种或多种感兴趣抗原的免疫应答是期望的。在另一实施方式中，可以产生表达IL-12的一种逆转录病毒载体，其与表达一种或多种抗原和/或一种或多种其他免疫刺激分子和/或检查点抑制剂的单独的逆转录病毒载体一起使用。因此，在考虑多个感兴趣序列的情况下，它们可以在相同或不同的载体上提供。
[0115] 在具体的例子中，病毒载体基因组包含：巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子序列；来自HIV 5'LTR的R和U5序列；包装序列(ψ)；HIV-1侧翼信号；内部增强子；内部启动子；目的基因；土拨鼠肝炎病毒响应元件；tRNA琥珀抑制子序列；缺失其增强子序列的U3元件；鸡β-珠蛋白绝缘子；和3'HIV LTR的R和U5序列。在一些示例中，载体基因组包含完整的慢病毒5'LTR和自灭活的3'LTR。(Iwakuma等Virology 15:120,1999,)
[0116] 载体基因组的构建可使用本领域已知的任何合适的基因工程技术来完成，包括但不限于标准技术的限制性内切核酸酶消化，连接，转化，质粒纯化和DNA测序，例如如Sambrook等，(1989.《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual).冷泉港实验室出版社，纽约),Coffin等(《逆转录病毒》(Retroviruses).冷泉港实验室出版社，纽约(1997))和《RNA病毒：实践方法》(RNA Viruses:A Practical Approach)(Alan J.Cann,编，牛津大学出版社(2000)。
[0117] C.病毒颗粒的生产
[0118] 本领域已知的多种方法中的任一种可用于产生感染性慢病毒颗粒，其基因组包含病毒载体基因组的RNA拷贝。在一个方法中，将病毒载体基因组导入包装细胞系，其包含将由病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装到病毒颗粒所需的组分。或者，除了一个或多个感兴趣序列之外，病毒载体基因组可以包括编码病毒组分的一个或多个基因。然而，为了防止该基因在靶细胞中复制，通常将复制所需的内源性病毒基因去除并且在包装细胞系中分开提供。
[0119] 通常，慢病毒颗粒由经一种或多种质粒转染的细胞系产生，该质粒包含生产该颗粒所需的组分。这些慢病毒载体颗粒通常不具有复制能力，即它们仅能够进行单轮感染。通常来说，利用多个质粒载体将生成慢病毒载体颗粒的各种遗传组分分开，主要是为了减少重组事件的机会，否则可能生成具有复制能力的病毒。然而，如果需要，可以使用具有所有慢病毒组分的单个质粒载体。作为使用多质粒载体的系统的一个示例，细胞系用含有病毒载体基因组(即载体基因组质粒)的至少一种质粒转染，包括LTR、顺式作用包装序列和感兴趣序列(其经常可操作地连接至异源启动子)、编码病毒酶促和结构组分的至少一种质粒(即，编码诸如Gag和Pol等组分的包装质粒)，以及编码虫媒病毒包膜糖蛋白至少一种包膜质粒。如本文所述和本领域已知的，可以使用其他质粒来增强逆转录病毒颗粒产生，例如Rev-表达质粒。病毒颗粒出芽(bud)穿过细胞膜并且包括这样的核心，该核心包含含有感兴趣序列的基因组和靶向树突细胞的虫媒病毒包膜糖蛋白。当虫媒病毒糖蛋白是辛德毕斯病毒E2糖蛋白时，与参考菌株HR相比，糖蛋白被工程改造以减少与硫酸乙酰肝素的结合。
[0120] 用本公开的质粒载体转染包装细胞可以通过众所周知的方法实现，并且待使用的方法不受任何限制。本领域已知许多非病毒递送系统，包括例如，电穿孔、包括脂质体的基于脂质的递送系统、“裸”DNA的递送和使用聚环糊精化合物的递送，如Schatzlein AG中所述的那些(2001《. 癌症基因疗法中的非病毒载体：原则和进展》(Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy:Principles and Progresses).Anticancer Drugs)。通常使用阳离子脂质或盐处理方法，参见例如Graham等(1973.Virol.52:456；Wigler等(1979.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373-76)。最常使用的是磷酸钙沉淀方法。然而，也可以使用其它将载体导入细胞的方法，包括核显微注射和细菌原生质融合。
[0121] 包装细胞系提供包括病毒调节和结构蛋白的组分，这些组分是将病毒基因组RNA包装到慢病毒载体颗粒时以反式形式(in trans)需要的。包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。一些合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。包装细胞系可以稳定地表达必需病毒蛋白。例如，这种包装细胞系描述于例如美国专利号6,218,181中。或者，可用编码一种或多种必需病毒蛋白的核酸分子以及病毒载体基因组瞬时转染包装细胞系。收集获得的病毒颗粒，并用于感染靶细胞。通常将编码包膜糖蛋白的基因克隆到诸如pcDNA3(英杰公司，美国加利福尼亚州)的表达载体中。真核细胞表达载体为本领域所熟知，并且可从许多商业来源获得。然后，将包装细胞如293T细胞与编码感兴趣序列(例如IL-12，任选的一种或多种抗原，其他细胞因子)的病毒载体基因组、编码病毒包装组分的至少一种质粒和用于靶分子表达的载体共同转染。包膜表达在包装细胞的膜上，并且被纳入病毒载体。
[0122] 在一种情况下，如本文所述，使用一种或多种载体将多核苷酸序列导入包装细胞系中以制备用辛德毕斯病毒包膜糖蛋白例如E2假型化的慢病毒载体颗粒。载体可含有编码病毒各种组分的多核苷酸序列，包括辛德毕斯病毒包膜，感兴趣序列(例如，IL-12和任选的一种或多种抗原或其它感兴趣序列)，和产生不是由包装细胞提供的病毒所需的任何组分。
[0123] 在其他情况下，用编码IL-12的病毒载体基因组和一种或多种其他载体共转染包装细胞。例如，除了编码IL-12(和任选的一种或多种其他感兴趣序列)的病毒载体外，第二载体优选携带编码修饰的(也称为变体)辛德毕斯病毒包膜的基因。在一些情况下，编码IL-12的病毒载体基因组还包括编码其他选择的免疫调节分子的多核苷酸序列，所述免疫调节分子包括但不限于趋化因子、细胞因子、DC成熟因子或调节免疫检验点机制的因子。在其他情况下，编码选择的免疫调节因子的多核苷酸序列被包含在第三载体中，该第三载体与编码IL-12的病毒载体和一种或多种其他载体共转染到包装细胞中。
[0124] 在一些或任何实施方式中，本文所述的慢病毒载体颗粒包含SAMHD1抑制剂。在某些实施方式中，SAMHD1抑制剂是Vpx蛋白或Vpr蛋白。在某些实施方式中，本文所述的慢病毒载体颗粒包含Vpx蛋白或其变体(参见例如WO2013/149167)。在一些或任何实施例中，变体保留抑制SAMHD1的能力。
[0125] 辛德毕斯病毒包膜蛋白含有四种N-连接的聚糖-两种在E2蛋白上，两种在E1蛋白上。在没有甘露糖苷酶I抑制剂的哺乳动物细胞中产生的病毒的两种N-聚糖具有高甘露糖结构(一个E2N连接的聚糖和一个E1N连接的聚糖)，而剩下的两种具有复杂的结构。两种复杂结构N-聚糖暴露于包膜蛋白的表面，而两种高甘露糖结构N-聚糖掩埋在包膜蛋白三聚体的中心。具有复合N-连接聚糖的辛德毕斯病毒颗粒不像具有不太复杂、高度甘露糖化的糖蛋白的颗粒那样有效地结合DC-SIGN。
[0126] 在某些实施方式中，病毒颗粒在甘露糖苷酶I抑制剂如几夫碱(kifunensine)(参见例如WO2013/149167)存在下在哺乳动物细胞中产生。因此，在一些或任何实施例中，病毒包装细胞在甘露糖苷酶I抑制剂存在下培养。在一些或任何实施方式中，甘露糖苷酶I抑制剂是几夫碱。在一些实施方式中，几夫碱以约0.01μg/ml至约1mg/ml、约0.1μg/ml至约10μg/ml、约0.1μg/ml至约9μg/ml、约0.1μg/ml至约8μg/ml、约0.1μg/ml至约7μg/ml、约0.1μg/ml至约6μg/ml、约0.1μg/ml至约5μg/ml、约0.1μg/ml至约4μg/ml、约0.1μg/ml至约3μg/ml、约0.1μg/ml至约2μg/ml、约0.1μg/ml至约1μg/ml、约0.25μg/ml至约10μg/ml、约0.25μg/ml至约9μg/ml、约0.25μg/ml至约8μg/ml、约0.25μg/ml至约7μg/ml、约0.25μg/ml至约6μg/ml、约
0.25μg/ml至约5μg/ml、约0.25μg/ml至约4μg/ml、约0.25μg/ml至约3μg/ml、约0.25μg/ml至约2μg/ml或约0.25μg/ml至约1μg/ml的浓度存在于培养基中。
0.25μg/ml至约5μg/ml、约0.25μg/ml至约4μg/ml、约0.25μg/ml至约3μg/ml、约0.25μg/ml至约2μg/ml或约0.25μg/ml至约1μg/ml的浓度存在于培养基中。
[0127] 在其中假型化的慢病毒载体颗粒包含辛德毕斯病毒E2糖蛋白和Vpx蛋白的一些或任何实施方式中，慢病毒颗粒在甘露糖苷酶I抑制剂存在下产生。在一些实施方式中，甘露糖苷酶抑制剂是脱氧芒硝吉米霉素(DMNJ)。在优选的实施方式中，甘露糖苷酶抑制剂是几夫碱。在一些实施方式中，DMNJ以约1.0μg/ml至约1.0mg/ml、约1.0μg/ml至约900μg/ml、约1.0μg/ml至约800μg/ml、约1.0μg/ml至约700μg/ml、约1.0μg/ml至约600μg/ml、约1.0μg/ml至约500μg/ml、约1.0μg/ml至约400μg/ml、约1.0μg/ml至约300μg/ml、约1.0μg/ml至约200μg/ml、约1.0μg/ml至约100μg/ml、约50μg/ml至约500μg/ml、约50μg/ml至约400μg/ml、约50μg/ml至约300μg/ml、约50μg/ml至约200μg/ml、约50μg/ml至约100μg/ml、约100μg/ml至约
500μg/ml、约100μg/ml至约400μg/ml、约100μg/ml至约300μg/ml、约100μg/ml至约200μg/ml、约200μg/ml至约500μg/ml或约200μg/ml至约400μg/ml的浓度存在于培养基中。
500μg/ml、约100μg/ml至约400μg/ml、约100μg/ml至约300μg/ml、约100μg/ml至约200μg/ml、约200μg/ml至约500μg/ml或约200μg/ml至约400μg/ml的浓度存在于培养基中。
[0128] 在一些或任何实施例中，在甘露糖苷酶I抑制剂(例如几夫碱)存在下产生的假型化的慢病毒载体颗粒包含包膜糖蛋白(例如辛德毕斯病毒E2)，其中至少60％的N-连接聚糖包含甘露糖(Man5)、Man6、Man7、Man8和/或Man9结构。在一些实施方式中，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％至少98％，至少99％或100％的N-连接聚糖包含Man5、Man6、Man7、Man8和/或Man9+结构。
[0129] 在一种情况下，如本文所述，使用一种或多种载体将多核苷酸序列导入包装细胞系中以制备用辛德毕斯病毒包膜糖蛋白例如E2假型化的慢病毒载体颗粒。在一些实施方式中，慢病毒载体颗粒是高度甘露糖基化的。在一些实施方式中，慢病毒载体颗粒还包含Vpx蛋白或其变体。在其他实施方式中，慢病毒载体颗粒高度甘露糖化并且包含Vpx蛋白或其变体。载体可含有编码病毒各种组分的多核苷酸序列，所述组分包括辛德毕斯病毒包膜、感兴趣序列(通常编码抗原)、以及包装细胞未提供的产生病毒所必需的任何组分。
[0130] 病毒包膜蛋白的糖基化谱可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，可以比较用糖苷酶(例如EndoH或PNGaseF)处理或未处理的病毒糖蛋白上的凝胶移位测定。其他方法包括从病毒糖蛋白中切割聚糖，并通过HPLC和质谱法分离和鉴定组分。
[0131] 如本文所述测量病毒的生产并表示为每体积IU。IU是感染单位，或者是传导单位(TU)；IU和TU可互换使用，作为病毒载体颗粒制备的滴度的定量测量。如本文所述，产生病毒，其中基因组可以表达容易测量的产物。优选荧光蛋白(绿色荧光蛋白)。慢病毒载体通常是非整合的。然后将该病毒给予靶细胞，并且例如通过流式细胞术确定表达GFP的靶细胞的5
