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新的内切葡聚糖酶

阅读：781发布：2022-08-25

专利汇可以提供新的内切葡聚糖酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种在 洗涤剂 ,洗涤,纺织和造纸纸浆应用中性能良好的酶制剂,该制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成,所述酶包含具有序列Thr Arg X3 X4 Asp Cys Cys X8 X9 X10 Cys X12Trp X14(其中X3和X4各自分别是Trp、Tyr或Phe;X8是Arg、Lys或His;X9、X10、X12和X13各自是20个天然 氨 基酸残基中的任何一个)的14个残基的第一氨基酸序列和具有序列Trp Cys Cys XX4 Cys(其中XX4是20个天然氨基酸残基中的任何一个)的5个残基的第二氨基酸序列,其条件是在第一氨基酸序列中,(i)当X12是Ser时,X14不是Ser,和(ii)当X12是Gly时,X14不是Ala。，下面是新的内切葡聚糖酶专利的具体信息内容。

1.一种酶制剂，该制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶包含 具有以下序列的由14个氨基酸残基组成的第一氨基酸序列 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二氨基酸序列 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10、12和14号的各位置上，在第二序列的4号位置上， 氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个，其条件是在第一氨基酸序列 中，(i)当12号位置上的氨基酸残基是Ser时，14号位置上的氨基酸残基 不是Ser，和(ii)当12号位置上的氨基酸残基是Gly时，14号位置上的 氨基酸残基不是Ala。
2.按照权利要求1的酶制剂，其中在第一序列的9号位置上的氨基酸 残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨 酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨 酸和色氨酸，优选地选自脯氨酸和苏氨酸。
3.按照权利要求1或2的酶制剂，其中在第一序列的10号位置上的氨 基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯 丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲 硫氨酸和色氨酸，优选地是丝氨酸。
4.按照权利要求1-3之任一的酶制剂，其中在第一序列的12号位置上 的氨基酸残基选自脯氨酸，苏氨酸，缬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸， 苯丙氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丝氨酸， 甲硫氨酸和色氨酸，优选地选自丙氨酸和甘氨酸。
5.按照权利要求1-4之任一的酶制剂，其中在第一序列的14号位置上 的氨基酸残基选自脯氨酸，苏氨酸，缬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸， 苯丙氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丝氨酸， 甲硫氨酸，色氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，优选地选自脯氨酸，苏氨酸，丝 氨酸，丙氨酸，谷氨酸和天冬氨酸。
6.按照权利要求1-5之任一的酶制剂，其中在第二序列的4号位置上 的氨基酸残基选自脯氨酸，苏氨酸，缬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸， 苯丙氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丝氨酸， 甲硫氨酸，色氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，优选地选自丙氨酸，甘氨酸和谷 氨酰胺。
7.按照权利要求1-6之任一的酶制剂，其中，在第一序列中，在第3 号位置上的氨基酸残基是酪氨酸；或在第4位置上的氨基酸残基是色氨酸； 或在第8号位置上的氨基酸残基是赖氨酸。
8.按照权利要求1-7之任一的酶制剂，其中所说的第一序列包括选自 以下序列的氨基酸序列： Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13； Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Thr Ser Cys Ala Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13；和 Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13.
9.按照权利要求1-8之任一的酶制剂，该酶制剂是微生物来源的，优 选地是真菌来源的。
10.一种DNA构建体，该构建体编码按照权利要求1-9之任一的酶。
11.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于层菌纲(Hymenomycetes)(担子菌门(Basidiomycota))的菌株获 得的，这种酶包含选自以下序列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
12.按照权利要求11的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
13.按照权利要求11的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
14.按照权利要求11-13之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
15.按照权利要求11-14之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于 由以下目的菌株获得的：蘑菇目(Agaricales)、非褶菌目 (Aphyllophorales)和木耳目(Auriculariales)。
16.按照权利要求15的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下科 的菌株获得的：黑耳科(Exidiaceae)、口蘑科(Tricholomataceae)，鬼伞 科(Coprinaceae)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)，烟管菌科 (Bjerkanderaceae)和多孔菌科(Polyporaceae)；优选地是可以从属于由以 下属的菌株获得的：黑耳属(Exidia)、毛皮伞属(Crinipellis)，层孔菌属 (Fomes)，斑褶菇属(Panaeolus)，栓菌属(Trametes)，裂褶菌属 (Schizophyllum)和绵皮孔菌属(Spongipellis)。
17.按照权利要求16的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下种 的菌株获得的：黑胶耳(Exidia glandulosa)、Crinipellis scabella、 木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)和Spongipellis sp.；优选地是可以从以 下菌株获得的：黑胶耳CBS 277.96、Crinipellis scabella CBS 280.96、 木蹄层孔菌CBS 276.96和Spongipellis sp.CBS 283.96。
18.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于壶菌门(Chytridiomycota)的菌株获得的，这种酶包含选自以下 序列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   ；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
19.按照权利要求18的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
20.按照权利要求18的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
21.按照权利要求18-20之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
22.按照权利要求18-21之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于 壶菌纲(Chytridiomycetes)的菌株获得的，优选地是可以从属于由以下目 的菌株获得的：壶菌目(Chytridiales)、Spizellomycetales、肋壶菌目 (Harpochytriales)和芽枝霉目(Blastocladiales)。
23.按照权利要求22的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于 Spizellomycetaceae科的菌株获得的，优选的是可以从属于囊壶菌属 (Rhizophlyctis)的菌株获得的，更优选的是可以从属于红根囊壶菌 (Rhizophlyctis rosea)的菌株获得的，尤其是可以从红根囊壶菌CBS 282.96获得的。
24.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于接合菌门(Zygomycota)的菌株获得的，这种酶包含选自以下序 列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
25.按照权利要求24的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
26.按照权利要求24的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
27.按照权利要求24-26之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
28.按照权利要求24-27之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属 于接合菌纲(Zygomycetes)的菌株获得的，优选的是可以从属于毛霉目 (Mucorales)的菌株获得的。
29.按照权利要求28的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由毛霉科 (Mucoracea)和枝霉科(Thamnidiaceae)的菌株获得的，优选的是可以从属 于由根毛霉属(Rhizomucor)、须霉属(Phycomyces)和刺枝霉属 (Chaetostylum)的菌株获得的。
30.按照权利要求29的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由 Rhizomucor pusillus、闪光须霉(Phycomyces nitens)、弗雷生刺枝霉 (Chaetostylum fresenii)的菌株获得的，优选地是可以从属于由以下菌株 的菌株获得的：Rhizomucor pusillus IFO 4578、闪光须霉IFO 4814和 弗雷生刺枝霉NRRL 2305。
31.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于由Archaeascomycetes、盘菌纲(Discomycetes)、 Hermiascomycetes、腔菌纲(Loculoascomycetes)和不整囊菌纲 (Plectomycetes)的菌株获得的，这种酶包含选自以下序列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
32.按照权利要求31的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
33.按照权利要求31的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
34.按照权利要求31-33之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
35.按照权利要求31-34之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于 由以下目的菌株获得的：盘菌目(Pezizales)、Phytismatales、座囊菌目 (Dothideales)和散囊菌目(Eurotiales)。
36.按照权利要求35的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下科 的菌株获得的：葫芦霉科(Cucurbitariaceae)、斑痣盘菌科 (Rhytismataceae)、粪盘菌科(Ascobolaceae)和发菌科 (Trichocomaceae)；优选地是由属于由以下属的菌株产生的：色二孢属 (Diplodia)、Microsphaeropsis、Ulospora、壳球孢属(Macrophomina)、 粪盘菌属(Ascobolus)、Saccobolus、青霉属(Penicillium)和 Thermomyces。
37.按照权利要求36的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下种 的菌株获得的：棉色二孢(Diplodia gossypina)、Microsphaeropsis sp、Ulospora bilgramii、Macrophomina phaseolina、Rscobolus stictoides、Saccobolus dilutellus、疣孢青霉(Penicillium verruculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和Thermomyces verrucosus；优选地是可以从属于由以下菌株的菌株获得的：棉色二孢 CBS 274.96、Ulospora bilgramiiNKBC 1444、Macrophomina phaseolina CBS 281.96、Saccobolus dilutellus CBS 275.96、疣孢青霉ATCC 62396、 产黄青霉ATCC 9480和Thermomyces verrucosus CBS 285.96。
38.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于由间座壳目(Diaportales)、炭角菌目(Xylariales)、 Trichoaphaeriales和黑痣菌目(Phyllachorales)的菌株获得的，这种酶 包含选自以下序列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
39.按照权利要求38的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
40.按照权利要求38的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
41.按照权利要求38-40之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
42.按照权利要求38-41之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于 由以下科的菌株的菌株获得的：炭角菌科(Xylariaceae)、黑腐皮壳科 (Valsaceae)和Phyllachoraceae，优选地是可以从属于由以下属的菌株获 得的：间座壳属(Diaporthe)、刺盘孢属(Colletotrichum)、黑孢属 (Nigrospora)、炭角菌属(Xylaria)、Nodulisporum和孔座壳属 (Poronia)。
43.按照权利要求42的酶，其中所说的酶是可以从属于由以下种的菌 株获得的：Diaporthe syngenesia、葫芦科刺盘孢(Colletotrichum lagenarium)、Nigrospora sp.、鹿角团炭角菌(Xylaria hypoxylon)、 Nodulisporum sp.和点孔座壳(Poronia punctata)，优选地是可以从属于 由以下菌株的菌株获得的：Diaporthe syngenesia CBS 278.96、葫芦科刺 盘孢ATCC 52609、Nigrospora sp.CBS 272.96和鹿角团炭角菌CBS 284.96。
44.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于由小赤壳科(Nectriaceae)，粪壳科(Sordariaceae)，毛壳科 (Chaetomiaceae)，Ceratostomaceae，毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)的 菌株和属于顶孢霉属(Acremonium)，粘帚霉属(Gliocladium)， Scytalidium，柱孢属(Cylindrocarpon)和周刺座霉属(Volutella)的菌株 获得的，这种酶包含选自以下序列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；  和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
45.按照权利要求44的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
46.按照权利要求44的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
47.按照权利要求44-46之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
48.按照权利要求44-47之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于 由以下属的菌株获得的：柱孢属(Cylindrocarpon)、丛赤壳属(Nectria)、 周刺座霉属(Volutella)、粪壳属(Sordaria)、梭孢壳属(Thielavia)、 Sypastospora、毛壳属(Chaetomium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、 Scytalidium、Cladorrhinum、粘帚霉属(Gliocladium)、顶孢霉属 (Acremonium)。
49.按照权利要求48的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下种 的菌株获得的：Cylindrocarpon sp.、Nectria pinea、Volutella colletotrichoides、粪生粪壳(Sordaria fimicola)、大孢粪壳(Sordaria macrospora)、Thielavia terrestrls、Thielavia thermophila、 Syspastospora boninensis、Cladorrhinum foecundissimum、墙毛壳 (Chaetomium  murorum)、Chaetomium virescens、Chaetomium brasiliensis、Chaetomium cunicolorum、Myceliophthora thermophila、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、Scytalidium  thermophila和Acremonium sp.；优选地是可以从属于由以下菌株的菌株 获得的：链孢粘帚霉ATCC 10523和CBS 227.48、Nectria pinea CBS  279.96、Volutella colletotrichoides CBS 400.58、粪生粪壳ATCC  52644、大孢粪壳ATCC 60255、Thielavia terrestris NRRL 8126、 Thielavia thermophila CBS 174.70、墙毛壳CBS 163.52、Chaetomium  virescens CBS 547.75、Chaetomium brasiliensis CBS 122.65、 Chaetomium cunicolorum CBS 799.83、Syspastospora boninensis NKBC 1515、Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373、Myceliophthora thermophila CBS 117.65、Scytalidium thermophila ATCC 28085和 Acremonium sp.CBS 478.94。
50.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是 可以从属于由番茄镰孢(Fusarium lycopersici)、Fusarium passiflora、 腐皮镰孢(Fusarium solani)、蛇形镰孢(Fusarium anguioides)、早熟禾 镰孢(Fusarium poae)、黑腐质霉(Humicola nigrescens)和灰腐质霉 (Humicola grisea)的菌株获得的，这种酶包含选自以下序列的氨基酸序列： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
51.按照权利要求50的酶制剂，其中在7号位置上的氨基酸残基是半 胱氨酸(Cys)。
52.按照权利要求50的酶制剂，其中在1号位置上的氨基酸残基选自 天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。
53.按照权利要求50-52之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下 序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，氨基 酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。
54.按照权利要求53之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由 以下菌株的菌株获得的：番茄尖镰孢(Fusarium oxysporum ssp lycopersici)CBS 645.78、尖镰孢ssp passiflora CBS 744.79、腐皮 镰孢IMI 107.511、蛇形镰孢IFO 4467、早熟禾镰孢ATCC 60883、黑腐 质霉CBS 819.73和灰腐质霉ATCC 22726。
55.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、 53和54之任一的酶，其中在第一序列的9号位置上的氨基酸残基选自脯 氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸， 优选地选自脯氨酸和苏氨酸。
56.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、 53和54之任一的酶，其中在第一序列的10号位置上的氨基酸残基选自脯 氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸， 优选地是丝氨酸。
57.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、 53和54之任一的酶，其中在第一序列的12号位置上的氨基酸残基选自脯 氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸， 优选地选自丙氨酸和甘氨酸。
58.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、 53和54之任一的酶，其中在第二序列的4号位置上的氨基酸残基选自脯 氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、 谷氨酸和天冬氨酸，选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。
59.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、 53和54之任一的酶，其中在第一序列的第3号位置上的氨基酸残基是酪 氨酸；或在第4号位置上的氨基酸残基是色氨酸；或在第8号位置上的氨 基酸残基是赖氨酸。
60.一种DNA构建体，该构建体编码按照权利要求11-59之任一的酶。
61.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41-43、47-49、 53和54之任一的酶制剂，其中所说的第一序列包含选自以下序列的氨基 酸序列： Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13    ； Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Thr Ser Cys Ala Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13    ；和 Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13    .
62.一种提供微生物菌株的方法，所述菌株包含编码存在于按照权利要 求1-9、11-59和61之任一酶制剂中的酶的基因，该方法包括在标准条件 下与图1所示的任何保守区的寡核苷酸杂交(例如PCR扩增)。
63.按照权利要求62的方法，其中所说的寡核苷酸包含编码包含在选 自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸序列： a. Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14 在3或4在号位置上的氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在8号位置上的氨基 酸是Arg、Lys或His；在9、10、12和14号位置上的氨基酸分别是20 个天然氨基酸残基中的任何一个；和 b. Trp Cys Cys Xaa Cys Tyr 1   2   3   4   5   6 在4号位置上的氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个；和 C. Xaa Pro Gly Gly Gly Xaa Gly Xaa Phe 1   2   3   4   5   6   7   8   9 1号位置上的氨基酸是Met或Ile；6和8号位置上的氨基酸分别是Leu、 Ile或Val；和 d. Gly Cys Xaa Xaa Arg Xaa Asp Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9 在3号位置上的氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个；在4和6号 位置上的氨基酸分别是Trp、Tyr或Phe；并且 在9号位置上的氨基酸是Phe或Met。
64.按照权利要求62的方法，其中所说的寡核苷酸包含互补于权利要 求63的序列的核苷酸序列。
65.按照权利要求63的方法，其中所说的寡核苷酸相应于选自以下PCR 引物的PCR引物： 有义， 5′-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’ 反义1， 5′-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3’； 反义2， 5′-CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/GICCICCICCIGG-3’；和 反义3， 5’-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICG/TCC-3’.
66.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示溶纤活性之酶的DNA序 列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：1中所示的DNA序列和/或可以从啤酒糖酵母DSM 9770中 的质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：1中所示的DNA序列的类似物或可以从啤酒糖酵母DSM 9770中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少70％同源于SEQ ID NO：1中所示的DNA序列和/ 或可以从啤酒糖酵母DSM 9770中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：1中所示的DNA序列和/或可 以从啤酒糖酵母DSM 9770中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂 交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少65％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：1中所示的DNA序列和/ 或可以从啤酒糖酵母DSM 9770中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：1中所示的DNA序列或可以从 啤酒糖酵母DSM 9770中的质粒获得的DNA序列编码。
67.按照权利要求66的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于毛壳 科的菌株，优选地是属于毁丝霉属的菌株，特别是属于M.thermophila的 菌株，尤其是M.thermophila CBS 117.65的文库。
68.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：4中所示的DNA序列和/或可以从啤酒糖酵母DSM 10082 中的质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：4中所示的DNA序列的类似物或可以从啤酒糖酵母DSM 10082中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少70％同源于SEQ ID NO：4中所示的DNA序列和/ 或可以从啤酒糖酵母DSM 10082中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：4中所示的DNA序列和/或可 以从啤酒糖酵母DSM 10082中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂 交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少60％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：4中所示的DNA序列和/ 或可以从啤酒糖酵母DSM 10082中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：4中所示的DNA序列或可以从 啤酒糖酵母DSM 10082中的质粒获得的DNA序列编码。
69.按照权利要求68的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于肉座 菌科(Hypocreaceae)的菌株，优选地是属于顶孢霉属的菌株，特别是 Acremonium sp.CBS 478.94的文库。
70.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：6中所示的DNA序列或可以从啤酒糖酵母DSM 10080中的 质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：6中所示的DNA序列的类似物或可以从啤酒糖酵母DSM 10080中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少65％同源于SEQ ID NO：6中所示的DNA序列或 可以从啤酒糖酵母DSM 10080中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：6中所示的DNA序列或可以从 啤酒糖酵母DSM 10080中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少70％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：6中所示的DNA序列或可 以从啤酒糖酵母DSM 10080中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：6中所示的DNA序列或可以从 啤酒糖酵母DSM 10080中的质粒获得的DNA序列编码。
71.按照权利要求70的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于 Chaetomiceae科的菌株，优选地是属于顶孢霉属的菌株，特别是Acremonium sp.CBS 478.94的文库。
72.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：8中所示的DNA序列或可以从啤酒糖酵母DSM 10081中的 质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：8中所示的DNA序列的类似物或可以从啤酒糖酵母DSM 10081中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少75％同源于SEQ ID NO：8中所示的DNA序列或 可以从啤酒糖酵母DSM 10081中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：8中所示的DNA序列或可以从 啤酒糖酵母DSM 10081中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少70％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：8中所示的DNA序列或可 以从啤酒糖酵母DSM 10081中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：8中所示的DNA序列或可以从 啤酒糖酵母DSM 10081中的质粒获得的DNA序列编码。
73.按照权利要求72的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于毛壳 科的菌株，优选地是属于Thielavia terrestris的菌株，特别是Thielavia terrestris NRRL 8126的文库。
74.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：10中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM 10512中的 质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：10中所示的DNA序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM 10512中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少65％同源于SEQ ID NO：10中所示的DNA序列或 可以从大肠杆菌DSM 10512中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：10中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10512中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交， 
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少55％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：10中所示的DNA序列或 可以从大肠杆菌DSM 10512中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化的内切葡聚糖酶的抗体免疫 学反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：10中所示的DNA序列或可 以从大肠杆菌DSM 10512中的质粒获得的DNA序列编码。
75.按照权利要求74的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的。所述DNA文库是属于斑痣 盘菌科的菌株，优选地是属于壳球孢属的菌株，特别是属于Macrophomina phaseolina的菌株，尤其是M.phaseolicola CBS 281.96的文库。
76.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：12中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM 10511中的 质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：12中所示的DNA序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM 10511中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少60％同源于SEQ ID NO：12中所示的DNA序列或 可以从大肠杆菌DSM 10511中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：12中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10511中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少60％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：12中所示的DNA序列或 可以从大肠杆菌DSM 10511中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：12中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10511中的质粒获得的DNA序列编码。
77.按照权利要求76的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于口蘑 科的菌株，优选地是属于毛皮伞属的菌株，特别是属于Crinipellis scabella的菌株，尤其是C.scabella CBS 280.96的文库。
78.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：16中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM 10571中的 质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：16中所示的DNA序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM 10571中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于，优选地至少70％同源于SEQ ID NO：16中所示的DNA序列或 可以从大肠杆菌DSM 10571中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：16中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10571中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少60％同源于由一种DNA 序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQ ID NO：16中所示的DNA序列或 可以从大肠杆菌DSM 10571中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：16中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10571中的质粒获得的DNA序列编码。
79.按照权利要求78的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于周刺 座霉属的菌株，优选地是属于Volutella colletotrichoides的菌株，特 别V.colletotrochoides CBS 400.58的文库。
80.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的 DNA序列，所述DNA序列包括
a)SEQ ID NO：19中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM 10576中的 质粒获得的DNA序列，或者
b)SEQ ID NO：19中所示的DNA序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物
i)同源于SEQ ID NO：19中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM 10576 中的质粒获得的DNA序列，
ii)在本文所描述的条件下与SEQ ID NO：19中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，
iii)编码一种多肽，该多肽同源于由一种DNA序列编码的多肽，所述DNA 序列包含SEQ ID NO：19中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM 10576 中的质粒获得的DNA序列，
iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQ ID NO：19中所示的DNA序列或可以 从大肠杆菌DSM 10576中的质粒获得的DNA序列编码。
81.按照权利要求80的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA 文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于粪壳 科的菌株，优选地是属于粪壳属的菌株，特别属于粪生粪壳的菌株，尤其 是粪生粪壳ATCC 52644的文库。
82.按照权利要求66-81之任一的DNA构建体，该构建体还包含编码纤 维素-结合域的DNA序列。
83.权利要求82的DNA构建体，该构建体还包含编码纤维素-结合域 (CBD)的DNA序列，所述纤维素-结合域和由所述DNA构建体之DNA序列编 码的酶的酶核心(催化活性域)是可操作连接的。
84.一种重组表达载体，该载体包含按照权利要求62-83之任一的DNA 构建体。
85.一种细胞，该细胞包含按照权利要求66-83之任一的的DNA构建体 或按照权利要求84的重组表达载体。
86.按照权利要求85的细胞，该细胞是真核细胞，特别真菌细胞，如 酵母细胞或丝状真菌细胞，或所述基因所来源的内源性细胞。
87.按照细胞权利要求86的细胞，其中所说的细胞属于曲霉属 (Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)的菌株，特别 是禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲 霉(Aspergillus oryzae)的菌株。
88.一种产生显示内切葡聚糖酶活性的酶的方法，该方法包括在可以产 生所述酶的条件下，培养按照权利要求85-87之任一的细胞，并从培养物 中回收所述的酶。
89.一种显示内切葡聚糖酶活性的酶，该酶
a)由按照权利要求66-83之任一的DNA构建体编码，
b)由按照权利要求88的方法产生，或
c)是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的，所述内切葡聚 糖酶由序列表SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16、19之任一所 示的DNA序列编码。
90.一种使要洗的衣物颜色澄清的方法，该方法包括用包含按照权利要 求1-9、11-61和89之任一的酶制剂的浸泡、洗涤或冲洗液体处理要洗的 衣物。
91.按照权利要求90的方法，其中所说的要洗的衣物用洗衣机处理。
92.按照权利要求90或91的方法，其中所说的内切葡聚糖酶在机器 循环使用条件下，以每升液体1到1000 S-CEVU，优选地是5到200 S-CEVU 的有效量存在于浸泡、洗涤或冲洗液体中。
93.按照权利要求90-92之任一的方法，其中所说的浸泡、洗涤或冲洗 液体的最适pH在4和11之间，优选地在6和10.5之间。
94.按照权利要求90-93之任一的方法，其中温度在15℃和60℃之 间。
95.按照权利要求90-94之任一的方法，其中所说的浸泡、洗涤或冲 洗液体还包含一种或多种选自蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂 酶、过氧化物酶和漆酶的酶。
96.一种洗衣组合物，该组合物包含按照权利要求1-9、11-61和89 之任一的酶制剂，以及选自表面活性剂、助洗剂化合物和织物软化剂的化 合物。
97.按照权利要96的洗衣组合物，该组合物还包含一种或多种选自蛋 白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶、木聚糖酶、过氧化物酶和漆酶的酶。
98.按照权利要求97的组合物，其中所说的表面活性剂是非离子、阴 离子、阳离子、两性离子、两性或兼性表面活性剂。
99.按照权利要求98的组合物，其中所说的织物软化剂是阳离子或非 离子软化剂，优选地是季铵化合物，并且其可以进一步包含或不包含一种 或多种选自表面活性剂、电解质、缓冲液、抗氧剂和液态载体的化合物。
100.按照权利要求1-9、11-61和89之任一的酶在降解或修饰植物材 料(例如细胞壁)上的用途。
101.按照权利要求1-9、11-61和89之任一的酶在处理织物原料或织 物，优选地是在防止背染、生物抛光或“石洗”纤维素织物中的用途。
102.按照权利要求1-9、11-61和89之任一的酶在处理纸浆，优选地 是在剥树皮、脱纤维、纤维改性、酶促脱墨或改善排水中的用途。
103.一种酶制剂，该制剂富含按照权利要求1-9、11-61和89的显示 溶纤活性的酶。
104.按照权利要求103的制剂，该制剂还包含一种或多种选自半乳聚 糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李 半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶、内切葡聚糖酶、果胶甲酯 酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、纤维二糖水解 酶和转谷氨酰胺酶的酶。

说明书全文

本发明涉及新的酶制剂，该酶制剂包含显示内切葡聚糖酶活性的酶，其 在工业应用(如洗衣组合物、生物抛光(biopolishing)新制造的织物、提供 纤维素织物或衣物磨损的外观和处理纸浆)中性能良好。此外，本发明涉及 编码这种酶的DNA构建体、提供编码这种酶的基因的方法、产生所述酶的 方法、包含这种酶的酶制剂以及这些酶在许多工业应用中的用途。 发明背景

纤维素酶或溶纤酶是涉及纤维素水解的酶。在天然纤维素的水解中，已 知涉及三种主要类型的纤维素酶，即纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维 二糖水解酶EC 3.2.1.91)、内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切1，4-β-D-葡聚糖4- 葡聚糖水解酶EC 3.2.1.4)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

纤维素酶由大量微生物(包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌)合成，也 由植物合成。已鉴别了各种特异性的特定的内切葡聚糖酶。

溶纤酶的一种十分重要的工业用途是用来处理纤维素织物原料或织 物，例如作为洗涤剂组合物或织物软化剂组合物中的组分、用于生物-抛光 新织物(衣物修饰)和用于获得含纤维素织物(尤其斜纹粗棉布)的＂石洗 (stone-washing)＂外观。在例如下列文献中提出了几种这样的处理方法： GB-A-1368599，EP-A-0307564和EP-A-0435876，WO 91/172431 WO 91/10732，WO 91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132。

溶纤酶的另一个重要的工业用途是用于纸浆处理，例如为了改善导液 (drainage)或使再利用纸脱墨。

尤其是，对所论及的工业用途而言，内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)构成了 有意义的一组水解酶。内切葡聚糖酶催化下列键的内切水解：纤维素、纤 维素衍生物(如羧基甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D- 配糖键；混合的β-1，3葡聚糖(如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖)和其它含 纤维素部分的植物材料中的β-1，4键。公认的名称是内切-1，4-β-D-葡聚糖 4-葡聚糖基(glucano)水解酶，本发明中使用缩写术语内切葡聚糖酶 (endoglucanase)。可以参见T.-M.Enveri，＂微生物纤维素酶＂W.M. Fogarty，微生物酶和生物技术，应用科学出版社，p.183-224(1983)；酶 学方法，(1988)Vol.160，p.200-391(Wood，W.A.和Kellogg，S.T.编)； Béguin，P.，＂纤维素降解的分子生物学，微生物学年评(1990)，Vol.44， pp.219-248；Béguin，P.和Aubert，J-P.，＂纤维素的生物降解＂，FEMS微 生物学回顾13(1994)p.25-58；Henrissat，B.，＂纤维素酶和它们与纤维素 的相互作用＂，纤维素(1994)，Vol.1，pp.169-196。

许多出版物中已描述了真菌内切葡聚糖酶，特别是来源于例如尖镰孢、 Trichoderma reesei，Trichoderma longibrachiatum，棘孢曲霉， Neocallimastix patriciarum和例如Piromyces、腐质霉属，毁丝霉属， Geotricum，青霉属，耙菌属，鬼伞属的种的那些内切葡聚糖酶。

例如，真菌内切葡聚糖酶已由下列文献描述：Sheppard P.O.，等，用 保守纤维素酶家族-特异性的序列从尖镰孢克隆纤维素酶同系物cDNA，基 因，(1994)，vol.15，pp.163-167；Saloheimo，A.，等，＂在酵母中表达 的Trichoderma reesei的新小内切葡聚糖酶基因egI5＂，分子微生物 学，(1994)vol.13(2)，pp.219-228；van Arsdell，J.N.等，(1987)， Trichoderma reesei在啤酒糖酵母内切葡聚糖酶I的克隆，特征确定和表 达，生物/技术5：60-64；Penttil_，M.等，(1986)，＂Trichoderma reesei 纤维素酶基因之间的同源性：内切葡聚糖酶I基因的完整的核苷酸序列＂， 基因45：253 263；Saloheimo，M.等，(1988)，＂EGIII，一种新的 Trichoderma reesei内切葡聚糖酶：基因和酶两者的鉴定＂，基因63： 112l；Gonzales，R.等.，＂Trichoderma longibrachiatum egll基因的 克隆、序列分析和酵母表达＂，应用微生物学和生物技术，(1992)，vol.38， pp.370-375；Ooi，T.等棘孢曲霉纤维素酶(FI-CMCase)cDNA的克隆和 序列分析＂，Curr.Genet.，(1990)，vol.18，pp.217222；Ooi，T.等，编 码棘孢曲霉纤维素酶(FI-CMCase)的基因的完整的核苷酸序列＂，核酸研 究，(1990)，vol.18，No.19，P.5884；Xue，G.等，＂多种厌氧瘤胃真菌 Neocallimastix patriciarum纤维素酶cDNA在大肠杆菌中的克隆和表达＂， J.Gen.Microbiol.，(1992)，vol.138，pp.1413-1420；Xue G.等，＂编 码具有高内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和木聚糖酶活性的三个多功能催 化区的Neocallimastix patriciarum的新的多糖类水解酶cDNA(celD)＂，J. Gen.Microbiol.，(1992)，vol.138，pp.2397-2403；Zhou，L.等，＂来源 于厌氧真菌Neocallimastix patriciarum的编码模式家族内切葡聚糖酶的 无内含子celB″，生物化学杂志，(1994)，vol.297，pp.359 364；Dalbφge， H.和Heldt-Hansen，H.P.，＂有效表达克隆真菌酶基因的新方法＂，Mol. Gen.Genet.，(1994)，vol.243，pp.253260；Ali，B.R.S.等，＂厌氧真 菌Piromyces纤维素酶和半纤维素酶构成多蛋白纤维素-结合复合物和由多 基因族编码＂，FEMS微生物学通讯，(1995)，vol.125，No，1，pp.15′-21。 此外，日本DNA数据库(公众可从Internet上获得的DDBJ数据库)包括从 微紫青霉克隆的编码内切葡聚糖酶的两个DNA序列(分别由A.Koch和G. Mernitz克隆)和从灰腐质霉变种thermoidea克隆的编码内切葡聚糖酶DNA 序列(由T.Uozumi克隆)。两种Macrophomina phaseolina的内切葡聚糖 酶已被克隆和测序，参见Wang，H.Y.和Jones，R.W.：＂植物致病真菌 Macrophomina phaseolina的内切葡聚糖酶-编码基因的克隆，特征确定和 功能性表达＂，基因，158：125 128，1995；和Wang，H.Y.和Jones，R.W.： ＂从植物致病真菌Macrophomina phaseolina克隆的单一内切葡聚糖酶-编 码基因＂，应用和环境微生物学，61：2004-2006，1995。这些内切葡聚糖 酶中的一个显示与真菌Trichoderma reesei eg13内切葡聚糖酶的高同源 性，另一个显示与微生物植物病原体Pseudomonas solanacearum eg11的 同源性，说明两种内切葡聚糖酶都属于糖基水解酶5族(B.Henrissat，生 物化学J 280：309-316(1991))。Schauwecker F.等(1995)公开了二态真 菌玉米黑粉菌的纤维素酶基因的丝-特异性(filament-specific)表达。

WO 91/17243(Nordisk A/S)公开了一种纤维素酶制剂，该制剂由与抗 高度纯化的43 kDa内切葡聚糖酶(得自Humicola insolens DSM1800)的抗 体免疫反应性的同源内切葡聚糖酶组成。WO 91/17244(Nordisk A/S)公开 了一种新的(半)纤维素降解酶，如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡 糖苷酶，其可以来源于非木霉属和展齿革菌属的真菌；WO 93/2019321公 开了可以从棘孢曲霉获得的内切葡聚糖酶；WO 94/21801(Genencor公司) 涉及一种纤维素酶系统，该系统是从显示内切葡聚糖酶活性的Trichoderma longibrachiatum分离到的；WO 94/26880(Gist Brocades N.V.)公开了一 种分离的纤维素降解酶混合物(优选地是从木霉属、Rspergillus或 Disporotrichum获得的)，其具有内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和木糖葡 聚糖酶活性；WO 95/02043(Nordisk A/S)描述了一种具有内切葡聚糖酶活 性的来源于Trichoderma harzianum的酶，该酶可以用于许多目的，包括 例如植物细胞壁的降解或修饰。

已知纤维素酶可以也可以不具有纤维素结合域(CBD)。CBD增加酶对包 含纤维素纤维的结合，并增加酶的催化活性部分的功效。

仍然需要提供可以用于需要纤维素酶尤其是内切葡聚糖酶活性的场合 的新的纤维素酶制剂。

本发明的目的是提供新的酶制剂，该酶制剂实质上在酸性、中性或碱性 条件下具有溶纤活性，并在纸浆处理，织物处理和洗衣过程中或者在动物 饲养中具有改进的功效，优选地是新的纤维素酶，更优选地是性能良好的 内切葡聚糖酶的酶制剂，所述酶被尝试由重组技术生产或产生。 发明概述

令人惊奇地是，现已发现一组内切葡聚糖酶具有某些独特的特征，在通 常使用内切葡聚糖酶的那些工业应用中性能良好。这些独特的特征可以以 酶蛋白质氨基酸序列的保守区进行描述，本发明发现，具有某些保守区的 溶纤酶(即显示溶纤活性的酶)在处理要洗的衣物、处理新制造的织物和处 理造纸纸浆中十分有效。

因此，本发明第一方面涉及一种酶制剂，该制剂实质上由具有溶纤活性 的酶组成，所述酶包含具有以下序列的由14个氨基酸残基组成的第一氨基 酸序列 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二氨基酸序列 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10、12和14号的各位置上，在第二序列的4号位置上， 氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个，其条件是在第一氨基酸序列 中，(i)当12号位置上的氨基酸残基是Ser时，14号位置上的氨基酸残基 不是Ser，和(ii)当12号位置上的氨基酸残基是Gly时，14号位置上的 氨基酸残基不是Ala。

