一种调控植物黄酮醇合成的基因及应用
阅读：145发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种调控植物黄酮醇合成的基因及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种调控 植物 黄 酮 醇 合成的基因及应用。通过RACE技术从箭叶淫羊藿中获得了一条全长cDNA序列，并命名为EsMYBF1基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。EsMYBF1基因编码的蛋白序列为SEQ ID NO.2所示。通过基因工程技术提高EsMYBF1基因的表达量能够诱导黄酮醇合成基因的表达，从而促进黄酮醇的合成与积累。，下面是一种调控植物黄酮醇合成的基因及应用专利的具体信息内容。
一种调控植物黄酮醇合成的基因及应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程和生物技术领域。具体涉及到一种调控淫羊藿黄酮醇合成途径的EsMYBF1基因的分离克隆，功能分析和应用。EsMYBF1具有调控黄酮醇合成途径相关基因表达的功能，从而改变黄酮醇合成代谢。本发明还涉及到EsMYBF1基因在改变植物黄酮醇合成代谢上的应用。
背景技术
[0002] 淫羊藿(Herba epimedii)是使用最为悠久的中草药之一，最早记载于《神农本草经》；也是现在应用最为广泛的中草药之一(郭宝林，肖培根。中药淫羊藿主要种类评述。中国中药杂志，2003，8(4)：303-307)。淫羊藿药材主要来源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)中的少数几个物种的干燥叶片。淫羊藿属物种有50余种，绝大部分广泛分布于我国；其中被《中国药典》2010版收录的仅有5种，包含有淫羊藿(E.brevicornu Maxi m)、朝鲜淫羊藿(E.koreanum Nakai)、箭叶淫羊藿(E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim)、柔毛淫羊藿(E.pubescens Maxim)、巫山淫羊藿(E.wushanense T.S.Ying)。淫羊藿不仅具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，而且还有抗衰老、抗肿瘤、改善免疫功能等功效(Ma H,He X,Yang Y,Li M,Hao D,Jia Z.The genus Epimedium:An ethnopharmacological and phytoch emical review.J Ethnopharmacol,2011,134(3):519-541)，因而也是最具开发潜力的中药材之一，受到国内学者的高度重视。除此之外，淫羊藿植株的的花和叶形态各异，颜色丰富多彩，具有较高的园林观赏价值(任璘，戴思兰，王瑛。淫羊藿属植物种质资源及其园林应用。武汉植物学研究，2008，26(6)：644-649)。
[0003] 大量研究表明淫羊藿中主要活性成分为类黄酮化合物，特别是C8位置异戊烯修饰的黄酮醇苷类化合物(Ma H,He X,Yang Y,Li M,Hao D,Jia Z.The genus Epimedium:An ethno pharmacological and phytochemical review.J Ethnopharmacol,2011,134(3):519-541)。例如，常用于淫羊藿药材质量控制和化学型分类的四种主要活性成分，朝藿定A，B，C和淫羊藿苷(Epimedin A,B,C,Icariin)，均属于黄酮醇苷类化合物。众所周知，黄酮醇苷代谢物属于类黄酮合成途径中的黄酮醇分支途径的末端产物。类黄酮合成途径早已成为植物次生代谢途径中研究最多最清楚的途径之一，参与此途径中的所有结构基因在多个模式植物中得到了分离和功能鉴定，如拟南芥、玉米、矮牵牛、葡萄等(Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynt hesis.a colorful model for genetics,biochemistry,cell biology,and biotechnology.Plant Physiol,2001,126(2):485-493)。最近，在箭叶淫羊藿中类黄酮合成途径也得到了解析，绝大部分相关结构基因得到分离和鉴定(Huang W,Zeng S,Xiao G,Wei G,Liao S,Chen J,Sun W,Lv H,Wang Y.Elucidating the biosynthetic and regulatory mechanisms of flavonoid-derived bioactive c omponents in Epimedium sagittatum.Frontiers in Plant Science,2015,6:689)。众多研究表明，淫羊藿中主要活性成分的合成与积累受到环境因子和发育因子的影响，如光、蔗糖、植物激素、发育阶段等(Zeng S,Liu Y,Wang Y.Light stress suppresses the accumulation of epimedi ns A,B,C,and icariin in Epimedium,a traditional medicinal plant.Acta Physiol Plant,2013,35(11):3271-3275；Zeng S,Liu Y,Hu W,Liu Y,Shen X,Wang Y.Integrated transcriptional and phyt ochemical analyses of the flavonoid biosynthesis pathway in Epimedium.Plant Cell Tiss Organ C ult,
