动物摄食习性的测定方法
阅读：397发布：2020-11-28
专利汇可以提供动物摄食习性的测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种测定动物是否 摄食 过 目标 植物 的方法。该方法包括筛选动物存在的目标植物的至少一种指示物。，下面是动物摄食习性的测定方法专利的具体信息内容。
1.一种测定采食期的动物是否摄食过目标植物的方法，该方法包 括筛选动物存在的目标植物的至少一种指示物。
2.权利要求1的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、糖、 黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、次生代谢物、其衍 生物和它们的组合。
3.权利要求1的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可替 宁、降可替宁和棉酚。
4.权利要求1的方法，其中所述动物是害虫。
5.权利要求1的方法，其中所述动物是昆虫。
6.权利要求1的方法，其中所述目标植物是作物。
7.权利要求1的方法，其中所述目标植物是选自以下的作物：棉 花、玉米、油菜、玉蜀黍、烟草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜蓿 和小麦。
8.权利要求1的方法，其中所述动物是谷实夜蛾或烟夜蛾。
9.权利要求1的方法，其中所述指示物是黄酮类，选自花色素苷、 黄烷醇、二氢黄酮、黄酮醇、黄酮和异黄酮。
10.权利要求1的方法，其中所述指示物是生育酚，选自RRR- 生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、生育三烯酚、α-生育三烯酚、 γ-生育三烯酚和δ-三烯甘油酯。
11.权利要求1的方法，其中该方法还包括：
从动物中采集组织样品；
从组织样品中提取脂肪酸；
分析提取的脂肪酸以确定动物的脂肪酸特征；和
将该动物的脂肪酸特征与已知在其生命周期中摄食过目标植物 的动物的脂肪酸特征相比较。
12.权利要求11的方法，其中该方法还包括：
使提取的脂肪酸进行酯交换以产生脂肪酸甲酯的混合物；和
分离并检测脂肪酸甲酯的混合物以确定动物的脂肪酸特征。
13.权利要求11的方法，其中所述方法按高通量形式实施，包括：
从大量动物中采集组织样品；
将组织样品放入多孔板的各孔中；和
筛选各组织样品存在的目标植物的一种或多种指示物。
14.权利要求13的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、 糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、其衍生物和它 们的组合。
15.权利要求13的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可 替宁、降可替宁和棉酚。
16.一种测定动物是否摄食过至少一种目标植物的方法，该方法 包括：
从动物中采集至少一种组织；
测定组织的脂肪酸特征；和
将该组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标植物 的动物的脂肪酸特征相比较。
17.权利要求16的方法，其中该方法还包括：
将组织与溶剂接触以便从组织中提取脂肪酸；
使脂肪酸进行酯交换以制备脂肪酸甲酯的混合物；和
分析脂肪酸甲酯的混合物以测定组织的脂肪酸特征。
18.权利要求16的方法，其中所述目标植物是选自以下的作物： 棉花、玉米、油菜、玉蜀黍、烟草、大豆、花生、向日葵、水稻、苜 蓿和小麦。
19.权利要求16的方法，其中该方法还包括分析组织中存在的目 标植物的至少一种指示物。
20.权利要求19的方法，其中该方法包括测定组织的脂肪酸特征 后，分析组织中存在的目标植物的至少一种指示物。
21.权利要求19的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、 糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、次生代谢物、 其衍生物和它们的组合。
22.权利要求19的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可 替宁、降可替宁和棉酚。
23.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特 征中C16:1和C18:1的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄食过棉 花植物。
24.权利要求23的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织 中存在的棉酚。
25.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特 征中C16:0、C18:1和C18:2的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄 食过花生植物。