尽管在性能良好的内切葡聚糖酶内发现其它相当显著的变异，但可清楚 识别保守区的这一惊人的发现是大量真菌DNA序列研究的结果，所述DNA 序列编码具有有效的溶纤(尤其是内切葡聚糖酶)活性之酶的特定氨基酸序 列。

基于这一发现，开发了一种用于特异性筛选以编码本发明的酶为特征的 基因组DNA或cDNA的分子方法。构建了作为其工具的三套简并引物。因此， 本发明在其第二方面涉及提供编码具有上述保守区之溶纤酶基因的方法。

通过使用这种方法(即供基因组DNA PCR筛选的引物套)，令人惊奇地发 现编码所述酶的DNA可以从宽范围的真菌中发现，所述真菌属于分类学上 很不相同的生物体，并且栖息于生态学上十分不同的小生境中。

进一步地，通过使用这一方法，发现编码所述酶核心区(催化活性区或 域)而无任何连接的纤维素结合域(CBD)之DNA序列已经可能，所述酶的核 心区将不通过采用基于筛选方法的常规手段来选择。发明人经实验证实CBD 区与本发明的酶核心区(包括所述酶的催化活性区或域)的连接导致多域酶 的功效明显改善，例如，高出50倍的功效。

因此，本发明提供了新的纤维素酶，尤其内切葡聚糖酶，以其天然形式 或者同源或异源形式产生的这些酶在工业应用中具有改善的功效。

另一方面，本发明涉及新的溶纤酶制剂，该制剂是可以从分类学上的特 定门(phyli)、纲、目、科、属和种产生的，例如可以从担子菌门的 (Basidiomycotous)层菌纲(Hymenomycetes)、接合菌门(Zygomycota)、壶 菌门(Chytridiomycota)；或从纲盘菌纲(Discomycetes)、腔菌纲(腔菌 纲)、不整囊菌纲(Plectomycetes)；Archaeascomycetes、半子囊菌纲 (Hemiascomycetes)或者从间座壳目、炭角菌目(Xylariales)、假毛球壳目 (Trichosphaeriales)、黑痣菌目(Phyllachorales)或从科丛赤壳科 (Nectriaeae)、粪壳科(Sordariaceae)、毛壳科(Chaetomiaceae)、 Ceratostomaceae、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)；或从属柱孢属 (Cylindrocarpon)、粘帚霉属(Gliocladium)、周刺座霉属(Volutella)、 Scytalidium、顶孢霉属(Acremonium)、或从种番茄镰孢(Fusarium lycopersici)、Fusarium passiflora、腐皮镰孢(Fusarium solani)、蛇 形镰孢(Fusarium anguioides)、早熟禾镰孢(Fusarium poae)、黑腐质霉 (Humicola nigrescens)、灰腐质霉(Humicola grisea)产生的，尤其是实 质上由包含选自以下序列的氨基酸序列的酶组成的那些： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ； Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；  和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。

更具体地说，本发明的酶制剂优选地是可以从以上提到的分类学上的特 定门(phyli)、纲、目、科、属和种产生的，所述的所有微生物都产生内切 葡聚糖酶，该酶包含具有以下序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中，在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序 列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8号位置上， 氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12号的各位置上，在 第二序列的4号位置上，氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。

本发明另一方面提供了包含编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列 之DNA构建体，所述DNA序列包含分别在SEQ ID NO：1、4、5、10、 12、16和19中所示的DNA序列或者它们的类似物。

本发明也涉及包含本发明DNA构建体的重组表达载体；涉及包含本发明 DNA构建体或重组表达载体的细胞；涉及产生本发明酶(例如，重组体酶) 的方法；涉及通过使用本发明的酶使要洗的衣物颜色澄清的方法；涉及包 含本发明的酶的洗衣组合物；涉及本发明的酶在降解或改性植物材料(例如 细胞壁)，处理织物原料、织物或衣物，处理纸浆中的用途；并涉及富含本 发明的酶的酶制剂。 附图简要描述

图1是下列微生物的推定编码的氨基酸序列的序列对比：Acremonium sp.(I)，Volutella colletotrichoides，Crinipellis scabella， Acremonium sp.(II)，Myceliophthora thermophila，Thielavia terrestris，Macrophomina phaseolina。用Pileup程序(Feng和 Doolittle 1987)(GCG包，版本8.0)产生最好的序列对比。在至少四个序 列中相同的残基(方框中)在相应的氨基酸周围表示出来。

图2图2a，b，c说明在真菌界内的本文所讨论的所有微生物(其能够 产生本发明的酶制剂和酶)的分类学分类。

本文使用的分类学分类基于用于：NIH数据库(Entrez 1996春天版)的 系统，该系统可以从World Wide Web：(http：//www3.nebi.nlm.nih.gov /htbin/ef/entrez TAX)获得。

对未包含在Entrez数据库中的生物体的分类，使用了下列一般可获得 的和世界范围内接受的参考书：

对于子囊菌纲(Ascomycetes)：Eriksson，O.E.& Hawksworth，D.L.：子 囊菌纲系统，vol 12(1993)。

对于担子菌纲(Basidiomycetes)：Jülich，W，：担子菌纲的较高分类群， Bibliotheca Mycologia 85，485pp(1981)。

对于接合菌纲：O′Donnell，K.：培养中的接合菌纲，佐治亚大学，美国， 257pp(1979)。

一般性的微生物学参考书： Hawksworth，D.L.，Kirk，P.M.，Sutton，B.C.和Pegler，D.N.：真 菌词典，国际真菌学研究所，616pp(1995)；

Von Arx，J.A，：培养中形成孢子的真菌属，424pp(1981)。

迄今仍不清楚腐质霉属(Humicola)的分类学位置(implacement)。然 而，粪壳目(Sordariales)广泛选择的18SRNA的研究已给出腐质霉属归于 粪壳目的有力的提示(Taylor，Clausen & Oxenbφ11，未发表)。此外，这 些数据表明腐质霉属与蛾柱霉属(Scytalidium)一起与粪壳科、毛壳科，长 喙壳科(Ceratostomataceae)和毛球壳科仅有相当远的关系。依据上述，在 这里将腐质霉属和Scytalidium置于粪壳目内，科未知。

图3是推定的部分氨基酸序列的序列对比，所述序列来源于实施例5中 描述的46种微生物中选择的26种。 发明详述

在本文中，术语“20种天然氨基酸残基”指通常在蛋白质中发现的20 种氨基酸残基，照惯例被认为是丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮 氨酸(Ieu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或 F)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser 或5)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰 胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天门冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或 E)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、和组氨酸(His或H)。

按照本发明，本发明提供了新的性能良好的内切葡聚糖酶，其包含保守 氨基酸序列区，尤其是具有以下序列的由14个氨基酸残基组成的第一氨基 酸序列 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二氨基酸序列 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中， 在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe； 在第一序列的8号位置上，氨基酸是Arg、Lys或His； 在第一序列9、10、12和14号的各位置上，在第二序列的4号位置上， 氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个，其条件是在第一氨基酸序列 中，(i)当12号位置上的氨基酸残基是Ser时，14号位置上的氨基酸残基 不是Ser，和(ii)当12号位置上的氨基酸残基是Gly时，14号位置上的 氨基酸残基不是Ala。

优选地，本发明的酶是微生物来源的，即是可以从微生物(如真菌)获得 的。

在一个优选的实施方案中，在第一序列的9号位置上的氨基酸残基选自 脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、并亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨 酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨 酸，优选地选自脯氨酸和苏氨酸。

在另一个优选的实施方案中，在第一序列的10号位置上的氨基酸残基 选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、 甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和 色氨酸，优选地是丝氨酸。

在另一个优选的实施方案，在第一序列的12号位置上氨基酸残基选自 脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨 酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨 酸，优选地选自丙氨酸和甘氨酸。

在另一个优选的实施方案中，在第一序列的14号位置上的氨基酸残基 选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、 甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、 色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，优选地选自脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨 酸、谷氨酸和天冬氨酸。

优选地，在第二序列的4号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、 缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬 氨酸，更优选地选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。

更优选的实施方案的例子是这样的一些，其中，在第一序列中，第3号 位置上的氨基酸残基是酪氨酸；或在第4号位置上的氨基酸残基是色氨酸； 或在第8号位置上的氨基酸残基是赖氨酸。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的酶包括选自以下序列的氨基酸 序列： Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13    ， Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Thr Ser Cys Ala Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13    ， 和 Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13    .

在第二方面，本发明提供了用于发现和克隆编码这种酶的基因的方法， 该方法包括在标准条件下与来源于任何保守区的寡核苷酸杂交(例如PCR 扩增)，如图1所说明的。

一种有用的寡核苷酸包含编码包含在选自以下序列的肽中的至少五肽 的核苷酸序列： a. Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14 在3或4在号位置上的氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在8号位置上的氨基 酸是Arg、Lys或His；在9、10、12和14号位置上的氨基酸分别是20 个天然氨基酸残基中的任何一个；和 b. Trp Cys Cys Xaa Cys Tyr 1   2   3   4   5   6 在4号位置上的氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个；和 c. Xaa Pro Gly Gly Gly Xaa Gly Xaa Phe 1   2   3   4   5   6   7   8   9 1号位置上的氨基酸是Met或Ile；6和8号位置上的氨基酸分别是Leu、 Ile或Val；和 d. Gly Cys Xaa Xaa Arg Xaa Asp Trp Xaa 1   2   3   4   5   6   7   8   9 在3号位置上的氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个；在4和6号 位置上的氨基酸分别是Trp、Tyr或Phe；并且 在9号位置上的氨基酸是Phe或Met。

所述有用的寡核苷酸也包括与以上所述序列互补的核苷酸序列。

在本发明的方法的一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸相应于选自以 下PCR引物的PCR引物： 有义， 5’-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’ 反义1， 5’-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3’； 反义2， CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/GICCICCICCIGG-3’；和 反义3， 5’-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICG/TCC-3.

在第三方面，本发明提供了一种酶制剂，该制剂实质上由具有溶纤活性 和具有发明人所发现的保守区的酶组成，该酶包含具有下列序列的由7个 氨基酸序列组成的肽： Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7    ；和 Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa 1   2   3   4   5   6   7 其中， 在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe；和 在1和7号位置上，Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。

这种酶是可以从属于担子菌门的层菌纲菌株优选地属于蘑菇目、木耳目 和非褶菌目的菌株，更优选的属于黑耳科、口蘑科、鬼伞科、裂褶菌科、 烟管菌科和多孔菌科的菌株，特别是属于黑耳属、毛皮伞属、层孔菌属、 斑褶菇属、栓菌属、裂褶菌属和绵皮孔菌属的菌株获得的(参见图2)。

特定的例子是可以从属于黑胶耳、Crinipellis scabella、木蹄层孔 菌和Spongipellis sp.的菌株，特别是可以从黑胶耳CBS 277.96、 Crinipellis scabella CBS 280.96、木蹄层孔菌CBS 276.96和 Spongipellis sp.CBS 283.96获得的内切葡聚糖酶。

按照布达佩斯条约，黑胶耳于1996年3月12日以保藏号CBS 277.96 保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷兰；Crinipellis scabella于1996年3月12日以保藏号CBS 280.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273， NL-3740 AG Baarn，荷兰；木蹄层孔菌于1996年3月12日以保藏号CBS 276.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273， NL-3740 AG Baarn，荷兰；Spongipellis sp.于1996年3月12日以保 藏号CBS 283.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷兰。

本发明的酶制剂是也可以从属于壶菌门的菌株，优选地属于壶菌纲的菌 株，更优选地属于Spizellomycetales目的菌株，特别优选地属于 Spizellomycetaceae科的菌株，尤其是属于囊壶菌属的菌株获得的。所说 菌株的特定的例子是属于红根囊壶菌的菌株，尤其是红根囊壶菌CBS 282.96。

按照布达佩斯条约，红根囊壶菌于1996年3月12日以保藏号CBS 282.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat 1，Postbus 273， NL-3740 AG Baarn，荷兰。

本发明的酶制剂也可以从属于接合菌门的菌株，优选地从属于接合菌纲 的菌株，更优选地从毛霉目的菌株，尤其是从属于毛霉科和枝霉科的菌株， 尤其是属于根毛霉属、须霉属和刺枝霉属的菌株获得。特定菌株的例子是 属于Rhizomucor pusillus，闪光须霉和弗雷生刺枝霉的菌株，特别是 Rhizomucor pusillus IFO 4578、闪光须霉IFO 4814和弗雷生刺枝霉NRRL 2305。

此外，本发明的酶制剂也可以从属于Archaeascomycetes、盘菌纲，半 子囊菌亚纲，腔菌纲和不整囊菌纲的菌株，优选地从属于由盘菌目、斑痣 盘菌目(Rhytismatales)、座囊菌目和散囊菌目的菌株获得。尤其是所述酶 可以从属于葫芦霉科、粪盘菌科、斑痣盘菌科和发菌科的菌株，优选地从 属于色二孢属、Microsphaeropsis、Ulospora、壳球孢属，粪盘菌属， Saccobolus、青霉属和Thermomyces的菌株获得。特定的例子是可以从以 下菌株获得的酶，所述菌株是属于由棉色二孢、Microsphaeropsis sp.、 Ulospora bilgramii、Aureobasidium sp.、Macrophomina phaseolina、 Ascobolus stictoides、Saccobolus dilutellus、盘菌属(Peziza)、疣 孢青霉、产黄青霉和Thermomyces verrucosus的菌株，特别是棉色二孢CBS 274.96、Ulospora bilgramiiNKBC 1444、Macrophomina phaseolina CBS 281.96、Saccobolus dilutellus CBS 275.96、疣孢青霉ATCC 62396、 产黄青霉ATCC 9480和Thermomyces verrucosus CBS 285.96。

按照布达佩斯条约，棉色二孢于1996年3月12日以保藏号CBS 274.96 保藏在真菌菌种保藏中心；Macrophomina phaseolina于1996年3月12 日以保藏号CBS 281.96保藏在真菌菌种保藏中心；Saccobolus dilutellus 于1996年3月12日以保藏号CBS 275.96保藏在真菌菌种保藏中心； Thermomyces verrucosus于1996年3月12日以保藏号CBS 285.96保藏 在真菌菌种保藏中心。

此外，所述酶可以从属于间座壳目、炭角菌目、假毛球壳目和黑痣菌目 的菌株，优选地从属于炭角菌科、黑腐皮壳科和Phyllachoraceae的菌株， 更优选地从属于由间座壳属、刺盘孢属、黑孢属、炭角菌属、Nodulisporum 和孔座壳属的菌株获得。特定的菌株的例子是属于Diaporthe syngenesia、葫芦科刺盘孢、鹿角团炭角菌、Nigrospora sp.、 Nodulisporum sp.和点孔座壳的菌株，特别是Diaporthe syngenesia CBS 278.96、葫芦科刺盘孢ATCC 52609、Nigrospora sp.CBS 272.96、鹿 角团炭角菌CBS 284，96。

按照布达佩斯条约，Diaporthe syngenesia于1996年3月12日以保 藏号CBS 278.96保藏在真菌菌种保藏中心；Nigrospora sp.于1996年3 月12日以保藏号CBS 272.96保藏在真菌菌种保藏中心；鹿角团炭角菌于 1996年3月12日以保藏号CBS 284.96保藏在真菌菌种保藏中心。

所述酶也可从按照布达佩斯于1996年3月12日分别以保藏号CBS 270.96、CBS 271.96和CBS 273.96保藏在真菌菌种保藏中心的未鉴别的 真菌(有丝分裂孢子的，coleomycetous)获得。

所述酶也可从以下菌株获得，所述菌株是属于柱孢属、粘帚霉属、赤壳 属、周刺座霉属、粪壳属、Scytalidium、梭孢壳属、Syspastospora、 Cladorrhinum、毛壳属、Myceliphthora和顶孢霉属的菌株，特别是属于 Cylindrocarpon sp.、Nectria pinea、Volutella colletotrichoides、 粪生粪壳、大孢粪壳、Thielavia terrestris、Thielavia thermophila、 Syspastospora boninensis、Cladorrhinum foecundissimum、墙毛壳、 Chaetomium virescens、Chaetomium brasiliensis、Chaetomium cunicolorum、Myceliophthora thermophila、链孢粘帚霉、Scytalidium thermophila和Acremonium sp的菌株，尤其是Nectria pinea CBS 279.96、 Volutella colletotrichoides CBS 400.58、粪生粪壳ATCC 52644、大孢 粪壳ATCC 60255、Thielavia terrestris NRRL 8126、Thielavia thermophila CBS 174.70、墙毛壳CBS 163.52、Chaetomium virescens CBS 547.75、Chaetomium brasiliensis CBS 122.65、Chaetomium cunicolorum CBS 799.83、Syspastospora boninensis NKBC 1515、 Cladorrhinum foecrundissimum ATCC 62373、Myceliophthora thermophila CBS 117.65、Scytalidium thermophila ATCC 28085、链孢 粘帚霉ATCC 10523和Acremonium sp.CBS 478.94。

按照布达佩斯条约，Nectria pinea于1996年3月12日以保藏号CBS 279.96保藏在真菌菌种保藏中心；Acremonium sp.于1994年9月28日以 保藏号CBS 478.94保藏。

所述酶也可以从属于腐皮镰孢、蛇形镰孢、早熟禾镰孢、尖镰孢 ssp.lycopersici、尖镰孢ssp.passiflora、黑腐质霉和灰腐质霉的菌 株，尤其是番茄尖镰孢ssp lycopersici CBS 645.78、尖镰孢ssp passitlora CBS 744.79、腐皮镰孢IMI 107.511、蛇形镰孢IFO 4467、 早熟禾镰孢ATCC 60883、黑腐质霉CBS 819.73和灰腐质霉ATCC 22726 获得。应当注意灰腐质霉不同于灰腐质霉thermoidea变种。

在一个优选的实施方案中，本发明的酶制剂来源于所公开的纲、目、科、 属和种，并且实质上由下述酶组成，所述酶包含具有以下序列的由13个氨 基酸残基组成的第一肽 Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp 1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13 和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽 Trp Cys Cys Xaa Cys 1   2   3   4   5 其中，在第一序列的3号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序 列的4号位置上，氨基酸是Trp、Tyr或Phe；在第一序列的8号位置上， 氨基酸是Arg、Lys或His；在第一序列9、10和12号的各位置上，在 第二序列的4号位置上，氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个。

优选地，在第一序列的9号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、 缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，更优选地选自 脯氨酸和苏氨酸；在第一序列的10号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏 氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，优选地 是丝氨酸；在第一序列的12号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、 缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，优选地选自丙 氨酸和甘氨酸；在第二序列的4号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨 酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天 冬氨酸，更优选地选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。

另一方面，本发明提供了一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切 葡聚糖酶活性之酶的DNA序列，所述DNA序列包括

a)分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示的 DNA序列和/或可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、 DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571、DSM 10576 中的质粒获得的DNA序列，或者    

b)分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示的 DNA序列的类似物或可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571、 DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物

i)同源于分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所 示的DNA序列和/或可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571、 DSM 10576中的质粒获得的DNA序列，

ii)与分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示 的DNA序列和/或可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571、 DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，

iii)编码一种多肽，该多肽同源于由一种DNA序列编码的多肽，所述DNA 序列包含分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示 的DNA序列和/或可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571、 DSM 10576中的质粒获得的DNA序列，

iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学 反应性的，所述内切葡聚糖酶由分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、 12、16或19中所示的DNA序列或可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、 DSM 10571、DSM 10576中的质粒获得的DNA序列编码。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10512已于1996年2月2日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10511已于1996年2月2日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10571已于1996年3月6日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10576已于1996年3月12日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10583已于1996年3月13日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10584已于1996年3月13日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10585已于1996年3月13日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10586已于1996年3月13日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10587已于1996年3月13日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM 10588已于1996年3月13日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，啤酒糖酵母DSM 9770已于1995年2月24日保藏在 DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig， 德国)。

按照布达佩斯条约，啤酒糖酵母DSM 10082已于1995年6月30日保藏 在DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig，德国)。

按照布达佩斯条约，啤酒糖酵母DSM 10080已于1995年6月30日保藏 在DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig，德国)。

按照布达佩斯条约，啤酒糖酵母DSM 10081已于1995年6月30日保藏 在DSM(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig，德国)。

与SEQ ID NO：1有关的本发明DNA构建体可以从毁丝霉属的菌株，特 别是M.thermophila的菌株，尤其是M.thermophila CBS 117.65的DNA 文库分离或者基于该文库产生。

与SEQ ID NO：4和6有关的本发明DNA构建体可以从顶孢霉属的菌株， 尤其是Acremonium sp.CBS 478.94的DNA文库分离或者基于该文库产生。

与SEQ ID NO：8有关的本发明DNA构建体可以从梭孢壳属的菌株，特 别是Thielavia terrestris的菌株，尤其是Thielavia terrestris NRRL 8126的DNA文库分离或者基于该文库产生。

与SEQ ID NO：10有关的本发明DNA构建体可以从壳球孢属的菌株，特 别是M.phaseolina的菌株，尤其是M.phaseolina CBS 281.96的DNA文 库分离或者基于该文库产生。

与SEQ ID NO：12有关的本发明DNA构建体可以从毛皮伞属的菌株，特 别是C.scabella的菌株，尤其是C.scabella CBS 280.96的DNA文库分 离或者基于该文库产生。

与SEQ ID NO：19有关的本发明DNA构建体可以从粪壳属的菌株，特别 是粪生粪壳的菌株的DNA文库分离或者基于该文库产生。

在本发明中，分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19 中所示的DNA序列的＂类似物＂意指任何编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的 DNA序列，其具有性质i)-iv)的任一或全部。 类似的DNA序列

a)可以基于分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19 中所示的DNA序列，采用例如本文所公开的方法，从产生具有内切葡聚糖 酶活性之酶的其它或者相关(例如，相同)生物体分离；同系物可以是包含 本文所示的DNA序列的DNA序列的等位变体，即经突变产生的基因的另一 种形式。突变可以是沉默的(在编码的酶上无变化)或可以编码具有改变的 氨基酸序列的酶；所述DNA序列的同系物也可以是属或种同系物，编码来 源于另一个种的具有类似性质的酶。

b)可以基于分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19 中所示的DNA序列构建，例如通过引入不产生另一个由所述DNA序列编码 的内切葡聚糖酶的氨基酸序列(但其相应于用于产生所述酶的生物体的密 码子使用)的核苷酸取代，和能够产生一种不同的氨基酸序列的核苷酸取 代。然而，在后一种情况下，氨基酸的变化优选地是次要性质的改变(其是 保守氨基酸取代，不明显地影响蛋白质的折叠或活性)、小的缺失(典型地 是1到约30个氨基酸)；小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨 酸残基)，至大约20-25个残基的小的接头肽或有利于纯化的小的延伸(如 聚-组氨酸束，抗原表位或结合域)，总的情况参见Ford等，蛋白质表达和 纯化，2：95-107，1991。保守取代的例子在下列氨基酸的范围内：碱 性氨基酸(如精氨酸，赖氨酸，组氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨 酸)，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，异亮 氨酸，缬氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如 甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸)。

对本领域技术人员明显的是，可以进行这样的取代，其在对所述分子的 功能关键性的区域之外，并且仍然产生活性多肽。可以按照本领域已知的 方法鉴别对本发明的DNA构建体编码的多肽之活性必需的氨基酸，所述方 法例如定向诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244， 1081-1085，1989)。在后一技术中，在分子中的任何残基上引入突变，试 验形成的突变体分子的生物学(即内切葡聚糖酶)活性，以鉴别对所说分子 活性关键性的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过晶体结构 (由核磁共振、结晶学或光亲和性标记法之类的技术测定的)分析测定。参 见例如de Vos等，科学255：306-312，1992；Smith等，分子生物学杂 志.224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。

由本发明的DNA构建体的DNA序列编码的内切葡聚糖酶可以包括纤维素 结合域(CBD)，以编码完整酶一部分存在，或者其它来源的CBD可以引入 进内切葡聚糖酶酶，由此产生酶杂合体。在本文中，术语＂纤维素-结合域＂ 应如Peter Tomme等“不溶性碳水化合物的酶促降解”中的“纤维素-结 合域：分类和性质”，John N.Saddler and Michael H.Penner(编者)，ACS 专题研讨系列No.618，1996所定义的来理解。这一定义把120种以上的 纤维素-结合域(CBD)分类成10个家族(I-X)，并且其说明CBD在各种酶中 发现，如纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶 和壳多糖酶。CBD也在藻类中发现，例如，作为-非水解多糖类-结合的红 藻Porphyra purpurea蛋白质，参见Peter Tomme等，同上。然而，大多 数CBD来源于纤维素酶和木聚糖酶。CBD在蛋白质的N或C末端或内部发 现。酶杂合体在本领域是已知的，参见例如WO 90/00609和WO95/16782， 并且可以通过将包含至少一种编码纤维素-结合域的DNA片段(其带有或不 带有接头，与编码目的酶的DNA序列连接)的DNA构建体转化进宿主细胞 中，并培养该宿主细胞以表达融合基因来制备。酶杂合体可以用下式来描 述：

CBD-MR-X，

其中CBD是相应于至少纤维素-结合域的氨基酸序列的N-末端或C-末端 区；MR是中间区(接头)，和可以是化学键或者短的连接基团，这些基团优 选地具有约2至100个碳原子，更优选地具有2至40碳原子；或者优选地 是约2至约100个氨基酸，更优选地是2至40个氨基酸；X是由本发明的 DNA序列编码的多肽的N-末端或者C-末端区。

以两种序列之间的等同性的程度测定以上i)中提及的同源性，表示第一 序列和第二序列的差别。同源性可以用本领域已知的计算机程序合适地测 定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.， 分子生物学杂志，48：443-453，1970)。采用GAP和下列设置进行DNA序 列比较：GAP产生罚分5.0和GAP延伸罚分0.3，所述DNA序列的编码区显 示与分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA 序列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的 质粒获得的DNA序列具有优选地至少60％，更优选地至少65％，更优选地 70％，更优选地至少80％，尤其是至少90％的等同性程度。

以上ii)中提及的杂交意指在某些特点的条件下(在此后的材料和方法 中详细描述)，类似的DNA序列杂交到编码内切葡聚糖酶的DNA序列的相同 探针上。所使用的寡核苷酸探针是相应于分别在SEQ ID NO：1、4、6、 8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的质粒获得的DNA序列之内切葡聚糖酶 编码部分的DNA序列。

以两种序列之间的等同性的程度测定以上iii)中提及的同源性，表示第 一序列和第二序列的差别。同源性可以用本领域已知的计算机程序合适地 测定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.， 分子生物学杂志，48：443-453，1970)。采用GAP和下列设置进行DNA序 列比较：GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分0.1，所述DNA序列的编码区显 示与分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA 序列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的 质粒获得的DNA序列具有优选地至少55％，更优选地至少60％，更优选地 65％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，尤其是至少90％的等同性 程度。

关于以上iv)提及的性质，意指分别由从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、 DSM 10571或DSM 10576分离的DNA序列编码和由用所说DNA序列转化的宿 主生物体产生的内切葡聚糖酶酶，或者分别由Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris、Macrophomina phaseolina、Crinipellis scabella、Volutella colletotrichoides或 粪生粪壳天然内切葡聚糖酶。可以用以下材料和方法部分描述的方法测定 免疫学反应性。

本发明的另一方面涉及具有本发明的DNA构建体的表达载体、包含所说 DNA构建体和表达载体的细胞以及产生显示内切葡聚糖酶活性之酶的方 法，该方法包括在可以产生所说酶的条件下培养所说的细胞，并从培养物 回收所说的酶。

本发明的另一方面涉及一种显示内切葡聚糖酶活性的酶，这种酶

a)由本发明的DNA构建体编码

b)用本发明的方法产生

c)与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体是免疫学反应性的，所述内切葡聚 糖酶由分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示的 DNA序列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、 DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576 中的质粒获得的DNA序列编码。

以上c)中提及的内切葡聚糖酶可以是由从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、DSM 10511、 DSM 10571或DSM 10576分离的DNA序列编码和由用所说DNA序列转化的宿 主生物体产生的内切葡聚糖酶，或者分别由Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris、Macrophomina phaseolina、Crinipellis scabella、Volutella colletotrichoides或 粪生粪壳天然相应的内切葡聚糖酶。

一般地，在本文中，术语＂酶＂被理解为包括成熟蛋白质或其前体形式以 及其实质上具有全长酶活性的功能性片段。此外，术语＂酶＂旨在包括所说 酶的同系物。

所述酶的同系物可以具有一个或多个氨基酸取代，缺失或者添加。这些 变化优选地是次要性质的改变(其是保守氨基酸取代，不明显地影响蛋白质 的折叠或活性)、小的缺失(典型地是1到约30个氨基酸)；小的氨基-或羧 基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨酸残基)，多至大约20-25个残基的小的 接头肽或有利于纯化的小的延伸(如聚-组氨酸束，抗原表位或结合域)，总 的情况参见Ford等，蛋白质表达和纯化，2：95-107，1991。保守取代 的例子在下列氨基酸的范围内：碱生氨基酸(如精氨酸，赖氨酸，组氨酸)， 酸性的氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰 胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨 酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸， 甲硫氨酸)。

对本领域技术人员明显的是，可以进行这样的取代，其在对所述分子的 功能关键性的区域之外，并且仍然产生活性酶。可以按照本领域已知的方 法鉴别对本发明的DNA构建体编码的酶之活性必需的氨基酸，所述方法例 如定向诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244，1081- 1085，1989)。在后一技术中，在分子中的任何残基上引入突变，试验形成 的突变体分子的生物学(即内切葡聚糖酶)活性，以鉴别对所说分子活性关 键性的氨基酸残基。配体-受体相互作用的位点也可以通过晶体结构(由核 磁共振、结晶学或光亲和性标记法之类的技术测定的)分析测定。参见例如 de Vos等，1992；Smith等，1992；Wlodaver等，1992。

同系物可以是等位变体，即经突变产生的基因的另一种形式或可以是由 突变基因编码的改变的酶(但具有与本发明的酶实质上相同的活性)。由此 突变可以是沉默的(编码的酶无改变)或者可以编码具有改变的氨基酸序列 的酶。

所述酶的同系物也可以是属或种同系物，即来源于另一物种的具有类似 性质的酶。

所述酶的同系物可以通过本文描述的方法分离。 经聚合酶链反应分子筛选和克隆

使用从合适的来源(例如任何本文提及的生物体)分离的基因组DNA或者 双链cDNA和基于本文公开的DNA序列和氨基酸序列制备的合成寡核苷酸引 物，经聚合酶链反应(PCR)进行本发明的DNA序列的分子筛选。例如，合适 的寡核苷酸引物可以是在材料和方法部分中所描述的引物。

依据众所周知的方法，在分子筛选中所产生的PCR片段可以被分离和亚 克隆进合适的载体中。经例如菌落或者噬斑杂交，PCR片段可以用于筛选 DNA文库。 酵母中的克隆表达

可以通过一般性的方法分离编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的本发明 的DNA序列，所述方法包括

-在合适的载体中从合适的来源(例如任何本文提及的生物体)克隆DNA 文库，

-用所说的载体转化合适的酵母宿主细胞，

-在合适的条件之下培养所说宿主细胞，以表达由DNA文库中的克隆编 码的任何兴趣酶，

-通过测定由这些克隆产生的酶的任何内切葡聚糖酶活性筛选阳性克 隆，

-从这些克隆分离编码所述酶的DNA。

在WO 94/14953中进一步公开了一般性的方法，该文献的内容本文一并 参考。筛选方法更详细的描述在以下实施例1中给出。

可以分离编码酶的DNA序列，所述分离是例如通过筛选Macrophomina phaseolina、Crinipellis scabella、粪生粪壳或Volutella colletotrichoides的cDNA文库，并选择表达合适的酶活性(即内切葡聚 糖酶活性)的克隆进行分离；或者从按照布达佩斯条约于1996年2月2日 保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，Mascherodcr Weg 16，D-38124 Braunschweig，德国)的大肠杆菌DSM 10512分离；或者从按照布达佩斯条 约于1996年2月2日保藏在DSM的大肠杆菌DSM 10511分离；或者从按照 布达佩斯条约于1996年3月12日保藏在DSM的大肠杆菌DSM 10576分离； 或者从按照布达佩斯条约于1996年3月6日保藏在DSM的大肠杆菌DSM 10571分离；或者通过筛选Myceliphthora thermophila CBS 117.65、 Acremonium sp.CBS 478.94或Thielavia terrestris NRRL 8126的cDNA 文库，并选择表达合适的酶活性(即内切葡聚糖酶活性)的克隆进行分离； 或者从按照布达佩斯条约于1995年2月24日保藏在DSM(德意志微生物保 藏中心，Mascheroder Weg 16，D-38124 Braunschweig，德国)的啤酒糖酵 母DSM 9770分离；或者从按照布达佩斯条约于1995年6月30日保藏在DSM 的啤酒糖酵母DSM 10082分离；或者从按照布达佩斯条约于1995年6月30 日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10080分离；或者从按照布达佩斯条约于 1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10081分离。

然后，可以用标准方法(如实施例1中所描述的)从所述克隆分离合适的 DNA序列。 核酸构建体

本文使用的术语＂核酸构建体＂旨在指任何cDNA、基因组DNA、合成DNA 或者RNA来源的核酸分子。术语＂构建体＂旨在指核酸区段，其可以是单链 或双链，并且其可以是基于编码兴趣酶的全部或部分天然核苷酸序列。所 述构建体可以含有可以不含有其它核酸区段。

编码本发明酶的核酸构建体可以是基因组或cDNA来源的，例如通过制 备基因组或者cDNA文库，并按照标准技术(参见Sambrook等，1989)使用 合成寡核苷酸探针经杂交筛选编码全部或部分酶的DNA序列获得。

编码酶的核酸构建体也可以用已建立的标准的方法经合成制备，所述方 法例如由Beaucage和Caruthers(1981)描述的氨基亚磷酸酯方法，或 Matthes等(1984)描述的方法。按照氨基亚磷酸酯方法，在例如自动DNA合 成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接和在合适的载体中克隆。

此外，所述核酸构建体可以是合成和基因组，合成和cDNA或基因组和 cDNA混合来源的，其是经按照标准技术连接合成、基因组或者cDNA来源的 片段(相应于完整的核酸构建体的各种部分的片段)制备(以合适的方式) 的。

也可以采用特定的引物经聚合酶链反应制备所述的核酸构建体，例如按 照美国专利4,683,202或Saiki等(1988)描述的方法制备。

核酸构建体优选地是DNA构建体，这一术语将一直用于本说明书与权利 要求书中。 重组载体

包含编码本发明的酶的DNA构建体的重组载体可以是任何易于进行DNA 操作的载体，载体的选择常常取决于其所要引入的宿主细胞。这样，载体 可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于 染色体复制，例如质粒。另外，载体可以是这样一种，当其被引入宿主细 胞时，整合进宿主细胞基因组，并且与其整合进的染色体一道复制。