2013,115(3):355-365)，这意味着黄酮醇主要活性成分的合成积累可能受到某些转录因子的调控，如MYB，bHLH转录因子等。
2013,115(3):355-365)，这意味着黄酮醇主要活性成分的合成积累可能受到某些转录因子的调控，如MYB，bHLH转录因子等。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种调控植物黄酮醇合成的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种调控植物黄酮醇合成的基因EsMYBF1，该基因编码SEQ ID NO.2所示蛋白质，优选序列为SEQ ID NO.1所示。该基因可以调控黄酮醇合成途径相关基因的表达，从而改变黄酮醇代谢物的合成，为以后的淫羊藿活性成分黄酮醇的代谢工程研究奠定基础。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种调控植物黄酮醇合成的基因EsMYBF1在调控烟草黄酮醇合成上的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
[0008] 一种调控植物黄酮醇合成的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
[0009] 编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
[0010] 编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因序列优选为SEQ ID NO.1所示。
[0011] 扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物为：5’-CGCCCTTCAAGCTTTTCTGGT-3’和5’-TTACAACATTCTTCTTATGTAACATTCG-3’。
[0012] 一种调控植物黄酮醇合成途径的基因EsMYBF1在调控烟草黄酮醇合成上的应用，将EsMYBF1基因的编码区利用常规分子生物学手段在烟草中超量表达，结果发现烟草花中花青素含量下降而黄酮醇含量上升，并且类黄酮途径相关基因的表达受到影响，其中黄酮醇合成相关基因上调表达，而花青素合成相关基因则下调表达。
[0013] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0014] 1.本发明克隆的EsMYBF1基因具有调控黄酮醇合成途径的功能，这对阐明淫羊藿中黄酮醇主要活性成分合成积累的调控机制有着重要意义。
[0016] 图1.为一种EsMYBF1在箭叶淫羊藿不同组织中的基因表达模式示意图。
[0017] 结果表明：EsMYBF1基因主要在叶片组织中表达。
[0018] 图2.为一种用于瞬间双荧光素酶分析实验的表达载体pGreen II 62-SK和pGreen II 0800-LU C的T-DNA区域的示意图。
[0019] 载体pGreen II 62-SK作为双荧光素酶分析中激活因子(effector)，用于转录因子的表达，而pGreen II 0800-LUC作为双荧光素酶分析中的报告因子(reporter)，用于结构基因启动子的构建。
[0020] 图3.为一种EsMYBF1或者和EsTT8，AtTT8 bHLH调控蛋白对类黄酮途径相关结构基因的启动子的激活实验示意图。
[0021] 用于瞬间双荧光素酶分析实验的启动子有：EsCHS(chalcone synthase，查尔酮合成酶)，EsF3H(flavanone 3-hydroxylase，黄烷酮3-羟化酶)，EsFLS(flavonol synthase，黄酮醇合成酶)，EsDFR1(dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇还原酶)，EsDFR2和E sANS(anthocyanidin synthase，花青素合成酶)等；转录因子则有EsMYBF1，EsTT8，At TT8，AtMYB12等。EsMYBF1具有特异激活EsF3H和EsFLS结构基因启动子的能力，但是不具有与bHLH调控蛋白互作激活靶基因启动子的能力。
[0022] 图4.为一种用于EsMYBF1超量表达载体构建的pMV载体的T-DNA区域示意图。
[0023] LB和RB分别表示T-DNA区域的左边界和右边界；NPT II为植物抗性标记基因，赋予植物抗卡拉霉素的能力；P35S-EsMYBF1-TNos表达框表示EsMYBF1基因处于CaMV 35S启动子和Nos终止子的控制下表达。
