沙门氏菌属包含2个种：肠沙门氏菌(Samonella enteria)(根据生化 特征和在DNA水平上的同源性将该种分成6个亚种)和乍得沙门氏菌 (Salmonella bongori)。根据菌体和鞭毛抗原的限定将该属进一步分成超过2000 个血清型。沙门氏菌属的细菌通常是动物和人的病原体。因此已知 在发达国家中沙门氏菌属是最普遍的食物中毒病例的引发者之一； 这就是为什么快速和可信的检测沙门氏菌属亚种的方法显得重要 的原因。

引起食物毒性感染的沙门氏菌主要属于肠沙门氏菌(S.enterica)的亚 种I(也称I组)。

然而毒性感染不是由沙门氏菌属感染引起的唯一病状。

例如，肠沙门氏菌亚种的肠血清型伤寒(下文称为伤 寒)是人伤寒发烧的病原体。

如果提供了由沙门氏菌引起的感染的特征且特别需要确定在 取自病人或食物的生物学样品中沙门氏菌的存在，那么得到快速和 灵敏地检测它们在样品中存在的有效方法似乎是必须的。

到目前为止广泛地用于检测沙门氏菌的标准培养方法需要大 量的时间并且不适于诸如食品污染的监测。为了克服这些方法的缺 陷，根据分子生物学技术(如杂交试验和以聚合酶链式反应为基础的 试验)已提出了一些方法。各种DNA探针已用于几个杂交和PCR 方法中以检测食物中沙门氏菌属的亚种。然而，这些技术无一能令 人完全满意，因为所用的序列不是完全已知的或不是唯一存在于沙 门氏菌属中，因此可能会导致在探针和其它肠细菌DNA序列之间的 交叉反应或可能导致大量假阴性或假阳性。

本发明人找到了检测种肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌(S.bongori)所 有沙门氏菌的特异而灵敏的方法。最后，他们把注意力集中到肠沙门氏菌亚 种的肠血清型伤寒菌株伤寒沙门氏菌(S.Typhi)和与伤寒沙门氏菌侵入细胞 有关的基因上。

另外，他们限定了能够特异性检测沙门氏菌限定组(例如I组细 菌)的某些条件。

本领域的现有技术已表明伤寒菌株能附着到HeLa细胞单层上 并能进入这些细胞(Yabuuchi et al，1986)。然而，直到现在，与附着 和进入细胞过程有关的遗传决定因素尚未被清楚地鉴定。 Elsinghorst等(1989)克隆了伤寒染色体片段，该片段使大肠杆菌型 细菌获得穿透Henle 407细胞的能力。最近与伤寒Ty2菌株侵入 HeLa细胞有关的另一染色体区域已被鉴定和克隆(Popoff and Dion，1990)。

本申请发明人鉴定了一条2.4kb的伤寒沙门氏菌DNA片段，它包含在 Popoff和Dion(1990)描述的7.9Kb的Hind III序列之中，该区域能参 与肠沙门氏菌亚种肠血清型伤寒侵入细胞，特别是HeLa 型细胞培养物的活动，而且该区域能用于对种肠沙门氏菌和/或 乍得沙门氏菌的所有代表菌株进行一般化诊断或任选地在特定检测条 件下对肠沙门氏菌I组进行特异性诊断的反应中。

本发明人已鉴定了称为IagA的序列和称为IagB的序列并鉴定 为参与细胞侵入，这一特征在由肠沙门氏菌亚种肠血清型 伤寒菌株引起的感染中表现出来。

这些序列在伤寒沙门氏菌中的特异性使本发明人提出了其用途，以 便规定用于对伤寒沙门氏菌感染的诊断或甚至对沙门氏菌属种肠沙门氏菌 和/或乍得沙门氏菌感染的诊断，或在某些情况下检测肠沙门氏菌特定组 的工具。

可用于对肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌感 染进行诊断的这些工具包含能用于核苷酸序列扩增反应(例如聚合 酶链式反应)中的寡核苷酸。本发明还涉及用于检测肠沙门氏菌 或肠沙门氏菌特异亚种和/或乍得沙门氏菌之核酸的探针、这些核酸(其 中合适的)被扩增的片段。

本发明的主题还涉及用于检测在生物样品(例如食品)或任何用 于临床诊断的样品中肠沙门氏菌和/或乍得沙门 氏菌存在的试剂盒和方法。根据本发明的特定实例，这些检测试 剂盒和方法对肠沙门氏菌I组菌株是特异性的。

相反，根据本发明的另一实例，这些方法使搜寻沙门氏菌属 肠沙门氏菌或乍得沙门氏菌细菌的存在成为可能。因此，沙门氏菌属包 含6个亚种或I，II，III，IV，V或VI组。亚种I，II，III，IV或VI属于 肠沙门氏菌种，亚种V属于乍得沙门氏菌种。

本发明还涉及参与肠沙门氏菌亚种肠血清型伤寒菌 株侵入细胞的核苷酸序列，其特征在于它们是分别位于图1(Iag A) 提供之序列的核苷酸97和1755之间和图1(Iag B)提供之序列的核 苷酸1776和2255之间的序列iagA或iagB之一。

本发明还涉及经过与iagA或iagB有关的修饰但却表现出与侵 入细胞有关的相同特征或在严紧条件下与上述序列之一杂交的核 苷酸序列。

本申请的主题还涉及与图1提供的序列或这些序列的变异体 相应的IagA和IagB蛋白质，这些序列的变异体可通过突变，缺失或 增加氨基酸获得，只要由此获得的序列可被直接抗上述IagA或、 IagB序列之一的抗体识别。