所述载体优选地是表达载体，在其中编码本发明的酶的DNA序列可操作 地连接到该DNA转录所需的附加区段上。一般来说，表达载体是来自质粒 或病毒DNA的或可以包含它们的成分。术语＂可操作连接＂指所述区段排列 得使它们对预期的目的协调起作用，例如转录在启动子开始，并且经由编 码酶的DNA序列进行。

启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中显示转录活性， 并且可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

用于酵母宿主细胞的合适的启动子的例子包括来源于酵母糖解基因 (Hitzeman等，生物化学杂志.255(1980)，12073-12080；Alber和 Kawasaki，分子应用遗传学杂志，1(1982)，419-434)或酒精脱氢酶基因 (Young等，化学品的基因工程和微生物学(Hollaender等，编者)，Plenum 出版社，纽约，1982)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2- 4c(Russell等，自然，304(1983)，652-654)启动子。

用于丝状真菌细胞的合适的启动子是例如ADH3启动子(McKnight等， The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其它有用的启动子的 例子是来源于编码下列酶的基因的那些，所述酶是米曲霉TAKA淀粉酶、 Rhizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定 α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucor miehei脂 酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。优 选的是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。

用于细菌宿主细胞的合适的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌生麦 淀粉酶基因、地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶基因、液解化淀粉杆菌BAN淀粉酶 基因、枯草杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子或 噬菌体λPR或PL启动子或者大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

如果需要，编码本发明的酶的DNA序列也可以可操作地与合适的终止子 连接。    

本发明的重组载体还可以包含使得所述载体在所说的宿主细胞中复制 的DNA序列。

所述载体也可以包含选择性标记，例如，其产物补充宿主细胞缺陷的基 因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P.R. Russell，基因40，1985，pp.125-130描述)。对于丝状真菌，选择性标 记包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC。

为了引导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，也可以在重组载体中包 含分泌信号序列(也称作前导序列、前序列原或前序列)，将分泌信号序列 在正确的读框中与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列一般被置于编码 酶的DNA序列的5′。分泌信号序列可以是通常与所述酶相关的或者可以是 来源于编码另一个分泌蛋白质的基因的。

为了从酵母细胞分泌，分泌信号序列可以编码任何信号肽，该肽确保所 表达的酶以有效的方向进入细胞的分泌途径。信号肽可以是天然信号肽或 其功能性部分，或者其可以是合成肽。已发现合适的信号肽是α-因子信号 肽(参见美国专利4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶信号肽(参见0. Hagenbuchle等，自然2891981，pp.643-646)，修饰的羧肽酶信号肽(参 见L.A.Vails等，细胞48，1987，pp.887-897)，酵母BAR1信号肽(参 见WO 87/02670)或酵母天冬氨蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani 等，酵母，6，1990，pp.127-137)。

为了在酵母中有效地分泌，也可以将编码前导肽的序列插入到信号序列 的下游和编码酶的DNA序列的上游。前导肽的功能在于允许所表达的酶从 内质网被引导到达高尔基体，并进一步到达分泌泡以便分泌到培养基中(即 酶穿过细胞壁或至少穿过细胞膜进入酵母细胞的周质空间的输出)。前导肽 可以是酵母α-因子前导肽(其用途在例如US 4,546,082，EP 16201，EP 123294，EP 123544和EP 163529中描述)。另外，前导肽可以是合成 的前导肽，这就是说前导肽不是天然发现的。合成的前导肽可以按照例如 WO 89/0246 3或WO 92/11378中的描述构建。

对于在丝状真菌中的使用，所述信号肽可以方便地来源于编码 Aspergillus sp.淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码Rhizomucor miehei脂 酶或蛋白酶，Humicola lanuginosa脂酶的基因。所述信号肽优选地是来 源于编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸-稳定淀粉 酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。

分别用于连接编码所述酶的DNA序列、启动子以及可操作的终止子和/ 或分泌信号序列的方法和将它们插入到包含复制所需信息的合适载体中的 方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Sambrook等，以上引用的)。 宿主细胞

引入到宿主细胞的编码所述酶的DNA序列对所说的宿主细胞而言可以是 同源的或者是异源的。如果对宿主细胞是同源的，即由宿主细胞天然，则 其典型地被可操作连接到另一启动子或者(可用的话)另一分泌信号序列和 /或终止子序列上，而不是在其天然环境中。术语＂同源的＂旨在包括编码所 说宿主细胞天然酶的cDNA序列。术语＂异源的＂旨在包括所说宿主细胞天然 不表达的DNA序列。这样，所说的DNA序列可以来源于另一个生物体，或 者其可以是合成的序列。

本发明的DNA构建体或重组载体引入其中的宿主细胞可以是能够产生本 发明的酶的任何细胞，包括细菌，酵母，真菌和高等真核细胞。

经培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏-阳性菌， 例如芽胞杆菌属的菌株(如枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆 菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Bacillus alkalophilus、液解化 淀粉杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌 或苏云金芽孢杆菌菌株)或链霉菌属的菌株(例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉 菌的菌株)，或者革兰氏-阴性菌，例如大肠杆菌。可以用已知方法经原生 质体转化或者使用感受态细胞进行细菌的转化(参见Sambrook等，同上)。

当在细菌(如大肠杆菌)中表达酶时，酶可以被保留在细胞质中(典型地 是以被称作包含体的不溶性颗粒)或由细菌分泌序列引导到周质空间中。在 前一种情况下，裂解细胞，回收颗粒并变性，此后经稀释变性剂使酶再折 叠。在后一种情况下，可以经裂解细胞从周质空间回收所说酶，如通过超 声波或渗透冲击以释放周质空间的内含物并回收酶。

合适的酵母细胞的例子包括Saccharomyces spp.或 Schizosaccharomyces spp.的细胞，啤酒糖酵母或者克鲁弗酵母的特定菌 株。用于用异源DNA转化酵母细胞并且从此产生异源酶的方法在例如US 4,599,311，US 4,931,373，US 4,870,008，5,037,743，和US 4,845,075(所 有这些本文一并参考)中有描述。转化细胞由通过选择性标记确定的表型选 择。所述选择性标记一般是对药物的抗性或者在缺少特殊营养物(例如亮氨 酸)的情况下的生长能力。用于酵母的一个优选的载体是US 4,931,373中 公开的POT1载体。编码本发明的酶的DNA序列可以在信号序列和可有可无 的前导序列之前，例如如以上所述的。合适的酵母细胞的例子是克鲁维酵 母属(如乳酸克鲁维酵母)、汉逊酵母属(例如多形汉逊酵母)或毕赤酵母属 (如巴斯德毕赤酵母)的菌株(参见Gleeson等，遗传微生物学杂志132 1986，pp.34593465；US 4,882,279)。

其它真菌细胞的例子是丝状真菌的细胞，例如Aspergillus spp.， Neurospora spp.，Fusarium spp.或Trichoderma spp.，尤其是米曲霉， 构巢曲霉，黑曲霉或禾谷镰孢的菌株。EP 272277和EP 230023中描述 了Aspergillus spp.用于表达蛋白质的用途。尖镰孢的转化可以例如按照 Malardier等，1989，基因78：147-156的描述进行。

当丝状真菌用作宿主细胞时，其可以用本发明的构建体转化，通常是将 所说DNA构建体整合进宿主染色体中以获得重组体宿主细胞。这一整合一 般被认为是有利的，因为所述DNA构建体很可能稳定保持在细胞中。可以 按照常规方法(如同源或者异源重组)将所述DNA构建体整合进染色体中。

然后在可以表达所说酶的条件下在合适的营养培养基中培养以上描述 的转化或转染宿主细胞，接着从培养物中回收所形成的酶。

用于培养所说细胞的培养基可以是任何常规的适于培养所说宿主细胞 的培养基，例如含有适当补充物的最小或复合培养基。合适的培养基可以 从供应商获得或者可以按照出版的(例如美国典型培养物保藏中心目录中) 配方制备。然后，由所述细胞产生的酶可以用常规方法从培养基回收，所 述方法包括经离心和过滤从培养基分离宿主细胞，借助盐(如硫酸铵)沉淀 上层清液或滤液中的蛋白质组份，依据所述酶的类型，用各种色谱分离方 法(如离子交换色谱，凝胶色谱，亲合色谱)纯化等。

另一方面，本发明涉及产生按照本发明的酶的方法，其中在可以产生所 述酶的条件下培养合适的用编码酶的DNA序列转化的宿主细胞，并从培养 物中回收所形成的酶。 用分类学和生态学进行的酶筛选

设计来检测和选择所说类型的兴趣酶的象分子筛选之类的强有力的工 具其自身仍不能满足需要。为了使兴趣发现的机会最大，在这一研究中将 分子筛选方法与小心选择待筛选的真菌组合。通过全面考虑真菌的鉴别 法、分类学类别和种系发生关系进行选择。

如果包括生态学方法，则可以仅进一步地充分探讨溶纤酶产生的分类学 热点。设计聪明的筛选和取得成功的选择菌株和待研究的生态小生境需要 适应各种底物的全面的知识(尤其植物材料的腐生、神经营养或活体营养降 解)。

本文所公开的分类学和生态学方法两者的目标都是在分子筛选程序中 最多地发现所述酶。然而，仍然有几百(或者如果包括了所有初期工作)几 千种真菌被培养，以便检测本文报道的所说类型的溶纤酶的53个目标。

可以按以下所述进行筛选和克隆：

材料和方法

生物体列表：

啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081或大肠杆 菌DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571、DSM 10576分别含有质粒，该 质粒包含在穿梭载体pYES 2.0中的编码本发明的内切葡聚糖酶的全长DNA 序列。

大肠杆菌DSM 10583、10584、10585、10586、10587和10588。

棉色二孢Cooke

菌株的保藏：保藏号CBS 274.96

分类位置：子囊菌门(Ascomycota)，腔菌纲，座囊菌目，葫芦霉科

Ulospora bilgramii(Hawksw等)Hawksw等

菌株的保藏号：NKBC 1444，日本大学，(Prof.Tubaki保藏中心)

分类位置：子囊菌门，腔菌纲，座囊菌目，(科未分类)

Microsphaeropsis sp.

分离自：在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科， Guttiferales)

分类位置：子囊菌门，腔菌纲腔菌纲，座囊菌目，(科未分类)

Macrophomina phaseolina(Tassi)Goidannich

别名：Rhizoctonia bataticola

菌株的保藏：保藏号CBS 281.96

分离自在泰国生长的Glycine max(Leguminosa)cv CMM 60的种子，1990

分类位置：子囊菌门，盘菌纲，斑痣盘菌目，斑痣盘菌科

Rscobolus stictoideus Speg.

分离自挪威，Svalbard，鹅粪

分类位置：子囊菌门，盘菌纲，盘菌目，粪盘菌科

Saccobolus dilutellus (Fuck.)Sacc.

菌株的保藏：保藏号CBS 275.96

分类位置：子囊菌门，盘菌纲，盘菌目，粪盘菌科

疣孢青霉Peyronel

物种的保藏号：ATCC 62396

分类位置：子囊菌门，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科

产黄青霉Thom

菌株的保藏号：ATCC 9480

分类位置：子囊菌门，不整囊菌纲，散囊菌目，发菌科

Thermomyces verrucosus Pugh等

菌株的保藏：保藏号CBS 285.96

分类位置：子囊菌门，不整囊菌纲，散囊菌目，(科未分类； affiliation基于18S RNA，测序以及同源性)

鹿角团炭角菌L.ex Greille

菌株的保藏：保藏号CBS 284.96

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科

点孔座壳(Fr.ex L.)Fr.

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科

Nodulisporum sp.

分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科， Guttiferales)

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，炭角菌目，炭角菌科

Cylindrocarpon sp. 分离自海上样品，Bahamas 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，(科未分类) Acremonium sp 菌株的保藏：保藏号CBS 478.94 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 蛇形镰孢Sherbakoff 菌株的保藏号：IFO 4467 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 早熟禾镰孢(Peck)Wr. 物种的保藏号： ATCC 60883 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 腐皮镰孢(Mart.)Sacc.emnd.Snyd & Hans. 菌株的保藏号：IMI 107.511 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 番茄尖镰孢ssp lycopersici(Sacc.) Snyd.& Hans. 菌株的保藏号：CBS 645.78 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 尖镰孢ssp passiflora 菌株的保藏号：CBS 744.79 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 链孢粘帚霉Gillman & Abbott 菌株的保藏号：CBS 227.48 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，肉座菌科 Nectria pinea Dingley 菌株的保藏：保藏号CBS 279.96 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，小赤壳科 Volutella colletotrichoides 菌株的保藏号：CBS 400.58 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，肉座菌目，(科未分类) 大孢粪壳Auerswald 物种的保藏号：ATCC 60255 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，粪壳科 粪生粪壳(Roberge)Cesati et De Notaris 物种的保藏号：ATCC 52644 分离自H.Dissing的粪，ISP，KU，丹麦 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，粪壳科 灰腐质霉Traeen 物种的保藏号：ATCC 22726 来源：Hatfield Polytechnic 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，(科未分类) 黑腐质霉Omvik 菌株的保藏号：CBS 819.73 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，(科未分类) Scytalidium thermophilum(Cooney et Emerson)Austwick 菌株的保藏号：ATCC 28085 分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，(科未分类)

Thielavia thermophila Fergus et Sinden(别名Corynascus thermophilus)

菌株的保藏号：CBS 174.70，IMI 145.136

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

分离自蘑菇堆肥

Thielavia terrestris(Appinis)Malloch et Cain

菌株的保藏号：NRRL8126

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

Cladorrhinum foecundissimum Saccardo et Marchal

物种的保藏号：ATCC 62373

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛球壳科

分离自牙买加达拉斯山Selandin sp(Compositaceae，Asterales)的叶 片

Syspastospora boninensis

菌株的保藏号：NKBC 1515(日本大学，profe Tubaki保藏中心)

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，Cerastomataceae

管毛壳Fuckel

菌株的保藏号：CBS 799.83 

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

巴西毛壳Batista et Potual

菌株的保藏号：CBS 122.65

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

墙毛壳Corda

菌株的保藏号：CBS 163.52 

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

Chaetomium virescens (von Arx)Udagawa

菌株的保藏号：CBS 547.75

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

Myceliophthora thermophila(Apinis)Oorschot

菌株的保藏：保藏号CBS 117.65

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，粪壳目，毛壳科

Nigrospora sp

菌株的保藏：保藏号CBS 272.96

分离自在牙买加Christiana中生长的Artocarpus altilis的叶片， Moraceae，Urticales

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，Trichosphaeriales，(科未 分类)

Nigrospora sp

分离自云南昆明植物园的Pinus yuannanensis的叶片

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，假毛球壳目，Abietaceae， Pinales.

Diaporthe syngenesia

菌株的保藏：保藏号CBS 278.96

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，Diaporthales，黑腐皮壳科

葫芦科刺盘孢(Passerini)Ellis et Halsted别名围小丛壳orbiculare 变种Jenkins et Winstead

物种的保藏号：ATCC 52609

分类位置：子囊菌门，Pyrenomycetes，黑痣菌目

黑胶耳Fr.

菌株的保藏：保藏号CBS 277.96

分类位置：担子菌门，层菌纲，木耳目，黑耳科

Crinipellis scabella (ALb.Schw.：Fr.)Murr

菌株的保藏号：CBS 280.96

分类位置：担子菌门，层菌纲，蘑菇目

网纹斑褶菇(Fr.)Gill.

菌株的保藏号：CBS 275.47

分类位置： 担子菌门，层菌纲，蘑菇目，鬼伞科

木蹄层孔菌(L.)Fr.

菌株的保藏：保藏号CBS 276.96

分类位置：担子菌门，层菌纲，非褶菌目，Fomitaceae

Spongipellis sp.

菌株的保藏：保藏号CBS 283.96

分类位置：担子菌门，层菌纲，非褶菌目，烟管菌科(由18S序列和同 源性分类学鉴别和相联系)

血红栓菌(Fr.)Lloyd别名：血红多孔菌；血红密孔菌(L.：Fr.)

菌株的保藏号：AKU 5062(京都大学培养物保藏中心)

分类位置：担子菌门，非褶菌目，多孔菌科

Schizophyllum commune Fr.

物种的保藏号：ATCC 38548

分类位置：担子菌门，非褶菌目，裂褶菌科

红根囊壶菌(de Bary & Wor)Fischer

菌株的保藏号：CBS 282.96

分类位置：壶菌门，壶菌纲，Spizellomycetales， Spizellomycetaceae

Rhizomucor pusillus(Lindt)Schipper别名：微小毛霉

菌株的保藏号：IFO 4578

物种的保藏号：ATCC 46883

分类位置：接合菌门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科

闪光须霉(Kunze)vanTieghem & Le Monnier

菌株的保藏号：IFO 4814

物种的保藏号：ATCC 16327

分类位置：接合菌门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科

弗雷生刺枝霉vanTieghem & Le Monnier别名.Helicostylum fresenii

菌株的保藏号：NRRL 2305

分类位置：接合菌门，接合菌纲，毛霉目，rhamnidiaceae

未分类的：

粉红单端孢

菌株的保藏号：IFO 5372

Coniothecium sp

植物内寄生菌，分离自在中国云南省昆明的未鉴别的高等植物的叶片

未分类和未鉴别的：

菌株的保藏：保藏号CBS 271.96

分离自牙买加Christiana生长Artocarpus altilis(桑科，Urticales) 的叶片

菌株的保藏：保藏号CBS 273.96

分离自牙买加达拉斯山生长的Pimenta dioica(桃金娘科，Myrtales) 的叶片

菌株的保藏号：CBS 270.96

分离自牙买加达拉斯山生长的Pseudocalymma alliaceum(紫葳科， Solanales)叶片

其它菌株：

大肠杆菌MC1061和DH10B。

酵母菌株：所使用的啤酒糖酵母菌株是W3124(MATα；ura 3-52；leu 2-3，112；his 3-D200；pep 4-1137；prcl：：HIS3；prb1：：LEU2； cir+)。

质粒：

曲霉属表达载体pHD414是质粒p775(在EP 238023中描述)的衍生物。 pHD414的构建在WO 93/11249中有进一步的描述。

pYES 2.0(Invitrogen)。

pA2C477，pA2C193，pA2C357，pA2C371，pA2C385，pA2C475， pA2C488，pA2C502(参见实施例1、2、3和4)。 分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序 列的分离：

通过用本领域已知的方法(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手 册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)经抽提质粒，可以分别从保藏的生物体 啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081、大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576获得全长DNA序列， 这些全长DNA序列包含分别在SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12、16 或19中所示的编码本发明的内切葡聚糖酶的cDNA序列。 分子筛选本发明的纤维素酶的PCR引物：

四个简并的含脱氧肌苷的寡核苷酸引物(有义；s和反义；as1、as2 和as3)相应于四个高度保守氨基酸区，这些区在Thielavia terrestris纤 维素酶、Myceliophthora thermophilum纤维素酶和两种来源于 Acremonium sp.的纤维素酶的推定的氨基酸序列中发现，按照 Myceliophthora thermophilum序列对残基编号。在引物序列中脱氧肌苷 由I表示，限制位点上有下划线。

             27                                        35

       NH2 -Thr  Arg  Tyr  Trp  Asp  Cys  Cys  Lys  Pro/Thr-COOH s 5′-CCCCAAGCTT ACI  AGI  TAC  TGG  GAC  TGC  TGC  AAA  AC-3′

       HindIII    C      T         T    T    T    G  C

               106                     111

       NH2   -Trp Cys  Cys  Ala  Cys  Tyr-COOH

       asl 3′-CC  ACA  ACA  CGI  ACA  AT  AGATCTGATC-5′

                     G    G         G       XbaI

             145               152

      NH2  -Pro  Gly  Gly  Gly  Leu/Val  Gly  Ile/Leu  Phe-COOH

      as23′-GGI  CCI  CCI  CCI  AAI      CCI  AAI      AA  AGATCTGATC-5′

                                 C             G            XbaI

                                 G             T

             193                       198

      NH2  -Trp Arg  Phe/Tyr  Asp  Trp  Phe-COOH

      as33′-CC  GCI  AAA      CTA  ACC  AAA AGATCTGATC-5′ 

                 T     TG        G         G  XbaI 经聚合酶链反应(PCR)进行分子筛选： 基因组DNA和双链cDNA的体外扩增

按照以下描述从5微克poly(A)+RNA定向合成双链cDNA。按照Yelton等 的描述分离基因组DNA。

在PCR缓冲液中经PCR扩增约10至20ng双链纤维素酶-诱导的cDNA 或100至200ng选择的真菌菌株的基因组DNA，所说缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01％(w/v)明胶)包含200μM 各dNTP和100 pmol按以下组合的各简并引物： 1) 有义， 5′-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/ CC-3’ 反义1， 5’-CTAGTCTAGATAA/GCAIGCA/GCAA/GCACC-3’；或 2) 有义， 5’-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’ 反义2， CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/CICCICCICCIGG-3’；或 3) 有义， 5’-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC/TAAA/GA/CC-3’ 反义3， 5’-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICC/TCC-3；

一种DNA热循环仪(Landgraf，德国)和2.5单位Taq聚合酶(Perkin- Elmer，Cetus，US)。采用以下循环方式进行PCR的三十个循环：在94℃ 变性1分钟，64℃退火2分钟，72℃延伸3分钟。以HaeIII-消化的φX174 RF DNA为大小标记，通过在3％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)中的电泳分析 扩增产物的10微升等分试样。     PCR产物的直接测序

按照制造商的说明使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，US)纯化 PCR产物的80微升等分试样。经双脱氧链-终止方法，使用50-150ng模 板，Taq尾端脱氧循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，USA)，荧光标记的终 止剂，和5 pmol有义引物：5′-CCCCAAGCTTACIA/CGITAC/TTGGGAC/TTGC/TTGC /TAAA/GA/CC-3′直接在纯化的PCR产物上测定扩增的PCR片段的核苷酸序 列。按照Devereux等的描述对序列数据进行分析。 经聚合酶链反应(PCR)克隆：PCR片段的亚克隆

将如以上所述所产生的PCR产物25微升等分试样在0.8％低胶凝温度 琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶上进行电泳，从凝胶上切下相关的片 段。通过添加0.1体积10×琼脂糖酶缓冲液(New England Biolabs)和2单 位/100微升熔化的琼脂糖到样品中，接着在45℃温育1.5小时，经琼脂糖 酶处理回收。用酚和三氯甲烷抽提样品，经添加2体积96％EtOH和0.1体 积3M NaAc(pH5.2)沉淀。经离心回收PCR片段，在70％EtOH中洗涤，干 燥和再悬浮于20微升限制酶缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，50 mM NaCl，1mM DTT)中。以HindIII和XbaI消化片段，用酚和三氯甲烷提 取，经2体积96％EtOH和2体积NaAc(pH 5.2)沉淀回收，并亚克隆进 HindIII/XbaI-切割的pYES 2.0载体中。

筛选cDNA文库和阳性克隆的特征确定。以相应的随机引导的(Feinberg 和Vogelstein)32P-标记的(＞1×10cpm/微克)PCR产物作为探针，经菌落杂 交(Sambrook，1989)筛选按以下所说构建的啤酒糖酵母和大肠杆菌的cDNA 文库。于65℃在2×SSC(Sambrook，1989)、5×Denhardt′s溶液(Sambrook， 1989)、0.5％(w/v)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA中进行杂交20小时， 接着于25℃在5×SSC(2×15分钟)中、于65℃在2×SSC、0.5％SDS(30 分钟)中、于65℃在0.2×SSC、0.5％SDS(30分钟)，最后于25℃在5 ×SSC(2×15分钟)中洗涤。采用以下方法确定阳性cDNA克隆的特征，所 述方法是用pYES 2.0多接头引物(Invitrogen，USA)测序cDNA插入物的 末端，用双脱氧链终止法(Sanger等)采用荧光标记的终止剂测定两条链的 最长cDNA的核苷酸序列。按照制造商的说明，采用应用生物系统373A自 动测序仪，用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer USA)和pYES 2.0 多接头引物(Invitrogen，USA)或合成寡核苷酸引物测序Qiagen纯化的质 粒DNA(Qiagen USA)。按照Devereux等描述的方法进行序列数据分析。

用硫氰酸胍进行总RNA的抽提，接着经5.7 M CsCl垫层超离心法，采 用WO 94/14953中描述的方法经寡(dT)-纤维素亲合色谱法进行poly(A)+RNA 的分离。

cDNA合成：采用RNase H方法(Gubler和Hoffman(1983)基因25： 263-269，Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室， 冷泉港，NY)用F.S.Hagen(pers.comm.)开发的发夹修饰从5微克 poly(A)+RNA合成双链cDNA。在预硅烷化的无核糖核酸酶的Eppendorph试 管中于70℃加热poly(A)+RNA(在5μl DEPC处理的水中的5μg)8分钟，在 冰上骤冷，添加逆转录酶缓冲液至终体积50微升，所述逆转录酶缓冲液(50 mM Tris-Cl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2，10mM DTT，Bethesda研 究实验室)包含1mM dATP、dGTP和dTTP；0.5mM 5′-甲基- dCTP(Pharmacia)；40单位人类胎盘核糖核酸酶抑制剂(RNasin， Promega)；1.45微克oligo(dT)18-Not I引物(Pharmacia)以及1000单位 SuperScript II核糖核酸酶H逆转录酶(Bethesda研究实验室)。通过在45 ℃温育反应混合物1小时合成第一链cDNA。在合成之后，将mRNA：cDNA 杂交混合物按照制造者的说明经MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)旋转柱凝 胶过滤。

在凝胶过滤之后，将杂交体用第二链缓冲液稀释，所述缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、0.16 mM(NAD+)包含200μM各种dNTP、60单位大肠杆菌DNA聚合酶 I(Pharmacia)、5.25单位核糖核酸酶H(Promega)和15单位大肠杆菌DNA 连接酶(Boehringer曼海姆)。通过在16℃下温育反应试管2小时和在25 ℃下温育15分钟进行第二链cDNA合成。由添加乙二胺四乙酸至最终浓度 20mM终止反应，其后用酚和三氯甲烷抽提。

Mung大豆核酸酶处理：通过于-20℃下添加2体积的96％EtOH、0.2 体积的10M NH4Ac沉淀双链cDNA 12小时，离心回收，用70％EtOH洗涤， 干燥并再悬浮于30微升Mung大豆核酸酶缓冲液中，该缓冲液(30mM NaAc(pH4.6)、300mM NaCl，1mM ZnSO4，0.35mM DTT，2％甘油)包含25单 位Mung大豆核酸酶(Pharmacia)。通过在30℃温育反应物30分钟，接着 添加70微升10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM乙二胺四乙酸，苯酚抽提以及在 冰上用2体积96％乙醇和0.1体积3M NaAc(pH 5.2)沉淀来剪切单链发夹 DNA。用T4 DNA聚合酶钝化末端：离心回收双链cDNA，在30微升含0.5mM 各种dNTP和5单位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)的T4 DNA聚 合酶缓冲液中16℃温育1小时，使末端钝化。加入EDTA至终浓度20mM， 然后用苯酚和氯仿提取，加入2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2) 于-20℃沉淀12小时。

衔接子连接，Not I消化和大小选择：在填充反应完成后，经离心回收 cDNA，用70％EtOH洗涤并干燥。将cDNA沉淀重悬于25微升连接缓冲液 中，所述缓冲液(30mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)包含2.5微克非回文BstXI衔接子(Invitrogen)和30单位T4连接酶 (Promega)，在16℃温育12小时。通过在65℃加热20分钟然后在冰上冷 却终止反应。连接的cDNA用Not I限制酶消化，其是通过添加20微升水， 5微升10×Not I限制酶缓冲液(New England Biolabs)和50单位Not I(New England Biolabs)，接着在37℃温育2.5小时进行的。65℃加热10分钟 终止反应。经凝胶电泳在1×TBE中的0.8％SeaPlaque GTP低熔化温度琼 脂糖凝胶(FMC)上大小分级分离cDNA，以分离未连接的衔接子和小的 cDNA。按照制造者的说明，由切下0.7 kb并用β-琼脂糖酶(New England Biolabs)从凝胶救援出，并且于-20℃添加2体积96％EtOH和0.1体积3M NaAc(pH5.2)沉淀12小时来进行cDNA的大小选择。

文库的构建：通过离心回收定向的、选择了大小的cDNA，在70％EtOH中洗涤，干燥并悬浮在30μl的10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA中。按 照制造厂商的说明通过MicroSpin S-300 HR(Pharmacia)旋转柱进行凝胶过 滤使cDNA脱盐。在10μl包含5μl双链cDNA(反应试管#1和#2)、15单位 的T4连接酶(Promega)以及30ng(试管#1)、40ng(试管#2)和40ng(试管 #3，载体背景对照)的BstXI-NotI裂解的pYES 2.0载体的连接缓冲液(30mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中进行三种试验 连接。通过在16℃下温育12小时、在70℃下加热20分钟、然后向每个 试管添加10μl的水进行连接反应。如上所述把1μl的每种连接混合物电穿 孔进40μl电感受态的(electrocompetent)大肠杆菌DH10B细胞(Bethesda 研究实验室)中(Sambrook等，(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验 室，冷泉港，NY)。使用最优条件在包含库的大肠杆菌中建立文库。各库通 过在LB+氨苄青霉属素琼脂平板涂布转化的大肠杆菌并在37℃下培养24小 时产生15000-30000克隆/平板制作。把20ml LB+氨苄青霉素添加到平板上 并悬浮细胞。使细胞悬浮液于37℃下在50ml试管中振荡1小时。使用 QIAGEN质粒试剂盒按照按照制造厂商的说明从细胞分离质粒DNA并在-20 ℃下保存。

把得自各个库的1μl纯化质粒DNA(100ng/μl)的等分试样通过电穿孔转 化进啤酒糖酵母W3124中(Becker和Guarante(1991)酶学方法，194： 182-187)，把转化体平板接种于包含2％葡萄糖的SC琼脂上并在30℃下培 养。

阳性菌落的鉴别：在生长3-5天之后，把琼脂平板复制接种于一组包含 0.1％AZCL HE纤维素的SC+半乳糖-尿嘧啶琼脂平板上。将这些平板在30 ℃下培养3-7天。内切葡聚糖酶阳性菌落鉴定为蓝环围绕的菌落。

为了在琼脂上分离单个菌落，涂布得自酶-阳性菌落的细胞，为了鉴别 产生内切葡聚糖酶的菌落，选择产生酶的单个菌落。

阳性克隆的鉴定：阳性克隆作为单个菌落获得，使用生物素化的多接头 引物直接从酵母菌落扩增cDNA插入片段，通过磁性小珠(Dynabead M-280， Dynal)系统纯化，并通过使用链-末端方法(Sanger等(1977)美国科学院 学报，74：5463-5467)和Sequenase系统(美国生物化学)测定每个cDNA克 隆的5 ′-末端序列单个地确定其特征。

使用荧光标记的终止子通过双脱氧链终止方法(Sanger等)测定得自两 条链的最长cDNA的核苷酸序列。通过如下所述转化进大肠杆菌救援(rescue) 质粒DNA。使用Applied Biosystems 373A自动测序仪按照制造厂商的说 明用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer，US)和pYES 2.0多接头 引物(Invitrogen，USA)或合成的寡核苷酸引物测定Qiagen纯化的质粒 DNA(Qiagen，USA)的序列。序列数据的分析按照Devereux等进行。

在曲霉中表达的cDNA基因的分离：把产生内切葡聚糖酶的酵母菌落接 种于在50ml玻璃试管中的20ml YPD培养液中。试管在30℃下振荡2天。 通过在3000rpm下离心10分钟收获细胞。

按照WO 94/14953分离DNA并将其溶解在50μl水中。通过标准方法把 DNA转化进大肠杆菌。使用标准方法从大肠杆菌分离质粒DNA并通过限制酶 分析进行分析。使用适当的限制酶切除cDNA插入片段并连接进曲霉表达载 体中。

米曲霉或黑曲霉的转化

如WO 95/02043的16页，21行-17页，12行(本文一并参考)所述制 备原生质体。

把100μl的原生质体悬浮液和5-25μg在10μl STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mMCaCl2)中的适当DNA混合。将原生质体与 p3SR2(携带A.nidulans amdS基因的质粒)混合。混合物在室温下放置25 分钟。添加0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl2、10mM  Tris-HCl(pH 7.5)并小心地混合(两次)，最后添加0.85ml的相同溶液并小心地 混合。混合物在室温下放置25分钟，在2500g下旋转15分钟，把沉淀悬 浮在2ml的1.2M山梨醇中。在再次沉淀之后把原生质体涂布在最小的包含 1.0M蔗糖(pH 7.0)，10mM乙酰胺作为氮源以及20mM CsCl以抑制背景生长 的平板上(Cove，生物化学学报，113(1966)51-56)。于37℃下培养4- 7天之后，选择孢子并涂布以形成单个菌落。重复该过程，保存第二次再分 离之后的单个菌落的孢子作为所定义的转化体。

米曲霉转化体的试验

把每个转化体接种在10ml的YPM中并繁殖。在于37℃下接种2-5天之 后，除去10ml的上清液。如上所述通过AZCL HE纤维素鉴别内切葡聚糖酶 活性。

用于评价本发明的DNA构建体的性质ii)的杂交条件：

测定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间的杂交的合适条件包括：在 5×SSC(标准柠檬酸盐)中预浸渍包含待杂交DNA片段或RNA的滤膜10分钟， 滤膜在5×SSC(Sambrook等1989)、5×Denhardt′s溶液(Sambrook等 1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的声处理的鲑精DNA(Sambrook等1989) 中预杂交，然后在包含随机引物的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B. (1983)生物化学年评，132：6-13)、32P-dCTP-标记的(比活 ＞1×109cpm/μg)的探针的相同溶液中于约45℃下杂交12小时。然后滤膜在 2×SSC、0.5％SDS中洗涤两次30分钟，温度优选地不高于50℃，更优选 地不高于55℃，更优选地是不高于60℃，更优选地是不高于70℃，尤其 是不高于75℃。用于杂交的核苷酸探针是对应于分别在SEQ ID NO：1、4、 6、8、10、12或16中所示的DNA序列和/或分别可以从在啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081，大肠杆菌DSM 10512、 DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的内切葡聚 糖酶编码部分的DNA序列。

免疫交叉反应：用于测定免疫交叉反应的抗体可以通过使用纯化的纤维 素酶制备。更具体地说，抗本发明的纤维素酶的抗血清可通过按照N. Axelsen在“定量免疫电泳手册”，Blackwell科学出版社，1973，23章 中或A.Johnstone和R.Thorpe，实践免疫化学，Blackwell科学出版社， 1982(更具体地说在27-31页)中描述的方法制备。纯化的免疫球蛋白可从 抗血清获得，如通过盐沉淀((NH4)2SO4)并进行渗析和离子交换色谱(如在 DEAE-Sephadex上)。蛋白质的免疫化学定性可通过Outcherlony双扩散分 析(O.Ouchteriony：试验免疫学手册(D.M.Weir，Ed.)，Blackwell科 学出版社，1967，655-706页)、交叉免疫电泳(N.Axelsen等，同上，第 3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)完成。

