用于改进营养补充剂释放的方法和组合物
阅读：323发布：2020-11-28
专利汇可以提供用于改进营养补充剂释放的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及营养添加剂的改进的释放，该营养添加剂是通过将一种或多种分离和纯化的长链多糖与一种或多种选自抗 氧 化剂、维生素、矿物质、 氨 基酸、核酸及其混合物和组合的 营养补充剂 组合而成的，其中所述添加剂在大于100psi的压 力 下被压缩。，下面是用于改进营养补充剂释放的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种改进释放的膳食添加剂，其中包含：一种或多种分离和纯化的 长链多糖和一种或多种选自抗氧化剂、维生素、糖、矿物质、氨基酸、核酸 及其混合物和组合的营养补充剂，其中添加剂在大于100psi的压力下被压 缩。
2.权利要求1所述的添加剂，其中所述添加剂被置于胶囊、蔬菜胶囊 或硬明胶胶囊中。
3.权利要求1所述的添加剂，其中约85％的营养补充剂从约1至约8 小时被释放。
4.权利要求1所述的添加剂，其中约85％的营养补充剂从约2到约6 小时被释放。
5.权利要求1所述的添加剂，其中所述添加剂包含一种或多种赋形剂。
6.权利要求1所述的添加剂，其中所述长链多糖包含选自半乳糖、半 乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、 岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿拉伯糖、阿拉伯半 乳聚糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖及其混合物或组合的 单体。
7.权利要求1所述的添加剂，其中所述添加剂在约2,000至10,000psi 的压力下经碾压被压缩。
8.权利要求1所述的添加剂，其中所述添加剂在约5,000至10,000psi 的压力下被压缩。
9.权利要求1所述的添加剂，其中所述添加剂在大于10,000psi压力下 被压缩。
10.权利要求1所述的添加剂，其中所述一种或多种长链多糖包含重量 百分含量各为约0.1％到约75％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、 N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和 木糖。
11.权利要求1所述的添加剂，其中所述一种或多种长链多糖是分离和 纯化的黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼 脂、褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟 提取物、达瓦树胶、淀粉、纤维素、降解纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、 胶质、甲壳质、阿拉伯树胶(acacia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、褐藻酸、 角叉菜胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽 糖、葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳 糖及其混合物或组合。
12.权利要求1所述的添加剂，其中所述一种或多种长链多糖包含重量 百分含量各为约1％到约10％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N -乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和 木糖。
13.权利要求1所述的添加剂，其中所述抗氧化剂包含一种分离和纯化 的疏脂性氧自由基清除剂和一种分离和纯化的亲脂性氧自由基清除剂，其中 组合的疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂具有大于6,000μMol的Trolox当量 (TE)/克的氧自由基清除剂值。
14.权利要求13所述的添加剂，其中所述疏脂性氧自由基清除剂选自 一种或多种选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、ξ2和σ生育酚的维生素E和α、 β、δ和γ生育三烯酚、及其类似物、其药学上可接受的盐和其组合。
15.权利要求13所述的添加剂，其中所述亲脂性氧自由基清除剂选自 黄酮醇、槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及其衍生物、类似物、药学上 可接受的盐和组合。
16.一种改进释放的膳食添加剂，其中包含一种或多种选自分离和纯化 的黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、 褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取 物、达瓦树胶、淀粉、纤维素、降解纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、胶质、 甲壳质、阿拉伯树胶(acacia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、褐藻酸、角叉菜 胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、葡 聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖及其 混合物或组合的分离和纯化的长链多糖；以及一种或多种选自抗氧化剂、维 生素、矿物质、氨基酸，核酸、糖及其混合物和组合的营养补充剂，其中所 述长链多糖和营养补充剂在大于2,000psi的压力下被碾压。
17.权利要求16所述的添加剂，其中所述添加剂被置于胶囊、蔬菜胶 囊或硬明胶胶囊中。
18.权利要求16所述的添加剂，其中约85％的营养补充剂从约1至约 8小时被释放。
19.权利要求16所述的添加剂，其中约85％的营养补充剂从约2到约 6小时被释放。
20.权利要求16所述的添加剂，其中所述添加剂包含一种或多种赋形 剂。
21.权利要求16所述的添加剂，其中所述营养补充剂进一步包含营养 上有效量的两种或更多种选自半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露 糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N -乙酰化葡萄糖胺、阿拉伯糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、 艾杜糖醛酸、木糖及其混合物或组合的糖。
22.权利要求16所述的添加剂，其中所述添加剂在约2,000至10,000psi 的压力下被压缩。
23.权利要求16所述的添加剂，其中所述添加剂在约5,000至10,000psi 的压力下被压缩。
24.权利要求16所述的添加剂，其中所述添加剂在大于10,000psi压力 下被压缩。
25.权利要求16所述的添加剂，其中所述一种或多种营养补充剂包含 重量百分含量各为约0.1％到约75％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露 糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖 胺和木糖。
26.权利要求16所述的添加剂，其中所述一种或多种营养补充剂包含 半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木 糖。
27.权利要求16所述的添加剂，其中所述一种或多种营养补充剂包含 重量百分含量各为约1％到约10％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、 N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和 木糖。
28.权利要求16所述的添加剂，其中抗氧化剂包含一种分离和纯化的 疏脂性氧自由基清除剂和一种分离和纯化的亲脂性氧自由基清除剂，其中组 合的疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂具有大于6,000μMol的Trolox当量 (TE)/克的氧自由基清除剂值。
29.权利要求28所述的添加剂，其中所述疏脂性氧自由基清除剂选自 一种或多种选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、ξ2和σ生育酚的维生素E和α、 β、δ和γ生育三烯酚、及其类似物、其药学上可接受的盐和其组合。
30.权利要求28的所述添加剂，其中所述亲脂性氧自由基清除剂选自 黄酮醇、槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及其衍生物、类似物、药学上 可接受的盐和其组合。
31.权利要求16所述的添加剂，其中所述长链多糖包含约2到50,000 个单体。
32.权利要求16所述的添加剂，其中所述长链多糖包含约200到50,000 个单体。
33.权利要求16所述的添加剂，其中所述长链多糖包含约2,000到50,000 个单体。
34.权利要求28所述的添加剂，其中当向患者提供疏脂性和亲脂性氧 自由基清除剂时，经ORAC(β-PE)测定，疏脂性和亲脂性氧自由基清除 剂在患者的基线抗氧化水平的基础上提供了超过13％的增加值。
35.权利要求28所述的添加剂，其中所述疏脂性和亲脂性氧自由基清 除剂占添加剂重量的约1％至30％。
36.一种改进释放的膳食添加剂，其中包含：营养上有效量的一种或多 种分离和纯化的长链多糖，一种或多种亲脂性抗氧化剂和一种或多种疏脂性 抗氧化剂，其中添加剂在大于5,000psi的压力下被碾压。
37.权利要求36所述的添加剂，其中所述组合的疏脂性和亲脂性抗氧 化剂具有大于6,000μMol的Trolox当量(TE)/克的溶解氧值。
38.权利要求36所述的添加剂，其中所述长链多糖选自一种或多种选 自黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、 褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取 物、达瓦树胶、淀粉、纤维素、降解纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、胶质、 甲壳质、阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、褐藻酸、角叉菜 胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、葡 聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖及其 混合物或其组合的物质。
39.权利要求36所述的添加剂，其中所述长链多糖包含重量百分含量 各为约1％到约10％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰化 神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木糖。
40.一种制备改进释放的膳食添加剂的方法，其中包含以下步骤：混合 一种或多种长链多糖和营养上有效量的一种或多种选自抗氧化剂、维生素、 矿物质、氨基酸、核酸、糖、草药提取物(herbal extract)及其混合物和组 合的营养补充剂，并且将添加剂在大于2,000psi的压力下压缩。
41.权利要求40所述的方法，其中所述添加剂被置于外囊、蔬菜胶囊 或硬明胶胶囊中。
42.权利要求40所述的方法，其中约85％的营养补充剂从约1到约8 小时被释放。
43.权利要求40所述的方法，其中约85％的营养补充剂从约2到约6 小时被释放。
44.权利要求40所述的方法，其中所述添加剂进一步包含一种或多种 赋形剂。
45.权利要求40所述的方法，其中所述长链多糖选自半乳糖、半乳糖 胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩 藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木糖或其组合。
46.权利要求40所述的方法，其中所述添加剂在约2,000至10,000psi 的压力下被压缩。
47.权利要求40所述的方法，其中所述添加剂在约5,000至10,000psi 压力下被压缩。
48.权利要求40所述的方法，其中所述添加剂在大于10,000psi的压力 下被压缩。
49.权利要求40所述的方法，其中所述压缩为经过碾压。
50.权利要求40所述的方法，其中所述的一种或多种长链多糖包含重 量百分含量各为从约0.1％至约75％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露 糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖 胺和木糖。
51.权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种长链多糖选自黄蓍 胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、 刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦 树胶、淀粉、纤维素、降解纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、胶质、甲壳质、 阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、褐藻酸、角叉菜胶、右旋 糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、葡聚糖、香 菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖、其混合物和 组合。
52.权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种长链多糖包含各重 量百分含量为约1％到约10％的分离和纯化的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N -乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和 木糖。
53.权利要求40所述的方法，其中抗氧化剂包含一种分离和纯化的疏 脂性氧自由基清除剂和一种分离和纯化的亲脂性氧自由基清除剂，其中组合 的疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂具有大于6,000μMol的Trolox当量(TE) /克的氧自由基清除剂值。
54.权利要求53所述的方法，其中所述疏脂性氧自由基清除剂选自一 种或多种选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、ξ2和σ生育酚的维生素E和α、β、 δ和γ生育三烯酚、及其类似物、其药学上可接受盐和其组合。
55.权利要求53所述的方法，其中所述亲脂性氧自由基清除剂选自黄 酮醇、槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及其衍生物、类似物、药学上可 接受的盐和其组合。
56.一种改进释放的膳食添加剂，其中包含：营养上有效量的一种或多 种分离和纯化的多糖，所述多糖选自黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗、 甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种 子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树胶、淀粉、纤维素、降解纤维素、 果糖、高果糖玉米糖浆、胶质、甲壳质、阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶 (gum arabic)、褐藻酸、角叉菜胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、 乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维 素、菊糖、果聚糖、乳糖及其混合物或组合；和一种或多种选自抗氧化剂、 维生素、矿物质、氨基酸、核酸及其混合物和组合的营养补充剂，其中所述 多糖和营养添加剂在大于2,000psi的压力下被碾压。
发明领域
本发明总体上涉及营养补充剂的改进释放领域，更特别地涉及提供营 养补充的组合物、制剂和方法，它们提供的营养补充更类似于消化过程中 食物所提供的营养补充。
发明背景
本发明描述的背景与抗氧化传感器技术以及检测方法相关，但其不限 制本发明的范围。
生物系统已经进化出对抗自由基和其它促氧化物质的作用的抗氧化 剂系统。抗氧化剂是指任何显著延迟或防止可氧化物氧化的物质，与可氧 化物相比其以较低浓度存在。酶可以是抗氧化剂，例如超氧化物岐化酶和 过氧化氢酶，许多有机体都编码这些酶。例如维生素C和植物酚的物质 是通过饮食进入生物系统的抗氧化剂。有建议称通过体内产生或者正常饮 食吸收而自然形成的这些物质的水平并不充足。正常饮食经常无法提供足 够的抗氧化剂，这是因为水果和蔬菜中缺乏和/或饮食中的水果和蔬菜由于 现代的加工方法使它们的抗氧化剂被耗尽。正常饮食可以被改善，然而当 今的生活方式以及西餐单调的组成使得添加营养成为输送人体所需抗氧 化剂的最可行的方法。为了对正常的饮食进行补充，必须要确定添加剂中 所包含的成分的抗氧化能力。