26.权利要求25的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织 中存在的蛋白特异性变应原。
27.权利要求26的方法，其中所述蛋白特异性变应原是白藜芦 醇。
28.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特 征中C16:0和C18:3的相对含量，以确定采食期的昆虫是否摄食过烟 草植物。
29.权利要求28的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织 中存在的烟碱和/或烟碱衍生物。
30.权利要求29的方法，其中所述烟碱衍生物选自可替宁、降可 替宁、降烟碱和其它烟碱代谢物。
31.权利要求16的方法，其中该方法包括测定成虫体内脂肪酸特 征中C16:0、C18:1、C18:2和C18:3的相对含量，以确定采食期的昆 虫是否摄食过大豆植物。
32.权利要求31的方法，其中该方法还包括分析成虫的试验组织 中存在的至少一种异黄酮。
33.权利要求32的方法，其中所述至少一种异黄酮选自染料木 素、黄豆苷元和黄豆黄素。
34.一种测定与转基因作物相比的天然避难所区域的害虫的方 法，该方法包括：
从转基因作物附近诱捕害虫；
筛选诱捕害虫存在的至少一种目标植物的一种或多种指示物；和 测定摄食转基因作物以外植物的害虫种群百分比。
35.权利要求34的方法，其中所述指示物选自脂肪酸、生育酚、 糖、黄酮类、生物碱、植物蛋白、遗传标记、矿物质、其衍生物和它 们的组合。
36.权利要求35的方法，其中所述指示物选自烟碱、降烟碱、可 替宁、降可替宁和棉酚。
37.权利要求34的方法，其中该方法还包括：
从采集到的害虫中采集至少一种组织；
测定组织的脂肪酸特征；和
将该组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标植物 的害虫的脂肪酸特征进行比较。
38.权利要求34的方法，其中所述害虫是昆虫。
发明领域
发明背景
[0002]抗虫转基因作物不断地被研发出来，使得可以在增加作 物产量的同时降低农药的需求量。然而，转基因作物的抗虫性潜力已 得到普遍认同，因此农业界迫切希望建立可明显延迟或防止出现完全 非敏感害虫种群的方案。
[0003]使害虫进化到对转基因作物产生抗性的速率减慢的一 种方式是确保存在敏感害虫接触不到杀虫物质的避难所(refuge)。理论 上讲，出自避难所环境的成虫会扩散并与出自重组大田的任何害虫交 配，如果出自重组大田的任何昆虫发展成为具有一定水平的重组杀虫 蛋白抗性，则其后代可获得的抗性性状将被稀释，从而减少或延迟出 现完全抗重组植物的小种。
[0004]避难所区域可包括未处理目标作物部分(即结构性避难 所(structured refuge))或害虫的其它合适作物部分和杂草宿主部分(即 替代性宿主避难所(alternative host refuge)或天然避难所(natural refuge))。在评价可为能够在多种宿主植物上发育的害虫所利用的避难 所时，需要若干评价方法，来评价存在于不同潜在宿主上的部分昆虫 种群。
[0005]在当今的监督环境下，如要获得相关管理机构对重组植 物商业化的批准，则需要在农田-农田的基础上，种植占被种植的含 有重组性状作物总量一定百分比的同类作物，作为非重组作物或非转 基因作物的避难所。避难所的要求增加了农民的劳动量和财务费用， 并且难以监控。避难所的种植和隔离加重了劳动负担，并且由于较多 昆虫侵扰，因此避难所内的产量很可能较低，这都妨碍了农民遵守管 理部门的规定。
[0006]因此，需要测定动物、特别是害虫的摄食习性和摄食史 的方法，从而确定或者设计更有效的避难所区域。因此，需要能够按 易于鉴定迁移模式和摄食习性或摄食史的方式，筛选或鉴定动物或动 物种群的特征。发明概述
[0007]本发明提供一种测定动物是否摄食过目标植物的方法。 该方法包括筛选动物存在的目标植物的至少一种指示物。
[0008]本发明还提供一种测定动物摄食史的高通量方法。该方 法包括从大量动物中采集组织样品，将组织样品放入多孔板的各个孔 中，筛选各组织样品存在的目标植物的一种或多种指示物。
[0009]本发明还提供一种测定动物是否摄食过若干目标植物 之一的方法。该方法包括从动物中采集至少一种组织；测定组织的脂 肪酸特征；将该组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标 植物的动物的脂肪酸特征相比较。
[0010]本发明另还提供一种测定采食期(feeding stage)的昆虫 是否摄食过目标植物的方法。该方法包括筛选昆虫存在的至少一种指 示物，选自棉酚、烟碱、降烟碱、可替宁(cotinine)、降可替宁 (norcotinine)、白藜芦醇、染料木素(genestein)、黄豆苷元、黄豆黄素、 其衍生物和它们的组合。
[0011]本发明另还提供一种测定采食期的昆虫是否摄食过棉 花植物的方法。该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:1和C18:1 的相对含量。
[0012]本发明另还提供一种测定采食期的昆虫是否摄食过花 生植物的方法。该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0、C18:1 和C18:2的相对含量。