培养基

YPD：10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高压灭菌，添加 100ml 20％的葡萄糖(无菌过滤的)。

YPD：10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高压灭菌，添加 100ml 20％的麦芽糖糊精(无菌过滤的)。

10×碱盐(basel salt)：75g酵母氮碱(nitrogen base)，113g琥珀酸， 68g NaOH，加H2O至1000ml，无菌过滤。

SC-URA：100ml 10×碱盐，28ml无维生素的20％酪蛋氨基酸，10ml 1％ 的色氨酸，加H2O至900ml，高压灭菌，添加3.6ml 5％苏氨酸以及100ml 20％ 葡萄糖或20％半乳糖。

SC-URA琼脂：SC-URA，添加20g/l琼脂。

PD琼脂：39g马铃薯右旋糖琼脂，DIFCO 0013；添加去离子水至 1000ml；高压灭菌(121℃下15-20分钟)。

PC琼脂：马铃薯和胡萝卜(研磨，每种20g)，添加水至1000ml，煮沸1 小时；琼脂(20g/l Merck 1614)；高压灭菌(121℃下20分钟)。

PC液态培养基：如PC琼脂，但没有琼脂。

PD液态培养基：24g马铃薯右旋糖培养液，Difco 0549，添加去离子 水至1000ml；高压灭菌(121℃下15-20分钟)。

具有纤维素的PC和PD液态培养基：每1000ml添加30g Solcafloc (Dicacel可从Dicalite-Europe-Nord，9000Gent，比利时获得)。

PB-9液态培养基:把12g Rofec(Roquette 101-0441)和24g葡萄糖添 加至1000ml水中；把pH值调整到5.5；每1000ml添加5ml矿物油和5g CaCO3。高压灭菌(121℃下40分钟)。

YPG液态培养基：4g酵母提取物(Difco 0127)，1g KH2PO4(Merck4873)，0.5g MgSO4·7H2O Merck 5886，15g右旋糖，Roquette 101-0441，0.1 ml Pluronic(101-3088)；添加去离子水至1000ml；高压 灭菌(121℃下20分钟)

稀释盐溶液(DS)：制备两种母液：

P-母液：13.61g KH2PO4；13.21g(NH4)2PO4，17.42g KH2PO4；添加去离 子水至100ml。

Ca/Mg母液：7.35g GaGl2·2H2O，10.17g MgCl2·6H2O，添加去离子水至 100ml；把pH值调整至7.0；高压灭菌(121℃；20分钟)

把0.5mlP-母液和0.1ml Ca/Mg母液混合

添加去离子水至1000ml

AZCL HE纤维素(Megazyme，澳大利亚)。

用途

在洗涤和穿着过程中，染色的织物或衣物的染料通常渗色，从而使衣物 看起来已褪色和穿旧。从织物表面除去纤维将部分地恢复织物初始的颜色 和外观。本文所使用的术语“颜色澄清”是指通过多次洗涤循环织物或衣 物的初始颜色部分地恢复。

术语“除去丸状物”指从织物表面除去丸状物。

术语“浸泡液体”指这样的一种含水的液体，要洗的衣物在进行常规洗 涤过程前要浸泡在其中。浸泡液体可包含一种或多种通常用于洗涤或洗涤 方法的组分。

术语“洗液”指这样的一种含水的液体，在其中要洗的衣物进行洗涤过 程，即通常是一种手工或在洗衣机中的化学或机械结合的作用。通常，洗 液是粉剂或液体洗涤剂组合物的水溶液。

术语“冲洗液体”指这样的一种含水的液体，为了冲洗要洗的衣物，即 实质上从要洗的衣物中除去洗涤剂溶液，在其中浸泡并处理要洗的衣物， 通常是在洗涤过程之后立即进行。冲洗液体可包含织物条理或软化组合 物。

按照本发明的方法要洗的衣物可以是常规的可洗的衣物。优选地，要洗 的衣物的主要部分是缝合或未缝合的织物，包括从棉制造的编织物 (knits)、编织物(wovens)、斜纹粗棉布、纱线和毛巾、棉混纺物或天然或 人造纤维素(如制自包含木聚糖的纤维素织物，如制自木浆)或其混合物。 混合物的例子是具有一种或多种辅助材料的棉或人造纤维/纤维胶(如羊 毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚 氯乙烯纤维、聚偏二氯乙烯纤维、聚氨甲酸乙酯纤维、聚脲纤维、aramid 纤维)以及包含纤维素的纤维(如人造纤维/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、 黄麻、乙酸纤维素纤维、lyocell)。 洗涤剂组合物

按照本发明的一个方面，本发明的内切葡聚糖酶可典型地是洗涤剂组合 物的组分。同样地，它们可以以非尘状粒剂、稳定液体或受保护的酶形式 包括在洗涤剂组合物中。非尘状粒剂可按照，如在US 4,106,991和 4,661,452所(二者都属于Novo Industri A/S)公开的方法产生并可有可无 地按照本领域的方法包衣。蜡状的表面盖覆剂的例子是平均分子量为1000 至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷 单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇(其中醇包含12至20个碳原 子，具有15至80个环氧乙烷单位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油单、 双和三酸酯。在专利GB 1483591中给出了通过流化床技术制成的适于应用 的形成薄片的表面盖覆剂的例子。如液态酶制剂可按照已制定的方法通过 添加多羟基化合物(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸)稳定。其它酶稳定 剂在本领域中是已知的。受保护的酶按照在EP 238,216中公开的方法制 备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，如粉剂、粒剂、糊剂或 液体。液体洗涤剂可是水溶液，典型地包含多达70％的水和0-30％的有机溶 剂，或非水溶液。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，每种活化剂可以是阴离子、 非离子、阳离子或两性离子的。洗涤剂通常包含0-50％阴离子表面活性剂， 如线性烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸 酯)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲烷烃磺酸盐(SAS)、α-硫 代脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。它可以包含0-40％的非离子表面 活性剂，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的脂肪醇乙氧基化物、壬 基酚乙氧基化物、烷基聚苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸单乙 醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或聚羟烷脂肪酸酰胺(如如在WO 92/06154中所 描述的)。

洗涤剂组合物还可包含一种或多种其它酶，如淀粉酶、脂酶、角质酶、 蛋白酶、过氧化物酶和氧化酶，如漆酶。

洗涤剂可包含1-65％洗涤剂助洗剂或配位剂，如沸石、二磷酸盐、三磷 酸盐、膦酸酯、柠檬酸盐、次氨基三乙酸(NTA)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二 乙三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层硅酸盐(如 得自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可无助洗剂，即实质上不含洗涤剂助洗 剂。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯 吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙 烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可包含漂白系统，该系统包含H2O2源，如与形成过酸的漂白活化 剂(如四乙基乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸盐(NOBS))结合的过硼酸盐或过 碳酸盐。另外，漂白系统可包含过酸，如酰胺、酰亚胺或砜型。

本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规的稳定剂稳定，如多羟基化合 物(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸 酯，组合物可按照在如WO 92/19708和WO 92/19709中所述制成制剂。

洗涤剂也可包含其它常规的洗涤剂组份，如织物调理剂，包括粘土、泡 沫辅助剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀 菌剂、荧光增白剂或香料。

pH(于使用浓度下在水溶液中测量)通常是中性或碱性的，如在7-11的 范围内。

在本发明的范围之内洗涤剂组合物的具体形式包括：

1)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组合 物包含     线性烷基苯磺酸盐(按酸计)        7-12％   乙氧基脂肪醇硫酸酯(如C12-18醇，    1-2EO)或烷基硫酸盐(如C16-18)         1-4％   乙氧基脂肪醇(如C14-15醇，7EO)         5-9％        碳酸钠(计为Na2CO3)        14-20％   可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)         2-6％         沸石(计为NaAlSiO4)        15-22％         硫酸钠(计为Na2SO4)         0-6％        柠檬酸钠/柠檬酸(计为          C6H5Na3O7/C6H8O7)        0-15％      过硼酸钠(计为NaBO3·H2O)       11-18％                TAED         2-6％           羧甲基纤维素         0-2％  聚合物(如马来酸/丙烯酸的共聚物，              PVP，PEG)         0-3％      酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％  小组分(如抑泡剂，香料，光学增亮            剂，光漂白剂)         0-5％

2)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组合 物包含       线性烷基苯磺酸盐(以酸计)        6-11％  乙氧基脂肪醇硫酸酯(如(C12-18醇，1-      2EO)或烷基硫酸盐(如C16-18)        1-3％    乙氧基脂肪醇(如C14-15醇，7EO)        5-9％         碳酸钠(计为Na2CO3)       15-21％     可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)        1-4％          沸石(计为NaAlSiO4)        24-34％          硫酸钠(计为Na2SO4)        4-10％        柠檬酸钠/柠檬酸(计为          C6H5Na3O7/C6H8O7)        0-15％            羧甲基纤维素        0-2％   聚合物(如马来酸/丙烯酸的共聚物，             PVP，PEG)        1-6％       酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％        小组分(如抑泡剂，香料)         0-5％

3)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组合 物包含      线性烷基苯磺酸盐(以酸计)     5-9％   乙氧基脂肪醇(如C12-15醇，7EO)    7-14％      脂肪酸皂(如C16-22脂肪酸)     1-3％         碳酸钠(计为Na2CO3)    10-17％   可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)     3-9％        沸石(计为NaAlSiO4)    23-33％        硫酸钠(计为Na2SO4)     0-4％      过硼酸钠(计为NaBO3·H2O)    8-16％                TAED     2-8％          膦酸盐(如EDTMPA)     0-1％            羧甲基纤维素     0-2％   聚合物(如马来酸/丙烯酸的共聚物，               PVP，PEG)         0-3％      酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％  小组分(如抑泡剂，香料，光学增亮剂)         0-5％

4)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组合 物包含      线性烷基苯磺酸盐(以酸计)        8-12％   乙氧基脂肪醇(如C12-15醇，7EO)       10-25％        碳酸钠(计为Na2CO3)       14-22％   可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)         1-5％        沸石(计为NaAlSiO4)        25-35％        硫酸钠(计为Na2SO4)        0-10％           羧甲基纤维素         0-2％   聚合物(如马来酸/丙烯酸的共聚物，             PVP，PEG)         1-3％      酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％       小组分(如抑泡剂，香料)         0-5％

5)一种水溶液洗涤剂组合物，该组合物包含     线性烷基苯磺酸盐(以酸计)      15-21％  乙氧基脂肪醇(如C12-15醇，7EO或          C12-15醇，5EO)      12-18％        脂肪酸皂(如油酸)       3-13％        烯基琥珀酸(C12-14)       0-13％             氨基乙醇       8-18％              柠檬酸       2-8％              膦酸盐       0-3％        聚合物(如PVP，PEG)       0-3％          硼酸盐(计为B4O7)         0-2％               乙醇         0-3％              丙二醇        8-14％     酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％ 小组分(如分散剂，抑泡剂，香料，光             学增亮剂)         0-5％

6)一种含水结构化液体洗涤剂组合物，该洗涤剂包含：      线性烷基苯磺酸盐(以酸计)        15-21％   乙氧基脂肪醇(如C12-15醇，7EO或         C12-15醇，5EO)         3-9％          脂肪酸皂(如油酸)        3-10％         沸石(计为NaAlSiO4)        14-22％              柠檬酸钾        9-18％         硼酸盐(计为B4O7)        0-2％           羧甲基纤维素        0-2％         聚合物(如PVP，PEG)        0-3％  锚定聚合物，如甲基丙烯酸月桂酯/   丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1；MW                3800        0-3％                甘油        0-5％     酶(以纯化的酶蛋白质计算)      0.0001-0.1％ 小组分(如分散剂，抑泡剂，香料，光             学增亮剂)        0-5％

7)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组合 物包含         脂肪醇硫酸盐    5-10％   乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺    3-9％               脂肪酸皂         0-3％         碳酸钠(计为Na2CO3)        5-10％     可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)         1-4％         沸石(计为NaAlSiO4)       20-40％         硫酸钠(计为Na2SO4)        2-8％       过硼酸钠(计为NaBO3·H2O)        12-18％               TAED         2-7％    聚合物(如马来酸/丙烯酸的共聚物，                 PEG)         1-5％        酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％  小组分(如光学增亮剂，抑泡剂，香料)        0-5％

8)一种制成粒剂的洗涤剂组合物，该组合物包含      线性烷基苯磺酸盐(以酸计)        8-14％     乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺        5-11％             脂肪酸皂        0-3％        碳酸钠(计为Na2CO3)        4-10％    可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)        1-4％         沸石(计为NaAlSiO4)       30-50％        硫酸钠(计为Na2SO4)        3-11％      柠檬酸钠(计为C6H5Na3O7)        5-12％  聚合物(如马来酸/丙烯酸的共聚物，                PEG)         1-5％     酶(以纯化的酶蛋白质计算)      0.0001-0.1％       小组分(如抑泡剂，香料)         0-5％

9)一种制成粒剂的洗涤剂组合物，该组合物包含   线性烷基苯磺酸盐(以酸计)    6-12％       非离子表面活性剂         1-4％            脂肪酸皂         2-6％       碳酸钠(计为Na2CO3)        14-22％       沸石(计为NaAlSiO4)        18-32％       硫酸钠(计为Na2SO4)         5-20％     柠檬酸钠(计为C6H5Na3O7)         3-8％    过硼酸钠(计为NaBO3·H2O)         4-9％    漂白活化剂(如NOBS或TAED)         1-5％          羧甲基纤维素         0-2％     聚合物(如聚羧酸或PEG)         1-5％    酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％   小组分(如光学增亮剂，香料)         0-5％

10)一种液体洗涤剂组合物，该组合物包含        线性烷基苯磺酸盐(以酸计)        15-23％    乙氧基醇硫酸酯(如C12-15醇，2-3EO)         8-15％    乙氧基化醇(如C1-15醇，7EO或C12-15                 醇，5EO)         3-9％            脂肪酸皂(如月桂酸)        0-3％                 氨基乙醇        1-5％                 柠檬酸钠       5-10％          水溶助剂(如甲苯磺酸钠)        2-6％             硼酸盐(计为B4O7)        0-2％               羧甲基纤维素        0-1％                   乙醇        1-3％                  丙二醇        2-5％          酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％    小组分(如聚合物，分散剂，香料，光                学增亮剂)        0-5％

11)一种液体洗涤剂组合物，该组合物包含     线性烷基苯磺酸盐(以酸计)        20-32％   乙氧基化醇(如C12-15醇，7EO或          C12-15醇，5EO)        6-12％              氨基乙醇         2-6％              柠檬酸钠        8-14％          硼酸盐(计为B4O7)        1-3％  聚合物(如马来酸/丙烯酸聚合物，锚  定聚合物如甲基丙烯酸月桂酯/α-丙            烯酸共聚物)        0-3％                甘油        3-8％     酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％  小组分(如水溶助剂，分散剂，香料，            光学增亮剂)        0-5％

12)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组 合物包含 非离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐，烷 基硫酸盐，α-烯烃磺酸盐，α-硫代脂肪酸         甲基酯，烷磺酸盐，肥皂)        25-40％      非离子表面活性剂(乙氧基化醇)        1-10％          碳酸钠(计为Na2CO3)        8-25％     可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)        5-15％          硫酸钠(计为Na2SO4)        0-5％          沸石(计为NaAlSiO4)       15-28％       过硼酸钠(计为NaBO3·4H2O)       0-20％         漂白活化剂(TAED或NOBS)        0-5％       酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％     小组分(如香料，光学增亮剂)    0-5％

13)如在1)-12)中所述的洗涤剂制剂，其中线性烷基苯磺酸盐全部或部 分由(C12-C18)烷基硫酸盐取代。

14)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组 合物包含          (C12-C18)烷基硫酸盐         9-15％              乙氧基化醇         3-6％          聚羟烷基脂肪酸酰胺        1-5％          沸石(计为NaAlSiO4)       10-20％     层焦硅酸钾(如得自Hoechst的SK56)       10-20％           碳酸钠(计为Na2CO3)        3-12％     可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)        0-6％                柠檬酸钠        4-8％                过碳酸钠       13-22％                  TAED        3-8％         聚合物(如聚羧酸盐和PVP)        0-5％        酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％  小组分(如光学增亮剂，光漂白剂，香料，                 抑泡剂)        0-5％

15)一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组 合物包含       (C12-C18)烷基硫酸盐      4-8％            乙氧基化醇    11-15％                肥皂     1-4％          沸石MAP或沸石A     35-45％        碳酸钠(计为Na2CO3)     2-8％   可溶性硅酸盐(计为Na2O，2SiO2)     0-4％               过碳酸钠        13-22％                 TAED         1-8％             羧甲基纤维素         0-3％       聚合物(如聚羧酸盐和PVP)         0-3％       酶(以纯化的酶蛋白质计算)     0.0001-0.1％  小组分(如光学增亮剂，磷酸盐，香料)         0-3％

16)如在1)-15)中所述的洗涤剂制剂，该制剂包含作为另外的组分或作 为已经指出的漂白系统的替代物的稳定或胶囊化的过酸。

17)如在1)、3)、7)、9)和12)中所述的去垢组合物，其中所说的过 硼酸盐被过碳酸盐替代。

18)如在1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的去垢组合物，该 组合物还包含锰催化剂。锰催化剂可以是，例如在“用于低温漂白的有效 的锰催化剂”，自然369，1994，637-639中所描述的一种化合物。

19)制成非水溶液洗涤剂液体的去垢组合物，该组合物包含液态非离子 表面活性剂如线性的烷氧基化伯醇、助洗剂系统(如磷酸盐)、酶和碱。洗 涤剂也可以包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

内切葡聚糖酶可以以通常用于洗涤剂的浓度掺入。它包含在本发明的洗 衣组合物中，纤维素酶可以以对应于每升洗液中0.0001-10mg(以纯化的酶 蛋白质计算)的纤维素酶添加。

按照本发明的另一个方面，内切葡聚糖酶可典型地是织物调节剂或软化 组合物的组分。通常的软化组合物的例子在例如EP 0233910中公开。 纺织中的应用

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的内切葡聚糖酶在生物抛光过 程的用途。生物抛光是纱表面的特异性处理，这种处理改进了织物的手感 和外观的质量，而不失去织物可湿性。生物抛光最重要的作用可通过很少 起毛和形成丸状物、增加光彩/光泽、改进的织物手感、增加的耐用软度以 及改变的吸水能力表征。生物抛光通常发生在针织和编织的织物制造的湿 处理之中。湿处理包含如下步骤：脱浆、冲洗、漂白、洗涤、染色/印花和 涂饰。在每个这样的步骤期间，织物或多或少地进行机械作用。通常，在 针织和编织织物之后，织物进行到脱浆阶段，其后为冲洗阶段等。脱浆是 从织物除去浆糊的作用。在机械织机上编织之前，为了增加弯曲的纱线的 抗张强度，常常用浆糊淀粉或淀粉衍生物包被。在编织之后，浆糊包被物 在进一步处理织物之前必须除去以确保均匀和防洗效果。已知为了达到生 物抛光的效果，需要溶纤和机械作用的组合。还已知当用纤维素酶处理和 用软化剂的常规处理结合时可达到“超软化”。可以设想本发明的内切葡 聚糖酶用于纤维素织物的生物抛光是有优势的，如可达到更彻底的抛光。 生物抛光可通过应用例如在WO 93/20278中所描述的方法获得。 石洗

已知可通过在浮石存在下洗涤斜纹粗棉布或从这样的织物制造的牛仔 裤以提供所需的织物颜色的局部发亮或通过酶促处理织物(具体来说是用 溶纤酶)在染色的织物(具体来说是在斜纹粗棉布织物或牛仔裤中)上提供 “石洗的”外观(局部颜色磨损)。可以单独(如在US 4,832,864中所公开 的)或与比在传统的方法较少量的浮石一起或与珍珠岩一起(如在WO 95/09225中公开的)进行本发明的内切葡聚糖酶的处理。 纸浆和纸上的应用

在造纸纸浆工业中，本发明的内切葡聚糖酶有利地应用到如下方面：

-用于剥树皮：在机械转筒中剥树皮之前，用内切葡聚糖酶的预处理可 降解形成层，从而有利于节能。

-用于脱纤维：因为纤维素酶对内部纤维表面的水解作用，在精制或打 浆之前用内切葡聚糖酶处理含纤维素纤维的材料可导致能量消耗的减少。 使用内切葡聚糖酶与使用已知的酶相比可导致改进的节能，因为人们相 信：本发明的酶组合物具有更高的穿透纤维壁的能力。

-用于纤维改性，即纤维性质的改进，其中需要跨纤维壁的部分水解， 这需要更深的穿透酶(如为了使粗糙的纤维更柔韧)。迄今为止，纤维的深 度处理对高产量的纸浆(如机械纸浆或再循环纸浆的混合物)是不可能的。 这归结于纤维壁结构的性质(因为纤维壁的孔基质的物理限制，该性质阻止 酶分子的通过)。设想本发明的内切葡聚糖酶能渗入纤维壁。

-排水改进。造纸纸浆的排水能力可通过用水解酶(如纤维素酶)处理纸 浆得到改进。木素纤维素纸浆的处理可按照例如在WO 91/14819、WO 91/14822、WO 92/18688和WO 92/17573中的描述进行。 植物材料的降解

在另一个实施方案中，本发明涉及按照本发明的内切葡聚糖酶和/或酶 制剂用于植物材料(如细胞壁)降解的用途。

本发明涉及为了增加产量在酒、水果或蔬菜汁中应用本发明新内切葡聚 糖酶和/或酶制剂。按照本发明的内切葡聚糖酶也可用于各种植物细胞衍生 的材料或废材料的酶促水解，如农业残余物，如麦秸杆、玉米穗轴、整株 玉米植物、核果壳、草、蔬菜壳、豆壳、谷壳、甜菜浆等。为了改进不同 种类的加工、促进其它组分的纯化或提取(如从谷物中纯化β-葡聚糖或β- 葡聚糖低聚物)、改进食物价值、减少水结合量、在废水植物中提高降解、 提高(如秣草保藏法的草和谷类的)转化等，可以降解植物材料。

下列实施例说明本发明。

实施例1

通过表达克隆检测了4种真菌的溶纤酶，这4种真菌属于子囊菌纲的两 个目之内的3个科；测定了相应的DNA序列；异源表达和通过液体发酵产 生的酶在颜色澄清测定中进行特征分析，表明其具有良好的性能。

使分离物CBS 117.65、CBS 478.94、NRRL 8126和ATCC 10523在振 荡烧瓶培养器中在富含纤维素的马铃薯右旋糖培养液中生长，在26℃下培 养5天(振荡条件，150rpm)。 A.Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris和Volutella colletotrichoides的内切葡聚糖酶的克隆和表 达

分别分离Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris和Volutella colletotrichoides的mRNA，这些生物体生长 在含有纤维素的发酵培养基(振荡培养基以确保充分换气)中。在生长3-5 天后收获菌丝，立即把菌丝在液氮中冷冻，并且储存在-80℃下。在所描述 的大肠杆菌中利用1％的载体背景分别构建Myceliophthora、thermophila Acremonium sp.，Thielavia terrestris和Volutella colletotrichoides的文库，每个文库中含有大约106个单个克隆。

把每一个文库的一些集合的质粒DNA转化到酵母中，从每一个集合中得 到了含有250-400个酵母菌落的50-100个平板。

利用AZCL HE纤维素测定法在SC-琼脂平板上鉴别和分离内切葡聚糖酶 -阳性菌落。从酵母菌落直接扩增cDNA插入物，并且利用以上材料和方法 部分中描述的方法进行性质分析。

SEQ ID NO：1显示了编码Myceliophthora thermophila的内切葡聚糖 酶的cDNA的DNA序列，SEQ ID NO：1也显示了相应氨基酸序列。从DSM 9770 的质粒中可以获得此cDNA。

编码Acremonium sp.的内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列于SEQ ID NO： 4中，相应氨基酸序列列于SEQ ID NO：5中。从DSM 10082的质粒中可以 获得此cDNA。

编码Thielavia terrestris的内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列于SEQ ID NO：8中，相应氨基酸序列列于SEQ ID NO：9中。从DSM 10081的质粒 中可以获得此cDNA。

编码Volutella colletotrichoides的内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序 列列于SEQ ID NO：16中，相应氨基酸序列列于SEQ ID NO：17中。从DSM 10571 的质粒中可以获得该cDNA。

从酵母菌落分离出总DNA，并且通过转化以上所述的大肠杆菌救援质粒 DNA。为了在米曲霉属中表达内切葡聚糖酶，用适当的限制性内切酶消化 DNA，在凝胶上进行片断分级分离，分别纯化与Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris和Volutella colletotrichoides内切葡聚糖酶基因相应的片段，其后把基因连接到用适 当的限制性内切酶消化的pHD414中，分别形成了质粒pA2C357、 pA2C193、pA2C385和pA2C488。

在大肠杆菌中扩增DNA之后，把质粒转化到以上所述的米曲霉中。 米曲霉转化体试验

如上所述试验每个转化体的内切葡聚糖酶的活性。一些转化体比米曲霉 背景具有更大的内切葡聚糖酶活性。这表明了在米曲霉中内切葡聚糖酶的 有效表达。利用YPM培养基在500ml摇瓶中选择和接种了具有最高的内切 葡聚糖酶活性的转化体。在发酵(为确保良好的通气进行充分的搅拌)3-5天 后，把培养液以2000g离心10分钟，并且回收上清液。 B.内切葡聚糖酶活性的测定

可以测定内切葡聚糖酶相当于分析标准物的溶纤活性，并且以单位S- CEVU表示。

溶纤酶水解CMC，因此减少了培养混合物的粘度。可以通过振动粘度计 (例如法国Sofraser，MIVI 3000)测定产生的粘度减弱。

可以按照AF 301.1分析方法进行以S-CEVU测量的溶纤活性的测定，这 种方法可以向本申请人索取。

通过测量样品的减少羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力，S-CEVU测定 方法量化了样品中的催化活性。测定在40℃、pH7.5的条件下进行，同时 利用了降低CMC底物粘度的相关的酶标准物。

利用磷酸饱和纤维素(PASC)以SAVI单位测定内切葡聚糖酶活性的测 定方法： 定义： 1 SAVI-U是形成一定量的还原碳水化合物(相当于每分钟1μmol的葡萄糖) 的酶量。 测定条件： 酶溶液：0.5ml 0.1M缓冲液中的4g/PASC：2.0ml 20分钟，40℃ 敏感性： 最大0.1SAVIU/ml＝大约1 S-CEVU/ml(CMC粘度) 最小0.01 SAVIU/ml＝大约0.1 S-CEVU/ml 还原糖形成的测定：

按照Lever，M.比色法测定碳水化合物的一种新反应(生物化学年报 1972.vol 47(273-279))进行还原基团的测定。通过把1.5克对羟苯甲 酸氢酸(PHBILH)和5克酒石酸钠在100ml的2％氢氧化钠中混合制备试剂混 合物。 底物：

利用冰冻丙酮和磷酸按照下面的方式制备PASC贮液。把5克纤维素 (Avicel)用水湿润，加入150ml 85％的冰冻正磷酸。把混合物放置在冰浴 中，缓慢搅拌1小时。然后加入100ml冰冻丙酮并且搅拌。把浆液转移到 带有烧结的3号pyrex盘的Buchner过滤器中，并且用冰冻丙酮洗涤三 次，每次洗涤之后尽可能吸干。最后把滤饼用500ml水洗涤两次，每次洗 涤之后尽可能吸干。把PASC与去离子水混合，使总体积达到300ml，均 匀混合(使用超Turrax均化器)，并且保存在冰箱中(达一个月)。

用缓冲液平衡底物：20克磷酸饱和的纤维素PASC贮液以5000rpm. 离心20分钟，倒出上清液；沉淀在30ml缓冲液中再悬浮并在5000rpm. 下离心20分钟。倒出上清液，将总共60克的沉淀以5克纤维素/升的浓度 悬浮在缓冲液中。 pH8.5的测定缓冲液：0.1M巴比妥。 pH10的测定缓冲液：0.1M甘氨酸。 方法：

1.酶样品的稀释

将酶溶液在与底物相同的缓冲液中稀释。

2.酶反应

将缓冲溶液中的底物在42℃下预热5分钟(2ml)。然后加入0.5ml酶溶 液(稀释至0.2-1S-CEVU/ml)，混合5秒钟。通过在酶溶液中添加终止试 剂获得酶空白。40℃下培养20分钟。通过加入0.5ml 2％NaOH溶液并混 合5秒钟终止反应。

将样品以5000rpm.离心20分钟。将1ml上清液与0.5ml PHBAH试剂 混合，并且煮沸10分钟。试管在冰水浴中冷却。

3.还原末端基团的确定

使用分光光度计在410nm测量吸收率。通过在加入酶溶液之前加入氢 氧化钠制备空白。利用在相同缓冲液中的5，10，15和25mg/l浓度的葡 萄糖和在煮沸之前加入PHBAH试剂获得葡萄糖标准曲线。利用标准曲线计 算释放的还原葡萄糖当量。

4.催化活性的计算

测量410nm的吸收率

1)标准曲线 (葡萄糖)-(H2O)对葡萄糖的浓度 2)酶样品 (样品)-(空白) 按照标准曲线计算葡萄糖浓度 活性(SAVIU/ml)： C.M.termophila的内切葡聚糖酶的纯化和性质分析

将pA2C193转化的米曲霉在YPM培养基上培养4天。然后将液体离心并 无菌过滤。

利用20kD阈值的DOW膜GR61PP通过在AMICON室中的超滤作用浓缩样 品。分析超滤浓缩物的S-CEVU/ml和SaviU/ml，得到下列结果：  Uf-浓缩物    S-CEVU/ml    SaviU/ml    9.25ml       570       41

纯化：

把2毫升UF-浓缩物稀释5倍，以降低其离子强度，并通过0.22μm圆 板过滤器过滤。将样品加入到用50 mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的 Mono Q HR/5 Pharmacia柱上，流速为1毫升/分钟。在用缓冲液A洗脱到 基线时，用含有1M NaCl(缓冲液B)的Tris/HCl缓冲液(pH7.5)洗脱，梯度 洗脱是在1小时之内缓冲液B从0-50％变化。

36分钟后，出现高峰复合物，收集每份1ml的流份，将最初的10个流 份在羧甲基纤维素/琼脂糖/刚果红的平板上显示纤维素酶活性。

合并这些流份，并利用20kD阈值的DOW膜GR61PP通过在AMICON室中 的超滤作用浓缩至3毫升。

将样品加入到用100mM Tris/HCl缓冲液(pH 6.35)平衡的HiLoad 2660 Superdex 75TM prep梯度Pharmacia柱上，流速为1毫升/分钟。

82分钟后，出现高峰，每份1ml收集流份，最初的10个流份在羧甲基 纤维素/琼脂糖/刚果红的平板上显示纤维素酶活性。

合并这些流份，得到的结果如下： A280＝0.15 A280/A260＝1.62 Mw(SDS)＝22 kD pI＝3.5-5 SDS-PAGE上的纯度＝100％ S-CEVU/ml＝28.5 S-CEVU/A280＝188 S-CEVU/mg＝436 消光系数＝54880(计算的) Mw(计算的)＝22 kD

消光系数是以由所附的SEQ ID NO：1(氨基酸序列)的序列计算的酪氨 酸、色氨酸和半胱氨酸的含量为基础。在NOVEX Pre-Cast凝胶4-20％Tris- 甘氨酸凝胶1.0mm×10孔上进行SDS-Page。

在Pharmacia PAG板(pH3.5-9.5)上进行IEF，由羧甲基纤维素-刚果红 覆盖显现出活性。

KM和Kcat的测定：

在pH 8.5和底物浓度多达8克/毫升的情况下，以与测定SAVI单位相 同的方式测定Km和Kcat。

得到下列结果：

Kcat为38/每秒，

Km为5g/l，

磷酸饱和纤维素，pH8.5。

在pH7.5时对羧甲基纤维素的比活性：每毫克蛋白质436 S-CEVU。 D.M.thermophila的内切葡聚糖酶的pH和温度分布图的确定

在下列条件下测定pH的分布图：    

通过把0.1MTri-磷酸钠与0.1M柠檬酸混合制备pH值在2.5-10.0之间 的缓冲液。稀释纯化的内切葡聚糖酶以便确保测定反应在测定的线性范围 内。底物是0.4％AZCL-HE-纤维素(MegaZyme)的悬液，其以1∶1和柠檬酸/ 磷酸盐缓冲液混合，使最终的底物浓度为0.2％AZCL-HE-纤维素。向 Eppendorf_1.5ml聚丙烯管中的1ml底物加入10μl酶溶液，并在 Eppendorf_控温热混合仪(Thermomixer)中培养15分钟，然后将酶在另一 热混合仪中95℃下热灭活20分钟。离心，并将200μl的各上清液转移到 96孔微量滴定板的各个孔中，通过ELISA读数仪(Labsystems Multiskan_ MCC/340)在620nm测量OD。最适pH的培养温度是30℃。对于每个pH值， 三个管中都加入了酶并在热灭活之前培养，而一个管(空白)加入酶并立即 热灭活。计算了三个培养样品的平均值，并减去空白值。

测定了下列pH下分布：     pH   相对活性     2.5    ＜10％      3    ＜10％     3.5     22％      4     87％     4.5     89％      5    100％      6     94％     6.5     86％      7     78％     7.5     73％      8     68％     8.5     54％      9     31％     10     18％

可以看出内切葡聚糖酶在pH4.0和8.0之间有60％以上的活性，最佳活 性在pH5.0-6.0

温度分布：

在pH5.5下以相同的方式确定最佳温度。温度范围从30℃到80℃。对 于每种温度，进行三个培养，并计算平均值。通过酶的即刻热灭活产生三 个空白，并从培养的样品值减去空白的平均值。 可以看出内切葡聚糖酶在50-70℃时具有最佳活性。   温度(℃)    30    40    50     60    70    80   相对活性   74％   77％   99％   100％   93％   62％

在pH5.5和30℃下，以相同的方式测定温度稳定性，并将所说的酶溶 液在此温度下预热1小时。下表显示没有预热的酶样品的百分活性：   温度(℃)    40    50    60    70    80   相对活性   95％   84％   92％   86％   24％ E.以毁丝霉属纤维素酶(SEQ ID NO.1)除去表面纤丝和从含有纤维素纤维 的织物中突出的纤维为指标测量其对颜色的净化