[0024] 图5.为一种超量表达EsMYBF1的转基因烟草表型观察示意图。
[0025] 对照为转空载体(empty vector)的转基因烟草株系，而EsMYBF1超量表达的转基因烟草株系有F33，F38和F40。EsMYBF1的超量表达使得烟草花色变淡。
[0026] 图6.为一种超量表达EsMYBF1对转基因烟草中花青素(A)和黄酮醇(B)合成积累的影响示意图。
[0027] 相对于转空载体的转基因烟草对照(CK)而言，EsMYBF1的超量表达使得转基因烟草花(F33，F38，F40)中的花青素含量降低，而黄酮醇含量上升。
[0028] 图7.为一种超量表达EsMYBF1对转基因烟草中类黄酮相关基因表达的影响示意图。
[0029] CK代表转空载体的对照植株，而F33，F38和F40代表含有EsMYBF1超量表达的转基因烟草株系。相对于转空载体的转基因烟草对照而言，EsMYBF1的超量表达改变了烟草花中类黄酮相关结构基因的表达，其中黄酮醇合成相关基因上调表达，而花青素合成相关基因则下调表达。
具体实施方式
[0030] 实施例1：EsMYBF1基因的分离克隆
[0031] 以箭叶 淫羊藿叶片组 织的全长 cDNA为 模版 ，引物 序列为5 ’-CGCCCTTCAAGCTTTTCTGGT-3’和5’-TTACAACATTCTTCTTATGTAACATTCG-3’，使用高保真性DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)去扩增目的基因的全长cDNA克隆。按照其说明书进行PCR反应体系配置和运行。具体反应体系为50μL，其中箭叶淫羊藿叶片cD NA模版2μL，5×PrimeSTAR buffer 10μL，2.5mM dNTP 4μL，正反向引物各1μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5μL，加ddH2O至50μL。反应程序为98℃预变性，1min；98℃ 15sec、56℃ 15sec、72℃ 1min，32cycles；72℃延伸8min。PCR扩增出一条大小约为1.2-1.3kb的明亮主带，将PCR产物回收，通过加A反应后连接至pMD19-T载体上，并克隆测序。其中加A反应体系为10μL，回收的PCR产物7μL，10×Taq buffer 1uL，2mM dATP 1μL，5U/μL Taq DNA polymerase 1μL，72℃保温15-30min即可完成加A反应。
[0032] 测序结果表明：获得了一种分离的基因，并命名为EsMYBF1基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0033] 实施例2：EsMYBF1基因的组织表达模式分析
[0034] 为了分析EsMYBF1基因的组织表达模式，我们利用实时定量PCR检测EsMYBF1基因在箭叶淫羊藿不同组织中的表达水平。首先，在箭叶淫羊藿盛花期收集幼嫩的叶片、花蕾、花、根和果实等组织，经过液氮速冻，置于-70℃保存。然后，利用RNAiso Plus试剂(Ta kara公司)抽提上述叶片、花和花蕾组织的总RNA，而用它再结合Fruit-mate for RNA Puri fication试剂(Takara公司)抽提上述根和果实组织的总RNA，再利用凝胶电泳和核酸微量检测仪NanoDrop 2000确定总RNA的质量和浓度。取1μg总RNA进行反转录，反转录试剂盒为PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司)，反转录之前使用其中的gDNA Eraser消化总RNA溶液中可能存在的基因组DNA污染。消化反应体系为10μ L，包括5×gDNA Eraser buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，总RNA 1μg，加RNase free ddH2O至10μL。42℃保温2min，然后降至于4℃保温。将此反应产物10μL全部用来反转录，反转录体系为5×Primescript buffer 4μL，RT primer mix 1μL，Primescript RT enzyme m ix 1μL，RNase free ddH2O 4μL。37℃反转录15min，然后85℃，5sec失活，再恒温于4℃保存。最后，将反转录的cDNA产物稀释5-10倍作为实时定量PCR中的模板，置于-20℃保存备用。参考定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(Takara公司)的操作说明书进行引物设计，EsMYBF1的定量PCR引物为5’-AATAGGTGGTCACTGATTGCTGC-3’和5’-CACCCATCTTGGCTAAGTTCATC-3’，内参EsActin基因的定量PCR引物为5’-