[0013]本发明还提供一种测定采食期的昆虫是否摄食过烟草 植物的方法。该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0和C18:3 的相对含量。
[0014]本发明还提供一种测定采食期的昆虫是否摄食过大豆 植物的方法。该方法包括测定成虫体内脂肪酸特征中C16:0、C18:1、 C18:2和C18:3的相对含量。
[0015]本发明另还提供一种测定与转基因作物相比的天然避 难所区域的害虫的方法。该方法包括从转基因作物附近诱捕害虫，筛 选诱捕害虫存在的至少一种目标植物的一种或多种指示物，测定摄食 转基因作物以外植物的害虫种群百分比。
[0017]图1柱状图表示根据实施例1测定，棉花植物饲养的蛾 的脂肪酸特征。
[0018]图2柱状图表示根据实施例1测定，花生植物饲养的蛾 的脂肪酸特征。
[0019]图3柱状图表示根据实施例1测定，烟草植物饲养的蛾 的脂肪酸特征。
[0020]图4柱状图表示根据实施例1测定，大豆植物饲养的蛾 的脂肪酸特征。
[0022]本发明提供测定动物是否摄食过目标植物的方法。该方 法包括筛选动物存在的目标植物的至少一种指示物。
[0023]在进一步描述本发明之前，理解本文所要鉴定和强调的 问题是有益的。
[0024]动物行为模式在农业、土地利用实践、水土保持、房地 产等方面都具有许多商业意义。迁移模式通过无线电发射机、人造卫 星技术、标记等进行外部追踪，但是却存在许多困难。例如，较小型 的动物或长距离迁移的动物使用无线电遥测是不切实际的。人造卫星 技术由于成本而受到限制。标记则需要在一群动物中捕获和再捕获少 数动物，而且这些动物可能并不代表该群动物。
[0025]还使用了稳定同位素方法跟踪动物迁移的模式。稳定同 位素是天然存在的核质量不同的稳定形式的元素。将稳定同位素通过 动物饮食直接掺入动物组织内。虽然稳定同位素方法不依赖于先前捕 获动物的再捕获，但是必须进行其它假设。例如饮食、觅食位置和代 谢的差异，气候和海拔的差异以及基岩组成和土壤不均一性的差异， 总是影响动物组织的同位素模式。
[0026]Gould等人((2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99(26)， 16581-16586)提出稳定同位素评价作为鉴定被作物害虫谷实夜蛾 (Helicoverpa zea)(美洲棉铃虫(cotton bollworm))幼虫所利用的宿主植 物的方式。C3植物(例如棉花和大豆)的稳定碳同位素组成(13C与12C 的比率通常用δ13C表示)一般在-20至-320/00的范围内，C4植物(例如 玉米)的则在-9至-170/00的范围内。同样，Bontemps等人((2004)Proc. R.Soc.Lond.271，2179-2185)提出用δ13C来区别欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的宿主植物。然而，δ13C的使用限于C3植物和C4植物之间 的比较，不能用于区别例如棉花饲养的蛾幼虫和大豆饲养的蛾幼虫。
[0027]本发明的申请人发现了用于测定动物是否摄食过目标 植物的方法，该方法可以应用于多种植物。该方法一般包括筛选动物 存在的目标植物的至少一种指示物。
[0028]本文所用目标植物的“指示物”是可以在动物体内或体 表检测到的任何化合物，它表明动物或采食期的动物摄食过目标植 物。作为一个成功的指示物，该化合物既应是植物中特有的且不应发 生代谢，又应在动物摄食时发生预期的代谢变化。优选该指示物对于 植物是独特的，并且在动物生化组成中引起独特的模式变化。例如， 在一个实施方案中，指示物是生物标志。在另一个实施方案中，指示 物是目标植物中天然存在的化合物，例如烟碱或棉酚。在另一个实施 方案中，指示物是目标植物人为操作的结果，例如转基因植物特异性 遗传标记。在又一个实施方案中，指示物是动物摄食过目标植物后产 生预期代谢变化的化合物。
[0029]本文所用术语“摄食”包括类似的术语，包括例如采食、 吃、饮、代谢、消化和吸收。
[0030]筛选动物存在的指示物可能需要或者不需要从动物中 获取样品。在需要样品的实施方案中，样品可包括组织、毛发、羽毛、 唾液、汗液、泪液、肠内容物或排泄物。在一个实施方案中，本发明 的方法包括分析动物的至少一种组织中存在的植物指示物。在一个具 体实施方案中，动物的至少一种组织包括整个动物，例如昆虫。在其 它实施方案中，示例性的组织可包括皮肤、毛发、羽毛、翅翼、内脏、 血液、血浆、淋巴等。组织可以是完整器官，例如肝脏。或者，组织 样品可获自活组织检查。
[0031]一般而言，组织样品可通过适于测定存在的目标指示物 的任何实验室方法或大田试验进行分析。示例性的分析方法包括蛋白 质提取法、脂肪酸提取法、免疫沉淀法、DNA提取法、RNA提取法、 PCR、RNA印迹分析、DNA印迹分析、蛋白质印迹分析、元素组成 分析法、色谱法、质谱法、免疫染色法、共焦显微镜检术和荧光显微 镜检术。