仪器：Terg-O-tometer

液体体积：100ml

搅拌：150次/分钟的垂直搅拌器

冲洗时间：自来水5分钟

洗涤温度：40℃

洗涤液体：0.05M磷酸盐缓冲液

pH：7.0

洗涤时间：30分钟

重复：2次

酶：毁丝霉属SEQ ID NO.1B

剂量：500和2500S-CEVU/l

织物：2块旧的黑色100％棉布样品，5×6cm(0.9克)

干燥：滚动干燥

评价：由Datacolor Elrepho反射分光光度计测量光反射(Remission)。 将反射值计算成ΔL(Hanter实验室值)。当纤维素酶除去表面纤丝和从纱中 突出的纤维时，黑色织物的表面看起来更黑，并得到更低的L值。

将所说的样品和对照样品(即没有酶洗涤的样品)比较：

没有纤维素酶    500 ECU/l    2500 ECU/l

      0.00        -1.41         -1.91

ΔL值和对照样品比较。

所得的数据显示在试验的条件下，没有CBD的毁丝霉属纤维素酶给出很 好的颜色澄清作用。 F.Myceliophthora thermophila的内切葡聚糖酶和Humicola insolens的 43kD内切葡聚糖酶的基因融合体的构建

这两种构建的目的在于制造M.thermophila的内切葡聚糖酶的衍生 物，这种衍生物具有接头和H.insolens(在WO 91/17243中公开)的43kD 内切葡聚糖酶的CBD。M.thermophila的天然内切葡聚糖酶没有接头和/ 或纤维素结合域(CBD)。

CM1：构建体1由M.thermophila的内切葡聚糖酶(225个氨基酸)和H. insolens的43kD内切葡聚糖酶的72个C-末端氨基酸组成。

CM2：构建体2由M.thermophila的内切葡聚糖酶(225个氨基酸)和H. insolens的43kD内切葡聚糖酶的83个C-末端氨基酸组成。

以从Taka-启动子转录内切葡聚糖酶基因的方法将H.insolens的43kD 内切葡聚糖酶cDNA克隆到pHD414中。形成的质粒命名为pCaHj418。

以相似的方法将M.thermophila的内切葡聚糖酶的cDNA克隆到pHD 414中，形成的质粒命名为pA2C193。 引物1：5′- CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGG -3′ 引物2：5′ CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGCTCCG -3′ 引物3：5′- CGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAACTTCCCTGCCG -3′ 引物4：5′- CGGCAGGGAAGTTGCCGTCGTCGTTACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGCTCCG -3′ Taka-pro.引物：5′CAACATCACATCAAGCTCTCC-3′ AMG-term.引物：5′CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3′

通过如Higuchi等(1988)描述的PCR重叠延伸方法构建内切葡聚糖酶融 合体。

构建体1：

反应A：利用聚合酶链反应(PCR)扩增引物1和AMG-term.引物之间的 pCaHj418的片段(H.insolens的43kD内切葡聚糖酶的接头和CBD部分)。

反应B：pA2C193中的Taka-pro引物和引物2之间的片段(M. thermophila的内切葡聚糖酶基因)的PCR扩增。

反应C：在整个侧翼区引物(即Taka-pro引物和AMG-term.引物)存在的 情况下，在第三个PCR中利用前面的两个纯化的片断。

构建体2：

利用同样的方法，其中引物3和引物4分别替代引物1和引物2。

纯化反应C中扩增的片段，以限制酶Xba I和BsstE II消化。将纯化的 消化片段连接在以限制酶Xba I和BsstE II消化的pA2C193上。

用连接的质粒转化大肠杆菌菌株DH5αF′(新英格兰生物实验室)的感受 态细胞，并分离包含基因融合体的克隆。通过DNA测序验证克隆部分的序 列。

SEQ ID NO：2A和SEQ ID NO.3A显示了两个构建体的基因序列。

在如Perkin-Elmer推荐的标准条件下进行聚合酶链反应。

反应A和B以94℃2分钟开始，之后是20个循环(30秒钟，94℃；30 秒钟，50℃；1分钟，72℃)，并以72℃4分钟结束。

反应C以(2分钟，94℃；1分钟，52℃；和2分钟，72℃)开始，之后 是15个循环(30秒钟，94℃；30秒钟，52℃；90秒钟，72℃)，并以72 ℃4分钟结束。

如上面所述，将这两个构建体转化到米曲霉中。 G.克隆的带有纤维素结合域的纤维素酶的纯化和性质分析

发酵后，从生产菌的胞外液分离回收克隆产物。

然后，在含pH7.5的20mM磷酸钠的浆液中使用150克的微晶纤维素， 通过亲合层析高度纯化大约1克的纤维素酶。

将所说的微晶纤维素与共含约1克纤维素酶的粗发酵液混合。在4℃下 混合20分钟后，将所说的微晶纤维素酶装入大小为50×200mm的总体积 400毫升的柱中。

将柱用200ml缓冲液洗涤，然后在相同的缓冲液中以0.5M NaCl洗涤 直到不再有蛋白质洗脱液。然后以500ml 20mm的Tris(pH8.5)洗涤。最 后以1％三乙胺(pH11.8)洗脱纯化的全长酶。

将洗脱下来的酶溶液调至pH8，并利用带有膜DOW GR61PP(阈值为20kD 的聚丙烯)的Amicon室浓缩至每毫升含有5mg以上的蛋白质。

纯化的纤维素酶性质分析如下：

                           Mw    PI   库尔E.280  S-CEVU

                        SDS-PAGE                 /A.280 毁丝霉属(SEQ ID No.2)         43kD    4     74.950     135 顶孢霉属(SEQ ID No.5)         40kD    5     68.020     185 梭孢壳属(SEQ ID No.9)         35kD  4.3     52.470      75

                  活性超过50％   N末端    热稳定性DSC

                       的pH 毁丝霉属(SEQ ID No.2)    5.0-9.0    封阻的        80℃ 顶孢霉属(SEQ ID No.5)    6.0-9.5    封阻的        61℃ 梭孢壳属(SEQ ID No.9)    5.0-9.0    ASGSG---      83℃

通过SDS-PAGE分析纤维素酶的分子量，并利用Pharmacia的标准LMW蛋 白质标记试剂盒计算纤维素酶的分子量。分子量明显高于编码氨基酸的组 成的分子量，这是因为接头区是O-糖基化的，结果导致高分子量。使用 Pharmacia两性电解质PAG板(pH3.5至9.5)并再使用带有已知PI的蛋白 质的Pharmacia试剂盒确定PI。

利用已知吸收率的色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸以氨基酸组成为基础计算 摩尔消光系数。

利用羧甲基纤维素作为底物，以0.5pH为间隔在40℃下培养20分钟并 计算还原糖的形成而获得pH活性分布图。计算了不同pH下的相对活性， 表中包含有超过50％相对活性的间隔点。

利用应用生物系统模型473A测序仪确定了纯化的纤维素酶的N-末端。 按照制造商的说明操作此蛋白质测序仪。

两个纤维素酶被封阻，这是因为形成致热谷氨酸盐的N-末端谷氨酰胺， 无法检测致热谷氨酸盐，并且其阻断了进一步的测序。

利用MicroCalc公司的具有连续扫描速率的MC热量计(calorimeter)， 并将温度以每小时90℃的速率从20℃升至90℃，在中性pH(7.0)下进行 DSC差示扫描量热法。

产生抗体。利用毁丝霉属、顶孢霉属和梭孢壳属的纤维素酶在兔中产生 抗体。将0.1毫克纯化的溶解在0.9％NaCl溶液中的纤维素酶在注射前与 弗氏佐剂混合。以一周间隔将兔免疫10次。通过硫酸铵沉淀(25％饱和)纯 化免疫球蛋白G组分(IgG)。在水中溶解沉淀，然后对乙酸钠缓冲液(pH5.0， 50mM)(随去离子水的改变而改变)进行彻底透析。过滤后，IgG组分由叠 氮化钠(0.01％)稳定。

利用琼脂平板中的免疫扩散，三个纤维素酶都和其同源的抗血清形成单 一的免疫沉淀物，在3个克隆的纤维素酶和抗其它两种纤维素酶产生的抗 血清之间没有见到沉淀。 H-I.在缓冲液中测量构建体1内切葡聚糖酶(SEQ ID No.2)除去表面纤丝 和除去含纤维素纤维的织物中突出的纤维的性能

仪器：Terg-O-tometer

液体体积：100ml

搅拌：150次/分钟(rpm)

冲洗时间：自来水5分钟

洗涤温度：40℃

水硬度：1mM CaCl2

洗涤液体：0.05M磷酸盐缓冲液

pH：7.0

洗涤时间：30分钟

重复：2次

织物：2块旧黑色100％棉布样品，5×6cm

干燥：滚动干燥

评价：

由Macbeth Color Eye7000反射分光光度计测量光的反射。将反射值计 算成ΔL(Hanter实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的 纤维时，黑色织物的表面看起来更亮，并得到更低的L值。 结果：  S-CEVU/l    0     250     1000  本发明酶    0     -1.4     -1.6

所得的数据显示在试验条件下，本发明的酶给出很好的颜色澄清度。 H-II.在缓冲液中测定克隆的梭孢壳属的内切葡聚糖酶(SEQ ID No.9)除 去表面纤丝和除去含纤维素纤维的织物中突出的纤维的性能

仪器：Terg-O-tometer

液体体积：100ml

搅拌：150次/分钟，垂直搅拌  

冲洗时间：自来水10分钟

洗涤温度：40℃

洗涤液体：0.05M磷酸盐缓冲液

pH：7.0

洗涤时间：30分钟

重复：2次

织物：2块旧黑色100％棉布样品，5×6cm

干燥：滚动干燥  

评价：

由Macbeth Color Eye7000反射分光光度计测量光的反射。将反射值计 算成ΔL(Hanter实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的 纤维时，黑色织物的表面看起来更黑和更好，并得到更低的L值。 结果：   S-CEVU/l    0        50       1200   本发明酶    0   -0.66±0.10   -1.32±0.06

所得的数据显示在试验的条件下，本发明的酶给出很好的颜色澄清度。

H-III.在缓冲液中测定Volutella colletrichoides的内切葡聚糖酶 (SEQ ID No.17)除去表面纤丝和除去含有纤维素纤维的织物中突出的纤维 的性能

仪器：Terg-O-tometer

液体体积：100ml  

搅拌：150次/分钟，垂直搅拌

冲洗时间：自来水5分钟

洗涤温度：40℃

洗涤液体：0.05M磷酸盐缓冲液

pH：7.0  

洗涤时间：30分钟

重复：2次

剂量：2.5S-CEVU/ml

织物：2块旧黑色100％棉布样品，5×6cm(0.9克)

干燥：滚动干燥

评价：

由Datacolor Elrepho反射分光光度计测量光的反射。将反射值计算成 ΔL(Hanter实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维 时，黑色织物的表面看起来更黑，并得到更低的L值。

将此样品和对照样品(即没有酶洗涤的样品)比较：

没有纤维素酶有纤维素酶

0.00      -0.57

和对照样品比较的ΔL反射值。

所得的数据显示在试验条件下，Volutellhcolletrichoides纤维素酶 给出很好的颜色澄清度。 H-IV.在高pH高载洗涤剂中测量克隆的Thielavia terrestris和 Aclemonium sp.CBS 478.94的纤维素酶除去表面纤丝和除去含有纤维素纤 维的织物中突出的纤维的性能

仪器：Terg-O-tometer

液体体积：150ml

搅拌：150次/分钟，垂直搅拌

冲洗时间：自来水10分钟

洗涤温度：35℃

洗涤液体：1.0g/l的US型HDG(沸石/苏打助剂，阴离子/非离子重量比 ＞2.5)

pH：10.0

硬度：1.0mMCaCl2

0.34mM MgCl2

洗涤时间：12分钟

重复：6次

织物：2块旧黑色棉布样品，5×6cm(约150g/m2)

  2块深色针织棉布样品，5×6cm(约600g/m2)

干燥：滚动干燥

评价：

由Datacolor Elrepho反射分光光度计测量光的反射。将反射值计算成 △L(Hanter实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维 时，黑色织物的表面看起来更黑和更好，并得到更低的L值。分别试验了 Thielavia terrestris(SEQ ID NO：9)和Acremonium sp.CBS 478.94(SEQ ID NO：5)的克隆纤维素酶的不同剂量(分别称为A和B)。

结果：  S-CEVU/l    0     500      2000      A    0    -2.09    ±0.22     -2.86     ±0.19      B    0    -0.60    ±0.36     -1.96     ±0.23

所得的数据显示在试验条件下，两种纤维素酶都给出很好的颜色澄清 度。 H-V.测量从Thielavia terrestris和Aclemonium sp.CBS 478.94以及构 建体1(SEQ ID No.2)克隆的纤维素酶除去表面纤丝和除去含纤维素纤维的 织物中突出的纤维的性能

仪器：Terg-O-tometer

液体体积：150ml

搅拌：150次/分钟，垂直搅拌

冲洗时间：自来水10分钟

洗涤温度：35℃

硬度：1.0mM CaCl2

0.34mM MgCl2

洗涤液体：2.0g/l的HDL(中性，柠檬酸助剂HDL，非离子/阴离子重量 比＞0.5)

pH：7.0

洗涤时间：30分钟

重复：2次

织物：2块旧黑色棉布样品，5×6cm(约150g/m2)

2块深色针织棉布样品，4×7cm(约600g/m2)

干燥：滚动干燥

评价：

由Datacolor Elrepho反射分光光度计测量光的反射。将反射值计算成 △L(CIE实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维时， 黑色织物的表面看起来更黑和更好，并得到更低的L值。分别试验了 Thielavia terrestris(SEQ ID NO：9)和Acremonium sp.CBS 478.94(SEQ ID NO：5)及构建体1(SEQ ID NO：2)的克隆纤维素酶的不同剂量(分别称为 A和B及C)。

结果：  S-CEVU/l    0     100      200      400     A    0     -3.06    ±0.24     -3.15    ±0.27     -3.92    ±0.26     B    0     -1.75    ±0.27     -3.08    ±0.32     -3.51    ±0.44     C    0     -1.84    ±0.39     -1.70    ±0.47     -2.30    ±0.61

所得的数据显示在试验条件下，所有的纤维素酶都给出很好的颜色澄清 度。 I.应用Thielavia terrestris和Acremonium sp.及构建体1(SEQ ID NO. 2)的内切葡聚糖酶对斜纹粗棉布修整

实验

仪器：洗涤机Wascator FL 120

液体体积：20升

织物：1.1kg斜纹粗棉布织物，14.5 OZ 100％棉布

脱浆：10分钟，55℃，pH7

50ml Aquazyme 120L

2.5g/l磷酸盐缓冲液

磨蚀：2小时；

pH和温度根据下表变化：       酶       活性  pH/温度       缓冲液系统  SEQ ID No.2  1400 S-CEVU/g   6/55℃   2.5g/l磷酸盐缓冲液      No.9   292 S-CEVU/g   5/65℃    1g/l柠檬酸缓冲液      No. 5   782 S-CEVU/g   7/45℃   2.5g/l磷酸盐缓冲液

灭活：15分钟，80℃

1g/l碳酸钠

冲洗：在冷的自来水中，三个冲洗循环，各5分钟  

评价：

利用Texflash 2000作为磨蚀水平的测量手段，在420nm下测定织物 的反射。

用本发明的不同内切葡聚糖酶处理斜纹粗棉布织物，结果列于下表：          酶          剂量     实验条件   磨蚀420nm         空白     0 S-CEVU/g织物     pH6，55℃     9.96     SEQ ID No.2     10 S-CEVU/g织物     pH6，55℃     14.37         空白      0 S-CEVU/g织物     pH5，65℃      9.26     SEQ ID No.9     10 S-CEVU/g织物     pH5，65℃     16.86          空白      0 S-CEVU/g织物     pH7，45℃     9.47      SEQ ID No.5      10 S-CEVU/g织物     pH7，45℃     14.08

在斜纹粗棉布实验中，所有试验纤维素酶都显示极好的性能，尽管每一 种酶有其自身的作用方式。当在斜纹粗棉布实验中应用SEQ ID NO：2的酶 时，可能达到较高的磨蚀水平，同时强度损失很小。当使用SEQ ID NO：9 的酶处理斜纹粗棉布时，可以达到非常高的洗褪效果，几乎使织物达到漂 白的外观。当使用SEQ ID NO：5的酶进行斜纹粗棉布实验时，在较低的最 佳温度下，能达到很高的磨蚀水平，这使得可能减少加热并节约能源。 J.Acremonium sp.和Thielavia terrestris的克隆纤维素酶用于Lyocell 纤维的生物抛光

以商品名Tencel出售的Lyocell纤维是在以水为基础的溶剂中由木浆 纤维素纺成的，所用的溶剂较用于正常粘胶纤维产生的溶剂更有利于环 保。然而，当把此种纤维加工成织物时，其有形成纤丝的趋势，这种情况 在织物表面可见，并称为“绒毛”。利用纤维素酶，有可能永久地除去这 种暴露的绒毛状的纤维，极大地改进成品织物的外观，这种处理一般称为 “生物抛光”。本发明的内切葡聚糖酶尤其适于除去Lyocell表面的纤维。

材料和方法

纺织底物或者是100％编织的或者是不同种的深蓝色的针织运动衫的 Tencel。为了提高视觉效果，黑色的和编织的运动衫是优选的，这使评价 简单化。编织的70/30 Tencel/Rayon也可以限量使用。

或者以200ml的规模，利用Launder-O-meter完成测定；或者以20升 的规膜，利用Wascator完成测定。处理时间是wascator中55℃，60分 钟；LOM中60-90分钟。缓冲液为2g/l的乙酸钠(用醋酸调整pH至5)。 织物和液体的比率是1∶10，但是在Launder-O-meter中，使用了20个直 径14mm的钢球(每个11克)，以获得足够的机械磨蚀效果。生物抛光后， 立即在2g/l的碳酸钠中80℃下进行灭活15分钟，之后用冷水冲洗。

利用从1到5的绒毛分值评价所得的结果，其中1代表起始材料的纤丝 的外观，5代表高质量的外观，其表面上没有可见的纤维。既然内切纤维 素酶是特别针对表面处理的，重量的损失低于2％，因此此项不包括在评价 的指标中。评价了两种纤维素酶：Acremonium sp.(SEQ lD NO.5)和 Thielavia terrestris(SEQ ID NO.9)的克隆纤维素酶。

两种纤维素酶对Tencel及Tencel混合的织物都能去纤丝。利用本发明 的内切葡聚糖酶，除去的只是很小的纤丝，而当利用木霉属的酸性纤维素 酶混合物时，除去的是整个纤维。因此，利用本发明的内切葡聚糖酶时， 被处理织物的强度损失保持在最小水平。

下列剂量给出了良好的去纤丝作用，即绒毛分值为4或者以上：

每克织物15 S-CEVU的Acremonium sp.纤维素酶(SEQ ID NO：5)；和

每克织物10 S-CEVU的Thelavia terrestris纤维素酶(SEQ ID NO：9)。

实施例2

通过表达克隆以及通过PCR克隆检测由植物病原体产生的新的溶纤 酶，这种植物病原体从大豆种子中分离出来，并鉴定为Macrophomina phaseolina。

产生供PCR的生物量和表达克隆的方法：

使CBS 281.96的分离物在振荡烧瓶培养器中在富含纤维素马铃薯右旋 糖培养液中生长，在26℃下培养5天(振荡条件：150rpm)。 A.Macrophomina phaseolina的内切葡聚糖酶的克隆和表达

从Macrophomina phaseolina分离mRNA，这种病原体生长在包含纤维 素的发酵培养基中，搅拌以确保通气良好。在生长3-5天之后收获菌丝， 立即在液氮中冷冻，并保存在-80℃。按所述方法，用1％的载体背景在大 肠杆菌中构建Macrophomina phaseolina的含有大约106单个克隆的文库。

用一些库的质粒DNA转化酵母，并从每一个库中获得包含250-400个酵 母菌落的50-100个平板。

鉴定内切葡聚糖酶阳性菌落，并通过AZCL HE纤维素测定方法在SC琼 脂平板上分离。从酵母菌落上直接扩增cDNA插入物，并如上面的材料和方 法部分的描述进行其性质分析。SEQ ID NO：10中显示了编码内切葡聚糖 酶的cDNA的DNA序列，SEQ ID NO：11中显示了相应的氨基酸序列。

从DSM 10512质粒中能够获得该cDNA。

从酵母菌落分离总DNA，并通过转化如上述的大肠杆菌救援质粒DNA。 为了在曲霉属中表达所说的内切葡聚糖酶，用适当的限制酶消化所说的 DNA，在凝胶上对各个片断进行分级分离，将相应于内切葡聚糖酶基因的片 段纯化。将得到的基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414上，结果形成 质粒pA2C477。

在大肠杆菌中进行DNA扩增之后，用所说的质粒转化上述的米曲霉。 通过杂交筛选cDNA文库和阳性克隆的特征分析

利用随机引物32P-标记的M.phaseolina的PCR产物作为杂交探针筛选 大肠杆菌中的Macrophomina phaseolina cDNA文库的大约6000克隆形成 单位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述产生PCR产物。通过对cDNA插 入物末端进行测序和通过确定两条链中最长的cDNA的核苷酸序列而确定阳 性cDNA克隆。SEQ ID NO：10显示了编码内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序 列，SEQ ID NO：11显示了相应的氨基酸序列。 B.Macrophomina phaseolina的内切葡聚糖酶和Humicola insolens的43 kD内切葡聚糖酶基因融合体的构建

制备一种构建体的目的是制造M.phaseolina的内切葡聚糖酶的衍生 物，这种衍生物具有H.insolens(在WO 91/17243中公开)的43kD内切葡 聚糖酶的接头和CBD。M.phaseolina的天然内切葡聚糖酶没有接头和/或 纤维素结合域CBD。

此构建体由M.phaseolina的内切萄聚糖酶(223个氨基酸)和H. insolens的43kD内切葡聚糖酶的72个C-末端氨基酸组成。

将H.insolens的43kD内切葡聚糖酶的cDNA以此内切葡聚糖酶基因 从Taka-启动子转录的方式克隆到pHD414中。形成的质粒命名为 pCaHj418。

将编码M.phaseolina的内切葡聚糖酶的cDNA作为BstX I/Not I片段 克隆到pYES2.0中，形成的质粒命名为pClC477。 引物： 引物1： 5′-GGTCGCCCGGACTGGCTGTTCCCGTACCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGG-3′ 引物2： 5′-CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGGGTACGGGAACAGCCAGTCCGGGCGACC-3′ pYES2.0 F.HT引物：5′-CGGACTACTAGCAGCTGTAATACG-3′ AMG-term.引物：5′-CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3′

通过如Higuchi等(1988)描述的PCR重叠延伸方法构建内切葡聚糖酶融 合体。

反应A：利用聚合酶链反应(PCR)扩增引物1和AMG-term.引物之间的 pCaHj418的片段(H.insolens的43kD内切葡聚糖酶的接头与CBD部分)。

反应B：pYES2.0 F.HT引物和引物2之间的pClC477的片段(M. phaseolina的内切葡聚糖酶基因)的PCR扩增。

反应C：在整个侧翼区引物(即pYES2.0 F.HT引物和AMG-term.引物) 存在的情况下，在第三个PCR中利用前面的两个纯化的片段。

纯化反应C中扩增的片段，以限制酶Xba I和BamH I消化。将纯化的消 化片段连接在以限制酶Xba I和BamH I消化的pHD414上。

用连接的质粒转化大肠杆菌菌株DH5αF′(新英格兰生物实验室)的感受 态细胞，并分离包含基因融合体的菌落。通过DNA测序验证克隆部分的序 列。

在如Perkin-Elmer推荐的标准条件下进行聚合酶链反应。

反应A和B以94℃2分钟开始，之后是20个循环(30秒钟，94℃；30 秒钟，52℃；1分钟，72℃)，并以72℃4分钟结束。

反应C以(2分钟，94℃；1分钟，52℃；和2分钟，72℃)开始，之后 是20个循环(30秒钟，94℃；30秒钟，52℃；90秒钟，72℃)，并以72 ℃4分钟结束。

如上面所述，将此构建体转化到米曲霉中。

实施例3

Acremonium sp.和粪生粪壳的内切葡聚糖酶的克隆和表达。

表达克隆的生物量的产生方法：

使CBS 478.94的分离物和ATCC 52644分别在振荡烧瓶培养器中在富含 纤维素的马铃薯右旋糖培养液中生长，在26℃下培养5天(振荡条件：150 rpm)。

分别从Acremonium sp.CBS 478.94和粪生粪壳ATCC 52644中分离 mRNA，这两种生物体生长在包含纤维素的发酵培养基中，搅拌以确保通气 良好。在生长3-5天之后收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并保存在-80℃。 如上所述，用1％的载体背景在大肠杆菌中分别构建Acremonium sp.CBS 478.94和粪生粪壳ATCC 52644(每个含有大约106单个克隆)的文库。

用每一个文库中一些集合质粒DNA转化酵母，并从每一个集合中获得包 含250-400个酵母菌落的50-100个平板。

鉴定内切葡聚糖酶阳性菌落，并通过AZCL HE纤维素测定方法在SC琼 脂平板上分离。从酵母菌落上直接扩增cDNA插入物，并如上面的材料和方 法部分的描述进行其性质分析。

SEQ ID NO：6中显示了编码Acremonium sp.的内切葡聚糖酶的cDNA的 DNA序列，SEQ ID NO：7中显示了相应的氨基酸序列。从DSM 10080的质 粒中能够获得此cDNA。

SEQ ID NO：19中显示了编码粪生粪壳的内切葡聚糖酶之cDNA的部分 DNA序列(cDNA的5′末端的核苷酸序列)，SEQ ID NO：20显示了相应的氨 基酸序列。从DSM 10576的质粒中能够获得此cDNA。

从酵母菌落分离总DNA，并通过转化如上述的大肠杆菌救援质粒DNA。 为了在曲霉属中表达所说的内切葡聚糖酶，用适当的限制酶消化所说的 DNA，在凝胶上对各个片断进行分级分离，将分别相应于Acremonium sp. 和粪生粪壳的内切葡聚糖酶基因的片段纯化。将得到的基因连接到用适当 的限制酶消化的pHD414上，结果分别形成质粒pA2C371和pA2C502。

在大肠杆菌中进行DNA扩增之后，用所说的质粒转化上述的米曲霉。

实施例4 A.由PCR克隆Crinipellis scabella CBS 280.96的内切葡聚糖酶

使CBS 280.96的分离物在静态的烧瓶培养器中含小麦麸的培养基(每烧 瓶：300g小麦麸添加450ml的盐溶液)上生长，其中，在26℃下培养6 天。培养后，以蒸馏水抽提小麦麸(每烧瓶300ml)，并在1％琼脂糖(Litex琼 脂糖Medinova)中检验提取物的内切葡聚糖酶活性(0.1％AZCL-HE-纤维素 (megazyme))。在pH为3.0，7.0和9.5的平板上观察活性。

从如上所述生长的Crinipellis scabella中分离mRNA。在生长3-5天 之后收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并保存在-80℃。如上所述，用1％载 体背景，在大肠杆菌中构建Crinipellis scabella(每个含有大约106单个 克隆)的文库。

利用随机引物32P-标记的C.scabella的PCR产物作为杂交探针，筛选 大肠杆菌中的Crinipellis scabella cDNA文库的大约10000克隆形成单 位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述产生PCR产物。通过对cDNA插入 物末端进行测序和通过确定两条链中最长的cDNA的核苷酸序列而确定阳性 cDNA克隆。

SEQ ID NO：12显示了编码内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQ ID NO： 13显示了相应的氨基酸序列。

可以从DSM 10511中的质粒获得此cDNA。

从酵母菌落分离总DNA，并通过转化如上述的大肠杆菌救援质粒DNA。 为了在曲霉属中表达所说的内切葡聚糖酶，用适当的限制酶消化所说的 DNA，在凝胶上对各个片段进行分级分离，将分别相应于所说的内切葡聚糖 酶基因的片段纯化。接下来将得到的基因连接到用适当的限制酶消化的 pHD414上，结果形成质粒pA2C475。

在大肠杆菌中进行DNA扩增之后，用所说的质粒转化上述的米曲霉。 Crinipellis scabella的内切葡聚糖酶和Humicola insolensinsolens的 43kDa的内切葡聚糖酶的接头/CBD区的基因融合体的构建

Crinipellis scabella的天然内切葡聚糖酶既没有接头也没有纤维素结 合域(CBD)。此外，全长cDNA在编码内切葡聚糖酶的开放读框(ORF)的上游 包含ATG起始密码子，这可能导致基于异源cDNA表达的混杂翻译的起始， 如在酵母(啤酒酵母)和丝状真菌(米曲霉)中。这样，利用通过重叠延伸的 剪接(SOE)已经构建了Crinipellis scabella的内切葡聚糖酶和Humicola insolens的43kD的内切葡聚糖酶的接头/CBD区(在WO 91/17243中公开) 的两个基因融合体(Horton等，1989)。

构建体1由编码C.scabella的内切葡聚糖酶的226个残基的cDNA组 成，此cDNA通过PCR与H.insolens的编码位于H.insolens 43kD内切葡 聚糖酶的COOH-末端的接头和CBD区(72个氨基酸)的cDNA的3′-末端连 接。第二个杂交构建体和前述的基因构建体相同，只是通过PCR缺失了推 定的信号肽的前5′个残基，结果使信号肽变短，此信号肽从第二个框内起 始密码子开始。 质粒构建体

质粒pClC475包含C.scabella的全长cDNA，将其克隆到BstXI/NotI- 切口酵母表达载体pYES 2.0中；质粒pClC144包含H.insolens的全长 cDNA，将其克隆到pYES 2.0的BstXI位点上。 经重叠延伸的剪接

利用50-100ng的pClC475为模板，各300-350 pmol的正向引物(正向 引物1：5′-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3′；正向引物2： 5′-CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3′)，250 pmol的反向引物 (5′-GACCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGTTTACGAACACAGCCCGAGATATTAGTG-3′)， DNA热循环仪(Landgraf，德国)和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer， Cetus，USA)，在PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.01％明胶；包含每种dNTP 200μM)中产生编码C.scabella的内切 葡聚糖酶的核心区的两个PCR片段。利用循环方式(94℃变性1分钟；55 ℃退火2分钟；72℃延伸3分钟)进行三十个PCR循环。利用100ng的 pClC144作为模板，250pmol的正向引物(5′-CACTAATATCTCGGGC- TGTGTTCGTAAACCCTCCAGCAGCACCA-GCTCTCCGGTC-3′)，250pmol的pYES 2.0 反向引物(5′-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3′)，DNA热循环仪(Landgraf， 德国)和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，USA)，在PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.01％明胶；包含每种dNTP 200(μM)中产生编码H.insolens的内切葡聚糖酶的接头和CBD的PCR片 段。如上文进行三十个PCR循环。将PCR产物在0.7％低胶凝温度的琼脂糖 凝胶(SeaPlaque，FMC)中进行电泳，从凝胶中切割目的片段，并按照制造 商的说明通过琼脂糖酶(新英格兰生物实验室，美国)处理，之后是苯酚抽 提和在-20℃下通过加入2体积的96％EtOH和0.1体积的3M NaAc乙醇沉 淀12小时回收目的片段。

通过在两种组合的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3；50mM KCl；1.5 mM MgCl2；0.01％明胶；包含每种dNTP 200μM)中组合上述的重叠PCR片段 (每个模板约50ng)产生Crinipellis scabella的内切葡聚糖酶和Humicola  insolen的43kD的内切葡聚糖酶的接头/CBD区的重组杂合基因。利用DNA 热循环仪(Landgraf，德国)和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus， USA)进行SOE反应。利用循环方式(94℃变性1分钟；55℃退火2分钟；72 ℃延伸3分钟)进行二个PCR循环，终止反应，向反应混合物中加入各末端 引物(正向引物1：5′-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3′；正向 引物2：5′-CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3′；反向引物：5′- GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3′)，利用循环方式(94℃变性1分钟；55℃ 退火2分钟；72℃延伸3分钟)进行另外三十个PCR循环。 用于米曲霉中异源表达的表达盒的构建

将PCR产生的重组片段在0.7％低胶凝温度的琼脂糖凝胶(SeaPlaque， FMC)中进行电泳，从凝胶中切割目的片段，并按照制造商的说明通过琼脂 糖酶(新英格兰生物实验室，美国)处理，之后是苯酚抽提和在-20℃下乙醇 沉淀12小时回收目的片段。以HindIII和XbaI进行DNA片段消化，将DNA 片段连接在HindIII/XbaI切割的pHD414载体上，之后按照制造商的说明 将构建体电穿孔到大肠杆菌DH10B细胞(生命技术，美国)中。

如材料和方法部分所描述的，从两条链测定形成的基因融合体的核苷酸 序列，SEQ ID NO：14A和15A。如所描述的，这些构建体可以转化米曲霉。

实施例5

从46个丝状真菌和单轴真菌(monocentric fungi)中用PCR检测所说的 溶纤酶类型，这些真菌代表23个科的32个属，属于7个纲的15个目，总 而言之包括真菌的所有4个组：子囊真菌、担子真菌、壶真菌和接合真菌

5.1材料

1.棉色二孢

菌株的保藏，保藏号：CBS 274.96

2.Ulospora bilgramii(Hawksw等)Hawksw等

菌株的保藏号：NKBC 1444，

3.Microsphaeropsis sp

4.Ascobolus stictoideus Speg.

菌株的保藏号：Q026(Novo Nordisk保藏中心)

分离自鹅粪，Svalbard，挪威

5.Saccobolus dilutellus(Fuck)Sacc.

菌株的保藏：保藏号CBS 275.96

6.疣孢青霉Peyronel

物种的保藏号：ATCC 62396

7.产黄青霉Thom

菌株的保藏号：ATCC 9480

8.Thermomyces verrucosus Pugh等

菌株的保藏：保藏号CBS 285.96

9.鹿角团炭角菌L.ex Greville

菌株的保藏：保藏号CBS 284.96

10.点孔座壳(Fr.ex L.)Fr.

参见：A.Munk：丹麦Pyrenomyceles，Dansk Botanisk Arkiv， Voll7，1 1957

11.Nodulisporum sp

分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科， Guttiferales)

12.Cylindrocarpon sp

分离自海上样品，Bahamas

13.蛇形镰孢Sherbakoff

菌株的保藏号：IFO 4467

14.早熟禾镰孢(Peck)Wr.

物种的保藏号：ATCC 60883

15.腐皮镰孢(Mart.)Sacc.emnd.Snyd & Hans.

菌株的保藏号：IMI 107.511

16.番茄尖镰孢(Sacc.)Snyd.& Hans.