发明概述
本发明包括用于营养上有效量的如抗氧化剂、维生素、糖、矿物质、 氨基酸、核酸及其混合物和组合的改进释放的组合物、方法和制剂，其中 添加剂在长链多糖的存在下，在大于100psi的压力下被压缩。发现使用同 样的条件：胶囊、重量等，利用例如抗氧化剂的营养物指示剂，当与长链 多糖一起被压缩时，本发明使得营养物随时间溶出。作为营养补充养生法 的一部分，长链多糖的例子可以是具有例如2至约50,000糖单体长度的单 体亚单位，其可以在约100、500、1000、2000或者甚至10,000psi或更大 的压力下被压缩。与现今使用的大多数迅速释放的营养补充剂不同的是， 本发明使得一种或多种抗氧化剂、维生素、矿物质、氨基酸、核酸、糖、 及其混合物和组合更自然地释放。与食物不同的是，本发明可以被用于以 一种既科学又更天然的方式来补充基本营养物特定的缺失。
添加剂可以被置于胶囊、蔬菜胶囊或硬明胶明胶胶囊中。当在更高的 压力，例如大于5000psi时被压缩，发现超过85％的营养补充剂从约1至 约8小时被释放，在其它制剂中超过85％的营养补充剂从约2至约6小时 被释放。长链多糖可以包括选自半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、 甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳 糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿拉伯糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖及其混合物或组合的单体。添加剂可以通 过碾压在约2000到10,000；5,000到10,000；或大于10,000psi的压力下 被压缩。一种或更多种长链多糖可以含有重量百分比为约0.1％到约75％ 的，例如半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、 N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿 拉伯糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖 及其混合物或组合。
添加剂可以包括一种或多种选自半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰 化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木糖 的长链多糖，其来源于例如分离和纯化的黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、 甘蔗、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐 树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树胶(gum ghatti)、淀 粉、纤维素、降解的纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、果胶、甲壳质、阿 拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、藻酸、角叉菜胶、右旋糖 苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、葡聚糖、香 菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖及其混合物 或组合。在一个特定实施例中，长链多糖和/或营养上有效量的一种或多种 糖包括每种的重量百分比为约1％到约10％的分离和纯化的半乳糖、半乳 糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、 岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿拉伯糖、阿拉伯半乳 聚糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖及其混合物或组合。
在本发明的另一个实施方案中，改进释放的膳食添加剂包括一种或多 种分离和纯化的长链多糖，其选自分离和纯化的黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、 米粉、甘蔗(sugar cane)、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐 豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树 胶达瓦树胶、淀粉、纤维素、降解的纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、果 胶、甲壳质、阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、藻酸、角 叉菜胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽 糖、葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、 乳糖及其混合物或组合；以及一种或多种选自抗氧化剂、维生素、矿物质、 氨基酸、核酸、糖及其混合物和组合的营养补充剂，其中长链多糖和营养 补充剂在大于2,000psi的压力下被碾压。
本发明的另一种改进释放的膳食添加剂包括一种或多种营养上有效 量的分离和纯化的长链多糖，一种或多种亲脂性抗氧化剂，以及一种或多 种疏脂的抗氧化剂，其中添加剂在大于5,000psi的压力下被碾压。
本发明还包括一种制备改进释放的膳食添加剂的方法，其是通过混合 一种或多种长链多糖和营养上有效量的一种或多种选自抗氧化剂、维生 素、矿物质、氨基酸、核酸、糖、草药提取物及其混合物和组合的营养补 充剂，并且在大于100、500、1,000、2,000、5,000或10,000psi的压力下 被压缩而成的。上述方法可以被用于制造改进释放的膳食添加剂，其包括 营养上有效量的一种或多种来源于黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗 (sugar cane)、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、 刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树胶达瓦树胶(gum ghatti)、淀粉、纤维素、降解的纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、果胶、 甲壳质、阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、藻酸、角叉菜 胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、 葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖 及其混合物或组合的分离和纯化的多糖，以及一种或多种选自抗氧化剂、 维生素、矿物质、氨基酸、核酸及其混合物和组合的营养补充剂，其中多 糖和营养补充剂在大于2,000psi的压力下被压缩。
本发明还包括抗氧化传感器以及直接测定总样品的氧化水平和抗氧 化剂对总样品的氧化状态的影响的方法。本发明还包括用于为实现最佳健 康状态而向个体提供有效量抗氧化剂的组合物和方法。本发明披露的装置 和方法能同时地、实时地并直接地检测样品的总抗氧化能力。本发明人认 识到该技术已经人工地创造了两种相互独立类别的抗氧化剂(亲脂性和疏 脂性)并且分别测定它们。此外，该技术还经常使用一种可检测的报告分 子间接地测定了自由基的存在。
本发明通过使用快速的，便宜的且直接的检测系统克服了现有技术中 检测器和方法的局限性。为了突破这些局限，本发明人研发了本发明披露 的氧自由基吸收能力-氧(ORAC(o))装置和方法。利用ORAC(o)装置， 本发明人能够首次同时地、实时地测量亲脂性和疏脂性抗氧化剂对溶解氧 水平的效果的影响。利用ORAC(o)分析，发明人还能够开发出一种具有协 同效应的抗氧化组合物，其可以单独或者与一种或更多种抗氧化增效剂联 合使用。
更特别的是，本发明包括直接检测亲脂性和疏脂性抗氧化剂的抗氧化 活性的装置，该装置包括与在溶剂/水/表面活性剂混合物中的样品和氧自 由基敏感性分子通过流体相联系(communication)的溶解氧传感器，其中 氧自由基敏感性传感器同时检测溶剂/水/表面活性剂混合物中的亲脂性和 疏脂性抗氧化剂。氧自由基敏感性分子可以是与氧反应的分子，例如具有 共轭双键的分子；或含氮或硫的化合物。氧自由基敏感性分子的例子，例 如荧光素、β-藻红蛋白(β-PE)，谷光甘肽-S-转移酶、亚油酸或其组合。 氧自由基的水平可以通过溶解氧测定仪或传感器在溶剂/水/表面活性剂混 合物中直接确定。溶解氧水平可以利用氧传感器，例如电化学、化学发光、 表面等离子共振、红外线、电容耦合、染料偶合光纤(dye-coupled fiber optic) 或高光谱氧传感器(hyperspectral sensor)来测定。溶解氧测定仪或传感器 可以设置为在线进行高通量分析，也可以作为单独的样品检测器和/或适用 于办公室或者甚至家庭使用。溶剂可以是有机溶剂，例如丙酮。表面活性 剂可以是去污剂，例如非离子去污剂吐温-20。溶剂/水/表面活性剂混合 物中的溶剂通常至少占溶剂/水/表面活性剂混合物的体积的约10到90％， 如33％。溶剂/水/表面活性剂混合物中的水通常至少占溶剂/水/表面活性剂 混合物的体积的约10到90％，如33到67％。溶剂/水/表面活性剂混合物 中的表面活性剂(或去污剂)通常至少占溶剂/水/表面活性剂混合物的体 积的约0.1到10％，并且可以溶于水中储存。在一个特定的实施例中，溶 剂/水/表面活性剂的比率是1∶1∶1。
装置可以进一步包括一个或多个处理器，例如计算机，其可以控制检 测器、采集数据、存储数据、基于数据和/或信息数据库进行运算，和/或 以表格、曲线图、图表等形式显示数据或数据的概要。处理器/计算机还可 以连接并且甚至控制流控系统，该流控系统与氧传感器和溶剂/水/去污剂 混合物通过流体相联系。本发明测量的曲线下面积涉及由接受抗氧化能力 检测的样品的活性导致的氧相对消失，以及观察到的作为已知标准品的活 性结果的氧相对消失。利用本发明和本发明记载的方法，可以同时在包括 亲脂性和疏脂性抗氧化剂的溶液中直接测量溶解氧的水平。计算AUC的 公式的例子可以是
其中AUCsMP是样品的曲线下面积；其中AUCBLNK是空白的曲线下面 积；其中AUCTRLX是Trolox的曲线下面积；并且其中SMP是样品。
本发明还包括一种直接测定抗氧化剂活性的方法，其包括如下步骤： 在有一种或多种抗氧化剂和目标氧自由基存在下，测定溶解在溶剂/水/表 面活性剂混合物中的待测溶液的溶解氧水平，其中用氧检测器测量水溶性 和脂溶性抗氧化剂的活性。溶解的氧自由基水平可以利用氧检测器测定， 氧检测器例如电化学、化学发光、表面等离子共振、电容耦合、染料偶合 光纤(dye-coupled fiber optic)或高光谱氧传感器(hyperspectral sensor)。 抗氧化剂活性可以在37℃下测量。自由基引发剂的实例包括，例如2，2′- 偶氮二[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐，2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷) 二盐酸盐(AAPH)，2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)[2-(N-硬脂酰)脒基丙烷] 二盐酸盐(SA-1)，2，2′-偶氮(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)-[2-[2-(4-正辛基)咪唑啉 -2-基]-丙烷]二盐酸盐(C-8)，2，2′-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈) (MeO-AMVN)，2，2′-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)(AMVN)，偶氮二异丁 基腈，2，2′-偶氮二(2-甲基丙酸盐)(DAMP)和2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)， 及其盐、混合物或等同物。检测器甚至可以是一次性的。
本发明还包括膳食添加剂，该添加剂包括任何分离和纯化的疏脂性抗 氧化剂以及分离和纯化的亲脂性抗氧化剂，其中组合的疏脂性和亲脂性抗 氧化剂具有大于6,000μMol的Trolox当量(Equivalents)(TE)/克的溶 解氧值。技术人员会意识到该数值也可以用液体当量来表达，如6,000μMol 的Trolox当量(Equivalents)(TE)/毫升。疏脂性和亲脂抗氧化剂是随 时间释放的并且可以包括一种或多种选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、ξ2 和σ生育酚(tocopherol)的维生素E，以及α、β、δ和γ生育三烯酚 (tocotrienols)，及其类似物、其药学上可接受的盐和其组合。亲脂性抗氧 化剂的例子包括槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及其衍生物、类似物、 药学上可接受的盐和组合。
包括任何分离和纯化的疏脂性抗氧化剂和任何分离和纯化的亲脂性 抗氧化剂的膳食添加剂还可以包括两种或多种基本的糖，例如半乳糖、半 乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、 岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和/或木糖。在一个实施 方案中，添加剂还包括维生素C源，例如含有高水平天然的、可生物利用 的维生素C的植物原料，例如澳大利亚李树灌木(bush plum，Terminalia ferdinandiana)。在一个特定的实施方案中，维生素C是来自维生素C植 物原料的抗氧化活性的增强剂，维生素C植物原料例如野生澳大利亚李树 灌木(bush plum，Terminalia ferdinandiana)，其维生素C的百分含量比农 场生长李树灌木(bush plum)更高。添加剂也可以包括一种或更多种有益 菌种，如乳酸菌(Lactobacillus sp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)。添 加剂也可以被压缩以提供通常不能渗透氧气的表面，例如，碾压的颗粒、 胶囊、片剂、小片剂(mini-tab)、囊片、泡腾片或其组合。
与上述的ORAC(o)装置和方法比较而言，分离和纯化的亲脂性和 疏脂性抗氧化剂具有超过7000μMol的Trolox当量(Equivalents)(TE)/ 克的抗氧化ORAC(fl-lipo)值。本发明被用于开放式实验研究来测定每 个在饮食中摄取抗氧化剂/糖营养素(glyconutrient)混合物的个体的抗氧 化水平的变化，该混合物被中包括本发明的抗氧化剂。当向患者提供疏脂 性和亲脂性抗氧化剂时，通过ORAC(β-PE)测定可知相对于累积的患者 人群的平均基本抗氧化水平，疏脂性和亲脂性抗氧化剂提供了超过13％的 平均增加值。本发明还包括许多组合物。本发明公开的组合物是基于这样 的认识，即目前可获得的膳食添加剂无法将具有高于每种成分预期活性的 可测定活性的亲脂性和疏脂性抗氧化剂组合起来。利用本发明的装置和方 法，本发明人能够开发出不仅含有亲脂性和疏脂性抗氧化剂，还增加了抗 氧化物活性的增效剂的具有协同效应的组合。
目前已经表明如槲皮素这样的类黄酮通过基因的抗氧化反应元件来 增加谷胱甘肽合成中的限速酶，即γ-谷氨酰半胱氨酸(glutamylcysteine) 合成酶的重亚单位的转录。增加的转录随后在组织培养细胞中翻译，增加 了胞内还原(活性)谷胱甘肽水平。槲皮素是红葡萄酒、葡萄皮和洋葱中 的重要组分。对来自于红葡萄酒、葡萄皮和洋葱中的槲皮素的研究表明其 对健康的有益作用。已经显示槲皮素可以被人体很好地吸收。一项研究表 明所有吸收的槲皮素在进食后2个小时被代谢(European Research on Functional Effects of Dietary Antioxidants，September 25-28，2002， Cambridge，UK)。一经发现饮用适量红葡萄酒的受试者的LDL氧化实质 上被降低，研究者就声称保护效果很可能归因于槲皮素及其代谢物的活 性。已经显示槲皮素增强了红血球稳定性。
本发明人意识到由于众多不同的因素影响氧化应激，添加抗氧化剂需 要适应个体的需要和化学方面的要求。此外，已经意识到需要组合生育酚 以满足个体的不同需要。组合生育酚是必须的，因为某些抗氧化剂被机体 “选择”。例如，北美地区饮食中维生素E的主要形式是γ-生育酚，其通 常存在于植物油以及大豆和谷类产品中。然而人体主要保留α-生育酚。已 经发现一种依赖于α-生育酚转移蛋白的特定方法能够调节人体中α-生育 酚的浓度。与现有技术中抗氧化组合物不同，本发明使用混合生育酚向人 体提供多种形式的维生素E，从而实现选择、保持和使用每种形式的优选 剂量。而且，槲皮素和混合生育酚的具有协同效应的组合向人体提供了一 大批抗氧化剂营养物的优良选择，其可以根据个体需要而变化。