一般来说，本发明的主题涉及由图1提供的iagA和iagB基因编 码的任何氨基酸序列。

而且，本发明涉及足以使伤寒沙门氏菌保留其附着和感染细胞(特别 是培养中的HeLa细胞)之特性的这些序列之一的任何片段，尤其是 任何经纯化的片段。

感染培养中的HeLa细胞的方法是标准方法，它已被特别地描 述于公开号为WO 92/01056的国际专利申请中。

根据另一方面，本发明涉及用于检测生物样品中肠沙门氏菌和/ 或乍得沙门氏菌存在的工具，和适当时用于定量生物样品中肠沙门氏菌 和/或乍得沙门氏菌的工具。

应理解生物样品是指任何收集用于对动物或人进行体外分析 的样品或从食品中收集的不论其性质的样品或从任何液体，固体或 气体介质中收集的很可能含有所需病原体的样品。

本说明书中本发明的主题涉及包含至少9个核苷酸的核苷酸 序列，其特征在于它与上面提供的IagA或IagB序列之一杂交。

上面提及的杂交条件根据所需的杂交特异性进行限定，以本申 请实施例中提供的合适条件作为指导。

优选的是，本发明涉及来自图1提供的IagA序列C端部分的寡 核苷酸。

可选择寡核苷酸型序列作为引物，扩增后用于检测属于I组到 VI组的其它组或这些组的一部分的肠沙门氏菌种和/或乍得沙门氏菌种 沙门氏菌属的基因组DNA或cDNA，或用于在其它条件下特异性地 检测肠沙门氏菌I组。它们可以是根据本领域的技术人员已知的方法 经化学合成获得的特定的核苷酸序列。

优选的用于扩增的其特征为属于沙门氏菌属I，II，IIIa，IIIb，IV， V或VI组之一的细菌的核酸，特别是用于扩增肠沙门氏菌和/或 乍得沙门氏菌基因组DNA或cDNA的寡核苷酸是诸如下面所列的序列 (显示了它们在图1提供的IagA序列内的位置)：

Iag1：5′-TA TTA AGT ATG CAG GTT ATG-3′

1424-1443

Iag2：5′-AGA GAA TTT CTG CAA AGT GAA-3′

1585-1605

Iag3：5′-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA

          CTT-3′1495-1521

Iag4：5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-3′

1564-1584

Iag5：5′-GCA GGG ATC ACT AAG CTG TG-3′

1318-1337

Iag6：5′-CGT GGG CAA CCA GCA CTA ACG-3′

1637-1657

Slm1：5′-CG GGT TAA AGG TTA TCA CCT-3′

709-728

Slm2：5′-AG CAT GCC GCA AAT GGG-3

1014-1031

Slm3：5′-GCA CCA GGA AAG CAT TAA GTT GAT

          AGA ACA C-3′  732-762

Slm4：5′-CTT CGC TGG GAC ACA AAG CA-3′

823-842

SS28：5′-TAA TGC TTT CCT GGT GC-3′

其它能作为引物用于扩增肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌种的所有 沙门氏菌菌株iagB基因的DNA或cDNA的寡核苷酸已从图1提供 的iagB序列中限定。

因此，本发明的主题涉及与下列核酸链相对应的寡核苷酸：

Iag7：5′-T ACG GCA TGG GCT GAT TGC T-3′

Iag8：5′-T TAC GCT ATC GCC CAG CAG CAG

            GA-3′

Iag9：5′-T GGT CAT AAC CGA GAT GGT TCA

            AAC GAT C-3′

Iag10：5′-A CAG TTG TTA CAG GAT CCC T-3′

这些寡核苷酸也能用作探针，例如用于检测肠沙门氏菌和/或 乍得沙门氏菌DNA和/或cDNA的扩增产物。

用于对肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌(不论该细菌属于哪一组)的核 酸进行扩增的一对引物优选是诸如由引物Iag5(有义)和Iag6(反义) 组成。

这对引物指导340bP的核酸片段扩增。

另一对优选的引物由引物Slm1(有义)和Slm2(反义)组成。这些 引物能与I，II，III，IV，V或VI组之一的肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌细 菌的DNA或cDNA杂交。

根据另一优选的实例，本发明涉及能作为引物用于特异性地检 测肠沙门氏菌组I的寡核苷酸，DNA或cDNA扩增后的 检测条件如实施例I中所述。

这些引物的特征是具有扩增代表I，II，III，IV，V或VI组的 肠沙门氏菌或乍得沙门氏菌菌株的核酸序列的能力，但实施例I中列出的 检测条件仅能检测I组细菌。

能用于这些目的，作为特异性地检测肠沙门氏菌I组DNA或 cDNA序列的引物的一对寡核苷酸是由诸如下面列出的序列组成：

SS2 5′-CCGGGCAGATGATACCC-3′和

SS28 ′-TAATGCTTTCCTGGTGC-3′

本发明人限定的寡核苷酸使以灵敏快速，简便和特异性的满意 条件诊断肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌的设想成为可能。

本发明的主题还涉及经过对肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌基因组 的或互补的DNA的扩增用于检测肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌的试 剂盒，其特征在于它包含：

—上述的寡核苷酸，能在严紧条件下与肠沙门氏菌和/或 乍得沙门氏菌基因组DNA或cDNA杂交；

—用于检测与上文所给出的定义之一相关的扩增片段的探针，

—进行扩增反应所必须的试剂。

因此，本发明的主题特别是使用上述寡核苷酸作为引物以扩增 肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌的DNA或cDNA 序列，该寡核苷酸包含在上文所述的iagA或iagB序列之一中或与这 一序列互补，或可选择地使用这些寡核苷酸作为探针用于检测扩增 的核酸序列。