菌株的保藏号：CBS 645.78

17.尖镰孢ssp passiflora

菌株的保藏号：CBS 744.79

18.链孢粘帚霉Gillman & Abbott

菌株的保藏号：ATCC 10523

19.Nectria pinea Dingley

菌株的保藏，保藏号CBS 279.96

20.大孢粪壳Auerswald

物种的保藏号：ATCC 60255

21.灰腐质霉Traee

物种的保藏号：ATCC 22726

22.黑腐质霉omvik

菌株的保藏号：CBS 819.73

23.Scytalidium thermophilum(Cooney et Emerson)Austwick

菌株的保藏号：ATCC 28085

24.Thielavia thermophila Fergus et Sinden(别名Corynascus thermophilus)

菌株的保藏号：CBS 174.70，IMI 145.136

25. Cladorrhinum foecundissimum Saccardo et Marchal

物种的保藏号：ATCC 62373

26.Syspastospora boninensis

菌株的保藏号：NKBC 1515(日本大学，profe Tubaki保藏中心)

27.管毛壳Fuckel

菌株的保藏号：CBS 799.83

28.巴西毛壳Batia et Potual

菌株的保藏号：CBS 122.65

29.墙毛壳Corda

菌株的保藏号：CBS 163.52

30.Chaetomium virescens (von Arx)Udagawa

菌株的保藏号：CBS 547.75

31.Nigrospora sp

菌株的保藏：保藏号CBS 272.96

32.Nigrospora sp

分离自：

33.Diapor the syngenesia

菌株的保藏：保藏号CBS 278.96

34.葫芦科刺盘孢(Passerini)Ellis et Halsted

别名围小丛壳Var orbiculare Jenkins et Winstead

物种的保藏号：ATCC 52609

35.黑胶耳Fr.

菌株的保藏：保藏号CBS 277.96

36.木蹄层孔菌(L.)Fr.

菌株的保藏：保藏CBS 276.96

37.绵皮孔菌属(？)

菌株的保藏号：CBS 283.96

38.红根囊壶菌(de Bary & Wor)Fischer

菌株的保藏：保藏号：CBS 282.96

39.Rhizomucor pusillus(Lindt)Schipper

别名：微小毛霉

菌株的保藏号：IFO 4578

40.闪光须霉(Kunze)vanTieghem & Le Monnier

菌株的保藏号：IFO 4814

41.弗雷生刺枝霉vanTieghem & Le Monnier

别名：Helicostylum fresenii

菌株的保藏号：NRRL2305

42.粉红单端孢

菌株的保藏号：IFO 5372

43.Coniothecium sp Endophyte

分离自中国云南省昆明的鲜花植物的叶片

44.菌株的保藏物：保藏号CBS 271.96

Coelomycete，分离自牙买加Christiana的Artocarpus altilis的叶 片(桑科，Urticales)

45.菌株的保藏物：保藏号CBS 273.96

Coelomycete，分离自牙买加达拉斯山的Pimenta dioica(桃金娘科， Myrtales)的叶片

46.菌株的保藏号：CBS 270.96

Coelomycete，分离自生长在牙买加达拉斯山的Pseudocalymma alliaceum(Bignoniaceae，Solanales)的叶片

5.2方法

菌株的保持和生物量的产生：

将菌株保持在培养皿(9cm)中的琼脂或斜面上(参见培养基表：PCA和 PDA)。在以下生长条件之下在摇瓶中培养44种菌株：如PC、PD和PB9或 YPG的普通培养基(参见培养基表)；培养时间3至9天；温度26℃；rpm 在175-150之间。使14号菌株(F.poae)在小麦麸上生长l5天(26℃；静 态)。使38号菌株在加有1cm2高压灭菌滤纸片的稀释的盐溶液(DS/2)中生 长。

活性试验：

在由1％琼脂糖(HSB，Litex琼脂糖，Medinova)制成的0.1％AZCL-HE- 纤维素(Megazyme)平板(14cm培养皿)上试验活性。所有试验均以3份进 行，即将AZCL-HE-纤维素溶解在三种缓冲液中，调节至pH3，7或9.5(使 用各种比例的以下两种组分：一水柠檬酸单水合物，Merck产品号 100244(21.0g)，溶解在水中，使总体积为1000毫升；0.1M dodecabrohydrate三钠，Merck产品号6578(38g)，溶解在水中，使总体 积为1000毫升。在临用前混合。

收获生物量：

通过过滤(根据真菌的生长调节滤器网眼，最细的用于具有高度孢子形 成菌丝体的真菌，例如Fusarium spp.)收获生物量。将在滤器上的生物量 刮至无菌塑料袋中，并立即冷冻(掩没到液氮中)。

5.3结果

I.使用材料和方法中描述的PCR筛选与扩增技术，获得了下列部分 cDNA序列：

Saccobolus dilutellus(Fuck)Sacc.CBS 275.96：SEQ ID NO：21(和 在SEQ ID NO：22中的推定的氨基酸序列)；

Thermomyces verrucosus CBS 285.96：SEQ ID NO：23(和在SEQ ID NO： 24中的推定的氨基酸序列)；

鹿角团炭角菌CBS 284，96：SEQ ID NO：25(和在SEQ ID NO：26中的 推定的氨基酸序列)；

番茄尖镰孢CBS 645.78：SEQ ID NO：27(和在SEQ ID NO：28中的 推定的氨基酸序列)；

Nectria pinea CBS 279.96：SEQ ID NO：29(和在SEQ ID NO：30中 的推定的氨基酸序列)；

灰腐质霉ATCC 22726：SEQ ID NO：31(和在SEQ ID NO：32中的推定 的氨基酸序列)；

黑腐质霉CBS 819.73：SEQ ID NO：33(和在SEQ ID NO：34中的推定 的氨基酸序列)；

Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373：SEQ ID NO：35(和在SEQ ID NO：36中的推定的氨基酸序列)；

Syspastospora boninensis NKBC 1515：SEQ ID NO：37(和在SEQ ID NO：38中的推定的氨基酸序列)；

Nigrospora sp.CBS 272.96：SEQ ID NO：39(和在SEQ ID NO：40 中的推定的氨基酸序列)；

弗雷生刺枝霉：SEQ ID NO：41(和在SEQ ID NO：42中的推定的氨基 酸序列)；

黑胶耳CBS 277.96：SEQ ID NO：43(和在SEQ ID NO：44中的推定 的氨基酸序列)；

Coniothecium sp.：SEQ ID NO：45(和在SEQ ID NO：46中的推定的 氨基酸序列)；

保藏物CBS 271.96：SEQ ID NO：47(和在SEQ ID NO：48中的推定的 氨基酸序列)；

保藏物CBS 270.96：SEQ ID NO：49(和在SEQ ID NO：50中的推定的 氨基酸序列)；

棉色二孢CBS 274.96：SEQ ID NO：51(和在SEQ ID NO：52中的推 定的氨基酸序列)；

Ulospora bilgramii NKBC 1444：SEQ ID NO：53(和在SEQ ID NO：54 中的推定的氨基酸序列)；

疣孢青霉ATCC 62396：SEQ ID NO：55(和在SEQ ID NO：56中的推 定的氨基酸序列)；

点孔座壳：SEQ ID NO：57(和在SEQ ID NO：58中的推定的氨基酸序 列)；

蛇形镰孢，IFO 4467：SEQ ID NO：59(和在SEQ ID NO：60中的推定 的氨基酸序列)；

Thielavia thermophila CBS 174.70：SEQ ID NO：61(和在SEQ ID NO： 62中的推定的氨基酸序列)；

管毛壳CBS 799.83：SEQ ID NO：63(和在SEQ ID NO：64中的推定 的氨基酸序列)；

Chaetomium virescens：SEQ ID NO：65(和在SEQ ID NO：66中的推 定的氨基酸序列)；

葫芦科刺盘孢：SEQ ID NO：67(和在SEQ ID NO：68中的推定的氨基 酸序列)；

闪光须霉：SEQ ID NO：69(和在SEQ ID NO：70中的推定的氨基酸序 列)；和

粉红单端孢：SEQ ID NO：71(和在SEQ ID NO：72中的推定的氨基酸 序列)。

II.使用材料和方法中描述的PCR筛选与扩增技术，获得了部分编码本 发明的酶的部分cDNA序列，按照布达佩斯条约保藏了质粒：

大肠杆菌，DSM 10583，保藏日1996年3月13日；

来源于粉红单端孢的cDNA；

大肠杆菌，DSM 10584，保藏日1996年3月13日；

来源于Syspastospora boninensis的cDNA；

大肠杆菌，DSM 10585，保藏日1996年3月13日；

来源于Cheatomium murorum的cDNA；

大肠杆菌，DSM 10587，保藏日1996年3月13日；

来源于粪生粪壳的cDNA；

大肠杆菌，DSM 10588，保藏日1996年3月13日；

来源于未鉴别的菌株CBS 273.96的cDNA；

大肠杆菌，DSM 10586，保藏日1996年3月13日；

来源于Spongipellis sp的cDNA。 粗上清液的颜色澄清作用

在正常的洗涤期间，织物常常褪色。然而，如果织物用使颜色澄清的纤 维素酶洗涤，则织物的外观得到改善，原来的颜色得到更好地保持或保留。 以除去含纤维素纤维的织物纱突出的表面纤丝和纤维的作用测定颜色的澄 清作用。

装置：Terg-o-tometer

液体体积：100毫升

搅拌：用垂直搅拌器150次/分钟

冲洗时间：在自来水中5分钟

洗涤温度：40℃

洗涤液：0.05M磷酸盐缓冲液

pH：7.0

洗涤时间：30分钟

重复：2次

酶：以下所示菌株的粗上清液

剂量：200，500，1000或2500 S-CEVU/l的两种剂量

织物：2块旧黑100％棉布，5×6cm(0.9克)

干燥：滚动干燥

评价：

经Datacolor Elrepho反射分光光度测量反发射。以ΔL(Hunter实验值) 计算反射。当从纱突出的表面纤丝和纤维被纤维素酶除去时，黑色的织物 的表面显得更黑，获得更低的L值。

将样品与一种对照样品(即不用酶洗涤)比较。以下显示了与对照样品 比较的ΔLR反射值。

                                           ECU/l 菌株                              200     500    2000    2500 13.     蛇形镰孢                  n.t.   -0.71   n.t.   -1.28 15.     腐皮镰孢                  n.t.   -0.96   n.t.   -1.37 24.     Thieiavia thermophila    -0.30    n.t.  -1.25    n.t. 25.     Cladorrhinum foecun.      n.t    -1.79   n.t.   -2.18 37.    Spongipeliis(？)           n.t.   -1.01   n.t.   -1.63 39.    Rhizomucor pusillus    n.t.   -1.90   n.t.   -2.66 41.    弗雷生刺枝霉           n.t.   -0.17   n.t.   -1.33 45.    保藏号：CBS273.96      n.t.   -1.31   n.t.   -1.20

数据表明，在试验条件下，所有菌株都给出良好的澄清作用(n.t.＝在 这一剂量下未试验)。

序列表 (1)一般信息：

(i)申请人：

      (A)姓名：Novo Nordisk A/S

      (B)街道：Nova Aile

      (C)城市：DK-2880 Bagsvaerd

      (E)国家：丹麦

      (F)邮区代码(ZIP)：DK-2880

      (G)电话：+45 44 44 88 88

      (H)传真：+45 44 49 32 56

(ii)发明名称：新的内切葡聚糖酶

(iii)序列数：72

(iv)计算机可读形式：

      (A)介质类型：软盘

      (B)计算机：IBM-PC兼容机

      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

      (D)软件：Patentln Release#1.0，版本#1.30(EPO) (2)SEQ ID NO：1A的信息：

(i)序列特征

      (A)长度：891个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：啤酒糖酵母

      (B)菌株：DSM 9770 (xi)序列描述：  SEQ ID NO：1A： AAAGAAAGGC    TCTCTGCTGT    CGTCGCTCTC    GTCGCTCTCG    TCGGCATCCT CCATCCGTCC        60 GCCTTTGATA    ACCCGCTCCC    CGACTCAGTC    AAGACGACGC    ATACTTGGCA CCATGCATCT        120 CTCCGCCACC    ACCGGGTTCC    TCGCCCTCCC    GGTCCTGGCC    CTGGACCAGC TCTCGGGCAT        180 CGGCCAGACG    ACCCGGTACT    GGGACTGCTG    CAAGCCGAGC    TGCGCCTGGC CCGGCAAGGG        240 CCCCTCGTCT    CCGGTGCAGG    CCTGCGACAA    GAACGACAAC    CCGCTCAACG ACGGCGGCTC        300 CACCCGGTCC    GGCTGCGACG    CGGGCGGCAG    CGCCTACATG    TGCTCCTCCC AGAGCCCCTG        360 GGCCGTCAGC    GACGAGCTGT    CGTACGGCTG    GGCGGCCGTC    AAGCTCGCCG GCAGCTCCGA        420 GTCGCAGTGG    TGCTGCGCCT    GCTACGAGCT    GACCTTCACC    AGCGGGCCGG TCGCGGGCAA        480 GAAGATGATT    GTGCAGGCGA    CCAACACCGG    TGGCGACCTG    GGCGACAACC ACTTTGACCT        540 GGCCATCCCC    GGTGGCGGTG    TCGGTATTTT    CAACGCCTGC    ACCGACCAGT ACGGCGCTCC        600 CCCGAACGGC    TGGGGCGACC    GCTACGGCGG    CATCCATTCC    AAGGAAGAGT GCGAATCCTT        660 CCCGGAGGCC    CTCAAGCCCG    GCTGCAACTG    GCGCTTCGAC    TGGTTCCAAA ACGCCGACAA        720 CCCGTCGGTC    ACCTTCCAGG    AGGTGGCCTG    CCCGTCGGAG    CTCACGTCCA AGAGCGGCTG        780 CTCCCGTTAA   GAGGGAAGAG   AGGGGGCTGG   AAGGACCGAA   AGATTCAACC TCTGCTCCTG       840 CTGGGGAAGC   TCGGGCGCGA   GTGTGAAACT   GGTGTAAATA   TTGTGGCACA CACAAGCTAC      900 TACAGTCCGT   CTCGCCGTCC   GGCTAACTAG   CCTTGCTGCG   GATCTGTCCA AAAAAAAAAA      960 (2)SEQ ID NO：1B的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：225个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1B： Met His Leu Ser Ala Thr Thr Gly Phe Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala 1                5                  10                  15 Leu Asp Gln Leu Ser Gly Ile Gly Gln Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

        20                  25                   30 Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ser Ser Pro Val

    35                  40                  45 Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Leu Asn Asp Gly Gly Ser Thr

50                  55                   60 Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Ser Gln 65                  70                  75                  80 Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val

            85                  90                  95 Lys Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ser Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu

        100         105                 110 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met  Ile Val Gln

    115                 120                 125 Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Ala

130                 135                 140 Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr 145                 150                 155                 160 Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Ile His Ser

            165                 170                 175 Lys Glu Glu Cys Glu Ser Phe Pro Glu Ala Leu Lys Pro Gly Cys Asn

        180                 185                 190 Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Thr Phe

    195                 200                 205 Gln Glu Val Ala Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Lys Ser Gly Cys Ser

210                 215                 220 Arg 225 (2)SEQ ID NO：2A的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：894个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

    (A)生物体：“构建体1”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2A： ATGCATCTCT    CCGCCACCAC    CGGGTTCCTC    GCCCTCCCGG    TCCTGGCCCT    GGACCAGCTC  60 TCGGGCATCG    GCCAGACGAC    CCGGTACTGG    GACTGCTGCA    AGCCGAGCTG    CGCCTGGCCC 120 GGCAAGGGCC    CCTCGTCTCC    GGTGCAGGCC    TGCGACAAGA    ACGACAACCC    GCTCAACGAC 180 GGCGGCTCCA    CCCGGTCCGG    CTGCGACGCG    GGCGGCAGCG    CCTACATGTG    CTCCTCCCAG 240 AGCCCCTGGG    CCGTCAGCGA    CGAGCTGTCG    TACGGCTGGG    CGGCCGTCAA    GCTCGCCGGC 300 AGCTCCGAGT    CGCAGTGGTG    CTGCGCCTGC    TACGAGCTGA    CCTTCACCAG    CGGGCCGGTC 360 GCGGGCAAGA    AGATGATTGT    GCAGGCGACC    AACACCGGTG    GCGACCTGGG    CGACAACCAC 420 TTTGACCTGG    CCATCCCCGG    TGGCGGTGTC    GGTATTTTCA    ACGCCTGCAC    CGACCAGTAC 480 GGCGCTCCCC    CGAACGGCTG    GGGCGACCGC    TACGGCGGCA    TCCATTCCAA    GGAAGAGTGC 540 GAATCCTTCC    CGGAGGCCCT    CAAGCCCGGC    TGCAACTGGC    GCTTCGACTG    GTTCCAAAAC 600 GCCGACAACC    CGTCGGTCAC    CTTCCAGGAG    GTGGCCTGCC    CGTCGGAGCT    CACGTCCAAG 660 AGCGGCTGCT    CCCGTCCCTC    CAGCAGCACC    AGCTCTCCGG    TCAACCAGCC    TACCAGCACC 720 AGCACCACGT    CCACCTCCAC    CACCTCGAGC    CCGCCAGTCC    AGCCTACGAC    TCCCAGCGGC 780 TGCACTGCTG    AGAGGTGGGC    TCAGTGCGGC    GGCAATGGCT    GGAGCGGCTG    CACCACCTGC 840 GTCGCTGGCA    GCACTTGCAC    GAAGATTAAT    GACTGGTACC    ATCAGTGCCT    GTAG 894 (2)SEQ ID NO：2B的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：297个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2B： Met His Leu Ser Ala Thr Thr Gly Phe Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala 1               5                   10                  15 Leu Asp Gln Leu Ser Gly Ile Gly Gln Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

        20                  25              30 Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ser Ser Pro Val             

    35                  40                  45 Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Leu Asn Asp Gly Gly Ser Thr

50                  55                  60 Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Ser Gln 65                  70                  75                  80 Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val

            85                  90                  95 Lys Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ser Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu

        100                 105                 110 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Ile Val Gln

    115                 120                 125 Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Ala

130                 135                 140 Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr 145                 150                 155                 160 Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Ile His Ser

            165                 170                 175 Lys Glu Glu Cys Glu Ser Phe Pro Glu Ala Leu Lys Pro Gly Cys Asn

        180                 185                 190 Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Thr Phe

    195                 200                 205 Gln Glu Val Ala Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Lys Ser Gly Cys Ser

210                 215                 220 Arg Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr 225                 230                 235                 240 Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr

            245                 250                 255 Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn

        260                 265                 270 Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys

        275             280                 285 Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu

290                 295 (2)SEQ ID NO：3A的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：927个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

    (A)生物体：“构建体2” (xi)序列描述：SEQ ID NO：3A： ATGCATCTCT  CCGCCACCAC  CGGGTTCCTC  GCCCTCCCGG  TCCTGGCCCT  GGACCAGCTC 60 TCGGGCATCG  GCCAGACGAC  CCGGTACTGG  GACTGCTGCA  AGCCGAGCTG  CGCCTGGCCC 120 GGCAAGGGCC  CCTCGTCTCC  GGTGCAGGCC  TGCGACAAGA  ACGACAACCC  GCTCAACGAC 180 GGCGGCTCCA    CCCGGTCCGG    CTGCGACGCG    GGCGGCAGCG    CCTACATGTG    CTCCTCCCAG 240 AGCCCCTGGG    CCGTCAGCGA    CGAGCTGTCG    TACGGCTGGG    CGGCCGTCAA    GCTCGCCGGC 300 AGCTCCGAGT    CGCAGTGGTG    CTGCGCCTGC    TACGAGCTGA    CCTTCACCAG    CGGGCCGGTC 360 GCGGGCAAGA    AGATGATTGT    GCAGGCGACC    AACACCGGTG    GCGACCTGGG    CGACAACCAC 420 TTTGACCTGG    CCATCCCCGG    TGGCGGTGTC    GGTATTTTCA    ACGCCTGCAC    CGACCAGTAC 480 GGCGCTCCCC    CGAACGGCTG    GGGCGACCGC    TACGGCGGCA    TCCATTCCAA    GGAAGAGTGC 540 GAATCCTTCC    CGGAGGCCCT    CAAGCCCGGC    TGCAACTGGC    GCTTCGACTG    GTTCCAAAAC 600 GCCGACAACC    CGTCGGTCAC    CTTCCAGGAG    GTGGCCTGCC    CGTCGGAGCT    CACGTCCAAG 660 CGACGGCAAC    TTCCCTGCCG    TCCAGATCCC    CTCCAGCAGC AGCGGCTGCT    CCCGTAACGA    CGACGGCAAC    TTCCCTGCCG    TCCAGATCCC    CTCCAGCAGC     720 ACCAGCTCTC    CGGTCAACCA    GCCTACCAGC    ACCAGCACCA    CGTCCACCTC    CACCACCTCG 780 AGCCCGCCAG    TCCAGCCTAC    GACTCCCAGC    GGCTGCACTG    CTGAGAGGTG    GGCTCAGTGC 840 GGCGGCAATG    GCTGGAGCGG    CTGCACCACC    TGCGTCGCTG    GCAGCACTTG    CACGAAGATT 900 AATGACTGGT    ACCATCAGTG    CCTGTAG 927 (2)SEQ ID NO：3B的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：308个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3B： Met His Leu Ser Ala Thr Thr Gly Phe Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala 1               5                           10          15 Leu Asp Gln Leu Ser Gly Ile Gly Gln Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

        20                  25                  30 Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ser Ser Pro Val

    35                  40                  45 Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Leu Asn Asp Gly Gly Ser Thr

50                  55                  60 Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Ser Gln 65                  70                  75                  80 Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val

            85                  90                  95 Lys Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ser Gln Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu

        100                 105                 110 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Ile Val Gln

    115                 120                 125 Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Ala

130                 135                 140 Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala Cys Thr Asp Gln Tyr 145                 150                 155                 160 Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Ile His Ser

            165                 170                 175 Lys Glu Glu Cys Glu Ser Phe Pro Glu Ala Leu Lys Pro Gly Cys Asn

        180                 185                 190 Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Ser Val Thr Phe

    195                 200                 205 Gln Glu Val Ala Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Lys Ser Gly Cys Ser

210                 215                 220 Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln  Ile Pro Ser Ser Ser 225                 230                 235                  240 Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr

            245                 250                 255 Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys

        260                 265                 270 Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys

    275                 280                 285 Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys  Ile Asn Asp Trp Tyr

290                 295                  300 His Gln Cys Leu 305 (2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：888个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

     (A)生物体：啤酒糖酵母，DSM 10082

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4： CCAGTGTGCT    GGAAAGCCTT    CGTGCTGTCC    CCGACGTATC    CCTGACCGCC    ATGCGTTCCA 60 CCAGCATCTT    GATCGGCCTT    GTTGCCGGCG    TCGCTGCTCA    GAGCTCTGGC    TCTGGCCATA 120 CAACCAGGTA    CTGGGACTGC    TGCAAGCCCT    CATGCGCCTG    GGATGAGAAG    GCGGCTGTCA 180 GCCGGCCGGT    CACAACATGC    GACAGGAACA    ACAGCCCCCT    TTCGCCCGGC    GCTGTGAGCG 240 GCTGCGACCC    CAACGGCGTT    GCATTCACCT    GCAACGACAA    CCAGCCTTGG    GCCGTAAACA 300 ACAATGTCGC    CTACGGTTTT    GCGGCTACCG    CCTTCCCTGG    TGGCAATGAG    GCGTCGTGGT 360 GCTGTGCCTG    CTATGCTCTT    CAATTCACAT    CCGGCCCCGT    TGCTGGCAAG    ACGATGGTTG 420

TGCAATCCAC    CAACACTGGC    GGAGATCTCA    GCGGCACTCA    CTTCGATATC    CAGATGCCCG 25  480

GTGGAGGTCT    CGGCATCTTC    GACGGCTGCA    CCCCGCAGTT    CGGCTTCACG    TTCCCCGGCA

540 30  ACCGCTACGG    CGGTACCACG    AGCCGCAGCC    AGTGCGCCGA    GCTGCCCTCC    GTCCTCCGTG

600

ACGGCTGCCA    CTGGCGTTAC    GACTGGTTCA    ACGATGCCGA    CAACCCCAAC    GTCAACTGGC

660 35

GCCGCGTCCG    ATGCCCGGCG    GCCCTCACGA    ACCGCTCCGG    CTGCGTCCGC    AACCACGACA

720

ACAGCTACCC    CGTCTTCGAG    CCCGGCACGG    GCACCCCGCC    GACCCCCACG    ACCACGACTA 40  780

CCAGCTCCCC    TCCTCAGCCC    ACCAACGGCG    GAGGCGGCGG    CACTTCTCCT    CACTGGGGCC

840

AGTGCGGCGG    CCAGGGCTGG    TCTGGCCCGA    CGGCCTGTGC    CGGTGGGTCG    ACCTGCAACC

900

TGATCAACCC    GTGGTACTCC    CAGTGCATTC    CCAACTAAGT    GATCCGGGCA    TTGCGGTCGA

960

AAGGGGACCG    TTAGTCGACA    AGGCCCAGCC    AGACCTCAGG    CAGGTGGCTG    CCATGGCAGA

1020 10  TTGTATATAG    TCTTCCGAGT    ACATACTATT    GAATGAAAAT    AAGAGCGGCT    CGGACCATGA

1080

GCAGATGCCA    TTTGATAAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAAA

1140 15

AAAAAAAAAA    AAAA    1154 (2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：295个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：5： Met Arg Ser Thr Ser Ile Leu Ile Gly Leu Val Ala Gly Val Ala Ala 1               5                   10                  15 Gln Ser Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys

        20                  25                  30 Pro Sar Cys Ala Trp Asp Glu Lys Ala Ala Val Ser Arg Pro Val Thr

    35                  40                  45 Thr Cys Asp Arg Asn Asn Ser Pro Leu Ser Pro Gly Ala Val Ser Gly

50                  55                  60 Cys Asp Pro Asn Gly Val Ala Phe Thr Cys Asn Asp Asn Gln Pro Trp 65                  70                  75                  80 Ala Val Asn Asn Asn Val Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Phe Pro

            85                  90                  95 Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Gln Phe

        100                 105                 110 Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Asn

    115                 120                 125 Thr Gly Gly Asp Leu Ser Gly Thr His Phe Asp Ile Gln Met Pro Gly

130                 135                 140 Gly Gly Leu Gly  Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Phe Thr 145                  150                 155                 160 Phe Pro Gly Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Thr Ser Arg Ser Gln Cys Ala

            165                 170                 175 Glu Leu Pro Ser Val Leu Arg Asp Gly Cys His Trp Arg Tyr Asp Trp

        180                 185                 190 Phe Asn Asp Ala Asp Asn Pro Asn Val Asn Trp Arg Arg Val Arg Cys

    195                         200         205 Pro Ala Ala Leu Thr Asn Arg Ser Gly Cys Val Arg Asn Asp Asp Asn

210                 215                 220 Ser Tyr Pro Val Phe Glu Pro Gly Thr Gly Thr Pro Pro Thr Pro Thr 225                 230                 235                 240 Thr Thr Thr Thr Ser Ser Pro Pro Gln Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly

            245                 250                 255 Gly Thr Ser Pro His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly

        260                 265                 270 Pro Thr Ala Cys Ala Gly Gly Ser Thr Cys Asn Leu Ile Asn Pro Trp

    275                 280                 285 Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Asn

290                 295 (2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1423个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

    (A)生物体：啤酒糖酵母，DSM 10080

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6： AAAGTTCTGG    CCGGAACAGA    TCTCCGTTGT    CGATCTTCGA    TTTTCCAGAC    TCAGTCTGTG 60 ACACTCCTTC    AATCCACATT    CCTTTACTTC    TTCGTCACTC    ATTCACATCA    TGATTTCAGC 120 TTGGATTCTC    CTGGGGCTGG    TAGGCGCCGT    GCCCTCCTCC    GTCATGGCCG    CCTCGGGCAA 180 AGGCCACACC    ACCCGCTACT    GGGATTGCTG    CAAGACTTCT    TGCGCATGGG    AGGGCAAGGC 240 ATCCGTCTCC    GAGCCTGTCC    TGACCTGTAA    CAAGCAGGAC    AACCCCATCG    TCGATGCCAA 300 CGCCAGAAGC    GGCTGCGACG    GCGGCGGGGC    ATTTGCCTGT    ACCAACAATT    CCCCTTGGGC 360 CGTGAGCGAG    GACCTGGCCT    ACGGATTTGC    TGCCACAGCC    CTCAGCGGCG    GCACTGAGGG 420 CAGCTGGTGC    TGCGCGTGTT    ACGCCATCAC    ATTCACGAGT    GGCCCTGTGG    CTGGCAAGAA 480 GATGGTCGTC    CAGTCCACGA    ACACGGGAGG    CGACCTGTCC    AACAACCACT    TTGACCTGAT 540 GATTCCCGGT    GGAGGCCTCG    GCATCTTTGA    CGGTTGCTCG    GCTCAGTTCG    GACAACTTCT 600 TCCCGGCGAG    CGTTACGGAG    GTGTTTCGTC    CCGCTCTCAA    TGCGATGGCA    TGCCCGAGCT 660 CTTGAAAGAC    GGTTGCCAGT    GGCGCTTCGA    CTGGTTCAAG    AACTCAGACA    ACCCTGACAT 720 CGAGTTCGAG    CAGGTCCAGT    GTCCCAAAGA    GCTCATTGCG    GTCTCTGGGT    GCGTCCGTGA 780 CGACGATAGC    AGCTTTCCCG    TCTTCCAAGG    TTCGGGCTCA    GGAGATGTCA    ACCCACCTCC 840 CAAGCCGACT    ACGACTACGA    CCTCGTCAAA    GCCGAAAACA    ACCTCTGCAC    CATCCACTCT 900 CTCGAACCCA    TCCGCCCCTC    AACAGCCAGG    GAACACTGAT    AGACCTGCCG    AGACAACCAC 960 TACCAAGCTG    CCTGCCCTGC    CGGCCACGAC    GAGCAGCCCT    GCTGTCTCAG    TTCCTTCGTC 1020 CAGCGCTCGC    GTGCCTTTGT    GGGGGCAATG    CGACTCGGAA    GCTTCATGGG    ACGCACCTAA 1080 GAAGTGTGCA    AAGGGCACCA    AGTGTGTCTA    CGTCAACGAC    TGGTACTCTC    AATGCCAGCC 1140 GAAGAACTCT    TGTGCTTGAG    AAGCAATGCT    CACAGCATGT    CCTCTTGTCA    CCCCTTCTTT 1200 TCATTCCCAA    ACATACTTAC    TGTATTATTA    TTTCCGATGC    TTCATTTCTT    GCTTGTTTCT 1260 GTCTTTCCTG    CACGCAGCTT    TCAACGATAC    CCTTCATGCG    ATTGCCCTAC    GATCAGATGA 1320 TGGGCACGAC    ATGGAGGATG    GTTTGGGCAC    TCACGCGTTC    AGGACGGGAA    AATTTATTAG 1380 GGCTGAGATC    CGTGAATTGA    CTTCATTTCG    GCGGAATGTC    TGC 1423 (2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：349个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7： Met Ile Ser Ala Trp Ile Leu Leu Gly Leu Val Gly Ala Val Pro Ser 1               5                   10                  15 Ser Val Met Ala Ala Ser Gly Lys Gly His Thr Thr Arg Tyr Trp Asp

        20                  25                  30 Cys Cys Lys Thr Ser Cys Ala Trp Glu Gly Lys Ala Ser Val Ser Glu

    35                  40                  45 Pro Val Leu Thr Cys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Ile Val Asp Ala Asn

50                  55                  60 Ala Arg Ser Gly Cys Asp Gly Gly Gly Ala Phe Ala Cys Thr Asn Asn 65                  70                  75                  80 Ser Pro Trp Ala Val Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr

            85                  90                  95 Ala Leu Ser Gly Gly Thr Glu Gly Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala

        100                 105                  110 Ile Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln

    115                 120                 125 Ser Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Ser Asn Asn His Phe Asp Leu Met

130                 135                 140 Ile Pro Gly Gly Gly Leu Gly Ile Phe Asp Gly Cys Ser Ala Gln Phe 145                 150                 155                 160 Gly Gln Leu Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Ser

            165                 170                 175 Gln Cys Asp Gly Met Pro Glu Leu Leu Lys Asp Gly Cys Gln Trp Arg

        180                 185                 190 Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ser Asp Asn Pro Asp Ile Glu Phe Glu Gln

    195                 200                 205 Val Gln Cys Pro Lys Glu Leu Ile Ala Val Ser Gly Cys Val Arg Asp

210                 215                 220 Asp Asp Ser Ser Phe Pro Val Phe Gln Gly Ser Gly Ser Gly Asp Val 225                 230                 235                 240 Asn Pro Pro Pro Lys Pro Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Pro Lys

            245                 250                 255 Thr Thr Ser Ala Pro Ser Thr Leu Ser Asn Pro Ser Ala Pro Gln Gln

        260                 265                 270 Pro Gly Asn Thr Asp Arg Pro Ala Glu Thr Thr Thr Thr Lys Leu Pro

    275                 280                  285 Ala Leu Pro Ala Thr Thr Ser Ser Pro Ala Val Ser Val Pro Ser Ser

290                 295                 300 Ser Ala Arg Val Pro Leu Trp Gly Gln Cys Asp Ser Glu Ala Ser Trp 305                 310                 315                 320 Asp Ala Pro Lys Lys Cys Ala Lys Gly Thr Lys Cys Val Tyr Val Asn

            325                 330                 335 Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Gln Pro Lys Asn Ser Cys Ala

        340                 345 (2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1174个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