GCCATTCAGGCTGTTCTTTC-3’和5’-GGTAAGATCGCGACCTGCTA-3’。实时定量PCR反应体系和运行程序参考说明书进行。具体来说，实时定量PCR反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq II 10μL，10μM引物各0.8μL，50×ROX Reference Dye II 0.4μL,cDNA模板2μL，加RNase free ddH2O至20μL。定量PCR反应在ABI公司PRISM 7500Fast型定量PCR仪上完成。反应程序采用两步法：95℃预变性30sec；95℃变性3sec，60℃退火延伸30sec，循环数40；反应结束后运行溶解曲线程序，以确保目的产物的特异扩增。最后，我们使用Comparative Ct方法进行基因的相对表达量计算(Schmittgen TD,Li vak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols,2008,3(6):1101-1108)。定量PCR分析结果表明EsMYBF1基因主要在叶片组织中表达，而在其它组织中表达量极低(图1)。
GCCATTCAGGCTGTTCTTTC-3’和5’-GGTAAGATCGCGACCTGCTA-3’。实时定量PCR反应体系和运行程序参考说明书进行。具体来说，实时定量PCR反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq II 10μL，10μM引物各0.8μL，50×ROX Reference Dye II 0.4μL,cDNA模板2μL，加RNase free ddH2O至20μL。定量PCR反应在ABI公司PRISM 7500Fast型定量PCR仪上完成。反应程序采用两步法：95℃预变性30sec；95℃变性3sec，60℃退火延伸30sec，循环数40；反应结束后运行溶解曲线程序，以确保目的产物的特异扩增。最后，我们使用Comparative Ct方法进行基因的相对表达量计算(Schmittgen TD,Li vak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols,2008,3(6):1101-1108)。定量PCR分析结果表明EsMYBF1基因主要在叶片组织中表达，而在其它组织中表达量极低(图1)。
[0035] 实施例3：瞬间双荧光素酶分析
[0036] 为了分析EsMYBF1基因对类黄酮合成途径中的结构基因启动子是否具有转录激活能力，我们采用在本式烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中进行瞬间双荧光素酶分析(trans ient dual-luciferase assay)。本实验中使用的载体和方法均参考文献(Hellens RP,Allan AC,Friel EN,Bolitho K,Grafton K,Templeton MD,Karunairetnam S,Gleave AP,Laing WA.Transi ent expression vectors for functional genomics,quantification of promoter activity and RNA silen cing in plants.Plant Methods,2005,1(1):1)。报告载体(reporter vector)为pGreen II 0800-LUC，含无启动子的LUC报告基因，同时带有CaMV 35S启动子驱动的Ren报告基因作为内参。将目的基因的启动子片段克隆此报告载体，用于激活下游LUC的表达(图2)。激活载体(effector vector)为pGreen II 62-SK，内含CaMV 35S-MCS-Ter CaMV表达框，将转录因子克隆至此载体，用于超量表达转录因子(图2)。用于瞬间双荧光素酶分析的类黄酮合成途径中相关结构基因的启动子包括有：ProEsCHS(chalcone synthase，查尔酮合成酶)，ProEsF3H(flavanone 3-hydroxylase，黄烷酮3-羟化酶)，ProEsFLS(flavonol synt hase，黄酮醇合成酶)，ProEsDFR1(dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇还原酶)，P roEsDFR2和ProEsANS(anthocyanidin synthase，花青素合成酶)；转录因子则有EsMYB F1，EsTT8，AtTT8，AtMYB12等。其中，分别包含有ProEsDFR1和ProEsANS启动子序列的pGreen II 0800-LUC重组质粒，以及分别包含有EsTT8和AtTT8转录因子的pGreen II62-SK重组质粒已由本实验室早期构建完成，可以直接使用，具体构建过程参见文献(Hu ang W,Sun W,Lv H,Luo M,Zeng S,Pattanaik S,Yuan L,Wang Y.A R2R3-MYB transcription factor from Epimedium sagittatum regulates the flavonoid biosynthetic pathway.PLoS ONE,2013,8(8):e70778)。