本发明人试图通过加入化合物进一步使具有协同作用的槲皮素和混 合生育酚的组合的活性最大化，这些化合物能够增强这些抗氧化剂的活 性。这种增效剂之一是维生素C。这是因为维生素C具有显著的抗氧化剂 活性以及几种非抗氧化剂的营养性功能。许多因素导致维生素C促氧化 (pro-oxidant)特性，特别是在过渡金属的存在下。维生素C的促氧化特 性可以不被完全破坏。然而，其他的研究者证实他们发现维生素C甚至在 未结合的金属存在下仍然作为抗氧化剂。具有抗氧化活性的其它增效剂包 括天然提取物，例如葡萄籽提取物和绿茶提取物。在一项研究中，绿茶表 现出有效的体外抗突变活性，抑制了大鼠结肠内致癌物诱导的癌前病变 (preneoplastic lesions)的发展。绿茶还明显抑制了肠息肉(intestinal polyps)的形成。因此本发明人不仅将天然来源的纯化和分离的抗氧化剂， 例如槲皮素和混合生育酚组合成具有协同效应的组合，而且进一步添加了 提高这些试剂可检测的抗氧化活性的增效剂。
更特别地是，膳食添加剂组合物包括营养上有效量的两种或更多种的 基本糖；分离和纯化的疏脂性氧自由基清除剂；以及分离和纯化的亲脂性 氧自由基清除剂，其中组合的疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂具有大于6， 000μMol的Trolox当量(TE)/克的氧氧自由基清除剂值。在一项试验中， 当给病人提供疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂时，通过ORAC(fl-lipo)测定 的相对于患者人群的基本抗氧化水平，疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂提 供了超过13％的平均升高值。疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂被包覆用于 延迟释放，其可以包括一种或多种下述维生素E分子：α、β、δ、ε、γ、ζ、 η、ξ1、ξ2和σ生育酚，以及α、β、δ和γ生育三烯酚(tocotrienols)及 其类似物、其药学上可接受的盐和其组合。亲脂性氧自由基清除剂可以包 括一种或多种下述物质：黄酮醇、槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及 其衍生物、类似物、药学上可接受的盐和其组合。添加剂可以进一步包括 两种或多种选自：半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、 N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木糖及其衍生物、类似物、药学 上可接受的盐及其组合的糖。
附图的简要说明
为了更充分理解本发明的技术特征和优点，将附图作为本发明详细描 述的参考，其中：
图1描述了进行ORAC(o)的直接抗氧化剂设备；
图2是本发明的ORAC(o)方法的流程图；
图3是两幅图，即对比ORAC(o)(氧百分比)测定和ORAC(fl)(荧 光)测定中的空白溶液，使用AAPH作为引发剂，Trolox作为标准品，亚 油酸或荧光素分别作为氧自由基靶点；
图4是两幅图，即对比ORAC(o)(氧百分比)测定和ORAC(fl)(荧 光)测定中的抗氧化剂标准品Trolox，使用AAPH作为引发剂，Trolox 作为标准品，亚油酸或荧光素分别作为氧自由基靶点；
图5是两幅图，即对ORAC(o)(氧百分比)测定和ORAC(fl)(荧 光)测量中的空白溶液、标准品和样品，使用AAPH作为引发剂，Trolox 作为标准品，亚油酸或荧光素分别作为氧自由基靶点；
图6是显示通过本发明的ORAC(o)方法测定的5μg/mL槲皮素(Q) 和5μg/mL混合生育酚(MT)的组合的抗氧化剂效果，并与浓度为10μg/mL 单独的每种组分进行对比的图；
图7是显示通过本发明的ORAC(o)的方法测定的5μg/mL槲皮素(Q) 和5μg/mL混合生育酚(MT)的组合的抗氧化剂效果，并以Trolox作为 对照的图；
图8是根据使用测定抗氧化能力的ORAC(o)方法测得的槲皮素和 混合生育酚的滴定率得到的曲线下面积(AUC)图；
图9是根据使用测定抗氧化剂能力的ORAC(o)方法测得的槲皮素 和混合生育酚的滴定率得到的AUC的另一幅图，该图证明了预期结果(线) 和检测到的与槲皮素和混合生育酚的滴定预期结果相比高于该线的协同 作用的程度；
图10是显示在49.18％槲皮素、32.79％混合生育酚以及1.64％李树灌 木(bush plum)存在下，不同比例的葡萄皮提取物和绿茶提取物的ORAC (o)分析结果的图，葡萄皮提取物与绿茶提取物的优选比例是60/40到 80/20；
图11是显示5μg/mL槲皮素(Q)和5μg/mL混合生育酚(MT)的组 合的ORAC(fl)结果，并与浓度为10μg/mL单独的每种组分进行对比的 图；
图12是显示测定槲皮素的滴定度相对溶解在丙酮：水中的生育酚的 ORAC(fl)分析图；
图13是显示测定抗氧化剂活性的ORAC(fl)分析的图，其测定了固 定比例的槲皮素：α-生育酚在溶剂∶水∶去污剂混合物中溶解的比例；
图14是显示测定抗氧化剂活性的ORAC(fl)分析的图，其测定了固 定比例的槲皮素：α-生育酚在两种不同比例的溶剂∶水∶去污剂混合物中溶 解的比例；
图15是显示获自不同比例的槲皮素和混合生育酚的ORAC(o)值的 图；
图16是显示不同比例的葡萄籽提取物和绿茶提取物的ORAC(o)值 的图；
图17是显示具有最大量的槲皮素：混合生育酚和葡萄籽提取物和绿茶 提取物组合的ORAC(o)值的图；
图18是显示被选的用于初次研究的三个模型；以及
图19和20是显示分别经HPLC和UV/Vis测定的槲皮素相对释放的 情况的图。
发明详述
在下文详细讨论本发明的各种实施方案的制定和用途时，应该认识到 本发明提供了许多可应用的发明构思，其可以通过各种特定语境来具体体 现。此处讨论的特定实施方案仅仅是以特定的方式说明本发明的制备和用 途，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，下文定义了许多术语。这里定义的术语具有本 发明涉及的领域的普通技术人员通常所理解的含义。术语例如“a”、“an” 和“the”并不意味着是指仅仅单个的实体，而是包括可以用特定例子来说 明的大类。此处的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是它们的应用 不限制本发明，除非权利要求书中指出。
本发明是部分基于对现有技术已经人为地制造出两种相互独立的抗 氧化剂类别并分别对它们进行测量的认识。而且现有技术还通常间接地测 定自由基的存在，即使用报道分子。本发明提供了不仅检测样品的总抗氧 化剂能力而且同时是直接测定的设备和方法。
本发明使用的术语“基本的糖”是用于定义细胞糖蛋白的寡糖链上常 见的单糖，其不能通过饮食和人体内生化合成方便地获得(参见例如， Harper’s Biochemistry(Murray等，1996)(第8行)和Principles of Biochemstry，Vol II(Zubay等，1995)(第11行))。自然界中已经发现超 过200种单糖，其中11种被认为是对维持哺乳动物健康重要的：半乳糖、 葡萄糖、甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N- 乙酰化葡萄糖胺、木糖、艾杜糖醛酸、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸。这些糖的 结构是熟知的(参见例如，Stryer’s Biochemstry(Stryer，1995)和Merck Index，12th Editon，1996)。
本发明使用的术语“长链糖”和“长链多糖”是用于描述具有两个或 多个能够以链间氢键结合的糖链的糖。例如，在此引用美国专利 NO.4735935号的相关部分作为参考，其教导了从芦荟(Aloe vera)中分离 长链多糖的方法，其中沉淀、冻干了每个链上具有2-约50,000个单体的 长链多糖。长链多糖可以从多种植物和动物原料中分离，正如这里所教导 和披露的。本发明的长链多糖的分离和纯化以及甚至是特定链长度的长链 多糖或其组合的分离可以通过例如长链多糖水解、特定长度的长链多糖的 大量分离、更长长链多糖的聚合、较短和较长长链多糖组合的筛选、长链 多糖的分离来获得，其中利用了例如电泳、FPLC、HPLC、分子筛(size exclusion)、分子筛色谱(size-exclusion chromatography)、沉淀等。
本发明使用的术语“改进的释放”是用于描述在一段延长的时间周期 内影响营养上有效量的营养物输送的释放状态，这里定义的延长的时间周 期为使用本发明的制剂约60分钟和约2、4、6、8或更多小时。改进的释 放还可以从功能上定义为大约60分钟和约2、4、6甚至8小时以后超过 80-90％的营养物释放。改进的释放还可以通过使营养物在不考虑吸收的 情况下使患者或受试者能够利用来评价，某些活性物质可能从来不被动物 吸收。不同的改进释放剂型可以由本领域技术人员根据这里披露的内容容 易地设计成向小肠和大肠，仅向小肠或仅仅向大肠输送，这取决于包衣材 料的选择和/或包衣材料的厚度。用于长链多糖的改进的例子包括例如改变 长链多糖中糖的类型或组合、化学修饰(有机地或化学地修饰)糖的侧链 (例如乙酰化)、水解长链多糖、选择长链多糖的大小、聚合更长的长链 多糖、选择较长和较短的长链多糖的组合、分离长链多糖，其中利用例如 电泳、FPLC、HPLC、分子筛(size exclusion)、分子筛色谱(size-exclusion chromatography)、沉淀等。可以制备和输送延迟释放制剂以实现在较低肠 道的某些通常可预测的部位的释放，如果没有选择改进的释放，这种释放 将在更末梢的部分实现。
本发明可以单独使用或组合使用一种或多种用于营养物质延迟释放 的方法、技术、机械的、化学的和其它改进方式、包封、包装等，例如胶 囊、凝胶帽或者甚至包衣。胶囊的例子包括动物、植物、聚合物及其混合 物和组合。可以采用足够厚度的包衣(类型、厚度等)以便部分或全部包 衣在pH值在低于约5的胃肠道流体中不溶，但在pH值约5和以上时溶 解。
本发明使用的术语“营养上有效量”是用于定义提供哺乳动物有益的 营养作用或反应的量。例如膳食添加剂中包含的维生素和矿物质的营养反 应根据哺乳动物的不同而不同，其应当被理解为维生素和矿物质的营养有 效量是各自不同的。同样的，已知必需氨基酸、维生素C、铁、碘、各种 维生素、矿物质、糖、脂质等的缺乏会影响生理功能和细胞功能。这里所 披露的抗氧化剂和糖的营养上有效量是指当它们保持和/或提高饮食中这 些重要营养物质水平时是营养上有效的，所述饮食例如是试图为了补充这 些营养物而保持或增加饮食的人的饮食。这样，当一种哺乳动物需要一种 包括上述定义的量的维生素和矿物质的特定方案时，其它哺乳动物可能需 要包括不同定义的量的维生素和矿物质的相同特定方案。
本发明使用的“抗氧化剂”是指任何延迟或防止可氧化的目标分子氧化 的分子。抗氧化剂通过清除生物学上重要的活性自由基或其它活性氧物质 (例如，O2 -、H2O2、HOCl、高铁离子(ferryl)，过氧化氢，过氧亚硝酸盐 (peroxynitrite)和烷氧基)来起作用；防止氧自由基形成；或催化自由基或 其它活性氧物质转化成活性较低的物质。抗氧化剂通常被分为两类：(1)脂 质(亲脂性或疏水性)抗氧化剂；以及(2)水性(疏脂性或亲水性)抗氧 化剂。脂质抗氧化剂的例子包括，但不限于类胡萝卜素(例如叶黄素、玉米 黄质、β-隐黄质、番茄红素，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素)，其存在于果核 的脂质隔室(compartment)内；和生育酚(例如维生素E、α-生育酚、γ- 生育酚和δ-生育酚)，其存在于脂质隔室的界面；和类维生素A(例如维生 素A、视黄醇和棕榈酸视黄酯)和脂溶性多酚，例如槲皮素。水性抗氧化剂 的例子包括，但不限于抗坏血酸及其氧化形式“脱氢抗坏血酸”、尿酸及其 氧化形式“尿囊素”、胆红素、白蛋白、维生素C和水溶性多酚，例如与磷 脂膜具有高亲和力的儿茶酚、异黄酮和原花青素(procyanidin)。
通常使用的检测氧自由基和抗氧化能力的相对水平的方法是氧自由基 吸收能力(ORAC)分析。在已知的ORAC型分析中，抗氧化剂值是通过测 定氧自由基对例如荧光或其它可检测分子的作用来间接测量，这对由特定氧 自由基引起的氧化来说可能不是一个好的靶点。通常，当抗氧化剂添加到待 测样品中时，与不用抗氧化剂处理的样品(例如对照样品)对比，可以在样 品中观察到可检测的自由基，例如过氧化物或非自由基活性类物质，例如过 氧化氢的量降低。然而，这些间接方法通过测定中间物(例如荧光，β-藻 红蛋白(β-PE)等)来监测抗氧化情况的变化，这种方法是基于自由基对 中间物的作用是对氧化剂和抗氧化剂的相对水平的真实反应的假设。这些分 析的对照是已知浓度的氧自由基产生剂和已知的经测量的抗氧化剂，其被用 作样品的标准品。
本发明使用的术语“自由基”是指包含至少一个未配对电子的分子。绝 大多数分子甚至包含多个电子，它们的共价键通常包括共有的电子对。这些 键的裂解产生两个独立的自由基，每个带有未配对电子(任何的配对电子除 外)。自由基可以是带电的或中性的，是高度活性的并且通常寿命很短。自 由基彼此或与带有未配对电子的原子结合。在与完整分子的反应中，自由基 尽量使它们自己的电子结构完整，产生新的自由基，其继续与其它分子反应 形成链式反应。自由基链反应对高温下的物质分解和聚合反应特别重要。在 人体内，氧化的自由基导致组织损伤。热、紫外线和离子辐射都能产生自由 基。产生自由基是氧化新陈代谢的次级效应。过量的自由基可以压制天然的 保护酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。自由基例如过氧 化氢(H2O2)、羟基自由基(HO)、单线态氧(1O2)、过氧化物阴离子自由 基(O2 -)、一氧化氮自由基(NO)、过氧化物自由基(ROO)、过氧亚硝酸 盐(ONOO-)可以存在于脂质或水性隔室(compartment)中。抗氧化剂营 养剂(如维生素C和E、硒、多酚)可以降低这些效果。
本发明使用的短语“脂质隔室”是指具有环状或非环状的长链脂肪烃 及它们的衍生物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物。例如，通常 的脂质包括脂肪酸、脂肪、磷脂、类固醇、类花生酸(eicosanoid)、蜡和脂 溶维生素。某些脂质通常可以被分为两组，单纯脂质和复合脂质，如甘油三 酸酯或脂肪和油、甘油脂肪酸酯、蜡、长链醇的脂肪酸酯和类固醇例如胆固 醇和麦角固醇。复合脂质包括，例如磷脂(phosphatide)或磷脂(phospholipid) (含磷的脂质)、糖脂(含糖的脂质)和鞘脂(含鞘氨醇的脂质)。
本发明使用的术语“脂质”包括脂肪或类似脂肪的物质。该术语是描述 性的而不是如蛋白质或糖的化学名称。脂质包括真脂(即脂肪酸和甘油的 酯)，类脂(即磷脂、脑苷脂、蜡)和类固醇(即胆固醇、麦角固醇(ergostrol))。 脂质可以是通过例如自氧化的机制氧化的靶点。在此使用的术语“脂肪酸” 是指一组例如带负电的、通常为线性的烃链。脂肪酸的烃链的长度和氧化状 态是变化的。通常，脂肪酸具有带负电的部分(例如以羧基为末端)，以及 一个“尾”部，其决定脂肪酸的水溶性和两性特征。例如，脂肪酸是包括生 物膜的磷脂的组分，如脂肪，其被用来将能量储存在细胞内，或用来在血流 中转运脂肪。在此使用的术语“磷脂”是指任何种类的磷酸酯，其包括下列 小组(side-group)中的至少一种：脂肪酸、醇和含氮的碱。
本发明使用的术语“脂肪”或“脂肪类”是指任何脂肪酸的甘油酯，例 如脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯形式。甘油三酸酯是指那些不带 电并且完全疏水的分子，即还原的分子。甘油单酯和甘油二酯是磷脂合成过 程中的代谢中间产物，同时甘油三酯形成了用来储存化学能量的以无水的、 紧密状态存在的脂肪分子。在此使用的术语“脂溶维生素”是指例如常见的 脂溶性维生素，包括维生素(A)(视黄醇)、维生素D(例如维生素D3(胆 钙化甾醇))、维生素E和维生素K等。
本发明使用的短语“脂质抗氧化活性”或“脂质抗氧化剂能力”可以互 换使用，是指对来自样品的脂质隔室(compartment)的抗氧化能力的测量值。 在此使用的短语“水性抗氧化剂活性”或“水性抗氧化剂能力”可以互换使 用，是指对来自样品的水性隔室(compartment)的抗氧化剂能力测量值。在 此使用的短语“总抗氧化剂活性”或“总抗氧化剂能力”可以互换使用，是 指对来自样品的脂质和水性部分的抗氧化能力测量值。
本发明使用的短语“水性隔室(compartment)”是指不与脂质隔室 (compartment)相互作用的流体样品的一部分。水性隔室(compartment) 包括生物流体样品，例如血液、血浆、血清、粪便、脑脊液、羊水、组织液、 淋巴液和滑液。例如，流体样品的水性隔室(compartment)例如血清，可以 不仅包括血液凝结后仍然保持的，并且经离心除去血细胞和凝结成分的液体 部分，还包括其它化合物，例如：蛋白质，例如白蛋白和球蛋白；抗体；酶； 少量的营养有机材料，例如氨基酸和葡萄糖；无机物，例如钠、氯化物、硫 酸盐、磷酸盐、钙、钾、碳酸氢盐、镁、碘、锌和铁；少量的废物，如尿、 尿酸、黄嘌呤、肌酸酐，肌氨酸，胆色素和氨；和痕量气体，例如氧气和二 氧化碳。流体样品还可以是非生物样品，例如化学制剂、合成的组合物或食 品和化妆品。
本发明使用的术语“样品”是指液体或流体生物样品、或固体生物样品， 其中利用自由基发生剂(例如亲脂性自由基发生剂或亲水性自由基发生剂) 可以产生自由基，并且可以利用(ORAC(o))监测器和本发明的方法检测。 生物样品包括，例如血液、血浆、血清、脑脊液、尿、羊水、组织液和滑液。 固体生物样品包括，例如组织、细胞、组织培养物、固定化细胞、细胞上清 液或甚至组织或细胞物质的部分(或提取物)。术语“样品”还包括非生物 样品，例如化学溶液、合成的组合物和食品。在此使用的术语“相对ORAC (o)”和“ORAC(o)”是指通过每克或每毫升的Trolox的微摩尔当量测定 的相同的值。ORAC(o)为负值表明比空白获得的自由基清除活性更低的自 由基清除活性，表明组合物是促氧化剂，即促进氧化而不是作为抗氧化剂发 挥作用的试剂。