    (A)生物体：啤酒糖酵母，DSM 10081

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8： GAGCAGCACC    CCTCAAGCTG    TACAGTTTCC    ACCCCGCTCT    CTTTTCTTCG    GCCCCCAGGA 60 TGCGCTCTAC    TCCCGTTCTT    CGCACAACCC    TGGCCGCTGC    ACTTCCTCTG    GTCGCCTCCG 120 CGGCCAGTGG    CAGTGGCCAG    TCCACGAGAT    ACTGGGACTG    CTGCAAGCCG    TCGTGCGCTT 180 GGCCCGGGAA    GGCCGCCGTC    AGCCAACCGG    TCTACGCGTG    CGATGCCAAC    TTCCAGCGCC 240 TGTCCGACTT    CAATGTCCAG    TCGGGCTGCA    ACGGCGGCTC    GGCCTACTCC    TGCGCCGACC 300 AGACTCCCTG    GGCGGTGAAC    GACAATCTCG    CCTACGGCTT    CGCCGCGACG    AGCATCGCCG 360 GCGGGTCCGA    ATCCTCGTGG    TGCTGCGCCT    GCTACGCGCT    CACCTTCACT    TCCGGTCCCG 420 TCGCCGGCAA    GACAATGGTG    GTGCAGTCAA    CGAGCACTGG    CGGCGACCTG    GGAAGTAACC 480 AGTTCGATAT    CGCCATGCCC    GGCGGCGGCG    TGGGCATCTT    CAACGGCTGC    AGCTCGCAGT 540 TCGGCGGCCT    CCCCGGCGCT    CAATACGGCG    GCATTTCGTC    GCGCGACCAG    TGCGATTCCT 600 TCCCCGCGCC    GCTCAAGCCC    GGCTGCCAGT    GGCGCTTTGA    CTGGTTCCAG    AACGCCGACA 660 ACCCGACGTT    CACGTTCCAG    CAGGTGCAGT    GCCCCGCCGA    GATCGTTGCC    CGCTCCGGCT 720 GCAAGCGCAA    CGACGACTCC    AGCTTCCCCG    TCTTCACCCC    CCCAAGCGGT    GGCAACGGTG 780 GCACCGGGAC    GCCCACGTCG    ACTGCGCCTG    GGTCGGGCCA    GACGTCTCCC    GGCGGCGGCA 840 GTGGCTGCAC    GTCTCAGAAG    TGGGCTCAGT    GCGGTGGCAT    CGGCTTCAGC    GGATGCACCA 900 CCTGTGTCTC    TGGCACCACC    TGCCAGAAGT    TGAACGACTA    CTACTCGCAG    TGCCTCTAAA 960 CAGCTTTTCG    CACGAGGTGG    CGGGACGGAG    CAAGGAGACC    GTCAACTTCG    TCATGCATAT 1020 TTTTTGAGCG    CTCAATACAT    ACATAACCTT    CGATTCTTGT    ACATAGCACG    CCGGTACACA 1080 TCTCACACCG    ACTTTGGGGG    CGGAATCAGG    CCCGTTTTAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA 1140 AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA    AAAA 1174 (2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：299个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9： Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Thr Leu Ala Ala Ala Leu Pro 1               5                   10                  15 Leu Val Ala Ser Ala Ala Ser Gly Ser Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp

        20                  25                  30 Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser

    35                  40                  45 Gln Pro Val Tyr Ala Cys Asp Ala Asn Phe Gln Arg Leu Ser Asp Phe

50                  55                  60 Asn Val Gln Ser Gly Cys Asn Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp 65              70                      75                  80 Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala

            85                  90                  95 Thr Ser Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr

        100                 105                 110 Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val

    115                 120                 125 Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Ile

130                 135                 140 Ala Met Pro Gly Gly Gly Val Gly  Ile Phe Asn Gly Cys Ser Ser Gln 145                 150                  155                 160 Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asp

            165                 170                 175 Gln Cys Asp Ser Phe Pro Ala Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg

        180                 185                 190 Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Gln

    195                 200                 205 Val Gln Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Arg Ser Gly Cys Lys Arg Asn

210                 215                     220 Asp Asp Ser Ser Phe Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly 225                 230                 235                 240 Gly Thr Gly Thr Pro Thr Ser Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser

            245                 250                 255 Pro Gly Gly Gly Ser Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly

        260                 265                 270 Gly Ile Gly Phe Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys

    275                 280                 285 Gln Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

290                 295 (2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：913个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

    (A)生物体：大肠杆菌，DSM 10512

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10： GCACTATTCT    CAGCTCCATT    CTCCCTTGAA    GTAATTCACC    ATGTTCTCTC    CGCTCTGGGC 60 CCTGTCGGCT    CTGCTCCTAT    TTCCTGCCAC    TGAAGCCACT    AGCGGCGTGA    CAACCAGGTA 120 CTGGGACTGC    TGCAAGCCGT    CTTGTGCTTG    GACGGGCAAA    GCATCCGTCT    CCAAGCCCGT 180 CGGAACCTGC    GACATCAACG    ACAACGCCCA    GACGCCGAGC    GATCTGCTCA    AGTCGTCCTG 240 TGATGGCGGC    AGCGCCTACT    ACTGCAGCAA    CCAGGGCCCA    TGGGCCGTGA    ACGACAGCCT 300 TTCCTACGGC    TTCGCTGCCG    CCAAGCTGTC    CGGAAAGCAG    GAGACTGATT    GGTGCTGTGG 360 CTGCTACAAG    CTCACATTCA    CCTCCACCGC    CGTTTCCGGC    AAGCAAATGA    TCGTGCAAAT 420 CACGAACACG    GGCGGCGACC    TCGGCAACAA    CCACTTCGAC    ATCGCCATGC    CGGGCGGCGG 480 CGTCGGCATC    TTCAACGGGT    GCTCCAAGCA    ATGGAACGGC    ATCAATCTGG    GCAACCAGTA 540 TGGCGGCTTC    ACTGACCGCT    CGCAATGTGC    GACGCTCCCG    TCCAAGTGGC    AGGCCAGCTG 600 CAACTGGCGC    TTCGACTGGT    TCGAGAATGC    CGACAACCCC    ACCGTCGATT    GGGAGCCTGT 660 CACTTGCCCA    CAGGAATTGG    TCGCCCGGAC    TGGCTGTTCC    CGTACCTAAG    TGGGGGTGGA 720 ACCTCCATGT    GAATTGGTGT    ATATAGCTCC    TGCCTGAGCA    TCCACCAGTT    CGCATGTGTT 780 GATCAGGAGT    TGTGTTGCCT    TGCTAGGAAA    GACTTTGTTG    GAAACTTGCG    TGTTTATTCC 840 AATTGAATAA    CCCTGTATAG    ACCGGTCACA    TTTTTCTCTG    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA 900 AAAAAAAAAA    AAA 913 (2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：222个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：11： Met Phe Ser Pro Leu Trp Ala Leu Ser Ala Leu Leu Leu Phe Pro Ala 1               5                   10                  15 Thr Glu Ala Thr Ser Gly Val Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys

        20                  25                  30 Pro Ser Cys Ala Trp Thr Gly Lys Ala Ser Val Ser Lys Pro Val Gly

    35                  40                  45 Thr Cys Asp Ile Asn Asp Asn Ala Gln Thr Pro Ser Asp Leu Leu Lys

50                  55                  60 Ser Ser Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Cys Ser Asn Gln Gly Pro 65                  70                  75                  80 Trp Ala Val Asn Asp Ser Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Ala Lys Leu

            85                  90                  95 Ser Gly Lys Gln Glu Thr Asp Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Lys Leu Thr

        100                 105                 110 Phe Thr Ser Thr Ala Val Ser Gly Lys Gln Met Ile Val Gln Ile Thr

    115                 120                 125 Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro

130                 135                 140 Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ser Lys Gln Trp Asn Gly 145                 150                 155                 160 Ile Asn Leu Gly Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Asp Arg Ser Gln Cys

            165                 170                 175 Ala Thr Leu Pro Ser Lys Trp Gln Ala Ser Cys Asn Trp Arg Phe Asp

        180                 185                 190 Trp Phe Glu Asn Ala Asp Asn Pro Thr Val Asp Trp Glu Pro Val Thr

    195                 200                 205 Cys Pro Gln Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Ser Arg Thr

210                 215                 220 (2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：808个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

    (A)生物体：大肠杆菌，DSM 10511

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12： CCGCTGCTGG    GTATATAATG    CTCAGACTTG    GAACCAATGG    TCCATCCAAA    CATGCTTAAA 60 ACGCTCGCTC    CATTGATCAT    CTTGGCCGCC    TCGGTCACAG    CGCAAACAGC   AGGAGTTACG 120 ACCCGCTACT    GGGACTGCTG    CAAGCCAAGC    TGTGGATGGA    GTGGAAAGGC    TTCTGTTTCT 180 GCTCCAGTCA    GAACTTGCGA    TCGTAATGGA    AATACACTTG    GCCCAGACGT    GAAAAGCGGA 240 TGTGATAGCG    GTGGAACGTC    ATTCACTTGC    GCGAACAATG    GTCCATTTGC    GATTGACAAT 300 AACACTGCAT    ATGGTTTTGC    TGCAGCCCAC    TTAGCGGGCT    CTAGCGAAGC    AGCCTGGTGT 360 TGCCAGTGCT    ACGAATTGAC    GTTTACGAGT    GGACCCGTAG    TTGGGAAGAA    ACTGACCGTT 420 CAAGTCACAA    ACACGGGAGG    TGACCTCGGA    AATAATCACT    TTGACCTGAT    GATCCCCGGT 480 GGAGGTGTTG    GCCTCTTCAC    ACAAGGATGT    CCTGCTCAGT    TTGGGAGCTG    GAACGGGGGT 540 GCTCAATACG    GGGGTGTGTC    CAGCCGTGAC    CAATGCTCCC    AACTTCCAGC    AGCTGTGCAA 600 GCTGGATGTC    AATTCCGTTT    CGACTGGATG    GGTGGCGCGG    ATAACCCCAA    CGTCACCTTC 660 CGACCTGTGA    CCTGCCCAGC    GCAGCTCACT    AATATCTCGG    GCTGTGTTCG    TAAATGATTC 720 ACGAATATGT    AGTGTCGAAT    ATGTACATGT    GTATGTACTA    TAGCTTCAAA    GATGGAGGGT 780 CTGTTTAAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAA 808 (2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：226个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13： Met Val His Pro Asn Met Leu Lys Thr Leu Ala Pro Leu Ile Ile Leu 1               5                   10                  15 Ala Ala Ser Val Thr Ala Gln Thr Ala Gly Val Thr Thr Arg Tyr Trp

        20                  25                  30 Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ser Gly Lys Ala Ser Val Ser

    35                  40                  45 Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp Arg Asn Gly Asn Thr Leu Gly Pro Asp

50                  55                   60 Val Lys Ser Gly Cys Asp Ser Gly Gly Thr Ser Phe Thr Cys Ala Asn 65                  70                  75                  80 Asn Gly Pro Phe Ala Ile Asp Asn Asn Thr Ala Tyr Gly Phe Ala Ala

            85                  90                  95 Ala His Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ala Ala Trp Cys Cys Gln Cys Tyr

        100                 105                 110 Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Val Gly Lys Lys Leu Thr Val

    115                 120                 125 Gln Val Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu

130                 135                 140 Met Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Leu Phe Thr Gln Gly Cys Pro Ala 145                 150                 155                 160 Gln Phe Gly Ser Trp Asn Gly Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Val Ser Ser

            165                 170                 175 Arg Asp Gln Cys Ser Gln Leu Pro Ala Ala Val Gln Ala Gly Cys Gln

        180                 185                 190 Phe Arg Phe Asp Trp Met Gly Gly Ala Asp Asn Pro Asn Val Thr Phe

    195                 200                 205 Arg Pro Val Thr Cys Pro Ala Gln Leu Thr Asn Ile Ser Gly Cys Val

210                 215                 220 Arg Lys 225 (2)SEQ ID NO：14-A的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1048个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14-A： GACTTGGAAC    CAATGGTCCA    TCCAAACATG CTTAAAACGC    TCGCTCCATT    GATCATCTTG 60 GCCGCCTCGG    TCACAGCGCA    AACAGCAGGA GTTACGACCC    GCTACTGGGA    CTGCTGCAAG 120 CCAAGCTGTG    GATGGAGTGG    AAAGGCTTCT GTTTCTGCTC    CAGTCAGAAC    TTGCGATCGT 180 AATGGAAATA    CACTTGGCCC    AGACGTGAAA    AGCGGATGTG    ATAGCGGTGG    AACGTCATTC 240 ACTTGCGCGA    ACAATGGTCC    ATTTGCGATT    GACAATAACA    CTGCATATGG    TTTTGCTGCA 300 GCCCACTTAG    CGGGCTCTAG    CGAAGCAGCC    TGGTGTTGCC    AGTGCTACGA    ATTGACGTTT 360 ACGAGTGGAC    CCGTAGTTGG    GAAGAAACTG    ACCGTTCAAG    TCACAAACAC    GGGAGGTGAC 420 CTCGGAAATA    ATCACTTTGA    CCTGATGATC    CCCGGTGGAG    GTGTTGGCCT    CTTCACACAA 480 GGATGTCCTG    CTCAGTTTGG    GAGCTGGAAC    GGGGGTGCTC    AATACGGGGG    TGTGTCCAGC 540 CGTGACCAAT    GCTCCCAACT    TCCAGCAGCT    GTGCAAGCTG    GATGTCAATT    CCGTTTCGAC 600 TGGATGGGTG    GCGCGGATAA    CCCCAACGTC    ACCTTCCGAC    CTGTGACCTG    CCCAGCGCAG 660 CTCACTAATA    TCTCGGGCTG    TGTTCGTAAA    CCCTCCAGCA    GCACCAGCTC    TCCGGTCAAC 720 CAGCCTACCA    GCACCAGCAC    CACGTCCACC    TCCACCACCT    CGAGCCCGCC    AGTCCAGCCT 780 ACGACTCCCA    GCGGCTGCAC    TGCTGAGAGG    TCCGCTCAGT    GCGGCGGCAA    TGGCTGGAGC 840 GGCTGCACCA    CCTGCGTCGC    TGGCAGCACT    TGCACGAAGA    TTAATGACTG    GTACCATCAG 900 TGCCTGTAGA    CGCAGGGCAG    CTTGAGGGCC    TTACTGGTGG    CGCAACGAAA    TGACACTCCC 960 AATCACTGTA    TTAGTTCTTG    TACATAATTT    CGTCATCCCT    CCAGGGATTG    TCACATAAAT 1020 GCAATGAGGA    ACAATGAGTA    CAGAATTC 1048 (2)SEQ ID NO：14-B的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：298个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：14-B： Met Val His Pro Asn Met Leu Lys Thr Leu Ala Pro Leu  Ile Ile Leu 1               5                   10                   15 Ala Ala Ser Val Thr Ala Gln Thr Ala Gly Val Thr Thr Arg Tyr Trp

        20                  25                  30 Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ser Gly Lys Ala Ser Val  Ser

    35                  40                  45 Ala Pro Val Arg Thr Cys Asp Arg Asn Gly Asn Thr Leu Gly Pro Asp

50                  55                  60 Val Lys Ser Gly Cys Asp Ser Gly Gly Thr Ser Phe Thr Cys Ala Asn 65                  70                  75                  80 Asn Gly Pro Phe Ala Ile Asp Asn Asn Thr Ala Tyr Gly Phe Ala Ala

            85                          90          95 Ala His Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ala Ala Trp Cys Cys Gln Cys Tyr

        100                 105                 110 Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Val Gly Lys Lys Leu Thr Val

    115                 120                 125 Gln Val Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu

130                 135                 140 Met Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Leu Phe Thr Gln Gly Cys Pro Ala 145                 150                 155                 160 Gln Phe Gly Ser Trp Asn Gly Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Val Ser Ser

            165                 170                 175 Arg Asp Gln Cys Ser Gln Leu  Pro Ala Ala Val Gln Ala Gly Cys Gln

        180                  185                 190 Phe Arg Phe Asp Trp Met Gly Gly Ala Asp Asn Pro Asn Val Thr Phe

    195                 200                 205 Arg Pro Val Thr Cys Pro Ala Gln Leu Thr Asn Ile Ser Gly Cys Val

210                 215                 220 Arg Lys Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser 225                 230                 235                 240 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro

            245                 250                 255 Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly

        260                 265                 270 Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr

    275                 280                 285 Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys Leu

290                 295 (2)SEQ ID NO：15-A的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1031个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15-A： CCATCCAAAC    ATGCTTAAAA    CGCTCGCTCC    ATTGATCATC    TTGGCCGCCT    CGGTCACAGC 60 GCAAACAGCA    GGAGTTACGA    CCCGCTACTG    GGACTGCTGC    AAGCCAAGCT    GTGGATGGAG 120 TGGAAAGGCT    TCTGTTTCTG    CTCCAGTCAG    AACTTGCGAT    CGTAATGGAA    ATACACTTGG 180 CCCAGACGTG    AAAAGCGGAT    GTGATAGCGG    TGGAACGTCA    TTCACTTGCG    CGAACAATGG 240 TCCATTTGCG    ATTGACAATA    ACACTGCATA    TGGTTTTGCT    GCAGCCCACT    TAGCGGGCTC 300 TAGCGAAGCA    GCCTGGTGTT    GCCAGTGCTA    CGAATTGACG    TTTACGAGTG    GACCCGTAGT 360 TGGGAAGAAA    CTGACCGTTC    AAGTCACAAA    CACGGGAGGT    GACCTCGGAA    ATAATCACTT 420 TGACCTGATG    ATCCCCGGTG    GAGGTGTTGG    CCTCTTCACA    CAAGGATGTC    CTGCTCAGTT 480 TGGGAGCTGG    AACGGGGGTG    CTCAATACGG    GGGTGTGTCC    AGCCGTGACC    AATGCTCCCA 540 ACTTCCAGCA    GCTGTGCAAG    CTGGATGTCA    ATTCCGTTTC    GACTGGATGG    GTGGCGCGGA 600 TAACCCCAAC    GTCACCTTCC    GACCTGTGAC    CTGCCCAGCG    CAGCTCACTA    ATATCTCGGG 660 CTGTGTTCGT    AAACCCTCCA    GCAGCACCAG    CTCTCCGGTC    AACCAGCCTA    CCAGCACCAG 720 CACCACGTCC    ACCTCCACCA    CCTCGAGCCC    GCCAGTCCAG    CCTACGACTC    CCAGCGGCTG 780 CACTGCTGAG    AGGTGGGCTC    AGTGCGGCGG    CAATGGCTGG    AGCGGCTGCA    CCACCTGCGT 840 CGCTGGCAGC    ACTTGCACGA    AGATTAATGA    CTGGTACCAT    CAGTGCCTGT    AGACGCAGGG 900 CAGCTTGAGG    GCCTTACTGG    TGGCGCAACG    AAATGACACT    CCCAATCACT    GTATTAGTTC 960 TTGTACATAA    TTTCGTCATC    CCTCCAGGGA    TTGTCACATA    AATGCAATGA    GGAACAATGA 1020 GTACAGAATT    C 1031 (2)SEQ ID NO：15-B的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：293个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15-B： Met Leu Lys Thr Leu Ala Pro Leu Ile Ile Leu Ala Ala Ser Val Thr 1               5                   10                  15 Ala Gln Thr Ala Gly Val Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys  Pro

        20                  25                  30 Ser Cys Gly Trp Ser Gly Lys Ala Ser Val  Ser Ala Pro Val Arg Thr

    35                  40                   45 Cys Asp Arg Asn Gly Asn Thr Leu Gly Pro Asp Val Lys Ser Gly Cys

50                  55                  60 Asp Ser Gly Gly Thr Ser Phe Thr Cys Ala Asn Asn Gly Pro Phe Ala 65                  70                  75                  80 Ile Asp Asn Asn Thr Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Ala His Leu Ala Gly

            85                  90                  95 Ser Ser Glu Ala Ala Trp Cys Cys Gln Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr

        100                 105                 110 Ser Gly Pro Val Val Gly Lys Lys Leu Thr Val Gln Val Thr Asn Thr

    115                 120                 125 Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Met Ile Pro Gly Gly

130                 135                 140 Gly Val Gly Leu Phe Thr Gln Gly Cys Pro Ala Gln Phe Gly Ser Trp 145                 150                 155                 160 Asn Gly Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Val Ser Ser Arg Asp Gln Cys Ser

            165                 170                 175 Gln Leu Pro Ala Ala Val Gln Ala Gly Cys Gln Phe Arg Phe Asp Trp

        180                 185                 190 Met Gly Gly Ala Asp Asn Pro Asn Val Thr Phe Arg Pro Val Thr Cys

    195                 200                 205 Pro Ala Gln Leu Thr Asn Ile Ser Gly Cys Val Arg Lys Pro Ser Ser

210                 215                 220 Ser Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser 225                 230                 235                 240 Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly

            245                 250                 255 Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly

        260                 265                 270 Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp

    275                 280                 285 Tyr His Gln Cys Leu

290 (2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征

    (A)长度：1132个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：大肠杆菌，DSM 10571 (xi)序列描述：SEQ ID NO：16： CAACAGTTCA    AACACCTACA    AGGTCCCGTG    CCCTGTAGAC    CATGCGTTCC    TCTGCAGTCC 60 TCATCGGCCT    CGTGGCCGGT    GTGGCCGCCC    AGTCCTCTGG    CACCGGCCGC    ACCACCAGAT 120 ACTGGGACTG    CTGCAAGCCG    TCCTGCGGGT    GGGACGAAAA    GGCCTCCGTC    AGCCAGCCCG 180 TCAAGACGTG    CGATAGGAAC    AACAACCCTC    TCGCGTCCAC    GGCCAGGAGC    GGCTGCGATT 240 CCAACGGCGT    CGCCTACACG    TGCAACGATA    ACCAGCCGTG    GGCTGTCAAC    GATAACCTGG 300 CCTATGGTTT    TGCTGCCACG    GCTTTCAGTG    GTGGATCGGA    GGCCAGCTGG    TGCTGTGCCT 360 GCTATGCCCT    TCAGTTCACC    TCCGGCCCTG    TTGCGGGAAA    GACCATGGTC    GTCCAGTCGA 420 CAAACACCGG    CGGCGACCTC    AGCGGCAACC    ACTTTGACAT    CCTCATGCCC    GGCGGCGGCC 480 TGGGCATCTT    CGACGGCTGC    ACCCCGCAAT    GGGGCGTCAG    CTTCCCCGGA    AACCGCTACG 540 GCGGCACCAC    CAGCCGCAGC    CAGTGCTCCC    AAATCCCCTC    GGCCCTGCAG    CCCGGCTGCA 600 ACTGGCGGTA    CGACTGGTTC    AACGACGCCG    ACAACCCCGA    CGTCTCGTGG    CGCCGCGTCC 660 AGTGCCCCGC    CGCACTCACC    GACCGCACCG    GCTGCCGCCG    CTCCGATGAC    GGGAACTATC 720 CCGTCTTCCA    GCCCGGTCCG    CCCCCGGCCA    CGACGATCAG    GACATCGACT    ACCATCACAG 780 CCTCATCGTC    GTCTTCGTCT    TCGTCGTCGT    CGACTACGGC    TGGTAGCCCG    CCTGTGCCGA 840 CTGGTGGTGG    TAGTGGGCCA    ACGTCGCCTG    TCTGGGGACA    GTGCGGCGGT    CAGGGATGGA 900 GTGGTCCTAC    GCGTTGTGTT    GCTGGGTCGA    CATGCAGTGT    GGTCAACCCG    TGGTACTCGC 960 AGTGTTTTCC    TTAAGGAGCC    TCTGGCTGAG    CAGATCCTTT    CGAAGAGGAG    GGTCTCTCTG 1020 CTCTTTCAGT    CTGTTCAGGG    AACGGCCGTC    TCGGCTACAT    TGTACATATC    CCACCTCGTA 1080 TATAGCTAGC    TCATCTACAC    TTGTGATCTC    CAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA    AA 1132 (2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：310个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17： Met Arg Ser Ser Ala Val Leu Ile Gly Leu Val Ala Gly Val Ala Ala 1               5                   10                  15 Gln Ser Ser Gly Thr Gly Arg Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys

        20                  25                  30 Pro Ser Cys Gly Trp Asp Glu Lys Ala Ser Val Ser Gln Pro Val Lys

    35                  40                  45 Thr Cys Asp Arg Asn Asn Asn Pro Leu Ala Ser Thr Ala Arg Ser Gly

50                  55                  60 Cys Asp Ser Asn Gly Val Ala Tyr Thr Cys Asn Asp Asn Gln Pro Trp 65                  70                  75                  80 Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Phe Ser

            85                  90                  95 Gly Gly Ser Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Gln Phe

        100                 105                 110 Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Asn

    115                 120                 125 Thr Gly Gly Asp Leu Ser Gly Asn His Phe Asp Ile Leu Met Pro Gly

130                 135                 140 Gly Gly Leu Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Trp Gly Val Ser 145                 150                 155                 160 Phe Pro Gly Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Thr Ser Arg Ser Gln Cys Ser

            165                 170                 175 Gln Ile Pro Ser Ala Leu Gln Pro Gly Cys Asn Trp Arg Tyr Asp Trp

        180                 185                 190 Phe Asn Asp Ala Asp Asn Pro Asp Val Ser Trp Arg Arg Val Gln Cys

            195            200              205 Pro Ala Ala Leu Thr Asp Arg Thr Gly Cys Arg Arg Ser Asp Asp Gly

210                 215                 220 Asn Tyr Pro Val Phe Gln Pro Gly Pro Pro Pro Ala Thr Thr Ile Arg 225                 230                 235                 240 Thr Ser Thr Thr Ile Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

            245                 250                 255 Ser Thr Thr Ala Gly Ser Pro Pro Val Pro Thr Gly Gly Gly Ser Gly

        260                 265                 270 Pro Thr Ser Pro Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly

    275                 280                 285 Pro Thr Arg Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Ser Val Val Asn Pro Trp

290                 295                 300 Tyr Ser Gln Cys Phe Pro 305                 310 (2)SEQ ID NO：18-A的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：885个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：来源于壳球孢属的构建体 (xi)序列描述：SEQ ID NO：18-A： ATG  TTC  TCT  CCG  CTC  TGG  GCC  CTG  TCG  GCT  CTG  CTC  CTA  TTT  CCT  GCC  48 Mer  Phe  Ser  Pro  Leu  Trp  Ala  Leu  Ser  Ala  Leu  Leu  Leu  Phe  Pro  Ala

           145                      150                      155 ACT  GAA  GCC  ACT  AGC  GGC  GTG  ACA  ACC  AGG  TAC  TGG  GAC  TGC  TGC  AAG  96 Thr  Glu  Ala  Thr  Ser  Gly  Val  Thr  Thr  Arg  Tyr  Trp  Asp  Cys  Cys  Lys

      160                      165                      170 CCG  TCT  TGT  GCT  TGG  ACG  GGC  AAA  GCA  TCC  GTC  TCC  AAG  CCC  GTC  GGA 144 Pro  Ser  Cys  Ala  Trp  Thr  Gly  Lys  Ala  Ser  Val  Ser  Lys  Pro  Val  Gly

175                       180            185 ACC  TGC  GAC  ATC  AAC  GAC  AAC  GCC  CAG  ACG  CCG  AGC  GAT  CTG  CTC  AAG 192 Thr  Cys  Asp  Ile  Asn  Asp  Asn  Ala  Gln  Thr  Pro  Ser  Asp  Leu  Leu  Lys 190                      195                      200                      205 TCG  TCC  TGT  GAT  GGC  GGC  AGC  GCC  TAC  TAC  TGC  AGC  AAC  CAG  GGC  CCA 240 Ser  Ser  Cys  Asp  Gly  Gly  Ser  Ala  Tyr  Tyr  Cys  Ser  Asn  Gln  Gly  Pro

                210                 215                           220 TGG  GCC  GTG  AAC  GAC  AGC  CTT  TCC  TAC  GGC  TTC  GCT  GCC  GCC  AAG  CTG 288 Trp  Ala  Val  Asn  Asp  Ser  Leu  Ser  Tyr  Gly  Phe  Ala  Ala  Ala  Lys  Leu

           225                      230                      235 TCC  GGA  AAG  CAG  GAG  ACT  GAT  TGG  TGC  TGT  GGC  TGC  TAC  AAG  CTC  ACA 336 Ser  Gly  Lys  Gln  Glu  Thr  Asp  Trp  Cys  Cys  Gly  Cys  Tyr  Lys  Leu  Thr

      240                      245                      250 TTC  ACC  TCC  ACC  GCC  GTT  TCC  GGC  AAG  CAA  ATG  ATC  GTG  CAA  ATC  ACG 384 Phe  Thr  Ser  Thr  Ala  Val  Ser  Gly  Lys  Gln  Met  Ile  Val  Gln  Ile  Thr

 255                      260                      265 20     AAC  ACG  GGC  GGC  GAC  CTC  GGC  AAC  AAC  CAC  TTC  GAC  ATC  GCC  ATG  CCG

   432

   Asn  Thr  Gly  Gly  Asp  Leu  Gly  Asn  Asn  His  Phe  Asp  Ile  Ala  Met  Pro

   270                      275                      280                      285 25     GGC  GGC  GGC GTC  GGC  ATC  TTC  AAC  GGG  TGC  TCC  AAG  CAA  TGG  AAC  GGC

   480

   Gly  Gly  Gly  Val  Gly  Ile  Phe  Asn  Gly  Cys  Ser  Lys  Gln  Trp  Asn  Gly

                       290                      295                      300 30     ATC  AAT  CTG  GGC  AAC  CAG  TAT  GGC  GGC  TTC  ACT  GAC  CGC  TCG  CAA  TGT

   528

   Ile  Asn  Leu  Gly  Asn  Gln  Tyr  Gly  Gly  Phe  Thr  Asp  Arg  Ser  Gln  Cys

                  305                      310                      315 35     GCG  ACG  CTC  CCG  TCC  AAG  TGG  CAG  GCC  AGC  TGC  AAC  TGG  CGC  TTC  GAC

   576

   Ala  Thr  Leu  Pro  Ser  Lys  Trp  Gln  Ala  Ser  Cys  Asn  Trp  Arg  Phe  Asp

             320                      325                      330 40     TGG  TTC  GAG  AAT  GCC  GAC  AAC  CCC  ACC  GTC  GAT  TGG  GAG  CCT  GTC  ACT

   624

   Trp  Phe  Glu  Asn  Ala  Asp  Asn  Pro  Thr  Val  Asp  Trp  Glu  Pro  Val  Thr

        335                      340                      345

   TGC  CCA  CAG  GAA  TTG  GTC  GCC  CGG  ACT  GGC  TGT  TCC  CGT  ACC  CCC  TCC

    672

   Cys  Pro  Gln  Glu  Leu  Val  Ala  Arg  Thr  Gly  Cys  Ser  Arg  Thr  Pro  Ser

   350                      355                      360                      365

   AGC  AGC  ACC  AGC  TCT  CCG  GTC  AAC  CAG  CCT  ACC  AGC  ACC  AGC  ACC  ACG

   720

   Ser  Ser  Thr  Ser  Ser  Pro  Val  Asn  Gln  Pro  Thr  Ser  Thr  Ser  Thr  Thr

                       370                      375            380 10

   TCC  ACC  TCC  ACC  ACC  TCG  AGC  CCG  CCA  GTC  CAG  CCT  ACG  ACT  CCC  AGC

   768

   Ser  Thr  Ser  Thr  Thr  Ser  Ser  Pro  Pro  Val  Gln  Pro  Thr  Thr  Pro  Ser 

                  385                      390                      395 15

   GGC  TGC  ACT  GCT  GAG  AGG  TGG  GCT  CAG  TGC  GGC  GGC  AAT  GGC  TGG  AGC

   816

   Gly  Cys  Thr  Ala  Glu  Arg  Trp  Ala  Gln  Cys  Gly  Gly  Asn  Gly  Trp  Ser 

             400                     405                       410 20

   GGC  TGC  ACC  ACC  TGC  GTC  GCT  GGC  AGC  ACT  TGC  ACG  AAG  ATT  AAT  GAC

   864 Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp

415                 420                 425 TGG TAC CAT CAG TGC CTG TAG 885 Trp Tyr His Gln Cys Leu  * 430                 435 (2)SEQ ID NO：18-B的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：295个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18-B： Met Phe Ser Pro Leu Trp Ala Leu Ser Ala Leu Leu Leu Phe Pro Ala   1               5                  10                  15 Thr Glu Ala Thr Ser Gly Val Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys

         20                  25                  30 Pro Ser Cys Ala Trp Thr Gly Lys Ala Ser Val Ser Lys Pro Var Gly

     35                  40                  45 Thr Cys Asp Ile Asn Asp Asn Ala Gln Thr Pro Ser Asp Leu Leu Lys

 50                  55                  60 Ser Ser Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Cys Ser Asn Gln Gly Pro  65                  70                  75                  80 Trp Ala Val Asn Asp Ser Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Ala Lys Leu

             85                  90                  95 Ser Gly Lys Gln Glu Thr Asp Trp Cys Cys Gly Cys Tyr Lys Leu Thr

        100                 105                 110 Phe Thr Ser Thr Ala Val Ser Gly Lys Gln Met Ile Val Gln Ile Thr

    115                 120                 125 Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Ile Ala Met Pro

130                 135                 140 Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn GIy Cys Ser Lys Gln Trp Asn Gly 145                 150                 155                 160 Ile Asn Leu Gly Asn Gln Tyr Gly Gly Phe Thr Asp Arg Ser Gln Cys

            165                 170                 175 Ala Thr Leu Pro Ser Lys Trp Gln Ala Ser Cys Asn Trp Arg Phe Asp

        180                 185                 190 Trp Phe Glu Asn Ala Asp Asn Pro Thr Val Asp Trp Glu Pro Val Thr

    195                 200                 205 Cys Pro Gln Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Ser Arg Thr Pro Ser

210                 215                 220 Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr 225                 230                 235                 240 Ser Thr Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser

            245                 250                 255 Gly Cys Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser

        260                 265                 270 Gly Cys Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp

    275                 280                 285 Trp Tyr His Gln Cys Leu  *

290                 295 (2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：425个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：大肠杆菌，DSM 10576 (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...425 (xi)序列描述：SEQ ID NO：19： CAAGATACAA    TATGCGTTCC    TCCACTATTT    TGCAAACCGG    CCTGGTGGCC    GTTCTCCCCT  60 TCGCCGTCCA    GGCCGCCTCA    GGATCCGGCA    AGTCCACCAG    ATATTGGGAC    TGCTGCAAAC 120 CATCTTGTGC    CTGGTCCGGC    AAGGCTTCTG    TCAACCGCCC    TGTTCTCGCC    TGCAACGCAA 180 ACAACAACCC    GCTGAACGAC    GCCAACGTCA    AGTCAGGATG    TGATGGCGGT    TCTGCATACA 240 CCTGTGCCAA    CAACTCTCCC    TGGGCAGTGA    ATGACAATCT    GGCCTACGGC    TTCGCGGCCA 300 CAAAACTCAG    CGGGGGGACC    GAGTCATCTT    GGTGCTGCGC    CTGTTATGCC    CTCACATTCA 360 CATCGGGTCC    TGTTTCTGGC    AAAACCTTGG    TTGTCCAGTC    TACCAGTACC    GGTGGTGATC 420 TTGGC 425 (2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：141个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：20： Met Arg Ser Ser Thr Ile Leu Gln Thr Gly Leu Val Ala Val Leu Pro 1               5                   10                   15 Phe Ala Val Gln Ala Ala Ser Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp

         20                  25                  30 Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Ser Gly Lys Ala Ser Val Asn

     35                   40                 45 Arg Pro Val Leu Ala Cys Asn Ala Asn Asn Asn Pro Leu Asn Asp Ala

 50                  55                  60 Asn Val Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys Ala Asn 65                  70                  75                  80 Asn Ser Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala

             85                  90                  95 Thr Lys Leu Ser Gly Gly Thr Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr

        100                 105                 110 Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Thr Leu Val Val

    115                 120                 125 Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly

130                 135 (2)SEQ ID NO：21的信息： (i)序列特征：

  (A)长度：108个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：Saccobolus dilutellus