数量。然后计算滴度。滴度优选尽可能高，但为细胞上清液的至少1×10 IU/mL，至少3×
105IU/mL，至少1×106IU/mL，至少3×106IU/mL或至少1×107IU/mL(在任何浓度之前)。或者，滴度为具有VSV-G包膜的相同细胞中假型化的相同慢病毒载体的滴度的至少80％，至少
90％，至少95％，至少100％。
数量。然后计算滴度。滴度优选尽可能高，但为细胞上清液的至少1×10 IU/mL，至少3×
105IU/mL，至少1×106IU/mL，至少3×106IU/mL或至少1×107IU/mL(在任何浓度之前)。或者，滴度为具有VSV-G包膜的相同细胞中假型化的相同慢病毒载体的滴度的至少80％，至少
90％，至少95％，至少100％。
[0132] D.递送病毒
[0133] 病毒可以以允许病毒接触靶树突细胞(DC)的任何方式递送至靶细胞，其中期望递送编码IL-12的多核苷酸和任何其他感兴趣多核苷酸。有时，将适量的病毒直接(体内)引入人类或其他动物，例如通过注射入体内。合适的动物包括但不限于马、狗、猫、牛、猪、绵羊、兔、鸡或其他鸟类。本文公开的病毒颗粒和其他治疗剂可以通过多种途径注射，如静脉内、真皮内、皮下、结节内、腹腔内或粘膜。可以使用皮下注射装置递送病毒，如美国专利号7,241,275、7,115,108、7,108,679、7,083,599、7,083,592、7,047,070、6,971,999、6,808,
506、6,780,171、6,776,776、6,689,118、6,670,349、6,569,143、6,494,865、5,997,501、5,
848,991、5,328,483、5,279,552、4,886,499中所公开的装置。在一个特定的实施方式中，病毒在瘤内递送。其他注射位置也是合适的，如直接注入包括靶细胞的器官。例如，可以使用淋巴结内注射、脾内注射或骨髓内注射分别将病毒递送至淋巴结、脾脏和骨髓。根据靶细胞的具体情况和性质，导入可以通过其他方式进行，包括例如吸入或直接接触上皮组织，例如眼，口或皮肤中的那些。
506、6,780,171、6,776,776、6,689,118、6,670,349、6,569,143、6,494,865、5,997,501、5,
848,991、5,328,483、5,279,552、4,886,499中所公开的装置。在一个特定的实施方式中，病毒在瘤内递送。其他注射位置也是合适的，如直接注入包括靶细胞的器官。例如，可以使用淋巴结内注射、脾内注射或骨髓内注射分别将病毒递送至淋巴结、脾脏和骨髓。根据靶细胞的具体情况和性质，导入可以通过其他方式进行，包括例如吸入或直接接触上皮组织，例如眼，口或皮肤中的那些。
[0134] 如本文其他地方所指出的，在其中考虑多个感兴趣序列用于在靶细胞中表达的某些实施方式中，感兴趣序列可以由相同的载体表达或可以在分开的载体上提供。在这方面考虑了多个载体的给予。在某些实施方式中，每种载体通过相同的途径给予。在其他实施方式中，每种载体可以通过不同的途径并在不同的时间给予。在一个实施方式中，每种载体通过相同的途径但以不同剂量在不同时间给予。在另一实施方式中，每种载体通过相同的途径并且同时，在相同或不同的位点，以相同的剂量或以不同的剂量给予。在另一实施方式中，每种载体通过相同的途径并同时给予，但是每种载体以不同的剂量给予。
[0135] 作为一个示例，表达IL-12的载体可以与表达感兴趣抗原的单独载体经瘤内同时给予。在其他示例中，表达IL-12的载体可以与表达一种或多种感兴趣抗原和任选的一种或多种其他感兴趣序列的单独载体瘤内同时给予。在另一实施方式中，表达IL-12和一种或多种感兴趣抗原的载体经瘤内给予。在其他实施方式中，经瘤内给予表达IL-12的载体，并且在分别的位点同时给予表达一种或多种感兴趣抗原的单独载体，在不同的肿瘤经瘤内或在不同的位置并经由不同的途径(例如皮下，皮内或肌内)。在其他实施方式中，可以瘤内给予表达IL-12的载体，并且可以在表达IL-12的载体之前或之后，在相同位点或不同位点给予表达一种或多种感兴趣抗原的单独载体。在这方面，两种载体可以在不同的部位给予并使用不同的剂量。在其中同时给予表达IL-12的载体和表达一种或多种抗原和/或包含其它感兴趣序列的单独载体的某些实施方式中，将包含该单独载体的组合物混合成单一给予剂量可能是有利的。
[0136] 或者，提供靶细胞并与病毒体外(如在培养板中)接触。靶细胞通常是包括树突细胞的细胞群，所述树突细胞获自健康对象或者需要治疗或希望刺激对抗原的免疫应答的对象。由对象获得细胞的方法为本领域所熟知，包括静脉切开术、手术切除和活检。也可以通过获得CD34α+人造血祖细胞并使用其他地方所述的体外培养方法(例如，Banchereau等，Cell 106,271-274(2001))产生人DC。
[0137] 可将病毒悬浮于培养基，并且添加到培养板、管或其它容器的孔中。包含病毒的培养基可以在细胞铺板前或细胞铺板后添加。通常将细胞在适当量的培养基中孵育以提供存活力并允许培养基中合适浓度的病毒，从而发生宿主细胞的转导。优选地，用病毒孵育细胞足够量的时间以允许病毒感染细胞。优选地，用病毒孵育细胞至少1小时、至少5小时或至少10小时。
[0138] 在体内和体外递送中，使用包含感染所需靶细胞足够量的病毒颗粒的等分。当培养靶细胞时，病毒颗粒的浓度通常是至少1IU/μL，更优选至少10IU/μl，甚至更优选至少300IU/μL，甚至更优选至少1X104IU/μL，甚至更优选至少1X105IU/μL，甚至更优选至少
1X106IU/μL，或甚至更优选至少1X107IU/μL。
1X106IU/μL，或甚至更优选至少1X107IU/μL。
[0139] 在体外用病毒感染后，可将靶细胞引入(或重新引入)人或其他动物。可以将细胞引入真皮、真皮下或外周血流中。引入动物的细胞优选来自该动物的细胞，以避免不利的免疫应答。也可以使用源自具有相似免疫背景供体的细胞。还可以使用的其它细胞包括被设计成避免不利免疫应答的那些。
[0140] 例如，可以针对靶细胞分析例如感兴趣基因或序列的整合、转录和/或表达、整合的基因的拷贝数和整合的位置。这样的分析可以在任何时间进行，并且可以通过本领域已知的任何方法进行。
[0141] 可以通过任何本领域已知的方法分析给予了病毒或病毒感染的树突细胞的对象的感染细胞的位置、病毒递送的多核苷酸或感兴趣基因的表达、免疫应答的刺激和与疾病或病症相关症状的监控。
[0142] 以上公开的感染细胞的方法并不依赖于细胞的个体特异性特征。因此，很容易将它们扩展至各种动物物种。在一些情况中，将病毒颗粒递送至人或人树突细胞，并且在其他情况中，将它们递送至例如小鼠、马、狗、猫或小鼠或鸟类等动物。如本文所讨论，病毒基因组被假型化以赋予其广泛的宿主范围以及靶细胞特异性。本领域技术人员还将意识到适当的内部启动子和其他元件以实现在特定动物物种中感兴趣序列的所需表达。因此，本领域技术人员将能够修改感染来自任何物种的树突细胞的方法。
[0143] E.治疗和预防性给予
[0144] 靶细胞可以用本文所述的慢病毒载体颗粒感染，用于预防或治疗疾病或病症，特别是对患者中由IL-12影响的免疫应答的诱导是有益的疾病或病症。在具体实施方式中，树突细胞可以用本文所述的慢病毒载体颗粒感染，用于预防或治疗疾病或病症，特别是对患者中免疫应答的活化是有益的疾病或病症。许多这样的疾病是众所周知的。例如，适用于通过本发明的方法进行治疗或预防的疾病或病症包括但不限于癌症，自身免疫疾病和感染(包括病毒，细菌，真菌和寄生虫感染)。在一种方法中，通过本文所述的病毒颗粒治疗疾病以将感兴趣序列递送至树突细胞，其中感兴趣序列的表达产生IL-12和任选的疾病特异性抗原并导致细胞免疫应答和体液免疫应答的刺激。在某些实施方式中，IL-12与编码一种或多种抗原的感兴趣序列一起表达，其中针对所述抗原的免疫应答是期望的，但所述抗原通常不在树突细胞中表达。一种或多种抗原由树突细胞表达并呈递。病毒载体基因组可以进一步编码其他免疫刺激分子或其他免疫调节分子，如检查点抑制剂。
[0145] 在典型应用中，病毒颗粒向靶细胞递送编码IL-12的序列，并且在某些实施方式中，递送编码IL-12与一种或多种抗原的组合，其由相同的载体表达或者由单独的载体表达。递送可以通过在体外使树突细胞与病毒接触来实现，随后将感染的树突细胞提供给患者。其他时候，可通过将病毒递送给对象用于体内感染树突细胞来实现递送。然后树突细胞产生IL-12，由此触发对IL-12的细胞响应，包括诱导CD8 T细胞、增加B细胞和CD4 T细胞以及诱导TH1响应、以及由IL-12诱导的其他生物学活性。在某些实施方式中，经瘤内给予表达IL-12的靶向DC的慢病毒载体，由此触发Th1响应等诱导以及其他生物活性，并提供治疗性抗肿瘤活性。在某些实施方式中，表达IL-12的靶向DC的慢病毒载体与表达一种或多种抗原的载体的瘤内给予也刺激患者中的抗原特异性T细胞或B细胞，从而诱导针对该表达的抗原的细胞和体液免疫应答。以这种方式，患有疾病或病症的患者通过产生具有期望特异性的免疫细胞来治疗。
[0146] 在某些实施方式中，表达IL-12的载体可以经瘤内给予。本公开出乎意料地显示表达低水平IL-12的慢病毒载体的瘤内注射在多个测试模型中是治疗上有效的。具体而言，实验显示即使是本文所述的表达低水平IL-12的靶向DC的慢病毒载体的单一瘤内注射也是治疗有效的。本领域的其他研究需要用电穿孔多次注射IL-12并需要更高水平的IL-12。例如，在一项研究中，用电穿孔进行IL-12质粒的瘤内注射在第1,5和8天进行3次注射，并且可能在第7周进行第二疗程(参见例如临床试验NCT01440816)。在另一项研究中，对象可能在28天的周期内接受长达6个周期的治疗，包括两个治疗日，第1天和第8天。在这些研究中，患者接受瘤内注射pIL-12，随后立即在肿瘤部位周围放电，导致质粒DNA电穿孔进入肿瘤细胞(参见例如NCT01579318)。
[0147] 本发明出人意料地表明，由注射本文所述的慢病毒载体而在肿瘤中局部产生非常低水平的IL-12表达是治疗有效的。就此而言，基于在最佳培养条件下的体外研究，在前48小时期间，IL-12表达水平小于产生的约0.5微克/1E10载体基因组。可以使用如实施例1和实施例6中所述的体外转导测定来测量IL-12水平。例如，在第0天，将1E6的适当靶细胞(例如293-DC-SIGN细胞，其中慢病毒载体颗粒用修饰的辛德毕斯E2糖蛋白假型化)置于6孔板中的2mL适宜培养基中。在第1天，用8.5E9载体基因组转导细胞。通常在600μL培养基中进行转导，然后在6小时后加入0.9mL培养基。在第3天(转导后48小时)，通过0.45μm过滤器过滤上清液，使用标准ELISA(例如使用市售试剂盒，例如R&D试剂盒M1270)测量IL-12。
[0148] 因此，在本发明的一个具体实施方式中，本文所述的表达IL-12的病毒载体经瘤内给予，并且在某些实施方式中以单一注射瘤内给予，用于治疗癌症。在某些实施方式中，本文所述的表达IL-12的慢病毒载体的瘤内注射产生低水平的IL-12。在某些实施方式中，使用本文所述的表达IL-12的慢病毒载体的单一瘤内注射并产生低水平的IL-12。通过瘤内注射(在某些实施方式中是单一注射)，本文所述的慢病毒载体产生的IL-12的水平通常为前48小时期间产生的约0.05微克至前48小时期间产生的约5微克的当量，如通过上述体外测定法所测量。在某些实施方式中，通过单一瘤内注射本文所述的慢病毒载体所产生的IL-12水平为前48小时期间产生的约0.1微克至最初48小时期间产生的约1微克的当量。在某些实施方式中，通过单一瘤内注射慢病毒载体所产生的IL-12水平为前48小时期间产生的约
0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,
1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,
3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9或约5.0μg IL-12，如通过上述体外测定法所测量。由本文所述的特定剂量的慢病毒载体产生的IL-12的量可以使用最佳培养条件下的体外研究来测量。
0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,
1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,