本发明使用的短语“自由基产生剂”或“自由基引发剂”可互换使用， 是指能够产生自由基的试剂、化合物或分子。自由基产生剂能够产生一定可 测量水平的自由基，例如抗氧化剂或氧化指示剂能够与自由基相互作用产生 可测量的或可检测的输出信号的水平。自由基产生剂的例子包括，例如偶氮 自由基产生剂，其是以已知恒定速率产生自由基流的化合物。偶氮自由基产 生剂的例子包括，例如2，2′-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈) (MeO-AMVN)，2，2′-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)(AMVN)，偶氮二异丁基 腈，2，2′-偶氮二(2-甲基丙酸酯)(DAMP)，和2，2′-偶氮二-(2-脒基丙烷)， 2，2′-偶氮二[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、铁、抗坏血酸和金属离 子。
本发明使用的“受试者”是指任何活的有机体。术语“受试者”包括， 例如鱼、哺乳动物、爬行动物、鸟类和昆虫等。特定的例子包括：人类、非 人类灵长类，例如黑猩猩和其它猿类和猴类；牲畜，例如牛、绵羊、猪、山 羊和马；家养动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠 和豚鼠等。术语不表示特定的年龄或性别。这样，意味着成年的和新生的受 试者以及胎儿，或者雄性或者雌性都被涵盖。
本发明使用的短语“自由基相关的失调”是指产生自由基或暴露在自由 基下的病理状态。在此使用的术语“自由基相关的失调”包括疾病状态的病 理原因是自由基引起的损伤的病理状态，或其中给予自由基抑制剂(如去铁 胺)、清除剂(例如生育酚、谷胱甘肽)，或催化剂(例如SOD、过氧化氢酶) 时显示出产生了可检测的有益效果，这是通过减轻症状、提高存活率或提供 其它可检测的对临床保护或预防病理状态的有益作用来实现的。自由基失调 的例子包括、但不限于缺血再灌注性损伤、炎性疾病、系统性红斑狼疮、心 肌梗死、中风、创伤性出血、脊髓损伤、克罗恩氏病(Crohn′disease)、自 身免疫性疾病(例如风湿性关节炎、糖尿病)、白内障形成、与年龄有关的 黄斑变性、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、眼色素层炎、肺气肿、胃 溃疡、氧中毒、腺瘤、不希望的细胞凋亡和放射病。
本发明使用的术语“氧化应激”是指氧自由基在受试者体内造成的损伤 水平。损伤水平取决于活性氧物质的产生速度和之后的抗氧剂失活以及位置 和修复速度。当在此使用的术语“背离”或“偏离”与氧化状态以及氧化应 激相关时是可以互换使用的，是指样品的抗氧化剂活性的变化。氧化状态的 改变可以是抗氧化剂活性从已知的正常值增加、减少，升高或抑制。例如， 样品的脂质隔室(compartment)、样品的水性隔室(compartment)、或样品 的脂质和水性隔室(compartment)的抗氧化活性升高或降低。
本发明使用的术语营养剂的“药学上可接受的盐”被用来描述在有效的 医学评价范围内的，适合用于人和低等动物组织内、组织上或与组织一同使 用的，而且没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的有益效果 /风险率相当的那些盐。药学上可接受的盐是现有技术熟知的(参见例如， S.M.Berge等，J.Pharmaceutical Sciences，1977，相关部分引入本文作为参 考)。合适的盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间制备，或另外通 过游离功能碱与合适的有机酸反应而制备。代表性的酸加成盐包括，但不限 于醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐，天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸 盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄酸盐、甘油磷酸盐、 半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐，氢溴酸盐、氢碘酸盐、 2-羟基乙磺酸盐(羟乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、 2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味 酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨 酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。在此用作季铵化试剂的含氮碱 性基团的例子包括：低级卤代烷烃(甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化 物和碘化物)；二烷基硫酸盐(二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐)； 长链卤化物(癸基、十二烷基、十四烷基、硬脂基氯化物，溴化物和碘化物)； 芳基烷基卤化物(苯甲基和苯乙基溴化物)等。用来形成药学上可接受的酸 加成盐的酸的例子包括无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及例如草 酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。碱性加成盐也可以在本发明披露的 抗氧化剂化合物最终分离纯化期间用适当的碱进行原位制备，所述碱药学上 可接受的金属阳离子的例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或氨或有机伯胺、 仲胺或叔胺。药学上可接受的盐包括但不限于，基于碱金属或碱土金属的阳 离子，如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及除此之外的无毒的季胺和胺阳 离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵，甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙 基铵、二乙基铵和乙基铵。其它有代表性的用来形成碱加成盐的有机胺包括 乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪等。
本发明使用的术语“增强”是指一种或多种直接或间接提高或增强本发 明疏脂性和/或亲脂性抗氧化剂活性的试剂。这样的一种增效剂是维生素C， 其具有使抗氧化剂再活化和再生的作用，并且其自身也具有明显的抗氧化活 性。在过渡金属的存在下观察到维生素C的促氧化活性。其它的抗氧化剂活 性的增效剂包括天然提取物，例如葡萄籽提取物和绿茶提取物。在一项研究 中，绿茶显示出潜在的体外抗突变活性，并且抑制动物模型中致癌物诱导的 癌前病变(preneoplastic lesion)。同样地，增效剂增强或甚至可以与从天然 来源的纯化分离的抗氧化剂例如槲皮素和混合生育酚产生协同作用。
在此使用的术语“糖营养的(glyconutritional)”或“糖营养素 (glyconutrient)”是指自然界合成的复合碳水化合物或糖或简单糖，它们是 各类信息传递和信号分子的生化合成所必须的，这些分子可以是在间质细胞 液中游离的，具有细胞间信息传递的活性(例如细胞因子、生长因子等)， 或者形成包含细胞膜高特异性分子活性中心(foci)(例如，受体位点、离子 运输通道、抗原识别等)的分子构型。
本发明使用的术语“植物营养的(phytonutritional)”或“植物营养素 (phytonutrient)”是指仅存在于植物中的天然合成的分子，其被生产出来用 于保护植物细胞。植物营养素(phytonutrient)主要具有抗氧化剂、自由基 清除剂和重要的微量营养素的活性。这些分子通过饮食添加剂来提供，其存 在于成熟的植物组织中，而且大多数集中在种皮和种子周围的果实组织中。 在哺乳动物组织中，当这些分子以饮食提供时，它们具有优化细胞微环境中 的生物化学、免疫学和生理学性质的活性。
本发明使用的术语“植物提取物”和“草药提取物”可互换使用，是指 在植物组织中产生的植物化学成分，其可以通过水、极性或石油溶剂来提取， 并且具有某种程度的有益于健康或治疗的活性。绝大多数草药制剂可能是有 毒的，特别是被浓缩时，但是当它们以更传统的方式在茶中使用时通常是安 全的，并且可以作为“治疗疾病和促进健康的民间药物”用于药敷(poultices)。 在此使用的术语“调养身体的草药制剂(herbal body-toning agent)”是指发 明人已经观察到的减少和逆转由于老化或太阳损伤而造成的弹性组织和胶 原纤维损伤的物质，这是通过恢复皮肤圆润(skin turgor)和弹性而有效地 减少或消除皱纹、松弛、色素沉着(hyperpigmentation)，以及逆转其它损害 美容外观的因素来证明的。
本发明膳食添加剂中包括的糖可以从许多种天然和合成的来源获得，例 如灌木、树、植物、酵母、真菌、霉菌、植物胶、树脂、淀粉和纤维素衍生 物以及天然粘蛋白原料。特别是，某些天然原料包括：(a)包含阿拉伯树胶 (acasia)、刺梧桐树胶、黄蓍胶或达瓦树胶达瓦树胶(ghatti)的灌木或树 木渗出液；(b)包括琼脂、褐藻胶或角叉菜胶的海洋胶；(c)包括瓜尔豆、 剌槐豆或蚤草的种子胶；(d)含有果胶或乙酰化聚甘露糖的植物提取物；(e) 淀粉和纤维素衍生物，例如羟乙基淀粉、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙 基甲基纤维素、甲基纤维素，纤维素氧化物；以及含有葡聚糖、黄原胶的微 生物胶。然而，应该意识到本发明的组合物并不被获得的各种糖的来源所限 制。
本发明的多糖可以在自然界中以单、寡和/或多糖的形式存在。这样，本 发明的组合物可以含有单体、寡聚体和/或多聚体形式的多糖。为了列出已知 天然的多糖来源及其用途的列表，请参照美国专利申请US2003072770，在 本文中引入其相关部分作为参考。
本发明使用的术语“碳水化合物”可以与术语“糖”、“多糖”、“寡糖” 和“糖”互换使用，其定义对于碳水化合物化学领域的技术人员是熟知的。 虽然本发明的组合物希望包括至少两种或更多种的基本糖，但应该注意的是 糖可以以单、寡和/或多糖的形式存在，例如含有黄蓍胶和瓜尔胶的组合物将 被认为含有半乳糖醛酸、唾液酸、甘露糖和半乳糖。因此，通过控制特定膳 食添加剂中特定胶的含量，可以控制膳食添加剂中各种糖的量。
本发明使用的术语“至少两种形式的维生素E的混合物”被用来描述至 少两种形式的生育酚的混合物，所述生育酚选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、 ξ2和σ生育酚和α、β、δ、和γ生育三酚(tocotrienols)及其组合和衍生物。
在一个实施方案中，“至少两种形式的维生素E的混合物”是至少两种形式 的选自α、β、δ和γ生育酚的生育酚混合物。在另一个实施方案中，“至少 两种形式的维生素E的混合物”是α、β、δ和γ生育酚的混合物。“至少两 种形式的维生素E的混合物”可以从例如VITAECAPS，SA，Spain、Henkel 有限公司或Cognis有限公司(Kankakee，IL)获得。COVITOLF-350M从 Cognis购得，其包含天然来源的α-生育酚以及从食用蔬菜油中获得混合生育 酚。包括在本发明的抗氧化剂组合物中的生育酚的特定混合物是通过进行 ORAC(o)抗氧化剂测定来确认的。
生育酚的盐或衍生物包括药学上可接受的盐，例如乙酸盐、硫酸盐、琥 珀酸盐、烟酸盐、脲基甲酸盐(allophanate)、磷酸盐，苯醌(quinone)或 卤化的衍生物；酯；立体异构体等。本发明包括在6-色满醇(chromanol) 环和/或侧链上进行取代、加成以及其它变化的维生素E衍生物，条件是其 衍生物保持维生素E的抗氧化剂活性。例如，生育酚及其衍生物可以根据烷 基基团、双键和其它取代基数目和位置以及环上和侧链上的变化而变化。“烷 基”是环状、支链或直链化学基团，其中仅包含碳和氢，例如甲基、丁基和 辛基。烷基可以是未取代的或者被一个或多个取代基取代的，取代基是例如 卤素、烷氧基、酰氧基、氨基、羟基、巯基、羧基或者苄基。烷基基团可以 是饱和的或者在一个或几个位置上不饱和的。典型的烷基基团包括1-8个 碳、1-6或者1-4个碳原子。通过与不同的其它实体的环状结构或侧链的 耦联可以构建其它生育酚，其它实体例如含氧、氮、硫和/或磷的实体。生育 酚衍生物还可以通过修饰侧链的长度来制备，该侧链存在于原型的生育酚 中，例如α、β、δ和γ-生育酚。生育酚的环结构和侧链上的立体化学和键 饱和度也可以变化。
其它的生育酚衍生物，包括前药，可以通过将糖或其它成分偶联到侧链 或环状结构上来制备。混合的生育酚包括但不限于一种纯生育酚的立体异构 体的混合物(例如α-生育酚的+和-立体异构体)；(+/-)表示消旋体混 合物)或者结构上不同的生育酚的混合物(例如α加上γ-生育酚)。
尽管本发明包括上面所引用的11种基本的糖，但是值得注意的是其它的 糖、营养化合物或生物活性或者惰性化合物也可以包括在本发明的膳食添加 剂中。这类其它营养化合物包括任何一种或多种植物营养素(phytonutrients)、 薯蓣复合物、植物提取物、草药提取物、植物的一部分、草药成分、维生素 或矿物质。这些营养化合物可以被加入到本发明的膳食添加剂中，或者它们 由给予哺乳动物膳食添加剂来单独提供。例如，接受本发明的包含糖营养素 (glyconutrients)的制剂的人还可以接受相同的或者其它形式的植物营养素 (phytonutrients)。惰性化合物包括香料、填充剂、润滑剂、缓冲液、凝胶、 粘合剂、赋形剂、载体和/或其它能够促进本发明膳食添加剂的制剂和给予的 化合物。包含本发明膳食添加剂组合物的所有糖营养素(glyconutrients)，甚 至包含其它化合物、试剂或其它物质的糖营养素(glyconutrients)可以直接 从Mannatech Inc(Coppell，Tex.)获得。
本发明包括直接和同时地测定包括疏脂性和/或亲脂性氧化剂的组合物 的氧自由基吸收能力(ORAC)的装置和方法。使用术语“ORAC(o)”的 原因在于该分析是在直接测定ORAC(o)样品中氧含量的氧自由基吸收能 力实验中，直接追踪氧的消失来测量抗氧化剂清除自由基的能力。目前工业 上的标准分析例如ORAC(fl)和ORAC(β-PE)，是通过间接测量暴露 于氧自由基的荧光化合物(荧光素或β-藻红蛋白)的荧光发射的减弱来测 量抗氧化能力的。这些分析对于亲水性抗氧化剂来说效果好，但是在测量疏 水性抗氧化剂或疏水性和亲水性抗氧化剂的混合物时作用有限。此外，不像 已知的ORAC(fl)和ORAC(β-PE)体系，在此披露的ORAC(o)作为 一种一次性的传感器适用于简便制造。这个体系相当稳定甚至可以在办公室 生产，在家居系统快速测定来自生物样品的待测物的氧化能力。
ORAC(o)设备。图1描述了进行ORAC(o)的抗氧化设备10。正如 所描述的，设备10具有三个基本的部件：一个检测系统12，一个流控系统 14和一个数据处理器系统16，其可以相互连接来提供数据采集、流体控制 和样品控制以及数据处理。检测系统12有一个氧传感器18，其与流控系统 14通过一个或多个管道20与流体联通。使用一个或多个阀22对通过一个或 多个管道20流动的流体进行控制，所述阀可以是手动控制和/或受数据处理 器系统16的控制。在操作时，样品24进入流控系统，被引入检测器18，并 且在数据采集后输送到废物储存库26。流动体系14也可以包括一种或多种 溶液28，通过流控系统14由泵、真空或压力，例如压缩的惰性气体引导溶 液28流动(transit)。流控系统14中的溶液28通常会被预混合或平衡，用 于本发明时，其通常可以包括：水、溶剂，去污剂或水：去污剂的混合物、 氧自由基发生剂、氧化靶点等，并且在输送到氧检测室34之前在混合室30 中混合。流控系统的选择可以依赖于希望的或被选择的自动化程度，这对于 本领域技术人员而言是已知的。样品24可以用于校准氧传感器18的同样溶 液预混合，或者甚至可以在混合室30中预混合。
本发明中使用的氧检测器18的例子包括任何溶解氧传感器，其能够在溶 剂、水和去污剂存在下检测溶解氧。溶解氧传感器的例子包括，例如电化学、 化学发光的，表面等离子体共振、红外线、电容耦合、染料偶合光纤或甚至 是高光谱(hyperspectral)氧传感器。在一个特定的实施例中，溶解氧传感 器是YSI 5300A生物氧传感器(YSI，USA)、SPREETA传感器(Texas Instruments)，PASCOPS2108(Pasco，USA)等。在一个实施例中，溶解氧 传感器具有如下的规格：范围：0-20毫克/升；精度：满标度的±10％；分 辨率：0.01毫克/升；最大采样频率(maximum sample rate)：20sps；默认采 样频率(default sample rate)：2sps；响应：60秒内98％；温度范围：0-50 ℃；温度补偿：10-40℃；阴极：铂；阳极：Ag/AgCl；膜：1毫升硅，可 以用来与生产商提供的软件连接，例如溶解氧EZ(Pasco，USA)。该体系 还可以包括pH，ORP，与流控系统以液体联通的电导率传感器或混浊度传 感器。