例如，寡核苷酸iag5和iag6可分别用作有义和反义引物以检测 I，II，III，IV；V或VI组的肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌。

同样地，引物对Sml1和Slm2可用于检测生物样品中这些组之 一的肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌种的细菌。

本发明还涉及使用寡核苷酸SS2和SS28在体外特异性地检测 生物样品中肠沙门氏菌I组。

当用于扩增所需核苷酸序列的引物允许属于其它组II，III，IV V 或VI之一的肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌细菌扩增，但所用的条件不允 许检测存在于所试验的生物样品中的这些相同组的细菌或不同生 物体时，检测是特异性的。

因此，本发明涉及一套寡核苷酸，它在肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌 的基因组或互补DNA扩增后可用于检测肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌 细菌，其特征在于它包含：

—与上面所给出的定义相应的一对寡核苷酸，它在严紧条件下 能与肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌基因组DNA或cDNA杂交。

—与上面所给出的特征相应的探针。

能用于体外检测生物样品中属于I，II，III，IV，V或VI组之一的 肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌菌株的第一套寡核苷酸，其特 征在于它含有下列寡核苷酸：

—能用作引物进行扩增的序列Iag5(5′-GCA GGG ATC ACT AAG CTG TG-3′)和序列Iag6(5′-CGT GGG CAA CCA GCA CTA ACG-3′)。

—能用作显示探针的序列Iag3(5′-ATA TCC ACG CAGGAA ATA ACA GGA CTT-3′)和能用作捕捉探针的序 列Iag4(5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG TAT-3′)。

能用于体外特异性地检测生物样品中的肠沙门氏菌I组的另一 套寡核苷酸，其特征在于它包含下面寡核苷酸：

SS2(5′-CCGGGCAGATGATACCC-3′和

SS28(′-TAATCGTTTCCTGGTGC-3′)

本申请的主题还有由图1提供的核苷酸序列iagA编码的iagA 蛋白质，以及由图1提供的iagB核苷酸序列编码的蛋白质iagB。

优选的是iagA和iagB蛋白质分别具有图1提供的氨基酸序 列。

属于本发明范围的还有体外检测生物样品中由诸如经PCR预 先扩增的肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌核苷酸序列的方法， 其特征在于它包含下列步骤：

—变性扩增的肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌序列，

—将来自肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌的变性的扩增核苷酸序列 与从上面定义的寡核苷酸获得的捕捉探针和显示探针接触，接触条 件是能使所说的捕捉和显示探针与上面提到的来自肠沙门氏菌和/ 或乍得沙门氏菌的扩增核苷酸序列杂交，捕捉探针附着于微滴定板孔表 面显示探针被标记且游离于适当的杂交缓冲液中；

—将反应混合物温育足够的时间使发生杂交反应；

—洗涤，以便去掉未反应的寡核苷酸；

—显示与扩增的核苷酸序列已杂交的显示探针。

上述的检测方法优势特征在于按照下列步骤进行检测：

—经过加入等体积的200mM NaOH，40mM EDTA溶液使 10μl体积的扩增序列变性；

—在适当的杂交缓冲液中对孔表面用捕捉探针包被的微量培 养板进行预杂交；

—空出微量培养板并在各孔中加入200μl含变性的扩增片段 和以浓度为10ng/μl过氧化物酶标记的显示探针：

—37℃在搅拌条件下将混合物温育1小时；

—用10×洗涤溶液(100mM Tris，3M NaCl，1％Tween 20，pH7.4)洗涤已反应的混合物；

—在显色底物存在的条件下，以比色法检测与探针相连接的过 氧化物酶活性。

经过进行下列步骤可显示存在于显示探针上的过氧化物酶活 性：

—在含反应混合物的各孔中加入200μl 40mM柠檬酸三 钠，0.03％ H2O2 30％，7.5mg/ml邻苯二胺(OPD)的溶液；

—37℃在黑暗中将微量培养板温育30分钟。

—经过加入50μl/孔的4N H2SO4溶液阻止反应；

—在492nm波长下(620nm为参照)检测光密度。

优选所用的捕捉探针是寡核苷酸Iag4，显示探针是寡核苷酸 Iag3。

因此，本发明范围内定义的工具可以定性或定量地检测 肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌型细菌的存在，其中在Senterica和/或 乍得沙门氏菌I，II，III，IV，V或VI组之一内的检测是非特异性的。