3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9或约5.0μg IL-12，如通过上述体外测定法所测量。由本文所述的特定剂量的慢病毒载体产生的IL-12的量可以使用最佳培养条件下的体外研究来测量。
[0149] 在一个具体的实施方式中，用于单一瘤内注射的表达IL-12的靶向DC的慢病毒载体是整合载体。在另一实施方式中，用于单一瘤内注射的表达IL-12的靶向DC的慢病毒载体是非整合载体。
[0150] 在一个实施方式中，表达IL-12的靶向DC的慢病毒载体与调节性T细胞消耗剂例如环磷酰胺，抗-CTLA4或特异性结合调节性T细胞标志物的抗体(例如抗-CD25抗体；这样的抗体包括达珠单抗)一起经瘤内给予。就此而言，可以在瘤内给予如本文所述的LV-IL12之前、同时或之后给予这种调节性T细胞消耗剂。在某个实施方式中，表达IL-12的靶向DC的慢病毒载体的经瘤内给予与消耗调节性T细胞的试剂例如环磷酰胺，抗-CTLA4或调节性T细胞消除抗体或试剂的全身给予同时进行。在某些实施方式中，使用节律性方案给予低剂量环磷酰胺。在某些实施方式中，环磷酰胺经口服给予。
[0151] 存在或正在评估人体中消耗调节性T细胞的各种方法，并且本文所述的LV/IL12载体和方法可以与这些方法中的任一种一起使用。本领域技术人员将理解的，一种这样的方法是消耗CD44+CD137+调节性T细胞(参见例如Immunotherapy.2012年5月；4(5):483–485)。
[0152] 在另一实施方式中，本文表达IL-12的病毒载体与表达感兴趣抗原的第二载体同时给予。在其他示例中，表达IL-12的载体可以与表达一种或多种感兴趣抗原和任选的一种或多种其他感兴趣序列的单独载体瘤内同时给予。在另一实施方式中，表达IL-12和一种或多种感兴趣抗原的载体经瘤内给予。在其他实施方式中，经瘤内给予表达IL-12的载体，并且在分别的位点同时给予表达一种或多种感兴趣抗原的单独载体，在不同的肿瘤经瘤内或在不同的位置并经由不同的途径(例如皮下，皮内或肌内)。在其他实施方式中，可以瘤内给予表达IL-12的载体，并且可以在表达IL-12的载体之前或之后，在相同位点或不同位点给予表达一种或多种感兴趣抗原的单独载体。在这方面，两种载体可以在不同的部位给予并使用不同的剂量。在其中同时给予表达IL-12的载体和表达一种或多种抗原和/或包含其它感兴趣序列的单独载体的某些实施方式中，将包含该单独载体的组合物混合成单一给予剂量可能是有利的。
[0153] 病毒感染后，感兴趣序列(例如，编码IL-12并任选编码一种或多种抗原)由靶树突细胞表达。如果离体接触，则将靶树突细胞例如通过注射转移回患者，其中它们与能够产生针对所需抗原的免疫应答的免疫细胞相互作用。在优选的实施方式中，将重组病毒注射入患者，其中它原位转导经靶向的树突细胞。然后树突细胞表达IL-12和任选地与待治疗的疾病或病症相关的特定抗原，并且患者能够产生针对疾病或病症的有效免疫应答。
[0154] 病毒载体基因组可含有编码多于一种抗原的多核苷酸序列，并且在转导靶树突细胞时产生对递送至细胞的多种抗原的免疫应答。在一些实施方式中，抗原与单一疾病或病症有关。在其他实施方式中，抗原与多种疾病或病症有关。
[0155] 在一些病毒中，激活和/或刺激DC成熟的DC成熟因子与感兴趣序列一起递送。在替代方案中，通过在病毒递送之前、同时或之后递送DC成熟因子来激活DC。DC成熟因子可以与病毒的给予分开提供。
[0156] 如本文所述，一种或多种免疫调节分子和/或DC成熟因子可由包含在病毒基因组内并在病毒感染树突细胞后表达的一种或多种序列编码。编码免疫调节分子的序列也可以在分离的载体中提供，所述载体与编码IL-12的病毒载体和包装细胞系中任选的一种或多种抗原共转染。
[0157] 本文所述的方法可用于患者的过继免疫治疗。获得编码IL-12的多核苷酸，并且在某些实施方式中，获得期望的抗原，并将其包装入重组病毒中。从患者获得靶树突细胞并用含有多核苷酸的重组病毒转导，所述多核苷酸编码IL-12和任选的所需抗原。然后将树突细胞转移回患者体内。
[0158] 病毒颗粒可以在体内注射，其中它们感染DC并递送IL-12和任选的编码抗原或其他免疫刺激分子的序列。病毒颗粒的量至少为3×106IU、并且可以为至少1×107IU、至少3×107IU、至少1×108IU、至少3×108IU、至少1×109IU或至少3×109IU。在选定的时间间隔中，来自受体淋巴器官的DC可用于测量表达，例如通过观察标记物表达，如GFP或萤光素酶。核酸监测技术和逆转录酶(RT)活性的测量也可用于分析病毒颗粒的生物分布。可以从对抗原刺激的响应的量级和耐久性测量来自慢病毒载体颗粒处理的受试者的恶性或靶病原体感染组织、外周血单核细胞、淋巴结或脾脏的T细胞。可以分析DC以外的组织细胞如上皮细胞和淋巴样细胞的体内基因递送的特异性。
[0159] 疫苗通常包含佐剂。在某些实施方式中，表达IL-12的慢病毒载体可以用作佐剂与其他疫苗联合。
[0160] 本文所述的慢病毒载体颗粒也可以与佐剂一起给予。佐剂可以与重组病毒颗粒一起给予、在重组病毒颗粒之前给予或在重组病毒颗粒之后给予。如果与病毒颗粒一起给予，理想的佐剂不会显著破坏病毒颗粒的完整性，例如破坏含有包膜糖蛋白的病毒膜。
[0161] 多种佐剂可以与病毒组合使用以进一步增加引发的免疫应答。某些说明性佐剂包括明矾、3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见GB 2220211)。QS21是从南美洲发现的皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮中分离的三萜糖苷或皂苷(参见Kensil等《，疫苗设计：亚基和佐剂方法》(Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell和Newman编辑,纽约州普莱南出版社(Plenum Press),1995)；美国专利美国专利号5,057,540)。其他佐剂是水包油乳剂(例如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂例如单磷酰脂质A组合(参见Stoute等，N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。另一种佐剂是CpG(Bioworld Today，11月15日,1998)。或者，可将Aβ偶联至佐剂。例如，脂蛋白形式的Aβ可通过将棕榈酸或其他脂质直接偶联至Aβ的N末端来制备，如对乙型肝炎B抗原疫苗接种所描述的(Livingston,J.Immunol.159,1383-1392(1997))。然而，这样的偶联不应该实质上改变Aβ的构象，从而影响对其的免疫应答的性质。佐剂可以作为治疗组合物的组分与活性剂一起给予，或者可以在给予治疗剂之前、同时或之后分开给予。
[0162] 一类佐剂是铝盐(明矾)，如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝。这样的佐剂可以与或不与其他特定的免疫刺激剂例如MPL或3-DMP，QS21，聚合物或单体氨基酸例如聚谷氨酸或聚赖氨酸一起使用。另一类佐剂是水包油乳液制剂。此类佐剂可与或不与其它特异性免疫刺激剂联用，所述免疫刺激剂例如胞壁酰肽(例如，N-乙酰胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP),N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡萄糖胺酰基-N-乙酰胞壁酰基-L-Al-D-异谷氨酸-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP)TheramideTM)，或其它细菌细胞壁组分。水包油乳液包括(a)MF59(WO 90/14837)，其包含5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选地包含不同量的MTP-PE)，采用微流化器例如Model 110Y微流化器(微流体公司(Microfluidics)，马萨诸塞州牛顿市)配制成亚微米颗粒；(b)SAF，其包含10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121，和thr-MDP，其被微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生较大粒径的乳液，和(c)Ribi佐剂系统(RAS)(Ribi免疫化学公司，蒙大拿州哈密尔顿)，其包含2％鲨烯、0.2％吐温
80，和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分：单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)，优选是MPL+CWS(DetoxTM)。另一类优选的佐剂是皂苷佐剂，例如StimulonTM(QS21，Aquila，马萨诸塞州伍斯特)或由其生成的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)和ISCOMATRIX。其他佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。其它佐剂包括细胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)。
80，和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分：单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)，优选是MPL+CWS(DetoxTM)。另一类优选的佐剂是皂苷佐剂，例如StimulonTM(QS21，Aquila，马萨诸塞州伍斯特)或由其生成的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)和ISCOMATRIX。其他佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。其它佐剂包括细胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)。
[0163] 可以与本文组合物一起使用的另一种佐剂由化学式(I)表示：
[0164]
[0165] 其中，部分A1和A2独立地选自氢、磷酸酯和磷酸盐。对于磷酸盐而言，钠和钾是示例性抗衡离子。部分R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自具有3-23个碳的烃基(表示为C3-C23)。为更清楚起见，应理解，当一个部分“独立地选自”含有多个成员的特定基团时，第一部分所选成员在任何情况下都不会影响或限制第二部分成员的选择。R1、R3、R5和R6接合的碳原子是不对称的，且因此可以R或S立体化学结构存在。在一个实施方式中，所有那些碳原子都是R立体化学结构，而在另一个实施方式中，所有那些碳原子都是S立体化学结构。
[0166] “烃基”指完全由氢和碳形成的化学部分，其中碳原子的排列可以是直链或支链、非环状或环状，且相邻碳原子之间的连接可以完全是单键，即提供饱和烃基，或者两个相邻碳原子之间可存在双键或三键，即提供不饱和烃基，且烃基中碳原子的数目是3-24个碳原子。该烃基可以是烷基，代表性直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烃基包括环戊烯基和环己烯基等。不饱和烃基在相邻的碳原子之间含有至少一个双键或三键(如果该烃基是非环状的，分别称作“烯基”或“炔基”，如果该烃基是至少部分环状的，分别称作环烯基和环炔基)。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
[0167] 式(I)的佐剂可获自本领域已知的合成方法，例如PCT国际公开号WO 2009/035528以及WO 2009/035528中提及的出版物中公开的合成方法。还可通过购买获得所述佐剂中的某些。优选佐剂是阿凡提极性脂质制品公司(阿拉巴马州阿拉巴斯特)的产品目录中的产品号699800，参见下文与E10联用的E1。