在操作中，在此披露的ORAC(o)体系可以具有以下用途：使用者收集 样品并将溶解在ORAC(o)溶剂试剂盒(干式或液体式)中或用ORAC(o) 溶剂试剂盒(干式或液体式)溶解。ORAC(o)传感器，例如手持式表面等 离子体共振氧传感器(参见，例如Texas Instrument SPREETA传感器)被暴 露于一个或多个校准标准品中，然后暴露于使用者样品中。氧传感器与处理 器相连来评价来自传感器的检测器表面的输出值，并向使用者提供读数。读 数可以在屏幕上显示、打印和/或被传输到处理器或存储器等。使用者样品可 以是可能含有氧自由基的尿、唾液、眼泪、粘液分泌物、汗、血液(或血液 产物)、组织、粪便或者其它生物样品。在一个实施例中，样品是一种或多 种通过呼吸器例如封闭式呼吸器收集的呼吸气体(一种或多种吸入的和/或呼 出的气体)。通过传感器检测的数值甚至可以被储存在存储器中(挥发性、 半永久性或永久性)，用于将来作为参考或者与过去或未来的数值进行对比 以评价使用者的氧化状态。
本发明用于测试抗氧化活性的ORAC(o)试验的基本组成部分利用了现 有的ORAC式方法，因此其即便不需要大量培训就可以方便的适用于实验室 使用。简言之，ORAC(o)使用氧传感器，例如血浆氧传感器或溶解氧传感 器来测定促氧化剂活性，例如通过直接测定样品溶液中的一种或多种氧自由 基产生分子的相对活性，并以氧化清除剂(抗氧化剂)作为标准。必须注意 的是某些试剂例如还原剂或挥发剂在自由基源例如AAPH不存在的情况下， 可以导致溶液中氧的吸收和产生，影响了溶液中氧的含量。使用本发明，技 术人员能够通过例如在加入自由基引发剂之前评价溶液中样品的状况来区 分样品的自由基清除和非自由基清除活性。值得注意的是，待测样品的与氧 化状态相关的自由基清除和非自由基清除活性是通过应用本发明来测定的。 氧自由基产生剂和氧自由基清除剂的相对活性可以通过ORAC(fl)、ORAC (fl-lipo)、ORAC(β-PE)等间接方法随时间进行滴定和/或测定。
图2是概括说明本发明方法的基本步骤的流程图50。在步骤52中，在 溶剂∶水∶去污剂混合物的存在下，对溶解氧探针进行平衡和/或校正，并测定 基线。在一个实施例中，溶剂∶水∶去污剂是比例为1∶1∶1的丙酮∶水∶ 吐温-20的混合物。在步骤54中，确定抗氧化剂活性的基线作为阳性对照， 基线用于与使用例如Trolox作为抗氧化剂得到的抗氧化剂活性进行对比。 Trolox及其相关分子的一个优点是这些维生素E的衍生物批与批之间更稳 定，具有较小的批次差异而且是合成的，由此提供了稳定浓度的抗氧化剂活 性。在步骤56中，在加入步骤58中的氧自由基产生剂之前，将步骤54中 的混合物与氧自由基靶点例如亚油酸混合。进行实验操作，在步骤60中通 过随时间测定溶解氧的消失以及储存样品的数值来计算曲线下面积(AUC)。 在系列实验或平行实验中，将样品溶解于溶剂∶水∶去污剂混合物(步骤66)， 随后在步骤68中加入氧自由基靶点。一般地，在步骤56和68中使用相同 类型的氧自由基靶点，在步骤58和70中使用相同类型的氧自由基产生剂。 在步骤72中，检测样品的AUC以及储存样品的数值。由于标准品和样品的 AUC已经被测定，通过减去空白的AUC使数值合理化。合理化的标准品和 样品的AUC数值随后被用于对比和计算样品的抗氧化剂活性水平。
下面的讨论用于帮助说明本发明，但不作为对其保护范围的限制。去污 剂吐温-20可以帮助亚油酸分散。亚油酸提供双键，通过它氧可以被吸收。 Trolox是用作内标的合成抗氧化剂，从所有样品获得的数值都是以Trolox 的数值作为相对背景的。氧自由基产生分子：2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷) 二盐酸化物(AAPH反应物)，其与氧反应产生以碳为中心的自由基。AAPH 产生的自由基造成亚油酸的氧化。作为亚油酸氧化的结果，亚油酸的双键变 成酮基，并与以碳为中心的自由基中的分子结合。采取氧探针的方法测量由 于亚油酸的氧化导致的氧从反应室被除去的速率。偶氮自由基可以与亚油酸 直接反应，引起亚油酸自由基的形成。亚油酸自由基随后与反应室中存在的 氧反应形成酮。根据推测的机理，氧由于亚油酸的氧化而被消耗。抗氧化剂 通过阻止亚油酸的氧化而延缓了反应室中氧的消耗。计算溶解氧曲线下面积 与时距曲线的比值来获得样品的抗氧化剂能力的测量值，该抗氧化剂能力是 通过其延缓亚油酸氧化的能力显示出来的。
氧自由基产生剂。本发明ORAC(o)分析中出现的已知浓度的偶氮自由 基产生剂产生了用于测量抗氧化活性的自由基。偶氮引发剂包括，例如2，2′- 偶氮二[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物、2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷) 二盐酸化物(AAPH)、2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)[2-(N-硬脂酰)脒基丙烷]二 盐酸化物(SA-1)、2，2′-偶氮(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)-[2-[2-(4-正辛基) 咪唑啉-2-基]-丙烷]二盐酸化物(C-8)、2，2′-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲氧基 戊腈)(MeO-AMVN)、2，2′-偶氮二(2，4-二甲氧基戊腈)(AMVN)、偶氮二 异丁基腈、2，2′-偶氮二(2-甲基丙酸酯)(DAMP)、以及2，2-′偶氮二(2-脒 基丙烷)。
例如，自由基产生剂2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸化物(AAPH)分 解成氮分子和两个碳自由基。碳自由基结合形成稳定的产物或者与氧分子反 应形成过氧化氢自由基。AAPH的半衰期约为175小时(37℃下，pH值为中 性)。因此，在前几个小时，溶液中自由基的产生率基本上是恒定的。同样 地，被使用的AAPH经常被用于在脂肪酸的水分散液中进行脂质过氧化； 其可以单独使用或与亲脂性和/或疏脂性自由基产生剂组合使用。当设备测定 样品中总氧的时候，这里披露的溶剂系统可以使用亲脂性和/或疏脂性自由基 产生剂。
溶剂系统。用于ORAC(o)的溶剂系统是一种包括溶剂、水相和去污剂 三部分组成的系统。例如，溶剂可以是有机溶剂，其选自醇、胺、酯、乙二 醇醚、乙二醇、萜和/或其混合物。用于配制的有机溶剂系统少于溶剂成分的 约50％，约为30％或33％，少于20％以及在某些情况下少于10％。 在一个实施方案中，溶剂是丙酮，其可以是ORAC(o)溶剂系统的10 ％和90％(体积/体积)，水相约为ORAC(o)溶剂系统的10％和90％(体 积/体积)，去污剂为溶剂系统的0.001％到90％。例如，ORAC(o)溶剂系 统可以是三分之一的水、三分之一的去污剂(“三分之一”溶剂)，样品的浓 度为例如1毫克/毫升。使用相同的溶剂制备稀释液。去污剂可以是非离子去 污剂例如TWEEN(例如TWEEN20)、BRIJ或者TRITON；两性离子 去污剂例如CHAPS；阳离子去污剂；或者阴离子去污剂，例如胆酸盐、脱 氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠或者TWEEN-80；或者表面活性剂。水∶丙酮∶ 去污剂的比例可以分别约5％-90％至90％-5％。ORAC(fl)使用两种成 分的系统，其中二分之一是丙酮，二分之一是水，与之不同的是，ORAC(o) 溶剂系统的去污剂使得允许对总样品的氧进行直接测定。一种变化形式是使 用随机甲基化的β-环糊精的ORAC(fl-lipo)。
ORAC(o)分析的用途：ORAC(o)分析可以被用于测定生物样品的总 抗氧化剂活性以评价本发明的营养补充剂的成分，甚至对本发明的竞争剂和 /或最终膳食添加剂进行测试和评价。对于评价生物样品的用途而言，它们可 以是例如血清、脂溶性血清成分、水溶性血清成分、尿、脂溶性尿成分、水 溶性尿成分、LDL组分、组织匀浆、抗氧化剂添加剂的质量对照品、食物产 品或者防腐剂、新型抗氧化剂添加剂的开发、新型食物产品的开发、新型防 腐剂或者新型抗氧化剂治疗、食物生产和加工的质量控制、评价植物的抗氧 化剂活性、或者检测化妆品抗氧化剂活性。
实施例1：使用ORAC(fl)和ORAC(o)分析比较抗氧化剂活性
使用现有技术中测定荧光ORAC(fl)的氧自由基吸收能力方法，并 且使用本发明的测定溶解氧的方法ORAC(o)来分析抗氧剂组合物组分 的抗氧化剂活性。产品的抗氧化剂活性是指其保护系统免受过氧化氢自由 基引起的损伤的能力。
现有技术测定抗氧化剂活性的方法用于对比。对于ORAC(fl)分析 来说，使用Ou等(Ou，B.，Hampsch-Woodill，M.和Prior，R.L.，J.Agric. Food Chem.2001，49，4619-4626)的方法。与公开的Ou方法的区别包括振 荡摇床(orbital shaker)的速度(Ou，400rpm；本发明280rpm)，离心速 度(Ou，14,000rpm，15分钟；本发明3200rpm，15分钟)和分析时间(Ou， 30分钟；本发明100分钟))。荧光素、钠盐来自于Aldrich(Milwaukee， WI)。对于Ou的方法而言，将标准量的荧光素加入到待检测的抗氧化剂 产品中，测定初始荧光水平。加入游离的自由基引发剂，测定荧光消失的 时间和程度。Trolox，6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸，是维 生素E的细胞可渗透的水溶性衍生物，其具有潜在的抗氧化剂性质。 Trolox避免了大鼠胸腺细胞中过亚硝酸盐(peroxynitrite)介导的氧化应激 和凋亡，是批与批之间一致的合成的抗氧化剂，被用来作为标准并与每一 种样品进行比较。在计算每种样品的ORAC(o)值时，使用的空白(对 照)可以包括在每次操作中。绘制荧光：时间图。每个曲线需减去空白(对 照)。抗氧化剂曲线下的净面积与Trolox曲线下的净面积进行比较。曲线 下的净面积越大，样品中分子的抗氧化剂能力就越大。所有ORAC(fl) 分析都在COBAS FARA II离心分析仪(Roche Diagnostic System Inc.， Branchburg，NJ；激发波长＝493nm和发射滤波器(emission filter)＝515nm) 上进行。结果以每克样品的微摩尔Trolox当量形式给出。
测定抗氧化剂活性的方法。在操作中，本发明的ORAC(o)分析被 用来评价抗氧化剂组合物、组合和类似溶液，它们在与空气达到平衡的氧 存在下对抗目标分子(亚油酸)。加入自由基引发剂，测定氧消失所消耗 的时间以及形成的消耗率。Trolox被作为标准品使用，空白作为对照进行 操作。绘制溶解氧的量：时间曲线，并将曲线下的净面积进行直接对比。 一种具体的方法如下：缓冲液(K2HPO4(分子量174.2)，NaH2PO4(分子 量120.0))购自Sigma(St.Louis，MO)。亚油酸99％、Trolox(6-羟基 -2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸)97％、TWEEN20和2，2′-偶氮二(2- 甲基丙脒)二盐酸化物97％(AAPH)购自Aldrich(Milwaukee，WI)。 HPLC级丙酮购自Fisher(Hampbton，NH)。YSI 5300A生物氧测定仪购 自YSI(Yellow Springs，Ohio)，根据生产商的说明使用。
ORAC(o)方法。使用如下的储备溶液。制备磷酸盐缓冲液 (75Mm，pH7.4)；750mM K2HPO4(F.W.174.2)；称取65.33克放入500毫 升容量瓶中，加入dH2O至刻度。浓度为750mM。在配备有校准温度计的 冰箱(2至8℃)中存储750mM K2HPO4储备液。目标温度是4℃。750mM NaH2PO4(F.W.120.0)；称取45.00克放入500毫升容量瓶中，加入dH2O 至刻度。浓度为750mM。在配备有校准温度计的冰箱(2至8℃)中存储 750mM NaH2PO4储备液。目标温度是4℃。混合40毫升750Mm K2HPO4 存储液和10毫升750Mm NaH2PO4储备液(4比1的比例)。由此制成50 毫升ORAC存储缓冲液。在配备有校准温度计的冰箱(2至8℃)中存储 储备液。目标温度是4℃。用dH2O(1∶9)稀释混合物来制备ORAC缓 冲液的工作溶液，测量pH值。其pH值应为7.4。在室温下加盖保存备用。
制备吐温。称取10克吐温20，加入90克去离子水。加盖并搅拌混合 物过夜。吐温储备液保留一周，置于工作台面上。
制备溶剂。混合25毫升丙酮，25毫升去离子水和25毫升吐温20。 使用该溶剂制备样品。在进行操作之前，应特别留意膜，用探针检查破损， 如果需要就进行替换。探针应该带尖(tips)储存在去离子水中。该实验 中只能使用一个探针和一个反应室。每8个小时对空白和Trolox(10μg/ml 或0.03995μmol/ml)进行操作。样品在10μg/ml的浓度下进行操作。样品 浓度和Trolox浓度应该相同。
称取1毫克样品并加入1毫升用于进行最初提取的溶剂来制备稀释 液。振荡1小时，将0.5毫升的最初提取液置于玻璃闪烁管(scintillation vial) 中，然后加入4.5毫升的溶剂，制备第一稀释液。将第一稀释液漩涡振荡 约30秒。其浓度为0.1mg/ml或100ppm。取0.5毫升第一稀释液置于另一 个玻璃闪烁管中，然后加入4.5毫升的溶剂，漩涡振荡约30秒，其浓度为 0.01mg/ml或10ppm。取0.5毫升管中样品置于另一个玻璃闪烁管中，然 后加入4.5毫升的溶剂，漩涡振荡约30秒，其浓度为0.01mg/ml或10ppm。 将闪烁管置于4℃冰箱。在37℃水浴中使亚油酸解冻，通过向70.8毫克亚 油酸中加入0.18毫升吐温储备液、0.18毫升缓冲液以及0.44毫升去离子 水制备亚油酸溶液(避光)。用箔片包裹溶液管。每8小时制备新鲜的亚 油酸溶液。为了制备氧自由基产生剂，称取67.8毫克AAPH溶于0.9毫升 缓冲液中。保持AAPH冷冻使其可以在8小时后使用。振荡1小时。Trolox 溶液应该一直保持冷冻。为了开始测定抗氧化剂活性，向每个反应容器中 加入1.86毫升缓冲溶液，向37℃下的闪烁管中加入2.36毫升水，搅拌3 分钟至反应基质(matrix)达到所需温度。加入0.284毫升样品，将探针尖 (tip)放入到容器中，不要接触反应溶液，进行搅拌1分钟。上述测定最 好在不透光的环境中进行。
获得数据后，从反应室(chamber)移去探针，每个加入0.357毫升亚 油酸溶液，立即将替换的探针末端置于反应室(chamber)中。加入0.357 毫升AAPH溶液，将探针小心放入到溶液试管中，但要迅速以使反应区不 留下气泡，探针盒的防溢出突起(overflow ridge)上没有溶液。接着，将 探针放入溶液中进行读数。获取数据计算抗氧化剂活性。
在“三分之一溶剂(one-third solvent)”(也称为ORAC(o)溶剂体系) 中制备浓度为1mg/ml的样品。“三分之一溶剂”是等量的水、丙酮和 TWEEN20溶液用水稀释成1∶9。样品的振荡摇床上以280rpm、室温下 振荡1小时。样品溶液在进一步用“三分之一溶剂”稀释后(一般稀释到 10μg/ml)准备进行分析。也可以使用“三分之一溶剂”作为空白。
使用YSI 5300A生物氧测定仪进行ORAC(o)分析。通过向70.8毫 克亚油酸中加入0.18毫升75mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)，0.18毫升10 ％重量的TWEEN20储存液和0.44毫升去离子水来制备亚油酸。通过向 67.8mg的AAPH中加入0.9毫升缓冲液制备AAPH。在最终的反应体积 (5.218毫升)中，使用亚油酸(21.59mM)作为游离的自由基攻击的目 标，使用AAPH(19.00mM)作为过氧化氢自由基发生剂。Trolox(10μg/ml) 作为标准。每秒读取数据直至读数为零。
计算ORAC(o)值的公式(氧自由基吸收能力氧特定电极)是：
可选择的，当评价液体剂型时Trolox可以以微升计算。已知这种计 算得到的数值是以每克样品的Trolox当量的微摩尔数表示。负的ORAC (o)值反映出与空白获得的自由基清除活性相比较低的自由基清除活性， 这表明组合物是促氧化剂，例如促进氧化的试剂，而不作为抗氧化剂发挥 作用。ORAC(o)分析是假设氧不被吸收或者样品不释放氧，当然，可以 评价对样品氧水平的任何影响并用来补偿计算出的抗氧化剂值。
ORAC(o)和ORAC(fl)分析参数的比较。经比较ORAC(o)与 ORAC(fl)相比的优势是对抗氧化剂潜能的直接测定，而不是间接测量。 ORAC(fl)是一种间接检测氧自由基的方法，因为它依赖于荧光素(目标 分子)是唯一的被检测的荧光成分的假设。然而，许多抗氧化剂化合物自 然发出荧光(例如蓝莓(blueberry))；并且自由基-自由基反应中的这些 化合物的组合也发出荧光。因此，样品的荧光与基于荧光的分析结果不一 致。另一方面，ORAC(o)方法是一种直接测定氧吸收，即直接测定氧消 失成为自由基的方法。这种测定抗氧化剂能力的方法不依赖于氧是否附着 于水溶或脂溶成分。表1提供了ORAC(fl)和ORAC(o)方法分析参数 的比较。
表1：ORAC(fl)与ORAC(o)的分析参数比较
试验中的分析 参数 ORAC(fl) ORAC(o) 温度 37℃ 37℃ AAPH浓度 磷酸缓冲液中，1.28x10-2M 磷酸缓冲液中，19.00mM 目标分子浓度 荧光素，磷酸缓冲液中， 43.8nM 21.59mM亚油酸，在10％TWEEN20、缓 冲液和水(0.18毫升，0.18毫升，0.44毫 升)的混合物中 样品浓度 初始时20毫升中含有 500mg，将上清液用缓冲液稀 释至10μg/ml 初始时为1mg/ml，稀释至10μg/ml 样品溶剂 丙酮/水，用磷酸缓冲液稀释 至50/50(v/v) 水/丙酮/10％重量的TW EEN20，v/v/v (“三分之一”溶剂)，以“三分之一”溶 剂稀释 分析用缓冲 液，浓度 75mM磷酸盐，pH7.4 75mM磷酸盐，pH7.4 最终的分析体 积 400μl 5.218ml 空白(对照) 缓冲液 “三分之一”溶剂 标准 缓冲液中62.5μMTrolox “三分之一”溶剂中10μg/ml Trolox (38.7550μM 测定样品抗氧 化剂能力的方 法 荧光素被自由基氧化时产生 的荧光减少，抗氧化剂保护 和延迟降低 氧被自由基引发剂、亚油酸碳自由基占 据；抗氧化剂保护和减少氧的吸收