[0033]在一个具体实施方案中，本发明的方法用来测定昆虫(例 如有害昆虫)的摄食史。所涉及的昆虫一般包括被鉴定为重要经济作物 害虫的任何昆虫。有害昆虫的实例包括但不限于北方玉米根虫 (northern corn rootworm)、西方玉米根虫(western corn rootworm)、南方 玉米根虫(southern corn rootworm)、美洲棉铃虫(cotton bollworm)、烟 夜蛾(tobacco budworm)、欧洲玉米螟(European corn borer)、谷实夜蛾 (corn earworm)、粘虫、盲蝽和蝽。
[0034]同样，目标植物可包括被动物直接摄入或者通过食物链 被动物间接摄入体内的任何植物。在一个实施方案中，目标植物是农 作物、例如棉花、玉米(corn)、油菜、玉蜀黍(maize)、烟草、大豆、 花生、向日葵、水稻、苜蓿或小麦。在另一个实施方案中，目标植物 是水果植物或果树。在另一个实施方案中，目标植物是蔬菜。在又一 实施方案中，目标植物选自甘蔗、可可树和咖啡树。
[0035]如上所述，合适的指示物包括可以在动物体内或体表检 测到的任何化合物，它表明动物或采食期的动物摄食过目标植物。在 目标植物是作物的实施方案中，合适的指示物可选自脂肪酸、生育酚、 糖、黄酮类、烟碱、降烟碱、可替宁、降可替宁、棉酚、植物蛋白、 矿物质、植物次生代谢物、其衍生物和它们的组合。
[0036]示例性的黄酮类包括花色素苷、黄烷醇、二氢黄酮、黄 酮醇、黄酮和异黄酮。示例性的异黄酮包括染料木素、黄豆苷元和黄 豆黄素。
[0037]示例性的生育酚包括RRR-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、 δ-生育酚、生育三烯酚、α-生育三烯酚和δ-三烯甘油酯。示例性的糖 包括葡萄糖、果糖或麦芽糖。
[0038]示例性的脂肪酸包括C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2 和C18:3。
[0040]示例性的植物蛋白包括白藜芦醇。
[0041]示例性的植物次生代谢物包括棉酚和生物碱。示例性的 生物碱包括茄碱。
[0042]在一个具体实施方案中，当筛选摄食棉花的动物时，棉 酚可为合适的指示物。棉酚是存在于棉属(Gossypium)植物、特别是棉 花的种子、根皮(rootbark)和表皮下腺体的多酚醛(polyphenolic aldehyde)色素。Rojas等人((1992)Environmental Entomology 21(3)， 518-526)论述了在作物害虫烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(烟夜蛾 (tobacco budworm))体内的棉酚分布和代谢物。烟芽夜蛾幼虫以作物 (包括棉花)为食。该文献作者报道了烟芽夜蛾成虫含有烟芽夜蛾幼虫 所摄食总棉酚的2.4％。
[0043]棉酚仅与棉花(Gossypium spp.)和相关植物溶生型腺体 (lysigenous gland)有关。Rojas等人的工作证实，烟芽夜蛾成虫含有幼 虫期所食棉酚的2.4％。研究表明所有的棉酚都是结合型的，未发现游 离棉酚。因此，测定蛾成虫体内存在的结合棉酚的分析方法，能将在 棉花上发育的蛾与在其它宿主上发育的蛾区别开来。
[0044]在测定动物是否摄食过烟草植物的另一个实施方案中， 可筛选动物存在的烟碱或烟碱衍生物。一般而言，烟碱是摄入烟草植 物的合适指示物。然而，因为除烟草以外，环境中烟碱来源相对丰富， 所以烟碱衍生物(包括烟碱代谢物)可能是更优选的烟草摄食指示物。 烟碱代谢物的实例包括可替宁、降烟碱和降可替宁。
[0045]在又一个测定动物是否摄食过大豆植物的实施方案中， 可筛选动物存在的一种或多种异黄酮。合适的异黄酮包括例如染料木 素、黄豆苷元或黄豆黄素。
[0046]在测定动物是否摄食过至少一种目标植物的另一个实 施方案中，该方法包括从动物中采集至少一种组织；测定组织的脂肪 酸特征；将该组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标植 物的动物的脂肪酸特征相比较。一般通过使组织样品与溶剂接触，从 组织样品中提取脂肪酸，来测定脂肪酸特征。然后使提取的脂肪酸进 行酯交换以产生脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯可被进一步分离检测，以测 定组织样品的脂肪酸特征。
[0047]在一些实施方案中，一种脂肪酸的存在可确定动物是否 摄食过目标植物。在另一些实施方案中，两种或更多种脂肪酸的组合 可确定动物是否摄食过目标植物。在又一些实施方案中，脂肪酸特征 可确定动物是否摄食过目标植物。脂肪酸特征可以是一种或多种脂肪 酸相对于所测总脂肪酸的任何比率。
[0048]例如，已经发现动物体内脂肪酸特征中C16:1和C18:1 的相对含量可以确定动物是否摄食过棉花植物。此外，动物体内脂肪 酸特征中C16:0、C18:1和C18:2的相对含量是花生植物的指示物；动 物体内脂肪酸特征中C16:0、C18:1、C18:2和C18:3的相对含量是大 豆植物的指示物；动物体内脂肪酸特征中C16:0和C18:3的相对含量 是烟草植物的指示物。