[0037] 关于其它启动子和转录因子的载体构建过程如下。首先，利用新型植物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)抽提箭叶淫羊藿幼嫩叶片的基因组DNA；利用RNAiso Plu s试剂(Takara公司)抽提拟南芥哥伦比亚生态型幼嫩叶片的总RNA；利用凝胶电泳和Na noDrop 2000仪器检测核酸的质量和浓度。拟南芥叶片总RNA按照实施例2中的反转录方法合成相应的cDNA模版，置于-20℃待用。以箭叶淫羊藿基因组DNA为模版，高保真的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)扩增EsCHS，EsF3H，EsFLS和EsDFR2的启动子序列，所用引物分别为ProEsCHS.F：5’-ACATGTGTGGATTTGGCTTAACG-3’和ProEsCHS.R：5’-TTAGCTCTTACTGTTATTATTTATCACG-3’；ProEsF3H.F：5’-CTCCGCAATCTCCATACATTCGTC-3’和ProEsF3H.R：5’-TGCGGGTTAATAGTTTGTTTCCT-3’；ProEsFLS.F：5’-GTAGGTTTTGAGACTCACAGTAGGTGC-3’和ProEsFLS.R：5’-GAAACTTTGGTGTTTTCTTCTTCTTCTC-
3’；ProEsDFR2.F：5’-ATCTCAAAATTACCTTTCGTTGCTA-3’和ProEsDFR2.R：5’-TTCTTAAGGATGGTGTTAATTGTGAC-3’。以结构基因起始密码子为起点，EsCHS、EsF3H、EsFLS和EsDFR2的启动子序列长度分别为718bp，1772bp，624bp和1138bp。经过PCR扩增后，先将目的启动子序列克隆到pMD19-T(Takara公司)载体上，并送公司测序。挑取测序正确的方向正确的克隆抽提质粒，用Kpn I/Pst I双酶切，将启动子片段转移至经过同样酶切的pGreen II
0800-LUC载体中，并对得到的重组质粒进行PCR和酶切筛选，并测序鉴定。最后，抽提测序正确的重组质粒DNA备用。同时，先利用高保真PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)和拟南芥cDNA模版扩增AtMYB12(Accession No：NM_130314.3)的ORF，然后克隆到pMD19-T载体中，并测序验证。AtMYB12 ORF扩增所用引物序列为5’-ATGGGAAGAGCGCCATGTTGC-3’和
5’-TCATGACAGAAGCCAAGCGACCAA-3’。对于EsMYBF1转录因子而言，直接使用实施例1中分离得到的含有EsMYBF1全长的pMD19-T重组质粒。利用双酶切Pst I/Kpn I和Xba I/Sal I分别将AtMYB12的ORF和EsMYBF1的全长cDNA转移到pGreen II 62-SK激活载体中。再对获得的重组质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，并抽提测序正确的重组质粒DNA备用。最后，通过电击转化方法将构建好的报告载体和激活载体导入到农杆菌菌株GV3101中，在25mg/L利福平(Rifampicin，简写Rif，下同)和25mg/L庆大霉素(Gentamicin)以及50mg/L卡那霉素(Kanamycin，简写Kan，下同)等抗生素下进行筛选，并通过菌液PCR确认转化成功。值得注意的是，在pGreen II系列质粒DNA转化至农杆菌中时，必须连同辅助质粒pSoup一起共转，否则pGreen II不能在农杆菌中存活。
3’；ProEsDFR2.F：5’-ATCTCAAAATTACCTTTCGTTGCTA-3’和ProEsDFR2.R：5’-TTCTTAAGGATGGTGTTAATTGTGAC-3’。以结构基因起始密码子为起点，EsCHS、EsF3H、EsFLS和EsDFR2的启动子序列长度分别为718bp，1772bp，624bp和1138bp。经过PCR扩增后，先将目的启动子序列克隆到pMD19-T(Takara公司)载体上，并送公司测序。挑取测序正确的方向正确的克隆抽提质粒，用Kpn I/Pst I双酶切，将启动子片段转移至经过同样酶切的pGreen II
0800-LUC载体中，并对得到的重组质粒进行PCR和酶切筛选，并测序鉴定。最后，抽提测序正确的重组质粒DNA备用。同时，先利用高保真PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)和拟南芥cDNA模版扩增AtMYB12(Accession No：NM_130314.3)的ORF，然后克隆到pMD19-T载体中，并测序验证。AtMYB12 ORF扩增所用引物序列为5’-ATGGGAAGAGCGCCATGTTGC-3’和
5’-TCATGACAGAAGCCAAGCGACCAA-3’。对于EsMYBF1转录因子而言，直接使用实施例1中分离得到的含有EsMYBF1全长的pMD19-T重组质粒。利用双酶切Pst I/Kpn I和Xba I/Sal I分别将AtMYB12的ORF和EsMYBF1的全长cDNA转移到pGreen II 62-SK激活载体中。再对获得的重组质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，并抽提测序正确的重组质粒DNA备用。最后，通过电击转化方法将构建好的报告载体和激活载体导入到农杆菌菌株GV3101中，在25mg/L利福平(Rifampicin，简写Rif，下同)和25mg/L庆大霉素(Gentamicin)以及50mg/L卡那霉素(Kanamycin，简写Kan，下同)等抗生素下进行筛选，并通过菌液PCR确认转化成功。值得注意的是，在pGreen II系列质粒DNA转化至农杆菌中时，必须连同辅助质粒pSoup一起共转，否则pGreen II不能在农杆菌中存活。