本发明一个明显的优势是使用者不需要学习新技术或购买设备用来将现 在的设备和方法引进他们的实验室环境中。例如，当测量样品饱和度时，本 发明使用与由例如Ou等开发的成熟的间接测量体系中许多相同的缓冲液、 条件、提取和/或分离步骤。Ou等在丙酮/水(50∶50，v/v)中制备每20毫 升500mg浓度的样品，在旋转振荡器(rotary shaker)上以400rpm速度旋转 1小时，以14,000rpm离心15分钟，用pH7.4的75mM磷酸钾缓冲液稀释(Ou 等，利用随机甲基化的β-环糊精作为增溶剂测定亲脂性抗氧化剂的氧自由基 吸收能力试验的发展和确认(Development and Validation of Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay for Lipophilic Antioxidants Using Randomly Methylated-β-Cyclodextrin as the Solubility Enhancer)，J.Agric.Food Chem.2002，50，1815-1821)。本发明人发现在Ou的条件下(ORAC(fl)条件)， 很多待测样品不会进入溶液，更易溶的组分代替了不易溶的组分。结果，只 有在ORAC(fl)条件下溶解的部分样品才被包括在ORAC(fl)样品中并被测 定。因此，根据ORAC(fl)分析方法制备的上清液不可能代表实际样品的总 抗氧化剂活性。因为ORAC(fl)缓冲液中的样品溶液并不总是反映样品的含 量，所以使用ORAC(fl)得到的结果是有偏差的。
已经意识到样品不溶的问题，并且当采用ORAC(fl)时，观察到混合生育 酚对以槲皮素和混合生育酚的混合物进行的抗氧化剂测定缺少贡献。如图7 所述，利用ORAC(o)体系，与10μg/ml的单独的每种组分相比，发现了5μg/ml 槲皮素和5μg/ml混合生育酚的组合的抗氧化剂效果。相反地，间接的 ORAC(fl)体系显示相对于单独的槲皮素的数值，同样的组合没有进一步的效 果(见图11)。由于样品的浓度是更低并且样品的溶剂含有溶解样品的所有 成分的丙酮、水和去污剂，ORAC(o)方法中不存在这种含有混合生育酚的组 合的活性缺失和饱和度问题。样品溶剂中含有TWEEN20促成了混合生育 酚的活性检测。Trolox活性作为对照，图7显示了5μg/ml槲皮素和5μg/ml 混合生育酚的组合与单独的10μg/ml的每种组分对比的情况，而且包括 Trolox对照，表明ORAC(o)随时间检测样品中残留的氧自由基水平的能力。
与更昂贵的ORAC(fl)(自动式约250,000美元；非自动式约50,000美元)) 相比，ORAC(o)明显更节省。相反地，在此披露的ORAC(o)设备利用了现成 的氧传感器系统，所述氧传感器系统易于小型化和/或自动化，这样可以针对 商用开发出用于诊室甚至是家庭且其价格仅为大性荧光检测系统成本的一 部分的系统。根据公职分析化学工作者协会(AOAC)的关于单一实验室验 证的准则进行验证，结果见表2、3和4。
表2为期5天的精密度实验(重现性)
曲线下面积(AUC) 第1天 第2天 第3天 第4天 202.65544793963 212.901122995373 187.01466464995 202.856617129109
第5天(第二次分析) 五天的平均值 标准偏差 相对标准偏差 HORRAT值 213.124092629655 203.710389068730 10.649840914564 5.23％ 1.981060606061
每天的数值是浓度为10μg/ml的槲皮素样品进行3次实验的平均值。 HORRAT值是观察到的RSDR值与由本领域技术人员已知的Horwitz方程式 测算的RSDR值的比值，其被认为是在考察方法的精确度时，对方法的可接 受性的表征。在一项单独的实验效能研究中，一系列介于0.5和2.0之间的 HORRAT比率表明方法的精密度是可以接受的。为期5天实验的HORRAT 值是1.98。表3提供了作为线性范围的分析范围的测定值。
表3分析范围的确定
样品(μg/ml) 曲线下面积 1 124.567114093960 10 209.388111888112 100 693.611111111111 500 2327.96518987343 1000 2870.09540636041
y＝2.8335x+332.16；R2＝0.9231针对1-1000的点
y＝4.3353x+176.66；R2＝0.9967针对0-500的点
当样品浓度接近1000μg/ml时，线性完整性开始下降。测定作为线性范 围的分析范围的同时对可变浓度高达500μg/ml的曲线下面积值进行测定。
表4提供了单日结果精密度的结果。
表4单日精密度实验(重现性)
曲线下面积 第1次实验 207.369402985075 第2次实验 198.18118466899 第3次实验 205.035211267606 第4次实验 201.586572438162 第5次实验 202.110714285714
5次实验的平均值 202.856617129109 标准偏差 3.505016471434 相对标准偏差 1.73％ HORRAT值 0.654480870834
单日精密度实验包括对浓度为10μg/ml的槲皮素进行5次单独的实验。 表4中ORAC(o)方法的HORRAT值是0.65448。ORAC(o)分析被用于优化 实施例2提出的抗氧化剂组合物中各组分的比例。一种组合物的实施方案具 有以下重量比例：49.18％槲皮素；32.79％混合生育酚；9.84％葡萄皮提取物； 6.56％绿茶提取物；以及1.64％李树灌木(bush plum)，采用每克17,254微 摩尔Trolox当量的ORAC(o)得出了抗氧化剂值。采用每克5,281微摩尔 Trolox当量的ORAC(fl)得出了相同组合物的抗氧化剂值。这些数据表明测 定抗氧化剂活性的ORAC(o)和ORAC(fl)方法获得的结果因为间接ORAC(fl) 方法的局限性而不同。
实施例2：具有协同效应的抗氧化组合物。
根据本发明的膳食添加剂，将五种组分组合成抗氧化剂组合物，其中每 种组分都是在世界各地长寿人群的饮食中有特色的。本发明人根据对已知的 长寿区域的饮食的全面研究来选择组分。本发明人意识到这些区域的饮食中 富含黄酮醇和生育酚。发明人进一步意识到某些天然化合物与能够活化其抗 氧化剂活性的分子例如维生素C积极地相互作用。事实上，大量研究证实了 维生素C在例如α-生育酚的再生中的作用(Pizzorno和Murray，Textbook of Natural Medicine，1999，2ndEd.New York，Churchill Livingston)。
基于这种研究，本发明人将分离和纯化的天然提取物和其它原料组合成 制剂，其它原料包括高含量的来自不同的各种长寿人群居住区域的生物可利 用化合物。本发明的一个实施例中，选择如下的基本组分：黄酮醇、混合生 育酚、葡萄皮提取物、绿茶提取物或者厄瓜多尔的Vilcabamba的Andean村、 克什米尔喀喇昆仑地区的洪扎(Huza)地区、或者前苏联的格鲁吉亚共和国 的阿布哈西亚地区居民饮食中有特色的李树灌木，例如Leaf A.，Launois J 中所引述的：“A Scientist Visits Some ofthe World’s Oldest People，”National Geographic.1973年1月；意大利的撒丁岛(Koenig R.“Sardinia’s Mysterious Male Methuselahs，”Science.2001年3月16日)，以及澳大利亚人的居民饮 食中有特色的李树灌木(bush plum)。
本发明的组合物显示了协同的抗氧化剂活性。不希望被理论束缚，抗氧 化剂组合物的各种组分具有保护细胞内胞浆、细胞膜和细胞外流体的活性， 并因此保护整个身体。李树灌木(bush plum)成分中例如天然维生素C的 含量很高，其可以进入细胞并且是亲水的，可以用来保护胞浆；葡萄皮提取 物和绿茶提取物是亲水的，不能进入细胞，用来保护细胞外流体；混合生育 酚是亲脂的，与既亲水又亲脂的黄酮醇(例如槲皮素)一起保护膜。此外， 任何在饮食中或甚至是在膳食添加剂本身中包含的纤维可以提供充足的清 除载体。
协同效应的抗氧化剂组合物的组分。鉴于本发明的ORAC(o)设备和方法 的有效性，本发明人可以测定亲脂性和疏脂性抗氧化剂以及其它有助于增强 这些试剂抗氧化剂活性的试剂，例如维生素C等的组合的总抗氧化剂活性。 利用ORAC(o)系统，开发了包含黄酮类例如槲皮素、至少两种形式的维生素 E混合物以及任选的葡萄皮提取物、绿茶提取物和澳大利亚李树灌木(bush plum)的具有协同效应活性的抗氧化剂组合物。当槲皮素和维生素E形式的 混合物的重量比例为40/60到90/10％时观察到特别的协同效应。一个组合物 的实施方案包括如下的重量比例：49.18％槲皮素；32.79％混合生育酚；9.84 ％的葡萄皮提取物；6.56％的绿茶提取物；以及1.64％李树灌木(bush plum)。
图6显示了槲皮素、混合生育酚、生育酚和槲皮素的混合物以及合成的 抗氧化标准品Trolox(Hoffman-La Roche)的ORAC(o)分析结果的比较。
黄酮类例如槲皮素。组合物中的黄酮类可以是黄酮、黄酮醇、异黄酮、 异黄酮醇及其类似物、药学上可接受的盐或其混合物。黄酮醇的例子包括槲 皮素，山奈酚和杨梅黄酮。组合物中包括的特定的黄酮类或黄酮类似物或盐 通过进行ORAC(o)抗氧化剂测定来确定。被考虑的类似物提供了槲皮素活性 的80％以内的活性。涉及黄酮类，特别是槲皮素，也指其糖苷配基或糖苷， 其中糖例如是阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖或葡萄糖。已知槲皮素的鼠李糖糖 苷是芦丁或槲皮苷(quercetrin)，已知杨梅黄酮的鼠李糖苷为杨梅苷。槲皮 素的类似物包括那些包含在一个或多个3、5、7、3′和4′位点上除了-OH基 团以外的取代基的化合物。其它取代基包括：少于5个碳原子的烷基、乙酰 基、巯基(sulphyl)或丙二酰基。对于槲皮素类似物来说，仅仅一个或两个 位置被除-OH基团以外的任意基团取代。
黄酮类例如槲皮素可以在体外容易地合成。然而，黄酮类(包括槲皮素) 是现存的，可以从例如天然生成的食物，特别是水果和蔬菜，例如苹果、梨、 葡萄、洋葱、红葡萄酒、甜椒、红醋栗(red currant)、黑加仑(red currant)、 柠檬、樱桃、曼越橘、醋栗、西红柿、橄榄、萝卜、甘蓝、马铃薯和芦笋中 分离和纯化。槲皮素可以从Pharmline(Florida，NY)获得。
李树灌木(bush plum)：澳大利亚李树灌木(bush plum)(Terminalia ferdinandiana)含有约5％维生素C和HPLC色谱显示的多种成分(未显示 数据)。确信这些组分中包括黄酮和类黄酮。HPLC色谱形成条件：采用0.1 ％三氟乙酸和100％甲醇的梯度浓度的反相C18柱，流速为1毫升/分钟，使 用甲醇和水提取的李树灌木(bush plum)粉样品。摸索分离类黄酮和分离维 生素C的条件。在245nm下测定吸光率。
从李树灌木(bush plum)的果实种子中除去果肉和果皮，用水制备成浆。 将浆冷冻干燥并研磨。对于这里的抗氧化剂组合物来说，称量所需量的冷冻 干燥原料。李树灌木(bush plum)在本发明组合物中存在的量是0％到87.9 ％，或在其它的实施方案中，约为2％重量。
葡萄皮提取物。葡萄皮提取物由葡萄皮制得，其中含30-82％多酚并且可 以从Polyphenolics，Madera，CA；Human Kinglong，Bio-Resource Co.Ltd； Changsha Economic Development Zone，China或从Pharmline，Florida，NY 获得。
绿茶提取物。绿茶提取物是Camellia sinensis的叶子的提取物，含有35-95 ％多酚，可以从Amax NutraSource Inc.，Eugene，OR；Blue California，Rancho Santa Margarita，CA；或从PL Thomas&Co.，Morristown，N.J.获得。
其它成分。本发明的抗氧化剂组合物包括一种或多种无毒的药学上可接 受的载体，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸 氢钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇、环糊精、环糊精衍生物等。采用一种或多 种上述载体可以容易地制备胶囊或片剂，并且可以使其易于吞咽或咀嚼。片 剂可以包含适合的载体、粘结剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、矫味 剂、助流剂(flow-inducing agent)或融化剂(melting agent)。可以通过任选 与一种或多种其它的成分一起压片或成型来制备片剂。通过将自由流动形式 (例如粉状，颗粒)的活性组分任选地与粘结剂(例如凝胶、羟丙甲基纤维 素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如乙醇酸淀粉钠、交联羧 甲基纤维素)、表面活性剂或分散剂混合并压片来制备压制片。适合的粘结 剂包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成 胶如阿拉伯胶(acacia)、黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素，聚乙二醇或蜡等。 这些制剂形式中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、 醋酸钠或氯化钠等。崩解剂包括，例如淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土或 黄原胶等。成型片剂可以通过在适当的机器中对用惰性液体稀释剂润湿的粉 状活性组分进行成型而制备。
胶囊或片剂可以任选被包衣或刻痕(scored)，并可以被制成提供缓慢或 控制释放的抗氧化剂组合物制剂。用于试剂控制释放的随时间释放的组合物 一般含有试剂颗粒，所述试剂颗粒与在特定时间内能对抗肠降解和崩解的材 料混合或被该材料包衣。试剂可以通过浸滤(leeching)、腐蚀、破裂、分散 或类似方式释放。
载体可以提高抗氧化剂的稳定性也可以提供延时释放。被称为 AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)的植物碳水化合物混合物可以与 抗氧化剂组合物组合。这样的组合延长了抗氧化剂组合物的保存期限并提供 了延时释放的形式。AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)包含重量/重 量比例约为30/30/20/19/1的阿拉伯树胶(阿拉伯胶)、黄原胶、黄蓍胶，达 瓦树胶，(可以从TicGum获得)以及芦荟凝胶提取物(例如叶内凝胶(inner leafgel)，Carrington Labs，Irving，TX，MANAPOL粉或类似产品)。 AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)与本发明的抗氧化剂组合物以2∶1 到1∶2的重量比例混合。在另一个实施方案中，AMBROTOSE植物配方 (Phyto Formula)与抗氧化剂组合物以2∶1的重量比例混合。
根据特定的剂型，胶囊或片剂可以进一步含有重量百分比小于约0.1％到 90％的植物组分。对于载体而言，载体本身通常对组合物的营养上的重要性 没有影响，然而，这些载体可以对本发明营养上有效量的释放的持续时间、 释放位置和释放曲线有显著影响。例如，本发明的一种或多种抗氧化剂可以 在一种或多种大药丸(boluses)中释放，以便在一系列释放过程中实现例如 血或尿中检测到的抗氧化剂水平的峰值。在另一个实施方案中，抗氧化剂可 以有一些均匀的释放，或甚至可以随血或尿水平达到峰值以梯度方式提供。 事实上，本发明甚至可以包括疏脂性和亲脂性抗氧化剂在消化过程的不同时 间和/或位置上的释放。例如，可以以泡腾剂载体中提供抗氧化剂以使其立即 释放，同时提供的不同的抗氧化剂通过例如胃酸或在肠道释放。
制剂过程。配制碾压的抗氧化剂组合物的过程包括将AMBROTOSE植 物配方(Phyto Formula)与在此提出的抗氧化剂组合物混合。将得到的混合 物转移到碾压器中，在滚筒之间碾压形成压实体。混合时施加的压力增强了 组分间的物理粘合力。随后将压实体研磨成颗粒。然后将颗粒制成希望的剂 型，例如胶囊或片剂。在一个实施例中，Fitzpatrick Chilsonator Model 4LX10D 碾压器可以与跨表面和垂直于滚动面上有刻痕的滚筒一起使用，具有10吨 的固定压力，约0.093的Fitzmill屏。碾压装置可以具有可变的旋转速度、 施力(force application)和缺口宽度容量(gap width capability)，例如Gerteis Polygran干式碾压系统(Gerteis，Germany)。碾压器通过在两个反向旋转的 滚筒间传递混合物，并均一地向混合物施加压力而发挥作用。通过滚筒施加 到混合物上的压力将混合物压成压实体，例如片状或带状，典型地将其研磨 成颗粒。可供选择地，通过腾涌、研磨或根据需要筛分来获得颗粒。选择具 有20#-80#目的颗粒。
碾压后的抗氧化剂组合物与AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula) 的组合具有更长的保存期限，被认为是归因于暴露于氧气中的抗氧化剂组合 物的表面积减少。碾压后的组合还消除了胶囊或片剂制备过程中对赋形剂、 填充剂的需求。本发明提出的抗氧化剂组合物与AMBROTOSE植物配方 (Phyto Formula)的组合的其它优势包括：提供了作为肠道中未配对电子储 库的不溶性纤维，提供了用于调整细胞糖型(glycoform)的结构的单糖，所 述糖型对于在自由基损伤的细胞修复中细胞介导的信息传递很重要。