[0049]在一些实施方案中，该方法包括：首先，分析动物的组 织中存在的目标植物指示物，其次，测定组织的脂肪酸特征，最后， 对组织的脂肪酸特征与以该植物为食的脂肪酸特征指示物进行比较。 在其它实施方案中，该方法包括首先测定组织的脂肪酸特征，并将组 织的脂肪酸特征与已知摄食过该植物的动物的脂肪酸特征进行比较， 其次分析组织中存在的植物指示物。
[0050]在一个具体实施方案中，所设计的本发明方法为测定动 物的摄食特性提供了一种高通量方法。该方法一般包括从大量动物中 采集组织样品，将样品加到多孔板的各孔中。然后筛选多孔板中各样 品存在的目标植物的至少一种指示物，或者测定上述组织样品的脂肪 酸特征。
[0051]本文所述用于跟踪动物摄食习性或摄食史的方法和构 思具有多种用途。在具体实施方案中，本文所述筛选方法可以用来确 定相对于转基因作物的天然避难所区域的害虫。这种方法包括从转基 因作物附近诱捕害虫；筛选诱捕害虫存在的至少一种目标植物的一种 或多种指示物；测定摄食转基因作物以外植物的害虫种群百分比。或 者另外，该方法可以包括从诱捕害虫采集至少一种组织；测定组织的 脂肪酸特征；将组织的脂肪酸特征与已知在其生命周期内摄食过目标 植物的害虫的脂肪酸特征进行比较后，测定摄食转基因作物以外植物 的害虫种群百分比。因此，参与确定害虫避难所区域的产品开发商、 科学家和管理当局可以利用与害虫摄食习性和摄食史有关的资料，确 定这些害虫的天然避难所区域是否足以部分或全部代替农民在自己 农田中种植用于目标转基因作物的结构性避难所的需要，从而在明显 延迟或防止抗性害虫种群发生的同时使作物产量最大化。实施例
[0052]下面的实施例本质上仅是示例性的，不应解释为具有限 制性意义。
[0053]本实施例证明用于测定动物是否摄食过目标植物的本 发明方法。本实验包括给幼虫期烟夜蛾饲喂一种以下植物：烟草、棉 花、大豆或花生。变态后，对蛾成虫的脂肪酸特征进行分析。该特征 用来测定各个宿主植物品种的脂质脂肪酸特征中的差异。然后，分析 蛾存在的可替宁(烟碱代谢物)，以确定蛾是否曾在烟草上发育。最后， 分析蛾的棉酚以确定它是否曾在棉花上发育。
[0054]尽管本实验中按顺序完成分析，但是重要的是注意，该 分析可按任何顺序进行，或者彼此独立进行。脂肪酸的提取
[0055]采集蛾成虫，冻干，称重，单独地加到96孔板的2ml 孔中。然后将玻璃珠加至各孔中，研磨蛾，盖上板，将板放到研磨机 (参见例如美国专利第6,880,771号，通过引用结合到本文中)上。研磨 期间，研磨机以800rpm振摇板60秒钟。研磨后，将乙醚(1ml)加到 各孔中。再次盖上板，涡旋15分钟，蛾基质内的脂肪酸萃取到乙醚 中。然后，将脂肪酸的乙醚溶液加到新的96孔板的2ml孔中进行酯 交换。将最初的含蛾96孔板置于无水氮气流中，除去残余乙醚，然 后加盖并保存于-20℃，供稍后的可替宁和棉酚测定用。提取脂肪酸的转甲基作用
[0056]将乙酸甲酯(20μl)和甲醇钠(40μl)加到装有脂肪酸的乙 醚溶液的各孔中。将板再次涡旋30秒钟，使溶液在室温下静置10-40 分钟。之后，加入用草酸饱和的乙醚溶液(30μl)，将板涡旋至少20秒 钟。然后用无水氮气流除去乙醚溶液。干燥后，将己烷(1.5ml)加到各 孔中，使板涡旋。从各孔中取样品(1ml)转移到自动采样瓶中，供气相 色谱法分析用。气相色谱法和质谱法条件
[0057]气相色谱法包括DB-FFAP柱，长15米，直径0.25mm， 膜厚度0.25微米。进口温度为250℃，进样设置为分流进样(比率6∶1)。 用氦作为载气，流速0.8ml/分钟，注入各个样品(1μl)。使柱在85℃温 度下运行30秒钟，然后按25℃/分钟速度使温度升至150℃，再按17℃/ 分钟的速度使温度升至250℃。之后，将柱维持在250℃下3分钟。
[0059]按照下面的步骤，分析保留在96孔板各孔内经研磨的 蛾存在的可替宁：可替宁的提取
[0060]向1000ml容量瓶中加入乙酸(50ml)后再加入甲醇 (200ml)，来制备提取溶液。将去离子水加到该瓶中定容至总体积 1000ml。将40％NaOH加到提取溶液中，提高pH到11以上。
[0061]将提取溶液(1ml)加到装有研磨蛾的各孔中。然后，加入 氘化可替宁(20μl)作为内标。将石蜡膜覆盖在板上，然后将板盖压住 石蜡膜盖在板上，从而盖上板。首先将加盖的板涡旋15分钟，然后 离心。从各孔取出液体层，加到8ml小瓶中。将第二批提取溶液(1ml) 加到各孔中，使板涡旋5分钟，然后离心。将各孔的液体层加到之前 提取液相应的8ml小瓶中。向每个8ml小瓶中依次加入40％NaOH (150μl)、去离子水(4ml)。在无水氮气流下，使装有蛾残余物的96孔 板干燥，并保存于-20℃直到进一步的分析。
[0062]采用二乙烯基苯100mg固相萃取法(DVB SPE)，从提取 溶液中提取可替宁。柱子依次用乙醇(2ml)和去离子水(2ml)洗涤，准备 DVB SPE。然后，使提取溶液的可替宁过柱后加入去离子水(1ml)。向 柱子通入空气，使柱子干燥5-30分钟。随后，柱子用20％甲醇的乙醚 溶液(3ml)洗涤以将可替宁从柱上洗脱出来。用无水氮气流从可替宁中 除去甲醇/乙醚。将可替宁重新悬浮于甲醇/乙醚(150μl)，洗脱柱的各 侧，以避免丢失任何样品。将样品装入自动采样小瓶中供GC/MS分 析用。气相色谱法/质谱法联用