如实施例I所示在特定条件下进行检测步骤时，引物SS2，SS28 和探针SS40相反可对肠沙门氏菌I组细菌进行特异性检测。

本发明的其它特征和优势在下列实施例和图中给出：

图1： Salmonella ser Typhi侵入区的2.4Kb DNA片段的核 苷酸序列。下划线处为潜在的核糖体结合位点。

图2：以属于各种血清型的 Salmonella各种菌株经夹心杂交获 得的活性百分数。

所试验的各种沙门氏菌属分离物的血清型：

a：肠沙门氏菌  亚种enterica(1)，ref：C53

b：肠沙门氏菌  亚种Salamae(II)，ref：975-71

c：肠沙门氏菌  亚种Salamae(II)，ref：3975-83

d：肠沙门氏菌  亚种arizonae(IIIa)，ref：1600K

f：肠沙门氏菌  亚种diarizonae(II)，(ref：5250-85

g：肠沙门氏菌  亚种diarizonae(IIIb)，ref：8013-93

h：肠沙门氏菌  亚种houtenae(IV)，ref：1357-73

i：乍得沙门氏菌，ref：2790-79

k：肠沙门氏菌 亚种indica(VI)，ref：4355-84-7，6，5，4和3：log(DNA分 子的总量)。

图3：6组沙门氏菌属扩增片段(核苷酸1345至1644)的序列线性 排列。

图4：借助于引物Iag5和Iag6在沙门氏菌每组2个代表上进行 扩增。

图5：沙门氏菌扩增产物Southern印迹的放射自显影。

图6：可检测到的染色体DNA分子最小量的测定。Southern印 迹和微量培养板杂交的放射自显影。

图7：选择的寡核苷酸在IagA基因内的定位。

                        实施例I

                2.4Kb DNA片段的克隆和测序

使用经Hind III酶切割，从Popoff and Dion，1990的公开中所 描述的7.9Kb Hind III序列中获得限制性片段，将该DNA片段亚 克隆到载体m13的衍生物(Messing and Vieira，1982)上。

进行克隆后，使用经修饰的T7 DNA聚合酶(Sequenase.USB Corp)和使用通用的合成寡核苷酸作为引物进行链末端双脱氧法。 将所用的所有限制性片段末端互相重迭。对每条链至少进行2次 DNA测序。使用Lipan和Pearson程序(1985)分析核苷酸序列。

如图1提供的序列所示，在测序的片段上含有两个开放读框；用 术语iagA(侵入相关性基因的缩写)和iagB代表它们。两个开放读 框以相同的方向转录。认为前边有5′-AGAGA-3′序列的开放读框 iagA的第一个ATG密码子(b97)相当于iagA基因的翻译起始位 点。iagA基因编码含553个氨基酸残基的多肽，经计算其分子量为 63026Da。经检测在IagA蛋白质的N末端区域和与PhoB转录调 节的蛋白质相关区之间(叠加108个氨基酸时24％相同，52％相似) 以及与 E.coli蛋白质phoP之间(100个排的氨基酸中有25％相 同，69％相似)有明显的同源性。iagB基因起始的ATG密码子 (b1776)之前也有一个潜在的核糖体结合位点(5′-AGGAAG-3′)。 iagB基因编码的多肽含160个氨基酸、且计算出其分子量为 18369Da。将IagB蛋白质的序列与Genbank数据库中包含的翻译 序列比较，显示出与蛋白质IpgF具有明显的同源性(151个排列的 氨基酸中43％相同，66％相似)。

IpgF蛋白质由ipgF基因编码，该基因位于与 Shigellaflexneri 毒性相关的质粒上，即在mxi-spa基因座5′端(Allaoui etal，1993)。

因此认为检测的肠沙门氏菌亚种enterica血清型 Typhi蛋白质在这些细菌的感染中发挥作用，特别是在吸附和穿透 进细胞时发挥作用。

                          实施例2

                 S.enterica I组的特异性检测

已开发出通过聚合酶链式反应(PCR)检测沙门氏菌属亚种的 方法。限定了用作引物的一对寡核苷酸，以便扩增伤寒沙门氏菌菌株Ty2 侵入HaLa细胞所需之基因的93bp片段。根据 Chevrier.etal，1993.Mol.Cell Probes 7，187-197所述的方法使用两 种不同的寡核苷酸在微滴定板上经非放射性夹心杂交分析扩增产 物。将捕捉寡核苷酸在其5′端磷酸化并与微滴定板上含胺基团的孔 共价连接。检测寡核苷酸在其5′端氨基化，然后用生物素-N-羟基- 琥珀酰胺酯标记。杂交后，用与碱性磷酸酶和产色底物连接的抗生 物素蛋白质检测杂交分子。该方法需要使用仅仅一种热循环器和一 种常规微量培养板阅读器，并可以大批量进行。

                         材料和方法

细菌菌株：

用于本试验的228种临床分离物(表1)包括乍得沙门氏菌(Sambrook et al，1989.Molecular cloning，a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，肠沙门氏菌亚种I(116)。II(56)，IIIa(11)，IIIb(30)，IV(5) 和VI(5)，代表9个不同属的16种非沙门氏菌肠细菌菌株(表2)。 PCR试验中 S.ser.Typhimurium C53菌株用作阳性对照， E.coli HB101菌株用作阴性对照。

DNA的提取

菌株在LB培养基中37℃培养。为了进行快速的DNA提取， 将2ml维持过夜的培养物离心并重悬于1ml TE(10mM  Tris-HCl缓冲液，pH8，含1mM EDTA)中。离心细胞，将离心的片状沉 淀重悬于500μl无菌蒸馏水中并在100℃加热10分钟。最后离心 溶液，并将上清液贮存用于PCR实验。

寡核苷酸引物和探针

使用亚磷酰胺技术在气旋DNA合成仪(Millipore Waters)中 合成寡核苷酸。

寡核苷酸引物的序列如下：

SS2：5′-CCGGGCAGATGATACCC-3′和

SS28：5′-TAATGCTTTCCTGGTGC-3′。

根据Sambrook et al，1989，(Molecular cloning，a laboratory manal，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)所作的描述将捕捉寡核苷酸探针SS40：5′- CCCGAACTATCTCGATCTGTACAATATTATCATT-3′的5′端 用T4多聚核苷酸激酶(Boehringer)磷酸化。使用固相亚磷酰胺方法 在Applied Biosystem 380 B DNA合成仪中合成十八核苷酸 的检测探针SS41(5′-GCAGGTGATAACCTTAA-3′)，在其5′端有一 个氨基功能基团，然后，根据Tham et al.1990(FEMS Microbiol.Lett.69，109-116)所作的描述用D-生物素-∈-氨基己酸-N- 羟基琥珀酰亚胺酯(Boehringer)标记。捕捉和检测寡核苷酸都在快 速HR10/10脱盐柱上用FPLC系统(Pharmacia)纯化。