[0038] 农杆菌浸染本式烟草的方法也参考上述有关双荧光素酶分析所用载体发明和应用的文献，具体过程如下：本式烟草种植于温室中，22℃和自然光线下生长。当植株生长到6片叶子时，选择超过1cm的幼嫩叶片作为浸染的对象。挑含有重组质粒的农杆菌GV3101单克隆于LB培养基(加有50mg/L Kan)中，28℃过夜培养16-24h，然后离心收集菌体。再用一定体积的浸染液(10mM MgCl2，0.5μM乙酰丁香酮(acetosyringone))悬浮，使其OD600达到0.2-0.3，在室温下放置2h后准备浸染。按照100μL含有报告载体的农杆菌和900μL含有激活载体(如果有两个转录因子共转的话，各取450μL)的农杆菌菌液混合作为浸染工程菌。使用无针头注射器注射到幼叶上，每片叶片注射2-3个点，每棵植株处理3-4片叶片。每个处理至少有四棵独立的植株作为重复。在温室条件下，生长3-4days后，收集注射过的叶片部位，准备下一步的双荧光检测。
[0039] 利用Dual Luciferase Reporter Assay System试剂盒(Promega公司)测定瞬间转化本式烟草叶片中萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(renilla luciferase)的活力。具体操作过程如下：在浸染3-4days后，用叶片打孔器收集大小为1cm的小叶盘，置于500μL裂解液(Passive lysis buffer)中研磨，然后取10μL以1/100稀释过的粗提液置于40μL Luciferase Assay Buffer中测定荧光强度；然后再加40μL Stop and Glow buffer，再次测量荧光强度，并将两者的比值(Luc/Ren ratio)作为衡量转录因子对启动子激活能力的大小指标。使用的荧光检测仪为GloMax 20/20(promega公司)。每个处理至少包含4棵独立植株，实验重复三次。仅使用含有启动子的报告载体处理(没有转录因子存在)的植株作为背景对照。某些情况下，使用功能已知的AtMYB12作为阳性对照。瞬间双荧光素酶分析实验表明EsMYBF1基因具有激活结构基因EsF3H和EsFLS启动子的能力，但对EsCHS，EsDFRs和EsANS启动子不具有激活能力；并且EsMYBF1和EsTT8或者AtTT8bHLH调控蛋白不存在互作关系(图3)。
[0040] 实施例4：超量表达转基因验证基因功能
[0041] 为了进一步验证EsMYBF1具有调控黄酮醇合成途径的功能，我们利用农杆菌介导的遗传转化方法将EsMYBF1基因超量表达于烟草中，然后分析转基因烟草后代植株的表型变化、类黄酮成分变化、以及类黄酮相关基因的表达变化等。转基因功能验证大致如下。
[0042] 1.超量表达载体构建及农杆菌介导的烟草遗传转化
[0043] 用于EsMYBF1基因超量表达的载体为双元表达载体pMV，它经双元表达载体pBI121改造而来，内含CaMV 35S-truncated GUS-Tnos表达框，由华中农业大学张俊红博士惠赠。具体来源参见文献(张俊红。番茄Aux/IAA基因的克隆与功能分析。博士学位论文。武汉：华中农业大学，2006)。首先，通过双酶切Sal I/Sac I将实施例1中包含有EsMYBF1全长cDNA的pMD19-T重组质粒中的EsMYBF1全长cDNA转移到经过双酶切Xho I/Sac I的pMV表达载体，形成超量表达载体pMV-EsMYBF1。其T-DNA区域示意图如图4所示，即是EsMYBF1全长cDNA替换掉pMV载体中的truncated GUS，并将其置于CaMV 35S启动子之下。然后，对此超量表达载体的质粒DNA进行酶切和PCR鉴定，并测序验证。最后，将测序正确的重组质粒DNA通过电击转化方法导入到农杆菌菌株EHA105中，用于下一步的烟草遗传转化。同时，也将空载体pMV导入到农杆菌EHA105中，作为后续转化实验的对照。
[0044] 遗传转化所用烟草品种为NC89，由北京林业大学戴思兰教授惠赠。农杆菌介导的烟草遗传转化方法采用叶盘法(Horsch R,Fry J,Hoffmann N,Eichholtz D,Rogers SG,Fraley R.A simple and general method for transferring genes into plants.Science,1985,227:1229)。将超量表达载体pMV-EsMYBF1和空载体pMV转入到烟草中的转化过程大致如下。首先，制备农杆菌工程菌液，将含有pMV-EsMYBF1重组载体或pMV空载体的农杆菌EHA105涂皿于LB固体平板(带有25mg/L Rif和50mg/L Kan)，28℃培养2-3day，形成单克隆后保存平板于4℃备用，每两周划线复活。挑单克隆于5mL液体LB培养基中(加有25mg/L Rif和50mg/L Kan)，一般培养36-48h，调整OD600到0.8-1.2左右，即成浸染的工程菌液。然后，收集无菌烟草的幼叶，切成1cm左右的小块，浸泡于农杆菌工程菌液中，时间8-10min左右，然后取出叶片，在滤纸上晾干，然后转入共培养基(MS+6-BA 1mg/L+NAA