[0168] 在本发明的多个实施方式中，该佐剂具有式(II)的化学结构但部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5和R6选自前文针对这些部分提供的选项的子集，这些子集在下文中鉴定为E1、E2等。
[0169] E1：A1是磷酸酯或磷酸盐且A2是氢。
[0170] E2：R1、R3、R5和R6是C3-C21烷基；且R2和R4是C5-C23烃基。
[0171] E3：R1、R3、R5和R6是C5-C17烷基；且R2和R4是C7-C19烃基。
[0172] E4：R1、R3、R5和R6是C7-C15烷基；且R2和R4是C9-C17烃基。
[0173] E5：R1、R3、R5和R6是C9-C13烷基；且R2和R4是C11-C15烃基。
[0174] E6：R1、R3、R5和R6是C9-C15烷基；且R2和R4是C11-C17烃基。
[0175] E7：R1、R3、R5和R6是C7-C13烷基；且R2和R4是C9-C15烃基。
[0176] E8：R1、R3、R5和R6是C11-C20烷基；且R2和R4是C12-C20烃基。
[0177] E9：R1、R3、R5和R6是C11烷基；且R2和R4是C13烃基。
[0178] E10：R1、R3、R5和R6是十一烷基；且R2和R4是十三烷基。
[0179] 在某些选项中，E2至E10各自与实施方式E1联用，和/或E2至E9的烃基是烷基，优选直链烷基。
[0180] 式(I)佐剂可以配制成药物组合物，任选地与辅助剂一起，各自如下所述。就此而言，参考美国专利公开号2008/0131466，其提供了用于GLA佐剂的制剂，例如水性制剂(AF)和稳定的乳剂制剂(SE)，其中这些制剂可用于式(I)的任何佐剂。
[0181] 佐剂可以作为单一组合物与本发明的病毒一起给予，或者可以在给予本发明的重组病毒之前、同时或之后给予。在某些实施方式中，佐剂包含免疫原。免疫原和佐剂可以包装并供应在相同小瓶中，或者可以包装在单独的小瓶中并在使用前混合。免疫原和佐剂通常与表明预期的治疗应用的标签一起包装。如果免疫原和佐剂分开包装，包装通常包括使用前的混合说明。佐剂和/或运载体的选择取决于含有佐剂的疫苗的稳定性、给药途径、给药方案、佐剂对被疫苗接种的物种的效力，并且在人体内，药学上可接受的佐剂是有关监管机构已经批准或可批准进行人类使用的佐剂。例如，弗氏完全佐剂不适用于人体给予。明矾，MPL和QS21是优选。任选地，可以同时使用两种或更多种不同的佐剂，例如明矾与MPL，明矾与QS21，MPL与QS21，以及明矾、QS21和MPL一起。此外，可以使用不完全弗氏佐剂(Chang等，Advanced Drug Delivery Reviews 32,173-186(1998))，任选地与明矾、QS21和MPL的任一种组合及其所有组合。
[0182] 包含如本文所述的逆转录病毒载体的组合物还可在给予一种或多种其他治疗剂的同时、之前或之后进行给予。
[0183] 这类组合治疗可包括给予单一药物剂型，其含有本文所述病毒载体和一种或多种其他活性剂，并且以其自身的单独药物剂型给予本发明的包含病毒载体的组合物和各活性剂。例如，包含病毒载体和其他活性剂的组合物可合并在单个肠内(如口服)剂量组合物(如片剂或胶囊)中给予患者，或以各单独的肠内(如口服)剂量制剂给予各试剂。类似地，包含病毒载体和其他活性剂的组合物可合并在单个胃肠道外(例如已知且在本文中描述的任何胃肠道外途径，例如皮下、皮内、结内、瘤内或肌内)剂量组合物中给予患者(例如在盐水溶液或其他生理上可接受的溶液中)，或以单独的胃肠道外剂量制剂给予各试剂。如本文所述的组合治疗可以通过相同的途径给予，或者可以使用不同的途径给予。使用单独的剂量制剂时，包含病毒载体和一种或多种其他活性剂的组合物可在基本相同时间(即同时)给予，或在单独的交错时间(即依次)并以任意顺序给予；应理解组合疗法包括所有这些方案。
[0184] 因此，在某些实施方式中，还考虑包含本公开的病毒载体的组合物与一种或多种其它治疗剂(例如其他抗癌剂，或其他缓和性或辅助性疗法)组合给予。在某些实施方式中，本领域可接受此类治疗剂作为本文所述的特定癌症的标准治疗。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎药、免疫检查点抑制剂、化疗剂、放疗剂或其他活性和辅助性试剂。
[0185] 在一个实施方式中，包含本发明的病毒载体的组合物与一种或多种癌症治疗剂(包括一种或多种化疗剂)组合给予。癌症治疗剂的示例包括烷化剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)包含六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺甲二氯二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿柔比星、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、C放线菌素、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、D放线菌素、道诺霉素、地托比星、
6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、去甲氧柔红霉素
(idambicin)、马赛罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、波非罗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物、如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺素剂，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如叶烷酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群；伊达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋胺；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼； 雷佐生；西佐糖(sizofran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替派；紫杉醇类，如紫杉醇( 新泽西州普林斯顿的布里斯托-迈尔斯施贵宝公司
(Bristol-Myers Squibb Oncology))和多西他赛( 法国安东尼市的罗纳普
朗克乐安公司(Rhone-Poulenc Rorer))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；曲妥珠单抗、多西他赛、铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；二羟基蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(蓓萨罗丁)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯培拉霉素；卡培他滨；和上述任意药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和法乐通(Fareston)；和抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。其他癌症治疗剂包括索拉非尼和其他蛋白激酶抑制剂，如阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、埃罗替尼、福斯塔玛替尼(fostamatinib)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、冷瓦替尼(lenvatinib)、木利替尼、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼钠、兰尼单抗、鲁索替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维罗非尼和舒尼替尼；西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和其他mTOR抑制剂。
6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、去甲氧柔红霉素
(idambicin)、马赛罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、波非罗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物、如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺素剂，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如叶烷酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群；伊达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋胺；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼； 雷佐生；西佐糖(sizofran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；硫替派；紫杉醇类，如紫杉醇( 新泽西州普林斯顿的布里斯托-迈尔斯施贵宝公司
(Bristol-Myers Squibb Oncology))和多西他赛( 法国安东尼市的罗纳普
朗克乐安公司(Rhone-Poulenc Rorer))；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；曲妥珠单抗、多西他赛、铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；二羟基蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(蓓萨罗丁)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯培拉霉素；卡培他滨；和上述任意药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、凯奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和法乐通(Fareston)；和抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述药物的药学上可接受盐、酸或衍生物。其他癌症治疗剂包括索拉非尼和其他蛋白激酶抑制剂，如阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、埃罗替尼、福斯塔玛替尼(fostamatinib)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、冷瓦替尼(lenvatinib)、木利替尼、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼钠、兰尼单抗、鲁索替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维罗非尼和舒尼替尼；西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和其他mTOR抑制剂。
[0186] 在另一个实施方式中，本发明的病毒载体组合物与另一种免疫刺激剂联用。这类免疫刺激剂包括但不限于：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、干扰素γ和抗CD40抗体或结合并激活共刺激通路的其他抗体(例如CD28、ICOS、OX40、CD27等)。