[0063]气相色谱法包括DB-5柱，长15米，内径0.25mm，膜 厚度0.25μm。进口温度285℃，进样设定为分流进样/不分流进样(比 率6∶1)。每个样品注入1微升，用氦作为载气，流速2.1ml/分钟。柱 温度始于100℃，在该温度下保持0.1分钟，然后按40℃/分钟的速度 使温度升至175℃后，按30℃/分钟的速度使温度升至300℃。
[0064]所用质谱仪为飞行时间Leco Pegasus III，电子碰撞电离 能70eV，溶剂延迟50秒钟。扫描范围50-210m/z，扫描速度15次 扫描/秒钟。离子源温度为200℃。
[0065]通过测定m/z 176面积与m/z 180面积的比率，对样品 的可替宁进行定量测定，其中m/z 180为氘化可替宁标准。使用每个 样品中的可替宁标准来测定保留时间。可替宁数据用十亿分之几表 示，检出限大约十亿分之一。棉酚分析
[0066]按照下面的方法，分析96孔板中残余研磨蛾存在的棉 酚：棉酚的提取
[0067]蛾体内存在的大部分棉酚进行代谢并结合到蛋白质上。 为了提取结合型的棉酚，可通过用形成双苯胺-棉酚的苯胺产生席夫碱 (Shiff’s base)，使复合物衍生化。然后，可用DVB SPE将双苯胺-棉酚 从蛾基质中分离出来。两个步骤详述如下。
[0068]将苯胺(1ml)、冰乙酸(5ml)和二甲基甲酰胺(44ml)混匀， 制备衍生剂。衍生剂可保存在4℃下一周。将氘化苯胺(0.1ml d5-苯胺)、 乙酸(0.5ml)和二甲基甲酰胺(4.4ml)混匀，制备氘化衍生剂。氘化衍生 剂可保存于4℃下一周。
[0069]将衍生剂(1ml)加到装有研磨蛾的各孔中。板用石蜡膜覆 盖，把盖压在石蜡膜上将各孔密封。使板涡旋1分钟，然后打开盖去 掉密封膜后，板用箔纸覆盖。将板在烤箱或加热孔板夹中于80-90℃ 加热1小时。从加热系统中取出后冷却，再次将板用石蜡膜覆盖，加 盖密封各孔。将板在2500-3000rpm下离心5分钟。
[0070]采用DVB SPE从衍生剂中提取棉酚。柱子依次用丙酮 (0.5ml)和甲醇(0.5ml)洗涤，制备DVB SPE 96孔板。然后，柱子用含 有等量水和DMF混合物的溶液(0.5ml)保持湿润。
[0071]为了避免交叉污染，从装有蛾和衍生剂的96孔板小心 地打开盖子并掀起石蜡膜。然后，将水(0.5ml)加到各孔中。将各个样 品转移到DVB SPE 96孔板的相应孔中，使之过柱。再将另外的DMF (0.5ml)加到装有蛾残余物的最初的96孔板中，将板用石蜡膜覆盖， 然后加盖，涡旋1分钟，按3000rpm离心5分钟。离心后，把水(0.5ml) 加到各孔中，将样品转移到DVB SPE 96孔板的相应孔中。
[0072]样品过柱后，柱子依次用20∶80水∶甲醇(0.5ml)和5∶95 丙酮∶甲醇(0.5ml)洗涤。随后，用丙酮(500μl)把棉酚从柱子中洗脱到 2ml或1.5ml 96孔板中。从样品中除去丙酮，样品用温和的氮气流干 燥。将样品保存于-20℃直到用电喷雾离子化/质谱/质谱(ESI/MS/MS) 进行分析。棉酚的HPLC/ESI/MS/MS测定
[0073]向各样品中加入丙酮(200μl)，并将样品混匀。然后，将 包含5μg/ml氘化衍生化双苯胺-棉酚(20μl)的溶液加到各个样品中作 为内标。样品加盖后涡旋，然后转移到0.5ml 96孔板中用于分析。
[0074]HPLC使用短柱(Zorbax Eclipse XBD-C 18，购自Agilent Technologies，Inc.)双溶剂流动相。溶剂A为10％水的甲醇溶液，溶 剂B为2∶1乙腈∶丙酮。流速为0.25ml/分钟，梯度见表1。表1：HPLC溶剂梯度
时间(分钟) ％B∶A 0 0 2 0 2.1 5 2.5 50 4 60 4.1 0 5 0
时间(分钟) ％B∶A 0 0 2 0 2.1 5 2.5 50 4 60 4.1 0 5 0
[0075]质谱仪为Waters公司的Micromass Quattro Ultima LC/MS/MS检测器，包括电喷雾负离子化三重四极杆质谱仪(triple quadrupole mass spectrometer with negative electrospray ionization)。因 为HPLC无法提供正确的双苯胺-棉酚电喷雾负离子化的电离基质，所 以过HPLC柱后按0.05ml/分钟的流速，引入0.6％NH4OH的甲醇溶液。 用混合T形接口(mixing T-connection)，完成NH4OH的MeOH溶液与 HPLC洗脱液过柱后的混合。在MS/MS方式中，用第一个四极杆来 筛选667.3表示双苯胺-棉酚负离子的质荷比。在第二个四极杆中， 667.3质荷比在碰撞室内破碎。用第三个四极杆来筛选碎片离子一苯 胺基-棉酚，其质荷比为574.2，这是因为失去了一个苯胺。检出第二 碎片离子提供了改进的特异性，并增加了信噪比。
[0076]通过574.2m/z的峰面积与内标氘化双苯胺-棉酚峰面积 的比率确定棉酚的半量子化。然后将这些比率与标准、空白和实验室 饲养的对照蛾的结果相比较以确定棉酚是否存在。结果
[0077]如上所述，对饲养在烟草、棉花、大豆和花生植物的烟 夜蛾幼虫的脂肪酸特征、可替宁的存在和棉酚的存在进行了分析。