PCR实验

经过在每孔中依次加入95μl蒸馏水，5μl PCR样品，40μl 检测探针和14μl 1N NaOH使经受PCR反应的DNA片段直 接在孔中变性。10分钟后，经过加入21μl含1％十二烷基肌氨酸 钠的1MNaH2PO4进行中和。全部样品以一式二份制备。中和 后将样品板放置于金属表面并在火炉上维持在40℃过夜。生物素 标记的检测探针SS41终浓度为0.5nM。在火炉温育期间，优选使未 用的孔不空着，而加满水以便获得均匀的热交换。用TBS-Tw(0.15M NaCl，10mM Tris-HCl缓冲液，pH8，1％ Tween 20)在室温下洗涤 微量孔5次。向每孔中加入100μl用含1％牛血清白蛋白的 TBS-Tw稀释成的1μg/ml的碱性磷酸酶-体外抗生物素蛋白质连 接物。接着，将样品板在室温下孵育1小时；用TBS-Tw洗涤5次， 最终加入200μl含1mM MgCl2和1mM对硝基酚磷酸的1M 二乙醇胺(pH9.8)。酶反应进行30分钟到2小时。使用微量培养板 阅读器(Dynatech)在405nm下测量吸光度。用 S.ser.Typhimurium 菌株C53扩增的DNA片段(800fm/孔)的标准溶液获得的信号作为 100％，并用作每次杂交试验的参照。空白值相当于用寡核苷酸 SS40包被的仅与0.5nM生物素标记的寡核苷酸探针SS41保温的孔 中测量的平均吸光度。

                       结    果

                     方法的最优化

在iagA序列中选择引物和探针。为了优化在CovaLink微量培 养板上的夹心杂交技术，试验了各种各样的引物对。所选择的引物 对(SS2和SS28)能使Salmonella基因组DNA 93bp区特异性地扩 增。通过使用这一引物对，表明标准MgCl2浓度(1.5-2mM)导致相 当不利的扩增结果，且为了获得有效的扩增，MgCl2浓度必须是 4mM。内部寡核苷酸SS40和SS41在非放射性杂交试验中分别用 作捕捉探针和检测探针。

                    技术的特异性

用228种沙门氏菌菌株(表1)和16种异源细菌菌株(表2)评价 了沙门氏菌检测方法的特异性。结果在表3中作了概括。 Edwardsiella tarda，Klebsiella pneumoniae，Enterobacter和 Acintobacter的种，Pasteurella，Vibrio harveyi，Serratiamarcescens 和更大量的 Citrobacter种以及全部E.coli产生的杂交信号不超过 20％。根据这一值，可以得出结论：用本发明的方法可以检测属于亚 种I的所有沙门氏菌菌株。而且亚种II的56个菌株中只有一个菌 株(菌株3975-83)产生阳性信号，亚种IIIa的11个菌株中有3个菌株 产生阳性结果。乍得沙门氏菌和属于亚种IIIb，IV和VI的菌 株检测不到。

                 该技术对全细菌的检测水平

制备1/10稀释的 S.ser TyphimuriumC53菌株的悬液(从109 到10-2细胞/ml)以估计经PCR后再经非放射性杂交技术所能检测 的细菌最小数。使用煮沸快速提取技术从每种校准的悬液中提取 DNA。所得的结果清楚地显示：PCR反应前经简单煮沸悬液快速提 取DNA的技术是有效的技术。事实上，仅仅1cfu单位也可检测到。

       表1：用于评价DNA杂交试验特异性的沙门氏菌属亚种

试验微生物                        分离物数    血清型数目

肠沙门氏菌    亚种enterial I        116             43

血清型                                    1

      Agona                                         2

      Altona                                        1

      Angoda                                        1

      Bardo                                         2

      Blockley                                      1

      Bovismorbificans                              3

      Braenderup                                    4

      Brandenburg                                   1

      Bredeney                                      1

      Broughton                                     2

      Cerro                                         1

      Chester                                       1

      Coeln                                         1

      Concord                                       1

      Dakar                                         1

      Derby                                         2

      Enteridis                                     28

      Georgia                                       1

      Hadar                                         1

      Heidelberg                                    4

      Ibadan                                        2

      Indiana                                       1

      Infantis                                      5

      Lexington                                     1

      London                                        1

      Mbandaka                                      1

      Montevideo                                    6

      Moscow                                        1

      Ohio                                          1

      Orion                                         1

      Panama                                        3

      Paratyphi B                                   2

      Saintpaul                                     1

      Typhimurium                                   13

      Typhisuis                                     1

      Vaertan                                       1

      Veneziana                                     1

      Vinohrady                                     1

      Virchow                                       10

      Wien                                          1

      Woodinville                                   1

      Yolo                                          1

      肠沙门氏菌  亚种salamae II      56            56

      肠沙门氏菌  亚种arizonae IIIa   11            29

      肠沙门氏菌  亚种diarizonae IIIb 30            5

      肠沙门氏菌  亚种houtenae IV     5             5

      肠沙门氏菌  亚种indica VI       5             5

      乍得沙门氏菌                    5             5

(原来称为  肠沙门氏菌  亚种  bongori V)  