[0187] 在一个实施方式中，本发明所述的这些病毒载体组合物与一种或多种免疫检验点抑制剂联用。免疫检验点指免疫系统的多个抑制性通路，其对于维持自身耐受性和调控免疫应答的持续时间和幅度十分重要。肿瘤将某些免疫检验点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原有特异性的T细胞。(参见，例如，Pardoll,2012 Nature 12:252；Chen和Mellman 2013 Immunity 39:1)。本发明提供了可与GLA组合物联用且不含抗原的免疫检验点抑制剂。这类组合疗法协同作用以增强抗癌免疫应答。某些病毒还发展出了吸纳(co-opt)免疫检验点通路的机制。因此，在某些实施方式中，这类组合疗法可用于增强抗病毒免疫应答。
[0188] 免疫检验点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何试剂。这类抑制剂可包括小分子抑制剂或可包括抗体或其可以结合片段(其结合并阻断或抑制免疫检验点受体)或结合并阻断或抑制免疫检验点受体配体的抗体。可被靶向用于阻断或抑制的示例性免疫检验点分子包括但不限于，CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、+VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并表达在所有NK、γδ和记忆CD8 (αβ)T细胞上)、CD160(也称作BY55)和CGEN-15049。免疫检验点抑制剂包括这样的抗体或其抗原结合片段或其他结合蛋白，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-
15049。说明性免疫检验点抑制剂包括特姆单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、尼弗单抗(Nivolumab)(抗PD1抗体)、CT-011(抗PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗CTLA-4检验点抑制剂)。
15049。说明性免疫检验点抑制剂包括特姆单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、尼弗单抗(Nivolumab)(抗PD1抗体)、CT-011(抗PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗CTLA-4检验点抑制剂)。
[0189] 在其他实施方式中，本发明的病毒载体组合与其他TLR4激动剂或TLR8激动剂或TLR9激动剂联用。这类激动剂可选自肽聚糖、聚I:C、CpG、3M003、鞭毛蛋白和真核细胞核糖体延长和起始因子4a的利什曼原虫同源物(LeIF)。
[0190] 在另一个实施方式中，本发明的病毒载体组合物与细胞因子联用。“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的统称，其作用于另一细胞作为细胞间介导物。这类细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；
集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1至IL-36，包括但不限于IL-1、IL-1α、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CgP(GM-CSP)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1至IL-36，包括但不限于IL-1、IL-1α、IL-2、1L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、TNF；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
[0191] 在某些实施方式中，本文所述包含病毒载体的组合物可与氯喹联用，氯喹是一种趋溶酶体剂，其阻止内体酸化并抑制肿瘤细胞诱导的自体吞噬以在加速的细胞生长和营养物消耗中存活下来。更一般地，本文所述包含病毒载体的组合物可与用作自噬抑制剂、放射致敏剂或化疗致敏剂的治疗剂联用，例如氯喹、米索硝唑、甲硝唑和缺氧性细胞毒素，如替拉扎明。在这一方面，病毒载体与氯喹或其他放射或化疗致敏剂或自噬抑制剂的这类组合还可与其他癌症治疗剂或化疗联用。
[0192] 在另一个实施方式中，本文所述包含病毒载体的组合物可与小分子药物联用，这些小分子药物已知导致杀死肿瘤细胞并随后激活免疫应答，称作“免疫原性细胞死亡”，例如环磷酰胺、多柔比星、奥沙利铂和米托蒽醌。此外，还可与已知增强肿瘤细胞免疫原性的药物联用，例如帕土匹龙(大环内酯B)、靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体7A7.27、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如伏立诺他、罗咪酯肽、帕比司他、贝林诺特(belinostat)和恩替诺特)、n3-多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸、其他蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)、紫草素(紫草根的主要成分)和溶瘤细胞病毒(如TVec(塔利兰帕(talimogene laherparepvec)))。在其他实施方式中，本文所述包含病毒载体的组合物可与表观遗传疗法联用，例如DNA甲基转移酶抑制剂(如地西他滨，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)，其可局部或全身给予。
[0193] 在另一个实施方式中，本文所述包含病毒载体的组合物可与一种或多种提高DC对肿瘤的ADCC摄取的抗体联用。因此，本发明考虑将包含病毒载体的组合物与诱导或增强肿瘤细胞消化的任何分子或其片段联用，所述消化是通过抗原呈递细胞并随后将肿瘤抗原呈递至免疫系统。这些分子包括诱导受体结合(如Fc或甘露糖受体)并运输至抗原呈递细胞的试剂，例如抗体、抗体样分子、多特异性多价分子和聚合物。这类分子可与包含病毒载体的组合物联用进行瘤内给予，或通过不同途径给予。例如，本文所述包含病毒载体的组合物可与瘤内注射利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、坎帕斯、帕尼单抗、奥法木单抗、布图昔单抗(brentuximab)、帕妥珠单抗、Ado曲妥珠单抗埃姆他辛(Ado-trastuzumab emtansine)、奥比珠单抗(Obinutuzumab)、抗HER1、HER2或HER3抗体(如MEHD7945A；MM-111；
MM-151；MM-121；AMG888)、抗EGFR抗体(如尼妥珠单抗，ABT-806)或其他抗体联用进行瘤内给予。能够啮合Fc受体和其他诱导内化的受体的任何多价骨架都可与本发明所述组合疗法联用，例如能够结合与Fc片段连接的感兴趣的肽和/或蛋白质或能够啮合受体的聚合物。
MM-151；MM-121；AMG888)、抗EGFR抗体(如尼妥珠单抗，ABT-806)或其他抗体联用进行瘤内给予。能够啮合Fc受体和其他诱导内化的受体的任何多价骨架都可与本发明所述组合疗法联用，例如能够结合与Fc片段连接的感兴趣的肽和/或蛋白质或能够啮合受体的聚合物。
[0194] 在某些实施方式中，病毒载体与这类抗体的组合还可与促进共刺激信号的抗体(如抗CTLA-4)联用(例如通过阻断抑制性通路)或与激活共刺激通路的抗体(如抗CD40、抗-CD28、抗-ICOS、抗-OX40、抗CD27抗体)联用。
[0195] 包含病毒载体的组合物可单独给予或与其他已知的癌症治疗联用，所述癌症治疗是例如放疗、免疫检查点抑制剂、化疗或其他癌症治疗剂、移植、免疫治疗、激素治疗、光动力治疗等。这些组合物还可与抗生素联用。
[0196] 本公开内容提供了通过给予表达IL12的靶向DC的慢病毒载体，任选地与表达抗原的其他慢病毒载体组合，或与其他治疗剂组合来治疗癌症的方法。特定癌症的例子包括但不限于肺癌，结肠癌，乳腺癌，睾丸癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，结肠直肠癌和前列腺癌。其他癌症是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于：白血病，淋巴瘤，宫颈癌，神经胶质瘤肿瘤，腺癌，肉瘤，软组织肉瘤和皮肤癌。示例性癌症包括但不限于膀胱肿瘤，乳腺肿瘤，前列腺肿瘤，基底细胞癌，胆道癌，膀胱癌，骨癌，脑癌和CNS癌(例如神经胶质瘤)，宫颈癌，绒毛膜癌，结直肠癌，结缔组织癌，消化系统癌症；子宫内膜癌，食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤，神经母细胞瘤，口腔癌(例如唇，舌，口和咽)；卵巢癌；胰腺癌，视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌，肾癌，呼吸系统癌症；肉瘤，皮肤癌；胃癌，睾丸癌，甲状腺癌；子宫癌，泌尿系统癌以及其他癌和肉瘤。癌症还包括本领域众所周知的哺乳动物中的瘤形成和恶性病症。在一个实施方式中，本公开提供了通过将表达IL12的靶向DC的慢病毒载体经瘤内注射来治疗癌症的方法，并且在一些实施方式中用单一瘤内注射来治疗癌症。本文考虑具有可注射肿瘤的任何癌症，用于使用表达IL12的靶向DC的慢病毒载体进行瘤内注射。
[0197] F.药物组合物和试剂盒
[0198] 本文还考虑含有本文提供的病毒和一种或多种组分的药物组合物和试剂盒。药物组合物可包含本文所述的载体颗粒和药物运载体。试剂盒可以包括本文提供的药物组合物和/或组合，以及一种或多种组分，例如使用说明书，用于将化合物给予于对象的装置和用于将化合物给予于对象的装置。
[0199] 本文提供含有本文提供的病毒颗粒和合适的药物运载体的药物组合物。本发明提供的药物组合物可以是多种形式，例如，固体、液体、粉末、水性或冻干形式。合适的药物运载体的示例在本领域是众所周知的。可以通过常规方法配置这样的运载体和/或佐剂，并可以合适的剂量给予对象。稳定剂例如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以保护组合物免于在体内降解。
[0200] 本文提供的病毒载体颗粒可以包装成试剂盒。试剂盒可以任选地包括一种或多种组分，如使用说明书、装置和其它试剂及组分，如用于实践该方法的管、容器或注射器。示例性试剂盒可以包括本文提供的病毒，并且可以任选地包括使用说明书，用于检测对象中的病毒的装置，用于将病毒给予于对象的装置以及用于将化合物给予于对象的装置。
[0201] 本文还考虑包含编码感兴趣基因(通常是抗原)的多核苷酸的试剂盒。该试剂盒可以包括编码病毒包装组分的至少一种载体和编码辛德毕斯病毒E2糖蛋白变体的载体。一些试剂盒将含有编码病毒包装组分的至少一种质粒，编码辛德毕斯病毒E2糖蛋白变体的载体，和编码至少一种DC成熟因子的载体。
[0202] 本文还考虑包含编码感兴趣序列(通常为抗原)的病毒载体和任选地编码DC成熟因子的多核苷酸序列的试剂盒。在一些试剂盒中，试剂盒包含编码病毒包装组分的至少一种质粒和编码辛德毕斯病毒E2糖蛋白变体的载体。
[0203] 试剂盒还可含有说明书。说明书通常包括这样的有形表达，其描述了病毒，和任选地包括在该试剂盒中的其它组分，和给予方法，包括用于确定对象的适当状态、适当剂量和适当给予方法的方法，用于给予病毒。说明书还可包括用于在治疗期间监测对象的指南。
[0204] 本发明提供的试剂盒还可包括用于向对象给予病毒的装置。用于给予药物或疫苗的本领域已知的多种装置中的任一种都可包含在本发明提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于：皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予试剂盒病毒的装置将与试剂盒病毒相容；例如，可以将诸如高压注射装置等无针注射装置包括在具有未被高压注射损伤的病毒的试剂盒中，但通常不包括在具有被高压注射损伤的病毒的试剂盒中。