0.1mg/L)中，黑暗条件下培养2天。其次，再转移到选择培养基(MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 200mg/L+Cef 300mg/L)上(Cefotaxime，头孢霉素，简写为Cef)，每两周继代一次，直至分化出抗性芽。最后，将抗性芽转移到生根培养基(1/2MS+Kan 200mg/L+Cef 300mg/L)中生根壮苗。最后移栽至钵内，在温室内生长发育。植物激素6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，MS基本培养基配方见文献(Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant,1962,15(3):
473-497)。利用Kan抗生素筛选转化烟草植株，并且利用PCR分析确定EsMYBF1基因整合到转基因烟草基因组中。最后，获得了3个表型明显的独立的转基因烟草T2代株系作为后续分析的材料。另外，带有pMV空载体的转基因烟草植株作为对照使用。我们观察发现，EsMYBF1基因的超量表达使得转基因烟草花色变淡，由明显红色转变为淡红色或者粉色(图5)。
0.1mg/L)中，黑暗条件下培养2天。其次，再转移到选择培养基(MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 200mg/L+Cef 300mg/L)上(Cefotaxime，头孢霉素，简写为Cef)，每两周继代一次，直至分化出抗性芽。最后，将抗性芽转移到生根培养基(1/2MS+Kan 200mg/L+Cef 300mg/L)中生根壮苗。最后移栽至钵内，在温室内生长发育。植物激素6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，MS基本培养基配方见文献(Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant,1962,15(3):
473-497)。利用Kan抗生素筛选转化烟草植株，并且利用PCR分析确定EsMYBF1基因整合到转基因烟草基因组中。最后，获得了3个表型明显的独立的转基因烟草T2代株系作为后续分析的材料。另外，带有pMV空载体的转基因烟草植株作为对照使用。我们观察发现，EsMYBF1基因的超量表达使得转基因烟草花色变淡，由明显红色转变为淡红色或者粉色(图5)。
[0045] 2.转基因烟草花组织中总花青素和黄酮醇含量测定
[0046] 为了探明转基因烟草花色变淡背后的原因，我们对转基因烟草花组织中的总花青素和黄酮醇的含量进行了测定。我们采用分光光度法测量总花青素含量，使用HPLC(High Per formance Liquid Chromatography，高效液相色谱)方法分析黄酮醇含量。待测定的实验材料包括3个EsMYBF1超量表达的转基因烟草株系的花组织样本(F33，F38，F40)，和1个携带有空载体pMV的转基因烟草花组织对照样本(CK)。待转基因烟草处于盛花期时，采集整个花朵，经液氮速冻后放置于-70℃保存备用。转基因烟草花组织中类黄酮成分的提取、分离和测定按照已发表文献的说明进行操作(Huang W,Zeng S,Xiao G,Wei G,Liao S,Chen J,Sun W,Lv H,Wang Y.Elucidating the biosynthetic and regulatory mechanisms of flav onoid-derived bioactive components in Epimedium sagittatum.Frontiers in Plant Science,2015,6:689)。关于总花青素的含量测定来说，取一定量的冷冻样本在液氨中充分研磨，称取50-100mg的样本粉末，置于1mL的1％盐酸/甲醇(1％HCl/Methanol)抽提液中，于4℃黑暗条件下浸泡24h，期间每隔几小时摇晃下样本。在12,000g转数下离心10min，然后收集上清液，并过0.22μm滤膜即为抽提液，放于-70℃保存待测。使用Tecan公司的Infinit e 200 PRO型号的多功能酶标仪检测待测抽提液在530nm和657nm波长下的吸光值，利用公式A530-0.25*A657计算出总花青素对应的吸光值，然后用这个吸光值除以样本鲜重即为总花青素的相对含量。在测量样本吸光值时，使用1％HCl/Methanol抽提液作为空白对照。每个样本有5个不同的生物学重复，每个生物学重复测量三次。
[0047] 关于转基因烟草花组织中的黄酮醇测定来说，称取100-200mg经液氮充分研磨的样本粉末，置于3ml 80％甲醇溶液中超声处理30min，然后放在4℃冰箱过夜。在12,000g转数下离心10min，取上清液待下一步处理。通过酸水解抽提物释放黄酮醇苷的糖基，最终以黄酮醇糖苷配基(flavonol aglycones)的含量作为烟草样本中的黄酮醇含量。取上述上清液400μL转移到离心管中，加120μL的HCl(浓度为3M)，90℃加热1h，然后再加200μL甲醇混匀。此水解液再通过0.22μm滤膜，滤液置于-70℃保存待测。HPLC分析所用仪器为Agilent 1100型号，色谱柱为Agilent TC-C18(5μm，4.6*250mm)。采取三元流动相进行HPLC分离，流动相A(0.1％甲酸水，0.1％formic acid/water)，流动相B(乙腈，acetonitrile)和流动相C(甲醇，methanol)。梯度分离程序为：0min，10％B+2％C；10min，20％B+4％C；15min，50％B+