          表2：用于DNA杂交试验的异源性细菌。

属              种                       分离物数

Escherichia     coli                      4

Edwarsiella     tarda                     1

Citrobacter     amalonaticus              1

                freundii                  1

Klebsiella      pneumoniae                1

Enterobacter    agglomerans               1

                asburiae                  1

                hormoechei                1

Pasteurella     multocida                 1

Acinetobacter   lwoffii                   1

                haemolyticus              1

Vibrio          harveri                   1

Serratia        marcescens                1

表3：在夹心杂交试验中试验的细菌临床菌株和对照

           肠沙门氏菌   肠沙门氏菌   肠沙门氏菌  肠沙门氏菌

           亚种.        亚种.        亚种.       亚种.

           enterlca     salamae      arizonae    diarizonae

活性(％)

100％-20％ 116          1            3           0

19％       0            51           8           12

＞空白

＜空白     0            4            0           18

总计       116          56           11          30

           肠沙门氏菌  肠沙门氏菌  乍得沙门氏菌  非沙门  无DNA

           亚种.       亚种.                     氏菌    的对照

           houtenae    indica

活性(％)

100％-20％ 0           0           0             0       0

19％       4           4           5             9       0

＞空白

＜空白     1           1           0             7       23

总计       5           5           5             16      23

用纯化的基因组DNA进行定量杂交

在本文报道的试验中所用的非放射性杂交方法在定量试验中 容易实施。为了比较用各种沙门氏菌菌株获得的杂交信号，以代表 肠沙门氏菌6个亚种和乍得沙门氏菌种的10个菌 株中提取DNA，然后将校准量的DNA用于PCR反应，接着进行夹心 杂交。结果在图2中报道。它表明了用107个分子的 乍得沙门氏菌或肠沙门氏菌亚种II，IIIa，IIIb，IV和VI DNA获得的杂交信号比用103个分子的亚种I菌株DNA观察到 的杂交信号要低。然而，重要的是注意到分离物3975-83(亚种II)与 属于亚种I的菌株产生的杂交信号相同。

讨论

PCR扩增能非常灵敏地检测特异性的DNA序列。扩增的灵敏 度基本上取决于靶DNA的拷贝数、所要分析的样品纯度，DNA的 提取方法和用于检测PCR产物的方法的灵敏度。在电泳凝胶上用 溴化乙锭染色观察PCR产物与该技术的常规用途不相配且不够灵 敏。经过使用双重PCR或DNA探针并且使用斑点印迹或Southern 印迹杂交可提高灵敏度。然而，双重PCR对DNA的污染也非常敏 感且斑点印迹或Southern印迹杂交技术不适于自动化。因此，微量 培养板杂交提供了一种合适的方法以用于检测和定量PCR扩增的 片段。对于在微量孔中检测PCR扩增的片段而言，核酸简单地共 价连接到微量孔上代表被动吸附的有利的变化和实质性改进。

已知引起人感染的沙门氏菌属菌株基本上属于亚种I。事实上， 超过95％的人类临床分离物属于这一亚种(Rowe，b.，1987，沙门氏菌 属监视。从参与WHO计划的中心获得的报道。世界卫生组织，伦 敦)。而且1991年巴黎(法国)“Centre National d′Etudes Vét érinaires et Alimentaires”报道了[Corbion，B et al，1991，沙门 氏菌属目录]前几年即1988年和1989年在动物，食物和环境中分离 出的大多数菌株(这就是说有18832种菌株)属于亚种I(99.2％)。

本文报道的结果使限定以PCR扩增为基础的检测沙门氏菌属 病原菌株的方法成为可能。引物对SS2和SS28，探针对SS40和SS41 可从 Salmonella ser.Typhi菌株Ty2侵入HeLa细胞所必须的基 因中选择。经过使用PCR技术和微量培养板非放射性夹心杂交相 结合，可检测亚种I的全部沙门氏菌属细菌。

检测极限低于每PCR管10个细胞所代表的阈值，该阈值根据 的是其它相似PCR技术所获得的结果。如果在肠细菌成员之间存 在核酸相似性，检查这些新引物和探针对最可能导致假阳性型反应 的肠细菌属的特异性是重要的。从得到的结果可得出结论：当遵照 上面所述的PCR的杂交条件时，不会发生假阳性反应。

有利的是注意到沙门氏菌属菌株3975-83(亚种II)的杂交信号 与用属于亚种I的分离物获得的杂交信号相同。这一菌株于1983 年从英国一位病人的粪便中分离出。根据生化物征，将这种新血清 型分类为亚种II，但被认为是一种非典型的菌株，因为其存在不能 在明胶酶中检测(Le Minor，L.et al，1984，Supplement Noxx，1983，tokauffmann-Whits Scheme，Ann，MTcrobiol. (InstitutPasteur)135B，45-51)。根据本文报道的结果，菌株3975-83 的分类位置应使用DNA-DNA杂交技术重新检查。  

本文提供的资料表明：以使用沙门氏菌伤寒杆菌菌株Ty2侵入 HeLa细胞所必需的基因为基础的杂交方法可区别出亚种I的沙门 氏菌属菌株和其它肠细菌(包括大肠杆菌)。对于分析大量样品而言， 在共价连接NH的微量培养板上的非放射性杂交是灵敏的且是合 适的。