[0205] 本文提供的试剂盒还可以包括用于向对象给予化合物例如DC激活剂或刺激剂的装置。本领域已知的用于向对象给予药物的各种装置中的任何装置都可以包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置，但不限于，皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予试剂盒的化合物的装置将与给予化合物的所需方法相容。
[0206] 以下是本文考虑的慢病毒载体和使用方法的一些实施方式。
[0207] 实施方式1是包含靶向树突细胞的慢病毒载体颗粒的组合物，其中所述颗粒包含含有编码IL-12的多核苷酸序列的慢病毒载体基因组，所述组合物用于治疗癌症的用途，其中所述组合物经瘤内给予。
[0208] 实施方式2是如实施方式1所述用途的组合物，其中IL-12是单链IL-12(scIL-12)。
[0209] 实施方式3是如实施方式2所述用途的组合物，其中sclL-12包含p35-L-p40。
[0210] 实施方式4是如实施方式2所述用途的组合物，其中sclL-12包含p40-L-p35。
[0211] 实施方式5是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中慢病毒载体颗粒包含选择性结合至表达DC-SIGN的树突细胞的修饰的甲病毒E2糖蛋白。
[0212] 实施方式6是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒包括含辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分。
[0213] 实施方式7是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述治疗进一步包括经瘤内给予佐剂。
[0214] 实施方式8是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中佐剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性或水包油乳液制剂。
[0215] 实施方式9是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中包含慢病毒载体颗粒的组合物还包含吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性制剂。
[0216] 实施方式10是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒以单剂量给予。
[0217] 实施方式11是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述慢病毒载体颗粒产生在前48小时期间产生的约0.1μg至1μg/1E10载体基因组的IL-12水平，如体外转导测定所测量。
[0218] 实施方式12是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述治疗进一步包括调节性T细胞消耗。
[0219] 实施方式13是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中调节性T细胞消耗包括全身给予环磷酰胺或抗CD25抗体。
[0220] 实施方式14是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述全身给予环磷酰胺或抗CD25抗体在瘤内注射包含慢病毒载体的组合物之前进行。
[0221] 实施方式15是如前述实施方式中任一项所述用途的组合物，其中所述治疗进一步包括给予编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒。
[0222] 实施方式16是包含以下的产品：(a)第一组合物，靶向树突细胞的慢病毒载体颗粒，其包含含有编码IL-12的序列的慢病毒载体基因组；和(b)包含编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒的第二组合物；用于在对象中治疗癌症的方法中，其中所述第一组合物经瘤内给予，并且所述第二组合物通过不同的途径给予。
[0223] 实施方式17是如实施方式16所述的产品，其中所述第二组合物经皮内、皮下或肌内给予。
[0224] 实施方式18是如实施方式16-17中任一项所述的产品，其中所述第一组合物和所述第二组合物同时给予。
[0225] 实施方式19是如实施方式16-18中任一项所述的产品，其中所述第一组合物和所述第二组合物依次给予。
[0226] 实施方式20是慢病毒载体颗粒，其包括：包含辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和包含编码IL-23的序列的慢病毒载体基因组。
[0227] 实施方式21是慢病毒载体颗粒，其包括：a)包含辛德比斯病毒E2糖蛋白的包膜，所述糖蛋白为SEQ ID NO：1并且其中160X不存在或是除谷氨酸以外的氨基酸，或其SEQ ID NO：1的变体，该变体与SEQ ID NO：1具有至少80％相同性并且其中160X不存在或者是除谷氨酸以外的氨基酸，其能够感染树突细胞；其中E2不是与辛德毕斯病毒E3的融合蛋白的一部分；和b)包含编码IL-12的多核苷酸序列的慢病毒载体基因组。
[0228] 实施方式22是如实施方式21所述的慢病毒载体颗粒，其中IL-12是单链IL-12(scIL-12)。
[0229] 实施方式23是如实施方式21-22中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其中sclL-12包含p35-L-p40。
[0230] 实施方式24是如实施方式21-23中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其中sclL-12包含p40-L-p35。
[0231] 实施方式25是如实施方式21-24中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其中所述慢病毒载体基因组还包含编码抗原的序列。
[0232] 实施方式26是如实施方式21-25中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其中所述抗原是肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
[0233] 实施方式27是如实施方式26所述的慢病毒载体颗粒，其中所述肿瘤相关抗原选自：前列腺酸性磷酸酶、前列腺特异性抗原、NKX3.1,前列腺特异性膜抗原,PRAME；BAGE；RAGE,NY-ESO-1,SAGE,HAGE,GAGE,Plu-1,HASH-1,HasH-2,Cripto,Criptin,MART-1/Melan-A,gp100,gp75,mda-7,酪氨酸酶,酪氨酸酶相关蛋白,p53,Ras,c-Myc,A-Raf,B-Raf,和C-Raf,MAGE-A1,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A6,MAGE-A10,MAGE-A12,MART-1,BAGE,DAM-6,-10,GAGE-1,GAGE-2,GAGE-8,GAGE-3,GAGE-4,GAGE-5,GAGE-6,GAGE-7B,NA88-A,MART-1,MC1R,Gp100,PSM,TRP-1,TRP-2,ART-4,CAMEL,CEA,Cyp-B,hTERT,hTRT,iCE,MUC1,MUC2,PRAME,P15,RU1,RU2,SART-1,SART-3,维尔姆斯肿瘤抗原(WT1),AFP,β-连环蛋白/m,胱冬酶-8/m,CEA,CDK-4/m,ELF2M,GnT-V,G250,HSP70-2M,HST-2,KIAA0205,MUM-1,MUM-2,MUM-3,肌球蛋白/m,SART-2,TRP-2/INT2,707-AP,膜联蛋白II,CDC27/m,TPI/mbcr-abl,BCR-ABL,干扰素调节因子4(IRF4),ETV6/AML,LDLR/FUT,Pml/RAR,肿瘤相关的钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2,表皮生长因子受体(EGFR和EGFRvIII),血小板衍生的生长因子受体(PDGFR),血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR),整合素连接激酶(ILK),STAT3,STAT5,STAT6,HIF-1,HIF-2,核因子-κB(NF-κB),Notch1-4,c-Met,雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR),WNT,PMSA,PR-3,MDM2,间皮素(Mesothelin),肾细胞癌–5T4,SM22-α,碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)(也称为G250),STEAD,TEL/AML1,GD2,蛋白酶3,hTERT,肉瘤易位断点,EphA2,ML-IAP,EpCAM,ERG(TMPRSS2ETS融合基因),NA17,PAX3,ALK,雄激素受体,细胞周期蛋白B1,聚唾液酸,MYCN,RhoC,GD3,岩藻糖基GM1,间皮素(mesothelian),PSCA,sLe,PLAC1,GM3,BORIS,Tn,GLoboH,NY-BR-1,RGs5,SART3,STn,PAX5,OY-TES1,精子蛋白17,LCK,HMWMAA,AKAP-4,SSX2,XAGE 1,B7H3,豆荚蛋白(legumain),TIE2,Page4,MAD-CT-1,FAP,MAD-CT-2,和fos相关抗原1。
[0234] 实施方式28是治疗对象的癌症的方法，其包括向对象给予有效量的包含本文所述的任何慢病毒载体颗粒的组合物。
[0235] 实施方式29是如实施方式28所述的方法，其还包括向对象给予有效量的包含编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体的组合物。
[0236] 实施方式30是如实施方式28-29所述的方法，其中实施方式21表达的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体同时给予。
[0237] 实施方式31是如实施方式28-29中任一项所述的方法，其中实施方式21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体在不同的时间依次给予。
[0238] 实施方式32是如实施方式29所述的方法，其中实施方式21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体通过不同途径给予。
[0239] 实施方式33是如实施方式29所述的方法，其中实施方式21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体在不同位点给予。
[0240] 实施方式34是如实施方式29所述的方法，其中实施方式21的慢病毒载体颗粒和所述第二慢病毒载体通过相同途径在不同位点给予。
[0241] 实施方式35是如实施方式28所述的方法，其中所述慢病毒载体颗粒经瘤内给予。
[0242] 实施方式36是如实施方式29所述的方法，其中实施方式21的慢病毒载体颗粒经瘤内给予，并且所述第二慢病毒载体通过不同途径在不同位点同时给予。
[0243] 实施方式37是治疗对象的癌症的方法，其包括向对象给予有效量的包含实施方式25的慢病毒载体颗粒的组合物。
[0244] 实施方式38是如实施方式28所述的方法，其中所述方法进一步包括瘤内给予TLR4激动剂。
[0245] 实施方式39是如实施方式38所述的方法，其中所述TLR4激动剂是吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性或水包油乳液制剂。
[0246] 实施方式40是如实施方式35所述的方法，其中包含慢病毒载体颗粒的组合物还包含吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)的水性制剂。
[0247] 实施方式41是本文中任一种方法，其中所述慢病毒载体颗粒以单剂量给予。