  (B)菌株：CBS 275.96 (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...108 (xi)序列描述：SEQ ID NO：21： TCG GCT TGC GAT AAC GGT GGT GGC ACT GCA TAC ATG TGT GCC AGC CAG Ser Ala Cys Asp Asn Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Met Cys Ala Ser Gln   1               5                  10                  15 GAG CCG TGG GCA GTG AGC TCC AAC GTC GCG TAC GGC TTT GCT GCA GTT Glu Pro Trp Ala Val Ser Ser Asn Val Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Val

         20                  25                  30 AGA ATC AGC GGA Arg Ile Ser Gly

     35 (2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：36个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22： Ser Ala Cys Asp Asn Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Met Cys Ala Ser Gln   l               5                  10                  15 Glu Pro Trp Ala Val Ser Ser Asn Val Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Val

         20                  25                  30 Arg Ile Ser Gly

     35 (2)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：99个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：Thermonyces Verrucosus

      (B)菌株：CBS 285.96

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...99

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23： GCC TGC AAC GCA AAC TTC CAG CGC ATC AGT GAC CCC AAC GCC AAG TCG Ala Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Ala Lys Ser GGC TGC GAT GGT GGC TCG GCC TTC TCT TGC GCC AAA CAA ACC CCT TGG Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ser Cys Ala Lys Gln Thr Pro Trp GCC Ala (2)SEQ ID NO：24的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：33个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24： Ala Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Ser Asp Pro Asn Ala Lys Ser   1           5                      10                  15 Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ser Cys Ala Lys Gln Thr Pro Trp

         20                  25                  30     Ala (2)SEQ ID NO：25的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：225个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：鹿角团炭角菌

      (B)菌株：CBS 284.96

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...225 (xi)序列描述：SEQ ID NO：25： GAC CAG CCG CTC GGC GGA CAA CGG ACG CGA CCA AGG AGC GCG TGC GAC  48 Asp Gln Pro Leu Gly Gly Gln Arg Thr Arg Pro Arg Ser Ala Cys Asp

 35                  40                  45 AAT GGC GGC TCT GCA TAC ATG TGC AGC AAC CAG AGC CCG TGG GCC GTC  96 Asn Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Asn Gln Ser Pro Trp Ala Val  50                  55                  60                  65 GAC GAT TCT CTC AGT TAC GGA TGG GCT GCC GTT AGG ATC TAT GGA CAT 144 Asp Asp Ser Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val Arg Ile Tyr Gly His

             70                  75                  80 ACC GAA ACT ACT TGG TGC TGC GCT TGC TAC GAG TTG ACT TTT ACC AGC 192 Thr Glu Thr Thr Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser

         85                  90                  95 GGT CCG GTT AGC GGC AAG AAG ATG ATT GTT CAG 225 Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys Met Ile Val Gln

    100                 105 (2)SEQ ID NO：26的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：75个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26： Asp Gln Pro Leu Gly Gly Gln Arg Thr Arg Pro Arg Ser Ala Cys Asp   1               5                  10                  15 Asn Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Asn Gln Ser Pro Trp Ala Val

         20                  25                  30 Asp Asp Ser Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val Arg Ile Tyr Gly His

     35                  40                  45 Thr Glu Thr Thr Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser

 50                  55                  60 Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys Met Ile Val Gln  65                  70                  75 (2)SEQ ID NO：27的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：177个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：尖镰孢ssp lycopersici

      (B)菌株：CBS 645.78

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...177

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27： AGA AAC GAC AAC CCC ATC TCC AAC ACC AAC GCT GTC AAC GGT TGT GAG  48 Arg Asn Asp Asn Pro Ile Ser Asn Thr Asn Ala Val Asn Gly Cys Glu  30                  35                  40                  45 GGT GGT GGT TCT GCT TAT GCT TGC ACC AAC TAC TCT CCC TGG GCT GTC  96 Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro Trp Ala Val

             50                  55                  60 AAC GAT GAG CTT GCC TAC GGT TTC GCT GCT ACC AAG ATC TCC GGT GGC 144 Asn Asp Glu Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile Ser Gly Gly

         65                      70              75 TCC GAG GCC AGC TGG TGC TGT GCC TGC TAT CTA 177 Ser Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Leu

     80                  85 (2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：59个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28： Arg Asn Asp Asn Pro Ile Ser Asn Thr Asn Ala Val Asn Gly Cys Glu   1               5                  10 15 Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro Trp Ala Val

         20                  25                  30 Asn Asp Glu Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile Ser Gly Gly

     35                  40                  45 Ser Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Leu

 50                  55 (2)SEQ ID NO：29的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：63个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：Nectria pinea

  (B)菌株：CBS 279.96 (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...63 (xi)序列描述：SEQ ID NO：29： AGC GGC TGT GAC GGT GGT TCT GCC TAC GCC TGT GCA AAC AAC TCC CCT       48 Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asn Asn Ser Pro  60                  65                  70

75 TGG GCT GTC AAC GAT

         63 Trp Ala Val Asn Asp

             80 (2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：21个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30： Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ala Asn Asn Ser Pro   1               5          10 15 Trp Ala Val Asn Asp

         20 (2)SEQ ID NO：31的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：177个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：灰腐质霉Traeen

      (B)菌株：ATCC 22726

(ix)特征

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1..177

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31： AAC CAG CCT GTC TTC ACT TGC GAC GCC AAA TTC CAG CGC ATC ACC GAC        48 Asn Gln Pro Val Phe Thr Cys Asp Ala Lys Phe Gln Arg Ile Thr Asp

         25                  30                  35 CCC AAT ACC AAG TCG GGC TGC GAT GGC GGC TCG GCC TTT TCG TGT GCT        96 Pro Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ser Cys Ala

     40                  45                  50 GAC CAA ACC CCC TGG GCT CTG AAC GAC GAT TTC GCC TAT GGC TTC GCT       144 Asp Gln Thr Pro Trp Ala Leu Asn Asp Asp Phe Ala Tyr Gly Phe Ala

 55                  60                  65 GCC ACG GCT ATT TCG GGT GGA TCG GAA GCC TCG

        177 Ala Thr Ala Ile Ser Gly Gly Ser Glu Ala Ser  70                  75                  80 (2)SEQ ID NO：32的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：59个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32： Asn Gln Pro Val Phe Thr Cys Asp Ala Lys Phe Gln Arg Ile Thr Asp   1               5                  10  15 Pro Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ser Cys Ala

         20                  25                  30 Asp Gln Thr Pro Trp Ala Leu Asn Asp Asp Phe Ala Tyr Gly Phe Ala

     35                  40                  45 Ala Thr Ala Ile Ser Gly Gly Ser Glu Ala Ser

 50                  55 (2)SEQ ID NO：33的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：153个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：黑腐质霉Omvik

      (B)菌株：CBS 819.73

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...153

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33： GTC TAC GCC TGC AAC GCA AAC TTC CAG CGC ATC ACC GAC GCC AAC GCC        48 Val Tyr Ala Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Ala Asn Ala  60                  65                  70   75 AAG TCC GGC TGC GAT GGC GGC TCC GCC TTC TCG TGC GCC AAC CAG ACC        96 Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ser Cys Ala Asn Gln Thr

             80                  85 90 CCG TGG GCC GTG AGC GAC GAC TTT GCC TAC GGT TTC GCG GCT ACG GCG       144 Pro Trp Ala Val Ser Asp Asp Phe Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

         95                 100                 105 CTC GCC GGC

      153 Leu Ala Gly

    110 (2)SEQ ID NO：34的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：51个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34： Val Tyr Ala Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Ala Asn Ala   1               5                 10 15 Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ser Cys Ala Asn Gln Thr

         20                  25                  30 Pro Trp Ala Val Ser Asp Asp Phe Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

     35                  40                      45 Leu Ala Gly

 50 (2)SEQ ID NO：35的信息：

(i)序列特征：   (A)长度：181个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：Cladorrhinum forcundissimun

  (B)菌株：ATCC 62373 (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...181 (xi)序列描述：SEQ ID NO：35： GTC AAC CGC CCT GTC CTC GCC TGC GAC GCA AAC AAC AAC CCT CTG ACC        48 Val Asn Arg Pro Val Leu Ala Cys Asp Ala Asn Asn Asn Pro Leu Thr   1               5                  10 15 GAC GCC GGC GTC AAG TCC GGA TGT GAT GGC GGT TCT GCA TAC ACC TGT        96 Asp Ala Gly Val Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys

         20                  25                  30 GCC AAC AAC TCC CCA TGG GCA GTG AAC GAC CAG CTC GCC TAC GGC TTT       144 Ala Asn Asn Ser Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Phe

     35                  40                  45 GCC GCC ACC AAA CTG AGC GGC GGA ACT GAG TCG TCA

      180 Ala Ala Thr Lys Leu Ser Gly Gly Thr Glu Ser Ser

 50                  55                  60 (2)SEQ ID NO：36的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：60个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36： Val Asn Arg Pro Val Leu Ala Cys Asp Ala Asn Asn Asn Pro Leu Thr   1               5                  10 15 Asp Ala Gly Val Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys

         20                  25                            30 Ala Asn Asn Ser Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Phe

     35                  40                  45 Ala Ala Thr Lys Leu Ser Gly Gly Thr Glu Ser Ser

 50                  55                  60 (2)SEQ ID NO：37的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：64个碱基对

      (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：Syspastospora boninensis

  (B)菌株：NKBC 1515 (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...64 (xi)序列描述：SEQ ID NO：37： GGC TGC GAC GGC GGC AGC GCC TTC ACC TGC TCC AAC AAC TCT CCA TGG        48 Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Thr Cys Ser Asn Asn Ser Pro Trp GCT GTG AAC GAA GAT

        63 Ala Val Asn Glu Asp (2)SEQ ID NO：38的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：21个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：

Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Thr Cys Ser Asn Asn Ser

Pro Trp Ala Val Asn Glu Asp (2)SEQ ID NO：39的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：153个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：Nigrospora sp.

      (B)菌株：CBS 272.96

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...153

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39： ACA AGA AAC GAC GGG CCC CTG TCC AGC CCC GAT GCC GCC TCC GGC TGT        48 Thr Arg Asn Asp Gly Pro Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala Ser Gly Cys

         25              30                     35 GAT GGC GGC GAA GCC TTT GCC TGT TCT AAT ACC TCG CCT TGG GCC GTC        96 Asp Gly Gly Glu Ala Phe Ala Cys Ser Asn Thr Ser Pro Trp Ala Val

     40                  45                  50 AGC GAC CAG CTC GCG TAC GGA TAC GTC GCC ACG TCC ATC TCC GGC GGC       144 Ser Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Tyr Val Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly

 55                  60                  65 ACC GAG TCA

      153 Thr Glu Ser  70 (2)SEQ ID NO：40的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：51个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40： Thr Arg Asn Asp Gly Pro Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala Ser Gly Cys   1               5                  10 15 Asp Gly Gly Glu Ala Phe Ala Cys Ser Asn Thr Ser Pro Trp Ala Val

         20                  25                  30 Ser Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Tyr Val Ala Thr Ser Ile Ser Gly Gly

     35                  40                  45 Thr Glu Ser

 50 (2)SEQ ID NO：41的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：159个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (A)生物体：弗雷生刺枝霉

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...159

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41： GTC CGA ACG TGT AGT GCC AAC GAC TCG  CCC TTG TCC GAC CCA AAT GCC        48 Val Arg Thr Cys Ser Ala Asn Asp Ser Pro Leu Ser Asp Pro Asn Ala

         55                  60                  65 CCA AGT GGG TGT GAC GGT GGT AGC GCC TTC ACT TGT TCC AAC AAC TCC        96 Pro Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Thr Cys Ser Asn Asn Ser

     70                  75                  80 CCG TGG GCA GTC GAT GAC CAG ACA GCT TAT GGC TTT GCG GCA ACA GCC       144 Pro Trp Ala Val Asp Asp Gln Thr Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

 85                  90                  95 ATC AGT GGC CAG TCC

       159 Ile Ser Gly Gln Ser 100 (2)SEQ ID NO：42的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：53个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：42： Val Arg Thr Cys Ser Ala Asn Asp Ser Pro Leu Ser Asp Pro Asn Ala   1               5                  10 15 Pro Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Thr Cys Ser Asn Asn Ser

         20                  25                  30 Pro Trp Ala Val Asp Asp Gln Thr Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

     35                  40                  45 Ile Ser Gly Gln Ser

 50 (2)SEQ ID NO：43的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：153个碱基对

      (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：Ecidia glandulosa

  (B)菌株：CBS 277.96 (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...153 (xi)序列描述：SEQ ID NO：43： TGT GAG AAG AAC GAC AAC CCC TTA GCT GAC TTC AGC ACG AAA TCC GGG        48 Cys Glu Lys Asn Asp Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Thr Lys Ser Gly

 55                  60                  65 TGT GAA AGC GGA GGT TCG GCT TAT ACG TGT AAC AAC CAA TCA CCA TGG        96 Cys Glu Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys Asn Asn Gln Ser Pro Trp  70                  75                  80   85 GCC GTC AAT GAC TTG GTG TCG TAT GGC TTC GCC GCC ACA GCG ATC AAT       144 Ala Val Asn Asp Leu Val Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Asn

             90                  95 100 GGT GGC AAT

      153 Gly Gly Asn (2)SEQ ID NO：44的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：51个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：44： Cys Glu Lys Asn Asp Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Thr Lys Ser Gly   1               5                  10 15 Cys Glu Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys Asn Asn Gln Ser Pro Trp

         20              25                      30 Ala Val Asn Asp Leu Val Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Asn

     35                  40                  45 Gly Gly Asn

 50 (2)SEQ ID NO：45的信息：

(i)序列特征

      (A)长度：171个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性 (ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

  (A)生物体：Coniothecium sp. (ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...171 (xi)序列描述：SEQ ID NO：45： AGC CGC CCC GTC GGA ACC TGC AAG AGG AAC GAC AAC CCC CTC TCC GAC        48 Ser Arg Pro Val Gly Thr Cys Lys Arg Asn Asp Asn Pro Leu Ser Asp

         55                  60                  65 CCC GAT GCC AAG TCC GGC TGC GAC GGC GGC GGC GCC TTC ATG TGC TCC        96 Pro Asp Ala Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Gly Ala Phe Met Cys Ser

     70                  75                  80 ACC CAG CAG CCG TGG GCC GTC AAC GAC AAT CTG GCA TAT GGC TTC GCC       144 Thr Gln Gln Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala

 85                  90                  95 GCC ACG GCC ATC AGC GGC GGC AAC GAG

      171 Ala Thr Ala Ile Ser Gly Gly Asn Glu 100                 105 (2)SEQ ID NO：46的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：57个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：46： Ser Arg Pro Val Gly Thr Cys Lys Arg Asn Asp Asn Pro Leu Ser Asp   1               5                  10 15 Pro Asp Ala Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Gly Ala Phe Met Cys Ser

         20                  25                  30 Thr Gln Gln Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala

     35                  40                  45 Ala Thr Ala Ile Ser Gly Gly Asn Glu

 50                  55 (2)SEQ ID NO：47的信息：

(i)序列特征

      (A)长度：159个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：CBS 271.96

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)位置：1...159 (xi)序列描述：SEQ ID NO：47： ACT TGC AAC AAG AAC GAC GGG CCC CTG TCC AGC CCC GAT GCC GCC TCC        48 Thr Cys Asn Lys Asn Asp Gly Pro Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala Ser

     60                  65                  70 GGC TGT GAT GGC GGC GAA GCC TTT GCC TGT TCT AAT ACC TCG CCT TGG        96 Gly Cys Asp Gly Gly Glu Ala Phe Ala Cys Ser Asn Thr Ser Pro Trp

 75                  80                   85 GCC GTC AGC GAC CAG CTC GCG TAC GGA TAC CTC GCC ACG TCC ATC TCC       144 Ala Val Ser Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Tyr Leu Ala Thr Ser Ile Ser  90                  95                 100  105 GGC GGC ACC GAG TCG

       159 Gly Gly Thr Glu Ser

            110 (2)SEQ ID NO：48的信息：

(i)序列特征

     (A)长度：个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：48： Thr Cys Asn Lys Asn Asp Gly Pro Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala Ser   1               5                  10 15 Gly Cys Asp Gly Gly Glu Ala Phe Ala Cys Ser Asn Thr Ser Pro Trp

         20                  25                  30 Ala Val Ser Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Tyr Leu Ala Thr Ser Ile Ser

     35                  40                  45 Gly Gly Thr Glu Ser

 50 (2)SEQ ID NO：49的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：84个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：CBS 270.96

(ix)特征：

      (A)名称/关键词：CDS

      (B)位置：1...84

(xi)序列描述：SEQ ID NO：49： CCA GTT TTC TCC TGT GAC AAG  TAC GAC AAC CCT CTA CCT GAC GCC AAT        48 Pro Val Phe Ser Cys Asp Lys Tyr Asp Asn Pro Leu Pro Asp Ala Asn

 55                  60                  65 GCT GTG TCC GGG TGT GAC CCC GGA GGT ACT GCC TTC

        84 Ala Val Ser Gly Cys Asp Pro Gly Gly Thr Ala Phe  70                  75                  80 (2)SEQ ID NO：50的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：28个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：50： Pro Val Phe Ser Cys Asp Lys Tyr Asp Asn Pro Leu Pro Asp Ala Asn   1               5                  10 15 Ala Val Ser Gly Cys Asp Pro Gly Gly Thr Ala Phe

         20                  25 (2)SEQ ID NO：51的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：147个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA (vi)原始来源：

 (B)菌株：棉色二孢，CBS 274.96 (xi)序列描述：SEQ ID NO：51： ACCTGCGACG  CCTGCGACAG  CCCCCTCAGC  GACTACGACG  CCAAGTCCGG CTGCGACGGC       60 GGTAGCGCAT  ACACCTGCAC  CTACTCTACC  CCCTGGGCCG  TCGACGACAA CCTCTCCTAC      120 GGTTTCGCCG  CCGCCAAGCT  GAGCGGA

        147 (2)SEQ ID NO：52的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：49个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：

Thr Cys Asp Ala Cys Asp Ser Pro Leu Ser Asp Tyr Asp Ala Lys Ser

 1              5                   10   15

Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Cys Thr Tyr Ser Thr Pro Trp

             20                  25 30

Ala Val Asp Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Ala Lys Leu Ser

         35                 40                  45 Gly (2)SEQ ID NO：53的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：135个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

(B)菌株：Ulospora bilgramii，NKBC 1444   (xi)序列描述：SEQ ID NO：53： CCACTAGCAG   ATTTCACCGG   TGGAACCGGC   TGTAATGGCG   GTTCGACATT CTCATGCTCA        60 AACCAACAAC   CATGGGCGGT   CAACGACACA   TTCTCGTACG   GCTTTGCGGG CATCTTTATC       120 ACAGGCCATG   TCGAG

         135 (2)SEQ ID NO：54的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：45个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：

Pro Leu Ala Asp Phe Thr Gly Gly Thr Gly Cys Asn Gly Gly Ser Thr

 1              5                   10   15

Phe Ser Cys Ser Asn Gln Gln Pro Trp Ala Val Asn Asp Thr Phe Ser

             20                  25 30

Tyr Gly Phe Ala Gly Ile Phe Ile Thr Gly His Val Glu

        35                  40                  45 (2)SEQ ID NO：55的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：114个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：疣孢青霉，ATCC 62396

(xi)序列描述：SEQ ID NO：55： GCCAAATCTG   GATGTGATGC   TGGTGGAGGT   CAAGCCTACA   TGTGCTCCAA CCAACAACCT        60 TGGGTAGTCA   ACGACAACCT   CGCCTACGGT   TTCGCCGCAG   TCAACATTGC CGGC             114 (2)SEQ ID NO：56的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：38个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：56：

Ala Lys Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Gly Gln Ala Tyr Met Cys Ser

 1               5                  10  15

Asn Gln Gln Pro Trp Val Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala

            20                  25 30 Ala Val Asn Ile Ala Gly

    35 (2)SEQ ID NO：57的信息：

(i)序列特征：

       (A)长度：113个碱基对

       (B)类型：核酸

       (C)链型：单链

       (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：点孔座壳

(xi)序列描述：SEQ ID NO：57： TTCGACGTCC   GGGTGCGACA   ATGGCGGCAG   CGCCTTCATG   TGCTCTAACC AAAGCCCCTG        60 GGCCGTCAAC   GACGATCTGG   CCTACGGCTG   GGCCGCCGTC   TCAATCGCGG GCC            113 (2)SEQ ID NO：58的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：37个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：

Ser Thr Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Ser Ala Phe Met Cys Ser Asn

 1               5                  10   15

Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Trp Ala Ala

             20             25 30

Val Ser Ile Ala Gly

        35 (2)SEQ ID NO：59的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：177个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：蛇形镰孢，IFO 4467

(xi)序列描述：SEQ ID NO：59： TCAACACCGG    TGCAGACGTG    CGACCGCAAC    GACAACCCGC    TCTACGACGG CGGGTCGACG         60 CGGTCCGGCT    GCGACGCCGG    CGGCGGCGCC    TACATGTGCT    CGTCGCACAG CCCGTGGGCC        120 GTCAGCGACA    GCCTCTCGTA    CGGCTGGGCG    GCCGTCCGCA    TCGCCGGCCA GTCCGAG           177 (2)SEQ ID NO：60的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：59个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：

Ser Thr Pro Val Gln Thr Cys Asp Arg Asn Asp Asn Pro Leu Tyr Asp

1             5                     10   15

Gly Gly Ser Thr Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Gly Ala Tyr Met

             20                 25 30

Cys Ser Ser His Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Ser Leu Ser Tyr Gly

        35                  40                            45

Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Gln Ser Glu

                        55 (2)SEQ ID NO：61的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：150个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：Thielavia thermophila，CBS 174.70

(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：

AACGACAACC CCATCTCCAA CACCAACGCT GTCAACGGTT GTGAGGGTGG

TGGTTCTGCT      60

TACGCTTGCT CCAACTACTC TCCCTGGGCT GTCAACGATG ACCTTGCCTA

CGGTTTCGCT     120

GTTACCAAGA TCTCCGGTGG CTCCGAGGCC

           150 (2)SEQ ID NO：62的信息：

 (i)序列特征：

      (A)长度：50个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：

Asn Asp Asn Pro Ile Ser Asn Thr Asn Ala Val Asn Gly Cys Glu Gly

 1              5                   10   15

Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Ser Asn Tyr Ser Pro Trp Ala Val Asn

            20                  25 30

Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Val Thr Lys Ile Ser Gly Gly Ser

        35                  40                  45 (2)SEQ ID NO：63的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：180个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

(A)生物体：管毛壳，CBS 799.83

(xi)序列描述：SEQ ID NO：63： GTCAATCAGC   CCATCCGAAC   GTGTAGTGCC   AACGACTCGC   CCTTGTCCGA CCCAAATACC        60 CCAAGTGGCT   GTGACGGTGG   TAGCGCCTTC   ACTTGTTCCA   ACAACTCCCC GTGGGCAGTC       120 GATGACCAGA   CAGCTTATGG   CTTTGCGGCA   ACAGCCATCA   GTGGCCAGTC CGAGAGCAGC       180 (2)SEQ ID NO：64的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：60个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SE9 ID NO：64：

Val Asn Gln Pro Ile Arg Thr Cys Ser Ala Asn Asp Ser Pro Leu Ser

 1              5                   10  15

Asp Pro Asn Thr Pro Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Thr Cys

            20                  25 30

Ser Asn Asn Ser Pro Trp Ala Val Asp Asp Gln Thr Ala Tyr Gly Phe

        35                   40                 4   

Ala Ala Thr Ala Ile Ser Gly Gln Ser Glu Ser Ser

    50                  55                  60 (2)SEQ ID NO：65的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：159个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：Chaetomium virescens，CBS 547.75

(xi)序列描述：SEQ ID NO：65： ACCTGCGACA   AGAAGGACAA   CCCCATCTCT   GATGCCAACG   CCAAGAGCGG CTGTGATGGC        60 GGTTCTGCTT   TCGCCTGCAC   CAACTACTCT   CCCTTCGCCG   TCAACGACAA CCTCGCCTAC               120 GGTTTCGCTG   CCACCAAGCT   TGCTGGAGGC   TCCGAGGCT

         159 (2)SEQ ID NO：66的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：53个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：

Thr Cys Asp Lys Lys Asp Asn Pro Ile Ser Asp Ala Asn Ala Lys Ser

 1              5                   10   15

Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Phe Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro Phe

            20                  25 30

Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Leu Ala

    35                   40                 45 Gly Gly Ser Glu Ala

50 (2)SEQ ID NO：67的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：81个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：葫芦科刺盘孢

(xi)序列描述：SEQ ID NO：67： ACCTGCTACG   CCAATGACCA   GCGCATCGCC   GACCGCAGCA   CCAAGTCCGG CTGCGACGGC        60 GGCTCGGCCT   ACTCCTGTTC   T

          81 (2)SEQ ID NO：68的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：27个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：

Thr Cys Tyr Ala Asn Asp Gln Arg Ile Ala Asp Arg Ser Thr Lys Ser

 1              5                   10   15 Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ser

        20                  25 (2)SEQ ID NO：69的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：160个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：

      (B)菌株：闪光须霉

(xi)序列描述：SEQ ID NO：69： ACCTGTGACA   AGAAGGACAA   CCCCATCTCA   AACTTGAACG   CTGTCAACGG TTGTGAGGGT        60 GGTGGTTCTG   CCTTCGCCTG   CACCAACTAC   TCTCCTTGGG   CGGTCAATGA CAACCTTGCC      120 TACGGCTTCG   CTGCAACCAA   GCTTGCCGGT   GGCTCCGAGG

         160 (2)SEQ ID NO：70的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：53个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：

Thr Cys Asp Lys Lys Asp Asn Pro Ile Ser Asn Leu Asn Ala Val Asn

  1             5                   10   15

 Gly Cys Glu Gly Gly Gly Ser Ala Phe Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro

             20                  25 30

Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Leu

        35                  40                  45

Ala Gly Gly Ser Glu

    50 (2)SEQ ID NO：71的信息：

(i)序列特征：

      (A)长度：165个碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子型：cDNA

(vi)原始来源：粉红单端孢，IFO 5372

(xi)序列描述：SEQ ID NO：71： CCAGTAGGCA CCTGCGACGC CGGCAACAGC CCCCTCGGCG ACCCCCTGGC CAAGTCTGGC      60 TGCGAGGGCG GCCCGTCGTA CACGTGCGCC AACTACCAGC CGTGGGCGGT CAACGACCAG     120 CTGGCCTACG GCTTCGCGGC CACGGCCATC AACGGCGGCA CCGAG

       165 (2)SEQ ID NO：72的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：55个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：

Pro Val Gly Thr Cys Asp Ala Gly Asn Ser Pro Leu Gly Asp Pro Leu

 1              5                   10   15

Ala Lys Ser Gly Cys Glu Gly Gly Pro Ser Tyr Thr Cys Ala Asn Tyr

            20                  25 30

Gln Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr

        35                  40                  45

Ala Ile Asn Gly Gly Thr Glu

    50                  55 参考文献 本发明的背景 GB-A-1368599 EP-A-O 307564 EP-A-O 435876 WO 91/17243 WO 91/10732 WO 91/17244 WO 95/24471 WO 95/26398 酶学方法，1988，Vol.160，p.200-391(Wood，W.A.和Kellogg，S.T. 编). Beguin，P.，＂纤维素降解的分子生物学＂，微生物学年评(1990)，Vol.44， pp.219-248. Henrissat，B.，＂纤维素酶和它们与纤维素的相互作用＂，纤维素(1994)， Vol.1，pp.1 69-196. T.-M.Enveri，＂微生物纤维素酶＂，W.M.Fogarty，微生物酶和生物技 术，应用科学出版社，183-224(1983)。 Béguin，P.和Aubert，J-P.，＂纤维素的生物降解＂，FEMS微生物学回顾 13(1994)25-58. Sheppard，P.O.等，＂保守纤维素酶家族特异性序列在克隆Fusarium oxysporum纤维素酶同系物cDNA上的用途，基因，(1994)，Vol.15， pp.163-167. Saloheimo，A.等，＂经在酵母中表达分离的Trichoderma reesei的新的小 内切葡聚糖酶基因，egI5″，分子生物学(1994)，Vol.13(2)，pp.219- 228. van Arsdell，J.N.等，(1987)Trichoderma reesei内切葡聚糖酶I在啤酒 糖酵母中的克隆、特征确定和表达，生物/技术5：60-64. Penttil_，M.等，(1986)Trichoderma reesei纤维素酶基因之间的同源性： 内切葡聚糖酶I基因的完整的核苷酸序列，基因15：253-263. Saloheimo，M.等，(1988)EGIII，一种新的Trichoderma reesei内切葡聚 糖酶：基因和酶两者的特征，基因63：11-21. Gonzéles，R.等，＂Trichoderma longibrachiatum egll基因的克隆、序 列分析和在酵母中的克隆＂，应用微生物生物学(1992)，Vol.38，pp. 370-375. Ooi，T等＂棘孢曲霉的纤维素酶(FI-CMCase)cDNA的克隆和序列分析＂ Curr. Genet.(1990)，vol.18，pp.217-222. Ooi，T等，＂编码Aspergillus aculeatus纤维素酶(FI-CMCase)的基因的 完整的核苷酸序列＂核酸研究(1990)，vol.18，No.19，P.5884. Xu，G.等，＂多种厌氧rumen真菌Neocallimastix patriciarum纤维素酶 cDNA在大肠杆菌中的克隆和表达＂，遗传微生物学杂志(1992)，vol，138. pp.1413-1420. Xu，G.等，＂新的编码具有高的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和木聚糖酶 活性的三个-多功能催化区的Neocallimastix patriciarum多糖类水解酶 cDNA(cel D)＂，遗传微生物学(1992)，vol.138，pp.2397-2403. Zhou，L.等，＂厌氧真菌Neocallimastixpatriciarum的无内含子celB编 码模式家族内切葡聚糖酶＂，生物化学杂志(1994)，vol.297，pp.359-364. Dalbφge，H.和Heldt-Hansen，H.P.，＂用于真菌酶基因有效表达克隆的新 方法＂，Mol.Gen.Genet.(1994)，vol.243，pp.253-260. Ali，B.R.S等，＂厌氧真菌Piromyces的纤维素酶和半纤维素酶构成多蛋 白纤维素-结合复合物和被多基因家族编码＂，FEMS微生物学通讯(1995)， vol.125，No.1，pp.15-21. 日本DNA数据库(DDBJ). Wang，H.Y.和Jones，R.W.：＂phytopathogenic真菌Macrophomina phaseolina内切葡聚糖酶-编码基因的克隆、特征确定和功能性表达＂，基 因，158：125128，1995. Wang，H.Y.和Jones，R.W.：＂从phytopathogenic真菌Macrophomina phaseolina克隆的单一内切葡聚糖酶一编码基因＂，应用和环境微生物学， 61：20042006.1995. Henrissat：生物化学杂志，280：309316，1991. Schauwecker，F.L.S.F.，Wanner，G.，Kahmann，R.：＂dimorphic真 菌Ustilago maydis中纤维素酶基因的filament-特异性表达＂，1995，生 物化学Hoppe-Seyler，376：617-625. WO 93/20193 WO 94/21801 WO 94/26880 WO 95/02043 附图： Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.25：351-360. NIH数据库(Entrez 1996春天版)，在World Wrde Web上可以获得： (htt-p：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX). Eriksson，O.E.& Hawksworth，D，L.：Systema Ascomycetum vol 12(1993). Jillich，W.：担子菌纲的高级分类，Bibliotheca Mycologia，85 485pp(1981). O′Donnell，K.：培养中的接合菌纲，佐治亚大学，US，257pp(1979). Hawksworth，D.L.，Kirk，p.M.，，Sutton，B.C.和Pegler，D.N.：真 菌辞典，国际Mycological研究所，616pp(1995)； Von Arx，J.A.：培养中形成孢子的真菌属，424pp(1981). 详细描述： Ford等，肽表达和纯化2：95-107，1991. Cunningham和Well，科学244，1081-1085，1989. de Vos等，科学255：306-312，1992. Smith等，分子生物学杂志.224：899-904，1992. Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992. Tomme，P等＂纤维素-结合域：分类和性质＂在＂不溶性碳水化合物的酶促 降解＂中，John N.Saddler和Michael H.Penner(编者)，ACS专题研讨 系列No.618，1996. WO 90/00609 WO 95/16782 Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物学杂志，48：443-453，1970. WO 94/14953 Sambrook，J.，Fritsch，E.F.& Maniatis，T.1989.分子克隆：实验 室手册.冷泉港实验室，冷泉港，纽约. Beaucage和Caruthers，Tetrahed；四面体通讯22(1981)，1859-1869. Matthes等，EMBO杂志(1984)，801-805 US 4,683,202 Saiki等，科学239(1988)，487-491. Hitzeman等，生物化学杂志.255(1980)，12073-12080. Alber和Kawasaki，分子应用遗传学杂志.1(1982)，419-434. Young等，化学药品的基因工程和微生物学(Hollaender等，编者)Plenum 出版社，纽约，1982. US 4,599,311 Russell等，自然304(1983)，652-654. McKnight等，The EMBO J.4(1985)，2093-2099 Russell，基因40，1985，pp.125-130. US 4,870,008 Hagenbuchle等，自然289，1981，pp.643-646. Vails等，细胞48，1987，pp.887-897. WO 87/02670 Egel-Mitani等，酵母6，1990，pp.127-137. US 4,546,082 EP 16201 EP 123294 EP 123544 EP 163529 WO 89/02463 WO 92/11378 US 4,599,311 US 4,931,373 US 4,870,008 US 5,037,743 US 4,845,075 US 4,931,373 Gleeson等，遗传微生物学杂志132，1986，pp.3459-3465. US 4,882,279 EP 272277 EP 230023 Malardier等，1989，基因78：147-156. WO 93/11249. WO 94/14953. WO 95/02043. Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989) 基因77，61-68 Dalbφge，H.，和Heldt-Hansen，H.(1994)Mel.Gen.Genet.2431253-260 Christensen，T.，Wφldike，H.，Boel，E.，Mortensen，S.B.，Hjortshφj， K.，Thim，L.，和Hansen，M.T.(1988)生物/技术6，1419-1422 Sanger，F.，Nicklen，S.，和Coulson，A.R.(1977)美国科学院学报.71， 5463-5467 Devereux，J.，Haeberli，P.，和Smithies，0.(1984)核酸研究.12， 387-395 Becker，D.M.& Guarante，L.1991.酶学方法.194：182-187. Gubler，U.& Hoffman，B.J.1983.基因25：263-269. Higuchi，B.Krummel和R.K，Saiki(1988)，体外制备和特定突变DNA片 段的一般方法：肽和DNA相互作用的研究.核酸研究.16：7351-7367. Sanger，F.，Nicklen，S.& Coulson，A.R.1977.美国科学院学报A.74： 5463-5467. Axelsen等，定量免疫电泳手册，Blackwell科学出版社，1973，第2，3， 4和23章.

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