[0078]为了确立各植物宿主的脂肪酸特征，对总离子流色谱图 积分，获得各种脂肪酸(C16:0、C16:1、C18:0、C18:2和C18:3)的面积， 合计得到总量。一种脂肪酸占总脂肪酸的百分比见下表2至表5。所 有4种宿主植物的比较显示，每一种都有可用来与其它宿主区别的独 特的脂肪酸特征。表2：花生植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 蛾5 平均值 C16:0 0.2096 0.1690 0.1866 0.1816 0.2087 0.1911 C16:1 0.0082 0.0044 0.0065 0.0083 0.0228 0.0100 C18:0 0.0321 0.0291 0.0261 0.0215 0.0421 0.0302 C18:1 0.5010 0.5414 0.5109 0.5569 0.3996 0.5020 C18:2 0.2467 0.2561 0.2676 0.2317 0.3267 0.2658 C18:3 0.0024 0.0000 0.0023 0.0000 0.0000 0.0009
表3：棉花植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 平均值 C16:0 0.2959 0.3441 0.2667 0.2848 0.2979 C16:1 0.0549 0.0581 0.0366 0.0313 0.0452 C18:0 0.0212 0.0085 0.0169 0.0396 0.0216 C18:1 0.4276 0.4989 0.5179 0.4142 0.4647 C18:2 0.1243 0.0594 0.1122 0.1497 0.1114 C18:3 0.0761 0.0310 0.0497 0.0805 0.0593
表4：大豆植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 蛾5 平均值 C16:0 0.1141 0.1677 0.1917 0.1694 0.1677 0.1621 C16:1 0.0054 0.0117 0.0100 0.0033 0.0113 0.0084 C18:0 0.1012 0.0254 0.0231 0.0373 0.0257 0.0426 C18:1 0.1686 0.2538 0.2814 0.2447 0.2557 0.2408 C18:2 0.4698 0.4783 0.4324 0.4869 0.4772 0.4689 C18:3 0.1408 0.0631 0.0614 0.0583 0.0623 0.0772
表5：烟草植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 蛾5 平均值 C16:0 0.3133 0.1612 0.2797 0.2939 0.1520 0.2400 C16:1 0.0756 0.0599 0.0150 0.0281 0.0200 0.0397 C18:0 0.0235 0.0776 0.0510 0.0534 0.1303 0.0671 C18:1 0.2122 0.1991 0.1391 0.1380 0.1773 0.1731 C18:2 0.1746 0.2544 0.1314 0.1222 0.1446 0.1654 C18:3 0.2008 0.2478 0.3839 0.3644 0.3758 0.3145
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 蛾5 平均值 C16:0 0.2096 0.1690 0.1866 0.1816 0.2087 0.1911 C16:1 0.0082 0.0044 0.0065 0.0083 0.0228 0.0100 C18:0 0.0321 0.0291 0.0261 0.0215 0.0421 0.0302 C18:1 0.5010 0.5414 0.5109 0.5569 0.3996 0.5020 C18:2 0.2467 0.2561 0.2676 0.2317 0.3267 0.2658 C18:3 0.0024 0.0000 0.0023 0.0000 0.0000 0.0009
表3：棉花植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 平均值 C16:0 0.2959 0.3441 0.2667 0.2848 0.2979 C16:1 0.0549 0.0581 0.0366 0.0313 0.0452 C18:0 0.0212 0.0085 0.0169 0.0396 0.0216 C18:1 0.4276 0.4989 0.5179 0.4142 0.4647 C18:2 0.1243 0.0594 0.1122 0.1497 0.1114 C18:3 0.0761 0.0310 0.0497 0.0805 0.0593