[0248] 实施方式42是本文中任一种方法，其中所述慢病毒载体颗粒产生低水平的IL-12。
[0249] 实施方式43是本文中任一种方法，其中如在体外转导测定中所测量的，低水平的IL-12为在前48小时期间产生的约0.1μg至1μg/lE10载体基因组。
[0250] 实施方式44是本文中任一种方法，其中所述慢病毒载体颗粒经瘤内给予。
[0251] 实施方式45是如实施方式21-27中任一项所述的慢病毒载体颗粒，其用于治疗人或动物对象的方法中。
[0252] 实施方式46是包含如实施方式21所述的慢病毒载体颗粒和编码肿瘤抗原的第二慢病毒载体颗粒的组合物。
[0253] 实施方式47是治疗或预防性疫苗，其包含实施方式25的慢病毒载体颗粒和药学上可接受的赋形剂。
[0254] 通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
[0255] 实施例
[0256] 实施例1
[0257] 表达IL-12的慢病毒载体的工程改造
[0258] 用修饰的辛德毕斯E2包膜糖蛋白假型化的慢病毒载体经工程改造为表达鼠IL-12(本文称为VP02/IL-12)，所述糖蛋白将慢病毒载体靶向表达DC-SIGN的树突细胞(参见例如，美国专利号8,187,872和8,323,662)。IL-12包含与亚基p35和p40连接的两个二硫键。通过经弹性蛋白连接子连接但处于不同方向的两个亚基制备两种不同的构建体：p35-弹性蛋白-p40和p40-弹性蛋白-p35(p35-L-p40；p40-L-p35)。最初的实验显示p40-L-p35载体产生更高量的IL-12。在功能性生物测定中，将293-DC-SIGN细胞用VP02/IL-12候选物转导，并收集培养物上清液。将鼠脾细胞与上清液一起孵育。在1至48小时的时程实验中，收集脾脏培养上清液并分析分泌的IFNγ。结果显示两种VP02/IL-12候选物均产生功能性IL-12。然而，选择p40-L-p35候选物用于继续研究。
[0259] 进行进一步的实验以定量载体产生的IL-12的量。实验如下：
[0260] ·第0天：在6孔中用2.5ml培养基以1e6/孔接种293T-DCSIGN细胞
[0261] ·第1天：次日，转染VP02-mIL12(p35-p40)和VP02-mIL12(p40-p35):(使用来自英杰公司(Invitrogen)的Lipofectamine2000)包含VP02-GFP质粒用于阳性转染对照。
[0262] ■将1.5ug质粒加入到250ul OptiMEM培养基中
[0263] ■添加4.5ul Lipofectamine2000试剂，混合，室温孵育30分钟
[0264] ■直接加入接种的细胞
[0265] ·第1天：转染载体，10ul浓缩/孔
[0266] ■VP02-mlL12(p35-弹性蛋白-p40)-非整合性，3.1e11基因组/ml
[0267] ■VP02-mlL12(p40-弹性蛋白-p35)-非整合性，5.9e11基因组/ml
[0268] ■VP02-GFP-非整合性，1.9e11基因组/ml
[0269] ·第2天：用新鲜的10％FBS DMEM代替培养基，包括1x PBS洗涤
[0270] ·第4天：收集上清液并通过0.45uM过滤，保存在-80℃直至ELISA
[0271] 在所有上清液中检测到IL-12。如预期的那样，质粒转染具有比载体转导更高的水平。p40-L-p35载体比反向取向产生更多的IL-12。这些结果如下表所示。
[0272] pg/ml ng/ml ug/ml
阴性 BLQ BLQ BLQ
GFP载体 BLQ BLQ BLQ
35-40载体 4337.6 4.3 0.0
40-35载体 161973.3 162.0 0.2
GFP质粒 BLQ BLQ BLQ
35-40质粒 890050.0 890.1 0.9
40-35质粒 10698666.7 10698.7 10.7
阴性 BLQ BLQ BLQ
GFP载体 BLQ BLQ BLQ
35-40载体 4337.6 4.3 0.0
40-35载体 161973.3 162.0 0.2
GFP质粒 BLQ BLQ BLQ
35-40质粒 890050.0 890.1 0.9
40-35质粒 10698666.7 10698.7 10.7
[0273] BLQ:低于定量限制
[0274] 实施例2
[0275] VP02/IL-12与表达肿瘤抗原的慢病毒载体的共递送增强了肿瘤抗原特异性CD8 T细胞
[0276] 该实验显示VP02/IL-12与表达肿瘤抗原的VP02的共递送增强了抗肿瘤抗原CD8T细胞响应。
[0277] 进行了两个实验来评估VP02/IL-12慢病毒载体产生的IL-12与由VP02慢病毒载体表达的肿瘤相关抗原的表达的组合是否可以增强小鼠中抗原特异性CD8T细胞的响应。
[0278] 根据表1，用VP02/IL-12和VP02/肿瘤抗原(NY-ESO-1或CAIX)在尾的根部(base of the tail)经皮下免疫雌性C57/BL/6或B6D2/F1小鼠。在用CD8反应性肽离体再刺激后，免疫后13天通过细胞内细胞因子染色测量脾T细胞响应。
[0279]
[0280]
[0281] 如图1和图2所示，VP02/IL-12与表达NY-ESO-1(图1)或hCAIX(图2)的VP02的共递送增强了抗原特异性CD8响应。
[0282] 进行其他实验以进一步评估VP02/IL-12提供的增强。如图3所示，当以相对较高的载体基因组剂量(1E10载体基因组)给予时，VP02/IL-12与LV305(表达NY-ESO-1的VP02)的共给予增强了Ag特异性CD8T细胞响应。但是应注意，即使在这样高的v.g.剂量下，IL-12的总体表达依然很低(例如，基于在最佳培养条件下的体外研究，在前48小时内产生小于约0.5微克)。特别要注意的是，本实验中1E9vg下产生的抗NY-ESO-1抗原特异性免疫应答本质上是不可检测的，并且这种基本上检测不到的免疫应答出乎意料地通过VP02/IL-12的共递送而显著增强(图3B)。VP02/IL-12共递送还增强了CD4响应(参见图4A和4B)。
[0283] 甚至更低剂量的VP02/IL-12(1E9vg剂量)与临界免疫原性剂量的LV305(1E9vg)的共同给予增强了CD8和CD4响应(参见图5A-5D)。
[0284] 实施例3
[0285] VP02/IL12的共给予增强了高剂量VP02/hCAIX的治疗活性
[0286] 本实施例描述了所进行的实验，用于测试VP02/hCAIX与VP02/IL-12对已用BC.12hCAIX表达型肿瘤克隆攻击的小鼠的治疗益处。
[0287] 在小鼠右胁经皮下注射表达hCAIX的BC.12肿瘤细胞。在第8天给予治疗。每2-3天记录肿瘤大小。基本实验方案见下表2和3。
[0288]
[0289]
[0290] 图6显示共同给予VP02/IL12增强了高剂量VP02/hCAIX的治疗活性，但差异不显著。类似地，VP02/IL-12的共给予增强了中剂量VP02/hCAIX的治疗活性，但是差异不显著。
[0291] 实施例4
[0292] VP02/IL12的共同给予增强了低剂量VP02/NY-ESO-1(LV305)的治疗活性
[0293] 本实验显示VP02/IL-12的共同给予增强了亚免疫原剂量的表达NY-ESO-1的VP02(LV305)的治疗活性。
[0294] 该实验方法是：第0天：用1.5x 105CIN.23细胞(尾静脉静脉内)攻击BALB/c小鼠。第3天：用VP02/NYESO1±VP02/mlL12尾根免疫。第18天：从肿瘤中分离淋巴细胞并通过流式细胞术分析脾脏。
[0295] 如图7A所示，通过与VP02/IL12混合显著增强低剂量LV305介导的抗肿瘤功效，并且抗肿瘤功效与NYESO1特异性CD8T细胞的量级相关(图7B)。
[0296] 实施例1-4的总结和结论：VP02/IL12可用于增强对基于VP02的免疫疗法的CD8和CD4响应，包括增强的抗肿瘤功效。对CD8响应的影响通常相当于3-5倍的LV305剂量增加，对于CD4响应的增强相当于多达10倍以上。当VP02免疫疗法(例如，LV305)诱导较弱的响应水平时，VP02/IL12通常是最有效的。对于LV305，在本文所述的小鼠模型中，通常在1E9-1E10vg剂量范围诱导这样的响应。低剂量使用VP02/IL12效果较差。具体而言，仅在偶尔状况下，剂量低于1E10vg的IL-12才导致CD8响应的任何免疫增强作用。以与VP02/Ag相同(或更高)剂量使用VP02/IL12时通常有效，表明它可以从与肿瘤抗原(针对其的免疫应答是期望的)相同的载体有效表达。
[0297] 实施例5
[0298] 给予表达其他细胞因子的VP02
[0299] 测试了从VP02表达的7种不同细胞因子的组增强肿瘤特异性抗原特异性免疫应答的能力。
[0300] 测试的细胞因子是VP02/IL-15,VP02/IL-18,VP02/IL-21,VP02/IL-23,VP02/IL-1β,VP02/IL-TNF,VP02/IL-IFNγ。BALB/C小鼠以3种剂量水平的LV305(高(hi)、中(Med)、低(Lo))与恒定剂量的VPO 2/1L-X(高)免疫两次，其中间隔3周。在第14天，在引发后的外周血中测量T细胞响应(仅中等剂量)。在加强免疫后第33天，从脾中分离淋巴细胞，通过ICS和流式细胞术进行分析。
[0301] 在所测试的细胞因子中，VP02/IL-23能够显著增强引发后PBMC中由LV305诱导的CD8T细胞响应(参见图8)。
[0302] 实施例6
[0303] 单一瘤内给予表达IL-12的慢病毒载体导致所测的六个鼠肿瘤模型中的六个具有显著的抗肿瘤功效
[0304] 本实施例表明，瘤内注射表达IL-12的慢病毒载体在所测的六个鼠肿瘤模型中显著有效。
[0305] 使用以下概述的方法在6个不同的鼠肿瘤模型中测试瘤内LV/IL-12给予。
[0306] 方法
[0307] 第0天：用肿瘤细胞接种小鼠。第7天：用表达IL-12的LV免疫小鼠，所述LV用修饰的辛德毕斯包膜假型化(LV703-整合型；704-整合缺陷型，也称为VP02)，或者用VSVG而不是修饰的辛德毕斯包膜假型化的LV/IL-12(整合缺陷型)免疫小鼠。当肿瘤达到>100mm2(足垫)或200mm2(胁侧)时，将小鼠处死。
[0308] 监测小鼠肿瘤生长和存活持续6周以上。
[0309] 如图9-14所示，在测试的所有6个肿瘤模型中，LV/IL-12在减少肿瘤生长和增加经治疗动物的存活方面非常有效。703/mlL-12慢病毒载体是用修饰的辛德毕斯包膜假型化的整合型慢病毒载体，在所有肿瘤模型中均达到最佳抗肿瘤效果。尽管不如703载体有效，但整合缺陷载体(704/mlL-12(也称为VP02/IL-12)和VSVG/mlL-12)在延迟肿瘤生长和增加存活方面也是有效的。
[0310] 进行其他实验以确定，从上述瘤内注射实验中所用的载体转导的293-DC-SIGN细胞获得的上清液中的IL-12水平。在存在或不存在奈韦拉平的情况下，转导后48小时测试整合型和非整合型载体的IL-12产生。具体而言，在第0天，将2mL完全DMEM中的1E6 293-DC-SIGN细胞置于6孔板中。在第1天，在奈韦拉平不存在和存在下，用8.5E9载体基因组转导细胞。转导在600μL完全DMEM±奈韦拉平中进行，6小时后加入0.9mL完全DMEM±奈韦拉平。在第3天(转导后48小时)，通过0.45μm过滤器过滤上清液。使用市售试剂盒R&D试剂盒M1270进行标准ELISA。结果如下表所示。括号中的数字显示在奈韦拉平存在下测量的IL-12。
[0311]
[0312] 尽管没有进行比较研究，但与在较短时间内表达较高水平的IL-12的基于急性病毒家族的载体相比，相对较低的表达传播较长时间可能有助于在上述实验中观察到的令人惊讶的功效，并且对于安全性概况也可能是有利的。此外，在树突细胞(生理学上产生IL-12的最为熟知的细胞)中特异性靶向表达IL12可能有助于出乎意料地有效的抗肿瘤响应，这与通过电穿孔或通过其他双嗜性病毒随机注射到任何肿瘤细胞中相反。
[0313] 实施例7
[0314] 单一瘤内给予表达IL-12的慢病毒载体与抗-CTLA-4抗体和/或GLA-AF的组合在3个小鼠肿瘤模型中的3个中产生显著抗肿瘤功效
[0315] 本实施例显示，在所测三个鼠肿瘤模型中的三个中，瘤内注射表达IL-12的慢病毒载体与抗CTLA-4抗体和/或GLA-AF/SE的组合均显著有效。