10％C；20min，20％B+4％C；25min，10％B+2％C；28min，10％B+2％C。柱温为25℃，流速为
1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为350nm。转基因烟草样本中黄酮醇化合物的鉴定根据商品化的标准品山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercetin)进行比较，其含量的测定依据样本中黄酮醇色谱峰的峰面积和标准品的标准曲线进行换算。每个样本有5个独立的生物学重复，并且每个重复测量3次。类黄酮成分测定的结果表明，EsMYBF1基因的超量表达使得转基因烟草花组织中总花青素含量下降，而黄酮醇(山奈酚和槲皮素)含量上升(图6)。与对照相比，总花青素含量下降了近33％-46％，山奈酚则从108μg/g上升到最高的247μg/g，增加约2倍多，槲皮素则从175μg/g上升到最高的367μg/g，增加约2倍。
10％C；20min，20％B+4％C；25min，10％B+2％C；28min，10％B+2％C。柱温为25℃，流速为
1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为350nm。转基因烟草样本中黄酮醇化合物的鉴定根据商品化的标准品山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercetin)进行比较，其含量的测定依据样本中黄酮醇色谱峰的峰面积和标准品的标准曲线进行换算。每个样本有5个独立的生物学重复，并且每个重复测量3次。类黄酮成分测定的结果表明，EsMYBF1基因的超量表达使得转基因烟草花组织中总花青素含量下降，而黄酮醇(山奈酚和槲皮素)含量上升(图6)。与对照相比，总花青素含量下降了近33％-46％，山奈酚则从108μg/g上升到最高的247μg/g，增加约2倍多，槲皮素则从175μg/g上升到最高的367μg/g，增加约2倍。
[0048] 3.转基因烟草花组织中类黄酮合成相关结构基因的表达分析
[0049] 为了分析外源EsMYBF1基因的超量表达是否对转基因烟草花组织中类黄酮合成途径相关结构基因的表达有所影响，我们利用实时定量PCR分析确定类黄酮途径相关基因的表达水平。待分析的材料包括3个EsMYBF1超量表达的转基因烟草株系的花组织样本(F33，F38，F40)，和1个携带有空载体pMV的转基因烟草花组织对照样本(CK)(图7)。待转基因烟草处于盛花期时，采集整个花朵，经液氮速冻后，置于-70℃保存备用。总RN A提取，检测，反转录及定量PCR等操作均按照实施例2中的“EsMYBF1基因的组织表达模式分析”说明进行操作。简单来说，利用RNAiso Plus试剂(Takara公司)抽提烟草花组织总RNA，经电泳和NanoDrop 2000检测总RNA的质量和浓度，然后利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司)试剂盒进行反转录，最后利用SYBR Premix E x Taq II(Tli RNaseH Plus)(Takara公司)试剂盒进行定量PCR反应。用于实时定量PCR分析的烟草类黄酮合成途径相关结构基因包括NtCHS(chalcone synthase，查尔酮合成酶)，NtCHI(chalcone isomerase，查尔酮异构酶)，NtF3’H(flavonoid 3’-hydroxylase，类黄酮3’-羟化酶)，NtF3H(flavanone 3-hydroxylase，黄烷酮3-羟化酶)，NtFLS(flavonol synthas e，黄酮醇合成酶)，NtDFR(dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇还原酶)和NtANS(anthocyanidin synthase，花青素合成酶)等，并且使用烟草NtTub1基因作为内参基因。这些基因的实时定量PCR分析所用引物序列如表1所示。同样，也是使用Comparative Ct方法(Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols,2008,3(6):1101-1108)进行基因的相对表达量计算，设定对照样本的基因表达量为“1”。实时定量PCR分析结果表明，EsMYBF1基因的超量表达使得转基因烟草花组织中黄酮醇合成途径的结构基因(NtCHS，NtCHI，NtF3H，NtFLS)上调表达，而花青素合成相关的下游结构基因(NtDFR和NtANS)下调表达(图7)。
[0050] 表1用于转基因烟草中实时定量PCR分析的引物序列
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