实施例3：通过夹心杂交检测扩增的沙门氏菌属DNA

寡核苷酸序列：

选择的DNA片段如下(见图1序列上的位置)：

C-末端部分                             位置

Iag1：5′-TA TTA AGT ATG CAG GTT

          ATG-3′                    1424-1443

Iag2：5′-AGA GAA TTT CTG GAA AGT

          GAA-3′                    1585-1605

Iag3：5′-ATA TCC ACG CAG GAA ATA

          ACA GGA CTT-3’            1495-1521

Iag4：5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG

          ATA-3′                    1564-1584

Iag5：5′-GCA GGG ATC ACT AAG CTG

          TG-3′                     1318-1337

Iag6：5′-CGT GGG CAA CCA GCA CTA

          ACG-3′                    1637-1657

Slm1：5′-CG GGT TAA AGG TTA TCA

          CCT-3′                    709-728

Slm2：5′-AG  CAT GGC GCA AAT      GGG-3′

                                   1014-1031

Slm3：5′-GCA CCA GGA AAG CAT TAA

          GTT CAT AGA ACA C-3′    732-762

Slm4：5′-CTT CGC TGG GAC ACA

          AAG GA-3′               823-842

优选的是，引物对Iag5(有义)和Iag6(反义)指导340bp片段的扩 增，引物对Slm1(有义)和Slm2(反义)指导323bp片段的扩增(图3)。

图4显示了引物对Iag5和Iag6对沙门氏菌各组的2个代表的 扩增效率。

检测方法：

使用通过夹心杂交检测的方法。

两个寡核苷酸同时与变性的扩增片段杂交。其中一个称作捕捉 探针，它被动地吸附(但也能共价吸附)到96孔微滴定板孔的表面。 另一个称为显示探针，用容易检测的成份标记。显示探针游离于杂 交缓冲液中。

捕捉和显示探针与位于扩增片段内的两个不同区域互补。

在本文所述的例子中检测探针与酶标记物(特别是过氧化物酶) 连接并将用作显示探针。对于寡核苷酸Iag3和Slm3而言这是优选 的情况。其它寡核苷酸可吸附到微量培养板型固态支持物(颗粒或 膜支持物)上用作捕捉探针。这特别适合于寡核苷酸Iag4和Slm4。

实验条件：

1)沙门氏菌属DNA的制备：

在Chelex(6％ Chelex，0.1％SDS，1％NP40，1％Tween 20)存 在的条件下，使用煮沸法获得DNA序列。这种试剂由Biorad投放 市场并按厂商的程序使用(参考文献：Walsh et al.1991.BioTeehniques 10：506-513)。

2)扩增

根据Saiki最初描述和诸如欧洲专利EP 0,201,184列出的方 法。

使用下面反应混合物进行PCR：

50mM KCl

10mM Tris-HCl pH8.3

1.5mM MgCl2

125μM 脱氧核糖核酸(d CTP，dATP，dGTP)

250μM UTP

每种引物各25pmol

10ng DNA

1单位的Uracyl N 糖基化酶

1单位的Taq聚合酶。

使用10μl含待扩增DNA的溶液制备100μl体积的反应混 合物。dUTP和UNG用于去污染系统(Brevet Life Technologies 欧洲专利申请0401037)。所用的热循环器是PerKin Elmer9600。

在50℃温育2分钟以使UNG发挥作用，之后在95℃变性5分 钟。所用的温度循环如下：

—5次循环(95℃ 15秒，50℃ 15秒，72℃ 15秒)

—35次循环(95℃ 15秒，57℃ 15秒，72℃ 15秒)

3)观察扩增反应：

3-1)显示探针的标记：

用辣根过氧化物酶(参考文献：PCR操作：方法和应用指南；学术 出版(1990)，15，p4513-4534)，酶的活性以比色法测定。

3-2)用BET染色的琼脂糖凝胶和膜杂交

扩增后，10μl扩增产物沉积于琼脂糖疑胶上，根据常规技术 (Maniatis)将DNA转移到膜上。将膜在杂交缓冲液(10X Denhart，6XSSC，0.1％SDS)中68℃预杂交30分钟，然后在42℃与每 ml杂交缓冲液60ng探针的溶液杂交3小时。

然后根据下列步骤进行洗涤：

—室温下在2XSSC-0.1％SDS中10分钟洗涤2次，

—42℃在0.1XSSC-0.1％SDS中30分钟洗涤一次；

—室温在2XSSC中10分钟洗涤2次。

显示：在两层吸附纸(Whatman 3MM纸)之间印迹膜并放于 洁净干燥的箱中。

体积对体积

使用前立即制备等体积的Amersham检测试剂(ECL PRN 2105检测试剂)，一张5×8cm的膜使用30ml的总体积。经过将一 层吸附纸(Whatman 3MM纸)固定于底部得到放射自显影盒。所 有这些步骤都能在有光条件下进行，然后在暗室中进行。

将膜浸入检测试剂中1分钟，DNA面朝上，将膜迅速弄干并放入 盒中，DNA面朝上，将一层透明塑料放在上面(否则膜会粘着胶片)并 将X-射线胶片放在上面(X-OMAT KODAK胶片)。

在室温下曝光30分钟，然后以常规显影技术(显影剂，水，定影剂) 使胶片显影。

3-3)微量培养板

3-3-1)捕捉寡核苷酸的包被：

通过吸附(cook et al，NAR，16：4077-4095(1988)或共价连接 (Rasmussen，S.R.et al，1991.Analytical Biochemistry 198，138- 142)进行包被。

3-3-2)微量培养板杂交和阅读

经加入等体积的200mM NaOH，40mM EDTA溶液使10μ l扩增产物变性。

用含10X Denhart，6×SSC，0.1％SDS的杂交缓冲液使孔表面 被捕捉探针包被的微量培养板预杂交。

接着，空出微量培养板，每孔中加入200μl含变性扩增片段和 浓度为10ng/μl的显示探针的杂交缓冲液。在37℃下搅拌培养1 小时。

洗涤后(10×洗涤溶液：100mM Tris，3M NaCl，1％ Tween 20，pH7.4)，在显色底物存在的条件下以比色法检测与探针相连接的 过氧化物酶活性。