剂量。用于本发明组合物的给予的有效剂量制剂包括100、200、300、 400、500、600、700、800、900或1000毫克抗氧化剂组合物的胶囊或片剂。 在一个实施方案中，组合物中不添加填充剂、载体或稳定剂。在另一个实施 方案中，AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)与本发明的抗氧化剂组 合物以2∶1、1∶1或1∶2的重量比混合。在另一个实施方案中，AMBROTOSE 植物配方(Phyto Formula)与本发明抗氧化剂组合物以2∶1的重量比混合。 在另一个实施方案中，胶囊或片剂提供混合的500毫克的抗氧化剂组合物和 AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)。对于这个实施方案，每天可以服 用两片或两粒胶囊。适当的包衣可以用来提高适口性或延迟吸收。
图8和图9显示了利用测定抗氧化能力的ORAC(o)方法获得的不同比 例的槲皮素和混合生育酚的曲线下净面积(AUC)结果。针对每个被分析的 百分含量，样品(Q+MT)的总浓度是10μg/ml。例如，槲皮素的含量为0 ％时，混合生育酚的浓度是10μg/ml，样品中没有槲皮素。槲皮素的含量为 10％时，样品中含有1μg/ml槲皮素和9μg/ml混合生育酚。槲皮素的含量为 20％时，样品中含有2μg/ml槲皮素和8μg/ml混合生育酚。槲皮素的含量介 于40-100％之间时很容易观察到协同作用，槲皮素的含量为40-90％时最 容易观察到协同作用。直线代表叠加作用，例如槲皮素的含量为10％，直线 代表90％单独的混合生育酚的活性与10％单独槲皮素的活性的加和。在该 线以上存在协同作用。
本发明组合物最主要的抗氧化组分(以槲皮素代表的类黄酮，以及至少 两种形式的维生素E的混合物)包括从12.1％到100％，30％到85％，或者 在其它实施方案中重量百分比为约82％的五种组分。在一个实施方案中，在 五种组分的总重量中，槲皮素的量是49.18％，维生素E形式的量是32.79 ％。
本发明的组合物包括第二种组分(或增效剂)(葡萄皮提取物、绿茶提取 物和李树灌木(bush plum))，占五种组分重量的0％到87.9％，15％到70 ％，或约18％。如图10所示，在49.18％槲皮素、32.79％混合生育酚和1.64 ％李树灌木(bush plum)存在下，测定葡萄皮提取物和绿茶提取物最佳的比 例。葡萄皮提取物与绿茶提取物的最佳比例是60/40到80/20。在一个实施 方案中，在抗氧化剂组合物的总重量中，葡萄皮提取物是9.84％，绿茶提取 物是6.56％。作为组合物的组分提供的李树灌木(bush plum)(Terminalia ferdinandiana)的量在约0％到87.9％之间，或者在另一个实施方案中的量 是约2％。在图10的实施方案中，李树灌木(bush plum)占组合物的1.64 ％。
ORAC(o)分析显示具有如下重量比例的抗氧化混合物：49.18％槲皮素； 32.79％混合生育酚；9.84％葡萄皮提取物；6.56％绿茶提取物和1.64％李树 灌木(bush plum)，其具有每克17,254微摩尔Trolox当量的抗氧化剂活性。
AMBROTOSE AO的稳定性。AMBROTOSE AO，是AMBROTOSE (Mannatech，USA)与本发明的抗氧化制剂以2∶1重量比例的混合物，其已 经显示出在加速的稳定条件下(40℃，75％的相对湿度)在相当于约6个月 保存期限内保持活性。
通过与ORAC(fl)分析比较对ORAC(o)分析进行确认。图11是ORAC (fl)结果的图，其显示出当α-生育酚以不同比例与槲皮素混合时，其对 AO活性没有贡献。该图显示了在标准的丙酮∶水溶液中进行的ORAC(fl) 分析中，随着槲皮素浓度的升高而AUC直接地成比例升高，呈线性增加。 α-生育酚对AO活性没有贡献可能归因于其无法溶解于丙酮∶水溶液中。
图12A和12B图示了利用混合生育酚获得的ORAC(fl-lipo)结果，利 用溶剂/水/去污剂溶液溶解样品以及同时检测亲脂性和疏脂性抗氧化能力得 到的AUC结果。图11(上述)显示，利用标准的ORAC(fl)方法检测亲 脂性AOs对AO的贡献时，没有检测到α-生育酚具有任何统计学意义上的 显著活性。如图12A所述，以α-生育酚的ORAC(fl-lipo)AUC为标准， 在已公开的ORAC(fl-lipo)方法(丙酮∶水)和丙酮∶水∶吐温-20之间进 行比较，检测到ORAC(fl-lipo)分析的AUC有大幅度的增加。图12B显 示采用已知的ORAC(fl-lipo)方法，没有检测到槲皮素和混合生育酚组合 的协同作用，其结果为一条穿过横坐标的直线，表明采用该分析方法没有显 示协同作用。
基于对文献及其推荐的方法的研究，用已知的分析方法获得的这些结果 并不令人感到奇怪。目前用于评价所谓“高ORAC食品”的标准(参见，例 如，www.ars.usda.gov)表明该标准是用于测定与疏脂性抗氧化剂的潜能， 与测定亲脂性抗氧化剂是分开和独立的。本发明消除了这种对二分法的需 求，研究者已经观察到当把试管ORAC值与对血清ORAC值的影响联系起 来时，二分法可能会导致隔离状态。当测定血清的抗氧化剂作用时，与ORAC (fl)评价进行对比，美国农业部农业研究院(Agricultural Research Service of the USDA)发现，例如在试管ORAC分析中，菠菜的得分低于草莓，但是 菠菜对血清ORAC的影响要大于草莓。采用本发明和在此描述的组合物，本 发明人通过开发一种使不同溶解性的抗氧化剂之间相互作用，从而更好地反 映抗氧化剂在人体中的活性的体系来改变所述隔离状态。间接的ORAC(fl) 和/或ORAC(fl-lipo)方法无法测定总的抗氧化剂活性，也无法检测某些食 品的协同效应。
图13是利用α-生育酚的ORAC(fl)AUC结果的图，其中显示了去污 剂用量的变化对AUC测定的影响。在该项分析中，以完全的三分之一以及 其与少量吐温-20的混合物形式使用“三分之一”溶剂。图14是抗氧化剂活 性的ORAC(fl)分析的图，经测定的该抗氧化剂活性是溶解在两种不同比 例的溶剂∶水∶去污剂混合物中固定比例的槲皮素：α-生育酚的抗氧化剂 活性。图13和14的结果显示，去污剂(吐温20)确实使AUC增加，并且 也显示了与标准的丙酮∶水混合物相比，检测的ORAC(fl)活性是增加的。
实施例3抗氧化剂协同作用和增效作用的ORAC(o)检测
为了显示ORAC(o)分析能够同时检测亲脂性和疏脂性抗氧化剂活性， 进行一系列研究，表明已知浓度的亲脂性和疏脂性抗氧化剂的特定组合的效 果，以及与单独的葡萄皮提取物和绿茶提取物相比，加入例如葡萄皮提取物 和绿茶提取物的同样的组合的增效作用。图15是显示由不同比例的槲皮素 和混合生育酚获得的ORAC(o)值的图。图16是显示用不同比例的葡萄籽 提取物(GES)和绿茶提取物(GTE)的ORAC(o)值的图。在确定GSE 和GTE具有抗氧化剂活性的最大比例后，两者与优选比例的槲皮素和混合 生育酚组合。图17是显示具有最高的槲皮素：混合生育酚和葡萄籽提取物 以及绿茶提取物比例的组合的ORAC(o)值的图。发现组合的槲皮素和混 合生育酚、GSE、GTE使添加剂的抗氧化剂潜力最大化。
实施例4：AMBROTOSE AO对少量健康个人的抗氧化剂效果，开放的 标记研究，没有安慰剂作为对比。
抗氧化剂被定义为任何能够延迟或防止生物基质氧化的物质。富含含有 抗氧化剂的水果和蔬菜的饮食已经与被认为是由氧化应激造成的病理状况 的发生率降低有联系。然而，添加彼此分离的抗氧化化合物已经被证实在一 些情况下无助于改善健康，在其它情况下还是危险的1，3，4。已经有建议称大 量摄取水果和蔬菜带来的益处不仅仅是单一抗氧化剂的效果，而且还是存在 于这些食品中的不同抗氧化剂的组合的协同作用效果5，6。对于单一抗氧化 剂的关注可能是科学家们使用营养添加剂还没有复制出富含抗氧化剂饮食7 的保护效果的原因。
最近的研究表明糖营养素(glyconutritional，GN)补充剂、营养补充剂 提供维持细胞信号传输和免疫功能的糖，其具有体外和体内的抗氧化剂性 质。在含有GN添加剂的培养基中生长的大鼠肝细胞相对于对照显示出高水 平的还原性谷胱甘肽，因此表明提高了抗氧化剂保护8。
先导(pilot)临床实验研究表明在消耗GN补充剂的人群中，氧化应激 的生物标记减少和氧化防御的生物标记增加。随着日常饮食中每天添加2gr GN补充剂，在76天内观察到总的铁结合能力和叶酸的显著提高，铜/血浆 铜蓝蛋白比例显著降低。观察到的趋势还显示血清alkenals、高半胱氨酸、 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和总胆固醇减少以及氧自由基吸收能力 (ORACβ-PE)提高。
近期研究表明大多数营养物(一些是已知的，其它还没有被确认)赋予 水果和蔬菜抗氧化剂活性10，11，12，13，14。一些已知的有益抗氧化剂包括多酚 和维生素C和E6。某些食物和饮料，包括葡萄(和红葡萄酒)、绿茶和澳大 利亚李树灌木(bush plum)(Terminalia ferdinandiana)含有相对高含量的上 述抗氧化剂6，15，16。该研究测量了由GN补充剂与绿茶、葡萄、混合生育酚、 槲皮素和澳大利亚李树灌木(bush plum)混合物的组合而成的新型营养补充 剂所提供的抗氧化剂保护。
方法：血样由Cover-Tek，Inc.，Dallas，TX采集。所有的血样和尿样由 Genox Corporation，Baltimore，MD分析，并且所有统计分析由Decision Analyst，Arlington，TX来进行。
已经公开了许多测试样品抗氧化剂潜力的方法17。本研究中使用的测试 是对全血清ORACβ-PE的测定。该方法使用β-藻红蛋白，一种荧光探针来确 定血清样品抗氧化剂清除能力，特别是抗过氧化氢自由基的能力，并与已知 标准品Trolox对比。结果以每克微摩尔Trolox当量(TE)来表示18。用于 该项研究的其它标准化分析技术是测定尿脂质过氧化氢物和alkenals(其间 接地涉及自由基对脂质损伤的量)、尿8-OHdG(间接地涉及DNA损伤)19，20，21。
该项研究中使用的抗氧化剂营养补充剂AMBROTOSE AO是利用在体 外对组分的评价而开发的：槲皮素、混合生育酚、葡萄提取物、绿茶提取物 和澳大利亚李树。采用标准的ORACfl方法测定每种组分的体外抗氧化剂值 (使用不同的荧光探针，荧光素)。采用新开发的直接测定溶解氧的ORACo 方法测定组分混合物的抗氧化剂值。由于脂溶性和水溶性抗氧化剂在体内的 作用是一致的，同时测定脂溶性和水溶化合物的贡献和相互作用ORACo是 对以荧光为基础的方法(ORACfl、ORACfl-lipo和ORACβ-PE)的改善。这些方 法，最好单独测定脂溶性或水溶化合物的活性。因此，ORACo更加精确测定 了对水溶性和脂溶性组分的混合物的体外总抗氧化剂活性。将水溶性和脂溶 性组分组合，用ORACo评价来确定混合物最大协同效应和体外最佳的 ORACo值。
随后将混合物与Ambrotose复合物以1∶2比例一起碾压制得Ambrotose AO。Ambrotose中的许多天然胶已经被用来控制化合物的释放以提供持续 的输送。使用标准化实验设计该项研究来确定体内不同量的Ambrotose AO 的抗氧化剂活性，通过血清ORACβ-PE直接确定，通过尿脂质过氧化氢、alkenal 和8-OhdG分析间接确定。Prior和Cao最近建议一组实验而不是任何一个单 独实验是必需的，因为某些病理条件，例如肾衰竭，可以改变任何一个与氧 化应激毫不相关的实验22。
所有参与者都被告知并同意。登记了十二名健康男性和女性成年志愿者 不摄取营养补充剂或任何会干扰研究的药物。研究的受试者为年龄在22-61 岁的四名男性和8名女性，他们消耗增加用量的抗氧化剂补充剂。为了评价 ORACβ-PE随时间的变化以及验证实验结果的重复性，从其它没有摄取补充剂 的受试者中收集血样和尿样。在研究中，参与者继续他们正常的研究以前的 每日作息和饮食。表5提供了研究受试者的信息。
表5 人类志愿者的特征 受试者 性别 年龄 吸烟史 1 F 33 是 2 M 41 否 3 F 34 否 4 F 61 是 5 F 44 是 6 M 22 否 7 F 36 否 8 M 23 否 9 F 38 是 10 F 56 否 11 F 53 否 12 M 31 是
在最初的不使用补充剂的为期两周清除期(washout period)后，对12 名研究受试者进行早晨禁食后的血清ORACβ-PE和尿分析，在两周末增加每 个人的抗氧化剂添加剂用量。在应用添加剂的最初14天(周期1)中，每天 使用的添加剂的量是500毫克(1个胶囊)，在第二个14天期间(周期2) 中，每天使用的添加剂的量是1.0克(2个胶囊)，在第三个14天期间(周 期3)中，每天使用的添加剂的量是1.5克(3个胶囊)。此外，对没有食用 添加剂的个人的血样和尿样进行三次分析以验证分析的精密性。血样和尿样 通过独立的抽血者进行采集，迅速用干冰包装并且转移到一家当地医院的实 验室进行处理。然后经处理的血样和尿样在干冰中连夜船运(shipped)至 Genox，根据Genox的方法进行独立的分析23。然后，所有样品用干冰储存 在Genox，在完成研究的同时进行ORACβ-PE和尿的测定以使任何分析试剂 的可变性最小化。
结果：相对于基线数值的ORAC值和百分比含量变化。表6中给出了十 二名摄取Ambrotose AO的参与者相对于基线的ORACβ-PE值和百分比含量 变化。“基线”表示经2周清除后，周期1表示摄取500毫克两周后，周期2 表示摄取1.0克两周后，周期3表示摄取1.5克的两周后的数值。某些周期2 中的样品的血清瓶标签在船运至Genox期间脱落。ORACβ-PE值只能特别地 归属于该周期的3名研究参与者，不能归属于其余的研究参与者或者其它非 参与研究的人。
表6相对于基线的ORAC值和百分比含量变化
ORAC 相对于基线的变化％ 受试者 基线 周期1 周期2* 周期3 周期1 周期2 周期3 1 3300.3 5709.4 3117.8 73.0％ -5.5％ 2 3754.5 4618.6 6731.8 6189.0 23.0％ 79.3％ 64.8％ 3 3695.0 3867.9 3995.7 4.7％ 8.1％ 4 3954.3 3199.1 2703.8 -19.1％ -31.6％ 5 3107.3 3295.2 4476.2 6.0％ 44.1％ 6 3313.0 5073.8 3156.6 53.1％ -4.7％ 7 3785.5 5069.9 4390.4 33.9％ 16.0％ 8 3341.2 4207.7 4003.2 25.9％ 19.8％ 9 7568.9 6053.2 8977.6 7734.1 -20.0％ 18.6％ 2.2％ 10 4271.8 6132.5 6765.0 43.6％ 58.4％ 11 5619.2 6527.0 6420.0 6844.3 16.2％ 14.3％ 21.8％ 12 5642.9 5025.4 4398.7 -10.9％ -22.0％
原始ORAC数据的统计分析。进行重复的ANOVA测定来确定基线、周 期1、周期2和周期3的原始ORAC数据之间是否存在差异。所有周期之间 全部(F(3，24)＝4.02，p＝0.20)存在显著差异。由此，分析表明周期2与基线 明显不同(t(24)＝-3.47，p＝.002)。周期1和周期2明显不同(t(24) ＝-2.77，p＝.011)。周期2明显不同于周期3(t(24)＝2.87，p＝.009)。
每个时间周期的平均值显示于表7。
表7每个时间周期的平均ORACβ-PE值 受试者时间周期数 ORAC平均分值 基线 12 4279.5 847.9 周期1 12 4898.3 699.1 周期2 3 7376.5 3466.6 周期3 12 4814.6 1053.1
相对于基线ORAC数据的百分比含量变化的统计分析。与上述分析报告 (表6)中使用的原始数据相比，该分析检验了时间周期之间的差异，该差 异是以相对于基线的百分比含量变化来表示。进行重复的ANOVA测定来判 断相对于周期1、周期2和周期3的ORAC数据的基线的百分比含量变化之 间的差异。综合实验表明根本没有出现差异(F(2，13)＝0.71，p＝0.510)。此外， 据此的分析表明周期之间没有显著差异。表8显示了每个时间周期的平均值。
表8相对于时间周期基线的ORACβ-PE百分比含量的变化 时间周期 受试者数量 百分比含量变化平均值 ORAC分值± 周期1 12 19.1％ 18.1％ 周期2 3 37.4％ 90.3％ 周期3 12 14.3％ 19.0％
表9概括了脂质过氧化氢的平均值、总alkenal和8-OHdG值。它们被用 于校正尿浓度的变化，这种变化是根据在相同时间下测定相同样品的尿肌氨 酸酐来区分的。
表9每2周时间周期内尿生物标记的平均值 时间周期 受试者数量 过氧化氢/肌氨酸酐 μM/(mg/dl) alkenal/肌氨酸酐 μM/(mg/dl) 8-OhdG/肌氨酸酐 (mg/ml)/(mg/dl) 基线 12 0.0920 0.0761 0.0724 周期1 12 0.0808 0.0808 0.0861
周期2 12 0.0782 0.0835 0.0740 周期4 12 0.0764 0.0806 0.1025
空气质量。已知空气质量影响氧化应激(oxidative stress)。普通污染物 例如臭氧和二氧化氮的浓度升高会降低空气质量。这造成了更大的生成 ROS.24，25的潜力。表6中显示了美国环境保护局(U.S.Environmental ProtectionAgent，EPA)每两周时间对Dallas/Fort Worth(DFW)地区的受试 者居住地的平均空气质量指数的总结。EPA用颜色对地区空气质量图编码： 绿色：“良好”(每10亿中0-79份[ppb]臭氧)，黄色：“适中”(80-99ppb)， 橙色：“不利于敏感人群健康”(100-124ppb)，红色：“不利于健康”(125 -149ppb)和紫色：“非常不利于健康”(高于150ppb)。通过指定颜色的数 目来计算被研究地区每天每幅EPA图的数值：绿色：1，黄色：2，橙色：3， 红色：4和紫色：5，并根据发布的EPA图上的每种颜色代表的地区估算每 天的平均数值。然后将每天的数值平均分配至该研究的每个两周周期中(表 10)。