[0316] 使用以下概述的方法在3个不同的鼠肿瘤模型中测试瘤内LV/IL-12给予与抗CTLA-4抗体和/或GLA-AF/SE的组合。
[0317] 方法
[0318] 第0天：用肿瘤细胞接种小鼠(右侧)。第7天：用肿瘤细胞接种小鼠(左侧)。用LV703/IL-12免疫小鼠(703-整合型；1.3E10基因组；每只小鼠5.4ng rlL12)或LV703/IL-12/RTmut(703-整合型；逆转录酶突变以消除其活性；9.8E9基因组；每只小鼠5.4ng rlL12)，加或不加抗CTLA-4或GLA。抗CTLA-4每周给予一次，直到研究结束。在接受GLA的小鼠中，第一次GLA剂量(在第7天给予)是GLA-AF，与载体混合，然后瘤内给予。随后的GLA剂量是GLA-SE，每周给予一次，直到研究结束。当肿瘤达到>100mm2(足垫)或200mm2(胁侧)时，将小鼠处死。
[0319] 监测小鼠肿瘤生长和存活持续6周以上。
[0320] 如图17-19所示，在所测试的所有3个肿瘤模型中，单独的703/IL-12在降低肿瘤生长和增加经治疗动物的存活方面非常有效，证实了实施例6中显示的结果。这种治疗益处由具有完整逆转录酶的载体颗粒的存在所驱动，因为用LV703/IL-12/RTmut处理的小鼠中的肿瘤生长与未处理的携瘤小鼠相似。每个测试的肿瘤模型中的其他观察结果如下详述。
[0321] 在B16足垫模型中(图17)，原发性肿瘤(右侧)中的瘤内LV703/IL-12给予显著延迟未治疗的远端部位(左侧)的肿瘤生长，这种现象称为远隔影响。抗CTLA-4抗体的添加进一步延迟了原发性肿瘤的生长，但不延缓远端肿瘤的生长。
[0322] 在B16胁部模型(图18)中，在原发性肿瘤中瘤内给予LV703/IL-12显著延迟未治疗的远端部位的肿瘤生长。抗CTLA-4抗体的加入没有进一步延迟原发性肿瘤的生长(可能是因为单独LV703/IL-12成功抑制了几乎所有的肿瘤生长)，但进一步延迟了远端肿瘤的生长(参见图18B)。在该模型中，单一瘤内注射LV703/IL-12导致原发性肿瘤消退和未治疗的继发性肿瘤的延迟生长。肿瘤退化的小鼠未能抵抗第二次肿瘤攻击，表明免疫记忆的次最佳生成。
[0323] 如上所述，在4T1乳腺肿瘤模型(图19)中，在原发性肿瘤中瘤内给予LV703/IL-12显著延迟原发性肿瘤生长。额外的瘤内给予GLA-SE进一步延迟了原发性肿瘤的生长(图19A)。在原发性肿瘤中瘤内给予LV703/IL-12+GLA-SE也导致未治疗的远端部位的肿瘤生长延迟(图19C)。向LV703/IL-12+GLA-SE添加抗CTLA-4抗体不会进一步延迟原发性或远端肿瘤的生长(可能是因为4T1是强侵袭性肿瘤模型，动物死于由于肿瘤扩散至肺部而引起的窒息；见图19B和19C)。表4列出了动物的存活率。
[0324]
[0325] 因此，上述实施例支持单独使用LV/IL-12或其与检查点抑制剂和/或TLR4激动剂联合，用于治疗癌症和其他受益于免疫疗法的疾病。
[0326] 实施例8
[0327] 当与重组蛋白和GLA/SE共给予时，VP02/IL-12显著增加抗原特异性CD4T细胞响应[0328] 进行本实施例中的实验以评估共给予VP02/IL-12与重组蛋白+GLA/SE(合成的脂质A TLR4激动剂佐剂)的免疫原性。
[0329] 用VP02/IL-12和重组NY-ESO-1(rNY-ESO-1)，有或没有GLA/SE，经皮下注射在尾根部，从而免疫雌性B6D2/F1小鼠(见表5)。在用CD4和CD8反应性肽离体再刺激后，通过ICS免疫后7天测量脾T细胞响应。
[0330]
[0331] 结果示于图15。如预期的那样，具有GLA-SE的重组蛋白诱导了TH1 CD4T细胞响应。图15A显示细胞因子阳性CD4 T细胞百分比，图15B显示总IFNγ CD4阳性T细胞百分比。结果显示，当与混合在一起的rNY-ESO-1+GLA-SE共同给予并在尾巴根部经皮下给予时，VP02/IL-12的添加显著增加NY-ESO-1Ag-特异性CD4 T细胞响应。
[0332] 在使用重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)和GLA-SE组合的单独实验中，VP02/IL-12的添加显著增强了CD8 T细胞响应(图16A和16B)，但降低了CD4T细胞响应(图16C和16D)。
[0333] 与VP02/IL12增强针对表达抗原的VP02的响应的效果相比，CD4响应水平的降低或至少缺乏增加特别引人注目。可能的解释是表达抗原的VP02不能单独诱导高CD4响应，而具有重组蛋白抗原的GLA诱导显著的CD4水平。因此，IL12的加入可能不会为CD4诱导提供额外的刺激。
[0334] 实施例9
[0335] 在经瘤内LV/IL-12处理的小鼠血液中的检测到IL-12和IFNγ
[0336] 进行本实施例中的实验以评估经瘤内注射LV/IL-12后IL-12和IFNγ的血浆水平和动力学。
[0337] 用1x 105B16肿瘤细胞接种小鼠(6雌性/组)。当可触知肿瘤(第7天)时，用LV703/mlL12，IT免疫小鼠。在第0(出血前),1,3,6,8,12,15,17和20天，抽取血液以测量存在于血浆中的IL-12和IFNγ的量。每周检测肿瘤生长2-3次。当肿瘤面积超过200mm2(胁侧)时，将小鼠处死。如图20所示，在瘤内注射LV703/mlL12的小鼠的血液中检测到增加的IL12和IFNγ。
[0338] 实施例10
[0339] 经瘤内LV/IL-12处理的小鼠的细胞消耗研究
[0340] 进行本实施例中的实验以调查哪些细胞在经瘤内LV/IL-12处理的小鼠中负责抗肿瘤作用。
[0341] 方法
[0342] 用1x 105B16肿瘤细胞接种小鼠(10-20雌性/组)。在第4天开始用抗体(200ug)消耗特异性免疫细胞亚组并每周继续两次。当可触知肿瘤(第7天)时，用LV703/mlL12，IT免疫小鼠。每周检测肿瘤生长2-3次。当肿瘤面积超过200mm2(胁侧)时，将小鼠处死。
[0343] 如图21所示并且证实了先前的实验，单一瘤内注射LV703/IL12导致肿瘤消退。单一免疫细胞亚组的消耗不会消除由i.t.LV/IL12诱导的抗肿瘤功效。具体参见图21A和21B。此外，CD4和NK细胞一起消耗也不会消除由i.t.LV/IL-12诱导的抗肿瘤功效。CD8 T细胞的消耗确实表明这些细胞对于用i.t.LV703/IL-12注射的小鼠中的抗肿瘤控制是必需的，但不足够。(参见例如图21，其中仅CD8细胞的消耗不消除抗肿瘤作用，但当与CD4细胞的消耗、NK细胞的消耗或两者的消耗组合时，肿瘤控制被消除)。
[0344] 在本实验的第98天，在剩余总计41只小鼠中，8只小鼠患有肿瘤；33只小鼠没有肿瘤，进一步证实了用LV/IL12瘤内治疗的出乎意料的功效。
[0345] 有趣的是，在瘤内注射LV/IL12并消耗CD4 T细胞的小鼠中观察到严重的白斑病(参见图21B和21E)。仅当CD8T细胞存在时才观察到这种效应，表明i.t.LV703/IL-12产生靶向黑素细胞的效应器CD8T细胞的至少一个亚组，导致毛色的脱色素化(白斑病)。白斑病是由黑素瘤特异性抗肿瘤功效的强烈诱导而引起的常见自身免疫性疾病。此外，由于仅在i.t.LV703/IL-12处理且CD4 T细胞消耗的小鼠中观察到白斑病，所以调节性T细胞的缺失可进一步改善i.t.LV703/IL-12治疗。
[0346] 总之，局部(瘤内)给予LV/mlL12促进系统性CD8T细胞介导的抗肿瘤响应(使“冷”肿瘤变“热”)。不受理论限制，为了免疫记忆的最佳进展，调节性T细胞可能需要被消耗。
[0347] 实施例11
[0348] 经瘤内LV/IL-12处理的小鼠的调节性T细胞消耗研究
[0349] 进行实验以研究调节性T细胞消耗和瘤内IL-12给予的组合的治疗功效。
[0350] 方法
[0351] 用1x 105B16肿瘤细胞接种小鼠(10-20雌性/组)。在第4天开始用低剂量环磷酰胺、抗CD25或抗CTLA4抗体(200ug)或白喉毒素(见下文)消耗调节性T细胞并每周继续两次。当可触知肿瘤(第7天)时，用LV703/mlL12瘤内免疫小鼠。每周检测肿瘤生长2-3次。当肿瘤
2
面积超过200mm(胁侧)时，将小鼠处死。
2
面积超过200mm(胁侧)时，将小鼠处死。
[0352] 调节性T细胞也使用转基因小鼠(例如DEREG或Foxp3.LuciDTR小鼠)耗尽。这些小鼠可以携带在Foxp3启动子的控制下的白喉毒素受体(DTR)转基因，从而允许在任何时间点通过给予白喉毒素而特异性耗尽调节性T细胞(参见例如Li等，Eur J Immunol 2010,40:3325-3335)。
[0353] 不受理论限制，调节性T细胞的消耗进一步改善i.t.LV703/IL-12治疗。可测量记忆细胞以确定记忆表型细胞相比未接受调节性T细胞消耗治疗的组的增加。进行进一步的实验以对肿瘤消退的小鼠进行再攻击以确定治疗是否足以在再攻击后消除肿瘤生长。
[0354] 序列表中公开的序列也在WO201101584中提供：
[0355]SEQ ID NO 描述
1 辛德毕斯病毒E2糖蛋白
2 SVGmu
3 E2变体
4 E2变体
5 E2变体
6 E2变体
7 E2变体
8 E2变体
9 E2变体
10 E2变体
11 E2变体
12 E2变体
13 E2变体
14 E2变体
15 E2变体
16 E2变体
17 辛德毕斯病毒株HR的包膜糖蛋白的示例序列
18 HR株的E2蛋白
19 辛德毕斯蛋白
20 E3/E2多聚蛋白序列
21 载体U3区域
22 载体U3区域
23 载体U3区域
24 OVA257肽
25 AH1A5肽
26 E2/E3融合物的RSKRS
27 E2/E3融合物的RSKR
28 FLAG表位标签
1 辛德毕斯病毒E2糖蛋白
2 SVGmu
3 E2变体
4 E2变体
5 E2变体
6 E2变体
7 E2变体
8 E2变体
9 E2变体
10 E2变体
11 E2变体
12 E2变体
13 E2变体
14 E2变体
15 E2变体
16 E2变体
17 辛德毕斯病毒株HR的包膜糖蛋白的示例序列
18 HR株的E2蛋白
19 辛德毕斯蛋白
20 E3/E2多聚蛋白序列
21 载体U3区域
22 载体U3区域
23 载体U3区域
24 OVA257肽
25 AH1A5肽
26 E2/E3融合物的RSKRS
27 E2/E3融合物的RSKR
28 FLAG表位标签
[0356] 本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“一种抗原”，包括多种这类抗原，且提到“一种细胞”或“所述细胞”包括本领域技术人员已知的一种或多种细胞及其等同物(例如，多种细胞)等。类似地，提及“一种化合物”或“一种组合物”，包括多种此类化合物或组合物，并且除非本文中另有明确说明，分别指的是一种或多种化合物或组合物。当方法中的步骤被描述或需要保护，并且所述步骤以一定顺序描述时，描述第一步在“先于”或在第二步“之前”发生(或进行)等同于描述第二步“后续于”或在第一步“之后”发生(或进行)。指代数字或数字范围时，术语“约”表示所指数字或数字范围是实验变异性内的约数(或在统计学实验误差内)，且因此该数字或数字范围可在所示数字或数字范围的1％至15％之间变化。术语“包含”(和相关术语例如“包括”或“含有”或“具有”或“涵盖”)不意在排除在其它某些实施方式中，例如，本文所述的物质的任何组合物、组合物、方法或步骤等，可“由”所述特征“组成”或“基本由”所述特征“组成”。
[0357] 也可以组合所述各种实施方式以提供其他实施方式。本说明书中提及的和/或列于申请数据表单中的所有美国专利、美国专利申请公开文本、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利公开文本和由登录号提及的序列均通过引用其全文纳入本文。所述实施方式的各方面可被修改，必要时可应用各种专利、申请和出版物的概念，以提供更多的实施方式。
[0358] 根据上述详细说明可对实施方式进行这些和其他改变。总体而言，权利要求中所用的术语应不被认为是将权利要求限制到本说明书和权利要求中公开的具体的实施方式，而应认为是包括遵循与所列权利要求等同的完全范围的所有可能的实施方式。因此，权利要求并不受本公开内容限制。
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