检测时，将200μl的40mM柠檬酸三钠溶液，0.03％H2O230％，7.5mg/ml的邻苯三胺(OPD)分配到每个孔中。微量培养板在 黑暗中37℃温育30分钟，加入50μl/孔的4N H2SO4溶液以阻 止反应。

在波长492nm(参照为620nm)下测定光密度。

4)PCR产物的测序和序列的人工排列。

根据常规技术，使用诸如Applied Biosystem的“373 DNA 测序仪”自动仪器和Applied的“dye terminator”试剂盒。

结果：

典型模型优选下列寡核苷酸系统：

Iag5有意义引物-Iag6反义引物

Iag3显示探针和Iag4捕捉探针。

(应注意Iag4同样可被标记并用作显示探针)。

特异性研究

对表4和5列出的全部细菌菌株进行了实验。

从试验的45种沙门氏菌属中提取的DNA的扩增，产生了预期 大小的片段(参见图5)。全部扩增产物的Southern印迹是与用过氧 化物酶标记的内部寡核苷酸探针Iag3杂交。根据上面所述的方法 没有一个非沙门氏菌属的菌株与在膜上获得的过氧化物酶探针产 生杂交。

以微量培养板方法试验了相同的扩增产物。

任意规定在0.050处分界。每个沙门氏菌属组的全部代表，光 密度值都大于0.050(表6)。

灵敏性：

为了测定可被检测的沙门氏菌属染色体DNA分子的最小数， 扩增在一定范围内稀释的纯化染色体DNA。在Southern印迹放射 自显影上和以微量培养板杂交检测时可见5个分子；以比色法获得 的值大于分界值(图6)。

选择用于进行该实例的寡核苷酸位于IagA基因的序列上(图 7)。

                            表4试验的沙门氏菌属菌株     N°              菌株                    血清型     组     1     Salmonella Marseille     I     2     Salmonella Nyanza     I     3     Salmonella Poona     I     4     Salmonella Kampala     I     5     Salmonella Taksony     I     6     Salmonella Teshie     I     7     Salmonella lndiana     I     8     Salmonella enteritidis     I     9     Salmonella Kentucky     I     10     Salmonella Napoli     I     11     841 11:a:d:en 215     II     12     1703K 41:2:15     II     13     950-71 43:d:z 39     II     14     10-65 44:24，223:-     II     15     3209-81 45:z 23     II     16     5331/86 62:z 29:-     IIIa     17     3064-4/252 41:k:-     IIIa     18     594-54 38:z 54:-     IIIa     19     1694 cdai 426 63:z4，z32:-     IIIa     20     So 50/16 62:f，z51:-     IIIa     21     5251-85 58:r:z53     IIIb     22     1758-766，14:z 10:enx 215     IIIb     23     453-68 16:Iiv:z53     IIIb     24     4305-57 16:Ii(v):z35     IIIb     25     1698-75 11:Iiv:z     IIIb     26     8275-94 47:r:enx 215     IIIb     27     8283-94 53:z10:z     IIIb     28     cdc 456-5/93 40:i:1，5，7     IIIb     29     8284-94 60:i:z     IIIb     30     1693 K 38:k:z 55     IIIb     31     1707 48:f:z 51:-     IV     32     7231/89 45:z36，z38     IV     33     6887/60 48:f，z51:-     IV     34     1357/73 43:z4，z24:-     IV     35     1550 K 16:z4，z23:-     IV     36     Salmonella Bongor     261-66 48:z35:-     V     37     Salmonella Camdeni     2022-77 44:r:-     V     38     4985-85  48:z 39:-     V     39     7688-9166:z39:-     V     40     1387-7340:a:-     V     41     1941-77 6，7:z 41:1，7     VI     42     1449 K45:a enx     VI     43     4355-84 1，6.14，25:a:e，n，x     VI     44     1711K 11:b:enx     VI     45     1688K1，6.14，25:Z 10:1，12，7     VI

                         表5

                    非沙门氏菌属菌株     No.     名    称     鉴定     1   Klebsiells oxyioca     0059 SDP     2   Klebsiella pneumoniae     0054 SDP     3   Acinetobacter baumanii     0033 SDP     4   Proteus mirabilis     RP402     5   Serratla marcescens     0042 SDP     6   Enterobactar agglomerans     0067 SDP     7   Citrobacter diversus     0068 SDP     8   Pseudomonas aeruginose     0011 SDP     9   Enterobactet serogenes     0066 SDP     10   Escherichia coli     0131 SDP     11   Enterocoque faecalis     76117     12   Proteus mirabilis     AP03     13   Enterocoque faecalis     76117     14   Enterobacter cloacae     0060 SDP     15   Mycobacterium avium     6     16   Mycobacterium tuberculose     H 37 RV     17   Listeria manocriogenes     1/2 LG3

                           表6

                       微量板检测   样    品   420nm下的OD   2 Nyanza gpe I     3.029   3 Poona gpe I     3.103   11 gpe II     3.155   12 gpe II     0.751   18 gpe III a     3.139   20 gpe III a     3.068   21 gpe III b     3.161   30 gpe III b     3.201   31 gpe IV     0.272   35 gpe IV     0.527   36 gpe V     1.868   40 gpe V     3.347   45 gpe VI     0.900   Klebsiella oxytoca     0.022   Klebsiella pneumoniae     0.017   Acinetobacter baumanii     0.024   Proteus mirabilis     0.019   Serratia matcescens     0.019   Enterobacter agglomerans     0.023   Mycobacterium aviumn°6     0.025   Mycobacterium tuberculosis H 37 RV     0.020   Listetia monocytogenes 1/2 LG3     0.015   对照水     0.018   对照水     0.022