表4：大豆植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 蛾5 平均值 C16:0 0.1141 0.1677 0.1917 0.1694 0.1677 0.1621 C16:1 0.0054 0.0117 0.0100 0.0033 0.0113 0.0084 C18:0 0.1012 0.0254 0.0231 0.0373 0.0257 0.0426 C18:1 0.1686 0.2538 0.2814 0.2447 0.2557 0.2408 C18:2 0.4698 0.4783 0.4324 0.4869 0.4772 0.4689 C18:3 0.1408 0.0631 0.0614 0.0583 0.0623 0.0772
表5：烟草植物饲养蛾的脂肪酸比率
脂肪酸 蛾1 蛾2 蛾3 蛾4 蛾5 平均值 C16:0 0.3133 0.1612 0.2797 0.2939 0.1520 0.2400 C16:1 0.0756 0.0599 0.0150 0.0281 0.0200 0.0397 C18:0 0.0235 0.0776 0.0510 0.0534 0.1303 0.0671 C18:1 0.2122 0.1991 0.1391 0.1380 0.1773 0.1731 C18:2 0.1746 0.2544 0.1314 0.1222 0.1446 0.1654 C18:3 0.2008 0.2478 0.3839 0.3644 0.3758 0.3145
[0079]采用软独立建模分类法(Soft Independent Modeling for Class Analogy，SIMCA)，开发出基于4种作物每一种的饲养蛾脂肪酸 特征的监督分类(supervised classification)。SIMCA模型开发为4种作 物的每一种产生单独的主成分分析(Principal Component Analysis， PCA)模型或者分类模型。新的未知样品用各PCA模型进行分类，通 过未知样品距PCA组模型的最小距离确定其组成员关系。参见图1-4。 以Si/So对Ho作图显示，横坐标上样品至模型距离相对于平均模型距 离(Si/So)，及各样品在纵坐标上的水平(leverage)。按5％显著水平的水 平线和垂直线表示组限(class limit)。可将两条横线内接近原点的未知 样品划分为组模型成员。两条横线以外的样品不属于组模型。图1-4 显示可根据幼虫变态前饲喂的宿主植物，应用脂肪酸特征数据，对蛾 样品进行分类。表6显示模型之间的距离。模型间距离越大，组间差 异越大。一般而言，模型差异＞3表示有显著差异的组模型。数值范 围为200-45,000的，组模型显著不同，并可根据其组，对新样品进行 分类。表6：棉花、烟草、大豆和花生植物之间的模型距离
棉花PCA 烟草PCA 大豆PCA 花生PCA 棉花PCA 1 317 244 1735 烟草PCA 317 1 253 45430 大豆PCA 244 253 1 1744 花生PCA 1735 45430 1744 1
棉花PCA 烟草PCA 大豆PCA 花生PCA 棉花PCA 1 317 244 1735 烟草PCA 317 1 253 45430 大豆PCA 244 253 1 1744 花生PCA 1735 45430 1744 1
[0080]棉酚的有效性试验在不同的两天内分两批单独进行。大 多数昆虫饲养在棉花上。第一天进行第一批试验，包括苘麻、大豆和 豌豆喂养的昆虫用于比较。预期该批将被证明为棉酚阴性。第二天， 包括人工饲料喂养的昆虫作为阴性对照。这两天内，还进行空白和标 准试验作为额外的试验对照。
[0081]图5中的结果用电喷雾/质谱仪记录的信噪比表示，是电 喷雾/质谱仪给出最一致的结果。也可使用质谱仪的其它响应参数，例 如峰面积。提供以下每个处理组的最小、平均和最大信噪比：人工饲 料、苘麻、大豆、豌豆或棉花饲养昆虫(单独表示两天中棉花饲喂的昆 虫)。选择信噪比的截止值12作为确定棉酚存在与否的数值(若大于该 值，则样品为阳性；若小于或等于该值，则为阴性)。采用这些标准， 试验中棉花饲养昆虫总被鉴定为棉酚阳性。对于棉花饲养蛾，信噪比 通常＞100，几乎总＞30，并从未＜14。两天的最小值分别14和18， 每天所测得的棉花饲喂昆虫的总数＞50。信噪比标准(signal to noise criteria)取决于总的方法，因此在实验室之间有所不同。因此，进行有 效性研究以设定使假阴性最小的标准十分重要。
[0082]使用信噪比标准，棉酚HPLC-MS测定法有效性研究的 结果见表7。发现所有棉花喂养蛾都是棉酚阳性的。其它不含棉酚植 物的饲养蛾具有一定的假阳性比率。表7还表示非棉酚植物饲养的蛾 存在一定的假阳性比率。也就是说，有些蛾可能被鉴定为在棉花上饲 养，但是它们却不是在棉花上饲养的。例如，所测28只苘麻饲养蛾 中有4只被鉴定为在棉花上饲养。
[0083]检测棉酚所设置的信噪比为12∶1，试验成功鉴定出所有 得自棉花的昆虫(棉酚阳性)，但是假阳性比率约为15％。也就是说， 一定数量未在棉花上饲养的昆虫被保守地鉴定来自棉花。表7：有效性研究结果
饲料 苘麻 大豆 豌豆 棉花1 棉花2 阴性 27 24 5 5 0 0 阳性 6 4 2 0 56 58
饲料 苘麻 大豆 豌豆 棉花1 棉花2 阴性 27 24 5 5 0 0 阳性 6 4 2 0 56 58
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