表10每个时间周期的平均DFW EPA空气质量指数 时间周期 平均EPA空气质量指数 基线 1.0(范围1.0-1.0) 周期1 1.0(范围1.0-1.1) 周期2 1.4(范围1.0-2.5) 周期3 1.8(范围1.0-2.5)
如上所述，鉴于周期2中的研究参与者的数值分配不确定，对12名研究 参与者可能的最低ORACβ-PE平均值进行计算。假设最低的9个数值来自于 其标签不能被确认属于参与者的血清样品，将其与3个已知数值组合获得了 可能的最低平均值，由此获得了相对于基线的变化的最保守的估计值。9个 最低的ORACβ-PE值是4727.9、5233.9、5104.3、4599.9、5699.9、5364.8、3987.3、 4179.7和4584.9。当与表5中3个已知的周期2的数值组合时，得出的周期 2中12个研究参与者的ORACβ-PE平均值为5467.70。这个数值比基线的平均 值4279.49高出27.8％。
讨论。研究已经显示食用富含水果和蔬菜的饮食具有对氧化应激的保护 作用7，26，27。饮食指南提倡每天食用2-4份水果和3-5份蔬菜28。尽管存 在这样的认识和这些建议，美国没有几个人每天的饮食达到建议的量。在美 国农业部(U.S.Department Agriculture，USDA)资助的临床研究中，研究 者们发现增加对水果和蔬菜的消耗，特别是每天从通常的5份到实验性的10 份，在2周后血清ORACβ-PE值明显升高至约13％7。在目前的研究中，利用 每种添加量获得的血清ORACβ-PE平均值的升高值为：使用500毫克升高19.1 ％，使用1.0克升高37.4％，使用1.5克升高14.3％。这些数据表明在健康 人体中产生血清ORACβ-PE值相对于基线的最大增加值的最佳量是1.0克。据 保守估计，1.0g的Ambrotose AO导致27.8％的增量，这要比公布的关于个 人每天消费5份额外的水果和蔬菜时13％的报道的两倍还多。
尿脂质过氧化氢/肌酸酐值随着使用添加剂而降低。每个用量的降低为： 500毫克时为12.1％，1.0克时为15％，1.5克时为17.0％，这表明在研究范围 内随着添加剂量的增加，对脂质损伤的保护也随之增加。还不清楚为什么脂 质过氧化氢的数据与ORACβ-PE值不十分相关。血清ORACβ-PE是对血液中抗 氧化剂保护的测量，其与测量时清除自由基的能力相关。在过去的一段时间 里，尿脂质过氧化氢是脂质氧化损伤的标志。尿中实际的脂质损伤与脂质过 氧化氢出现之间的时间关系并没有得到很好的说明。很有可能这些时间差异 部分导致了这种偏差。除了尿脂质过氧化氢以外，尿8-OHdG和alkenals也 在每个时间周期内进行测定。没有发现显著性差异，也没有观察到趋势。这 可能再次涉及尿中实际的脂质和DNA损伤与生物标记的出现之间的时间差 异。
研究的参与者生活在DFW地区。公布的EPA对DFW每日空气质量评 价的周期为平均每两周。在研究的过程中空气质量正在恶化，这通常被认为 是ROS升高引起氧化应激升高，并由此增加了氧化性损伤的生物标记，例 如脂质过氧化氢29。相反的，测定的血清ORAC值升高证明保护增加。此外， 尿脂质过氧化氢值以及尿-OHdG和alkenals的稳定性下降的趋势证明了氧化 性损伤减少。总的来说，这些数据表明通过添加获得的抗氧化剂作用要比实 际测定的作用更强。
结论。根据公开的指导意见推荐每个人食用水果和蔬菜，但现实情况是 绝大多数人不会这样做。这些基本的数据表明，如血清ORACβ-PE所测定的， 包含在成品中保持抗氧化剂活性的优选的抗氧化剂成分的营养补充剂提高 了健康个体中的抗氧化剂保护，并且如尿脂质过氧化氢所测定的，降低了脂 质氧化损伤。使用500毫克、1.0克和1.5克的Ambrotose AO两周后，血清 ORACβ-PE相对于基线的提高证明健康人体中的保护要比公开数据中记载的 向饮食中添加5份水果和蔬菜长达两周时的保护要更强(19.1％、37.4％和 14.3％比13％)。
正如这里所显示的，利用对健康人体中氧化应激的四次测量对抗氧化剂 补充剂进行检验，发现血清ORACβ-PE升高。ORACβ-PE值表明：健康受试者 优选的剂量范围是每天1克，研究显示具有低血清ORAC值的个体可以从高 剂量的抗氧化剂补充中受益30。因此遭受氧化应激升高痛苦的人或者其它承 受压力的个体可以从更大剂量中获益。
当ORACo被用于抗氧化剂混合制剂中时，独立实验室使用已知的方法， 即ORACβ-PE来分析人临床实验血浆样品。Ambrotose AO产品的抗氧化剂效 力的体内评价并不依赖于ORACo方法的使用。这些数据证明：正如血清 ORACβ-PE所测定的，本发明抗氧化剂添加剂提高了消费者的抗氧化剂保护， 并且正如尿脂质过氧化氢所测定的，降低了脂质氧化损伤。
实施例5作为生物活性分子随时间释放的试剂的多糖原料在等于或大 于10,000psi压力下进行碾压。本发明人认识到某些用于研究制剂崩解的方 法及其制剂不能象期望那样释放，即例如抗氧化剂槲皮素等成分立即释放， 这些制剂使用了例如Ambrotose AO。研究从熟知的用途和正规的分析技术 开始，其被用于处理这里所示的所有样品。该方法包含两种水平的细节，因 为其最初被设计为完全定量，且抗氧化剂槲皮素作为分析物进行测定。最初 除槲皮素之外的成分的目测分析显示了不希望的释放情况，即经对比是相同 的、但实际结果又是不同的溶解条件。
图18显示被选用于初次研究的3个模型。4种分离的样品通过以下3个 步骤进行检验：槲皮素、葡萄皮和其它两种产物(分子式A所示抗氧化剂和 分子式B所示抗氧化剂)。注意“被控制的分解”步骤对于所有样品都是相 同的。简言之，所述分解是基于证明Ambrotose AO改进释放的方法，其包 括使用槲皮素作为标记的HPLC和UV-Vis。此外，制剂的目测观察与HPLC 和UV-Vis的观察相一致。
许多国家现有的关于膳食添加剂释放水平的规定包括片剂或胶囊形式的 产品在设备中完全崩解的条款，该设备大致地模拟了内脏的物理条件。这些 条件适用美国药典(USP)和英国药典(BP)的相关要求。被记载的最好的 崩解实验可以模拟添加剂原料与消化系统相互作用的生物利用性。成分进入 人体的条件对其利用的速度和效率有影响。营养物的利用速度和效率可以被 描述成“利用率曲线”。窄而集中的曲线可以代表例如静脉注射，而纤维性 营养物质由于更持续的释放形成较宽的曲线，所述纤维性营养物质例如存在 于在其能够利用之前必须经过消化的食物中物质。根据所希望的情形，可以 利用快速作用和按时间释放载体介质研发出分布模型。
利用例如标准低pH或水溶解情况分析法，对本发明的持续释放液体制 剂中的活性试剂的溶解情况进行检验。简言之，在37℃水浴中通过溶解检验 碾压的Ambrotose释放百分比，其中1升去离子水中加入5.0克氯化钾，搅 拌溶解，以每分钟150转(RPMs)的速度混合样品。用注射器(可以在水/KCl 混合物中冲洗)将5毫升待测的液体制剂样品，无杂质地或以滴定方式加入 到水浴中。在如0.5、1、3和8小时取出每等份2毫升的样品。可选择地， 可以通过利用配备了USF Apparatus II(搅拌)的Distek Model 2100B分解水浴 将剂型溶解来检测检溶解情况。搅拌旋转设定为50rpm。溶解介质可以是例 如900毫升的37℃的pH6.8磷酸盐缓冲液。
不幸的是，目前可接受的检测崩解的方法，其遵照了USP和BP制定的 关于在30分钟内总的可见的崩解的规定，由于要花费较长时间使消化道接 受而形成了渐进的曲线，因此不能准确地评价添加剂的利用率。Ambrotose AO胶囊被特别设计成持续释放和可被逐渐利用，其在30分钟内不会完全 崩解。这不能被看作是Ambrotose AO无法在指定的操作时间内成为可被利 用的，而是目前的方法对于快速起效的组分产生了偏差。USP和BP崩解要 求间接限制出相对狭窄的可用性。在某些实际应用中，根据所涉及的组分， 这是不需要的或具有潜在毒性。利用溶解提供了简单的方法，UV-Vis和 HPLC技术显示了期望的Ambrotose AO的延迟释放的活性。主要的目标是 使UV-Vis具有单独测量这种活性的能力，并且更多地涉及使用简单的并与 UV-Vis操作相关的HPLC方法。
方法。在该方法中，选择槲皮素作为分析物，原因在于其在377nm下具 有高UV-Vis活性、在Ambrotose AO中相对高的百分比组成以及良好的色 谱行为。Ambrotose AO制剂中使用的相同的槲皮素储备标准材料被用来提 供在溶解实验期望的浓度范围内的参考曲线。应该注意到该项研究中使用了 一批产自澳大利亚的Mannatech Ambrotose AO作为初次进料，用以证明根 据BP的崩解实验，给予TGA的制剂是失败的。
依据USP和BP建立溶解条件的模型进行类似的分析。一个例外是溶解 设备选择比平均转速更高的速度来保证合理的分析时间同时保持合理的结 果。使用双重测量技术使结果相互关联，尽管实践中可能只选择一种方法， 并且单独的简便UV-Vis方法是理想的。针对同样的待测样品进行崩解实验， 观察到30分钟的崩解实验失败。接着，在特定溶解条件下，针对0.5，1，2， 3，4，和8小时绘制基于槲皮素标记的Ambrotose AO的利用率曲线。这种 简单而一致的方法可以在任何具有适当配备的实验室中重复，如需要可以转 变为用于释放检验的质量保证环境。
设备。溶解系统：本方法使用Hanson SR8-Plus溶解系统。利用具有根据 指定规范校准的搅拌深度的USP II型设备(搅拌)进行操作。根据类似的分 析，溶解介质是每组800毫升去离子(d.i)水(18+Mohm)，水浴温度是 37℃，搅拌速度是200rpm。取样时需要1毫升吸液管以及12x75毫米玻璃 试管(或等同物)，以及准备用于仪器分析的稀释用甲醇。样品的稀释是经 过特定的步骤的，在UV-Vis和HPLC分析的最佳范围内，将实验水浴中槲 皮素浓度设为最大。
UV-Vis分光光度计：使用UV-Vis分光光度计(Cary 50 Bio，Varian)和 石英玻璃比色杯进行测量。读取377nm下单波长读数。所有读数使用同样的 石英比色杯，分别用每种溶解实验水浴的初始T0样品将仪器调零。在准备 UV-Vis读数中，检查系统保持零点不变和在预期的377nm处读数的能力。
HPLC系统。使用Shimadzu LC-VP双泵HPLC系统进行测定。使用的 检测器是Shimadzu PDA SPD-M10A，其以6.25Hz扫描速度在377nm处检测。 使用的色谱柱为Phenomenex Hydro RP，4.6毫米x150毫米，粒径为5μm。 色谱柱和PDA流动池保持在30℃的温度。所有的样品和标准品的进样量为 20微升。在HPLC上进样前，所有的样品和标准品都通过0.2微米的CA过 滤器(Whatman)。为了使峰稳定形成，积分值(Integrations)为自动的。使 用Shimadzu VP 7.2版本软件包来控制HPLC和积分值(integrations)。以下 是分析中使用的梯度方案(gradient program)。溶剂A是0.1％甲酸的去离子 (d.i)水溶液，溶剂B是0.1％甲酸的甲醇溶液。所有溶剂在系统平衡之前 都经过脱气，分析的总运行时间为30分钟。在给定的这些条件下，槲皮素 的洗脱峰预期在约14.8分钟出现。
表11槲皮素HPLC系统的梯度方案
分钟 浓度B％ 0.00 50 5.00 50 20.00 70 20.01 85 22.00 85 22.01 50 30.00 50
标准品和样品。利用Pharmline槲皮素HD(批次#152560)的系列稀释 液得出UV-Vis和HPLC标准品的范围。标准品给出的浓度范围涉及在800 毫升体积的去离子水(～0-100ppm)中单独溶解的Ambrotose AO胶囊。所 有样品取自同样的AUS Ambrotose AO(批次#N04081226)瓶，其释放被 接受而作为可接受的实验批次。标准品和待测样品以同样的方式进行处理， 首先溶解于去离子水中，然后以工艺中记载的方式制备样品，并在各种仪器 分析前用甲醇稀释至1∶3。
在溶出系统的条件稳定后，向每个水浴中加入Ambrotose AO胶囊。建 议至少使用3个水浴以获得溶出活性的精确结果。将胶囊被加入水浴的时刻 时间值设为To，所有的槲皮素利用度曲线的读数都是相对于该初始的To读 数而测定的。然后每隔半小时取样1毫升。此外，在取样后补加体积为1毫 升的去离子水以保持可控体积。一旦胶囊进入水浴就提取To时刻的初始样 品。然后从To开始连续取样至4-6小时，直到胶囊的溶出明显完成。一旦所 有样品完成取样，将它们用甲醇以1∶3比例稀释，在试管中振摇以便于对 它们进行分析。对于槲皮素标准品，以去离子水制成100ppm的溶液，并由 该储存液制成连续稀释液。然后从标准品稀释液中取样1毫升，以甲醇稀释 至1∶3的比例，以与样品相同的方式振摇以便于对其进行分析。根据槲皮 素浓度的预期范围至少取5个标准品连续溶出点。
利用盛满To时刻的被测样品的水浴或测定标准曲线时的75％甲醇的去 离子水溶液的石英比色杯(对于所有读数都是相同的)将光度计调零。以一 定体积的去离子水冲洗石英比色杯，除去前后读数之间任何残留的槲皮素。 溶出的终点被定义为在两次连续读数(1小时的时间)后不能再检测到样品 的UV-Vis活性升高的时间点。这个“高平台(plateau)”标志着所有槲皮素 从胶囊中溶出时的点。如果在UV-Vis读数期间中存在由于颗粒堵塞光源通 道等原因而产生的异常数值(rogue value)，使用Q检验忽略该读数并再次 对其测定。当读数通常地保持相当稳定时，一旦出现上述数值是很明显的。 每个样品至少进行三次读数以获得可接受的平均值。在进行UV-Vis测量后， 将样品过滤，并分别在设定的用于对比的HPLC条件下进行实验。然后将来 自所有仪器的数据与来自标准曲线的反应值联系起来，显示Ambrotose AO 样品的反应逐渐增加。
结果。尽管仪器可能是不同的，将本研究中形成的数据加以总结并作为 参考。其有助于理解Ambrotose AO在给定的实验条件下产生的预期的溶出 行为。以下是表和图，其总结了槲皮素UV-Vis吸光率反应与针对槲皮素标 准品浓度绘制的HPLC曲线下面积相对时间的图之间的联系。预期的来源于 Ambrotose AO的槲皮素活性的范围显示为0-200％。给出了三次独立实验操 作的平均值，所示实验操作是同时进行的。
表12标准品的UV-Vis和HPLC相关性表
以标准的Pharmline槲皮素二水合物HD(84％槲皮素) 测定储备AO的槲皮素的UV/Vis-HPLC相关性 AO槲皮素 最大浓度 ％ 实际的 ppm 377nm下的 UV-Vis(abs) 377nm下的 HPLC(auc) 与abs匹配的绘制的auc (auc/1700000) 12.50％ 3.13ppm 0.0819 139412 0.0820 25.00％ 6.25ppm 0.1628 284334 0.1673 50.00％ 12.50 ppm 0.3924 673170 0.3960 100.00％ 25.00 ppm 0.8283 1393657 0.8198 200.00％ 50.00 ppm 1.6170 2775973 1.6329
基于两个仪器间可见的细小变化，验证了标准品的相关性数值。此外， 发现在根据Ambrotose AO溶出实验预期的整个可能的浓度范围内槲皮素的 反应是线性的。表13显示了给定的曲线相关性的近似对比，所述曲线相关 性是每种样品的UV-Vis吸光率与绘制的HPLC曲线下面积相对时间的图的 相关性。正如所看到的，两个仪器间发现了类似的低偏差。这证明了较简单 的UV-Vis方法可以独立进行，并作为定量测定槲皮素从Ambrotose AO胶 囊中释放的总时间的工具。
表13样品的UV-Vis和HPLC相关性表
Ambrotose AO样品的UV/Vis-HPLC相关性 UV-Vis平均值(abs) HPLC刻度(auc) 原始HPLC(auc) 30min 60min 90min 120min 150min 180min 210min 240min 0.0337 0.1820 0.2937 0.3623 0.4539 0.5269 0.5864 0.6283 0.0470 0.1592 0.2766 0.4012 0.4362 0.5284 0.5458 0.6274 79838 270556 470176 681963 741491 898248 927924 1066522
样品曲线显示渐进的和一致性的升高是与槲皮素溶出相关的反应。对于 所有仪器，同样可以看到这种反应，且没有明显差异。重复实验显示在给定 的溶出条件下，这种升高延续长达平均4小时。可以对不同批次的样品进行 进一步重复实验来获得甚至更多的相关性。表12和13显示的结果分别在图 19和20以图的形式示出。在用研钵和杵重新研磨之前，在10,000psi压力下 处理颗粒至少120秒，并且重新制备胶囊来进行溶出实验。
讨论。在测定随时间变化的吸光率曲线的溶出研究中，相比初始读数， Ambrotose AO提高活性长达240分钟。显示的是Ambrotose AO胶囊逐渐 和一致地崩解进入溶液，由此可以解释在消化道中渐进的利用度。还必须注 意到单独的从压制片或胶囊形式中可见的崩解并不是总体溶出的完成点。某 些微胶囊材料也可以分散到溶液中并与槲皮素结合，结果造成其不易于利 用。
该研究的可视化分析证实在大约T60时，一部分好的胶囊材料从大批胶 囊分离，利用度反应曲线持续升高。这个方法可以用来解释USP和BP通过 胶囊崩解的方法失败的原因，也可以成为一种测定膳食添加剂改进的释放的 手段。特别的是，这些得到的结果支持了Ambrotose AO(澳大利亚)的改 进释放的权利要求，其具有扩大应用于其它改进释放的膳食添加剂片剂或胶 囊的潜力。在简便UV-Vis测定中，该方法还给出了将相似结果运用到更多 涉及HPLC测定中的把握。基于在特定的时间间隔内相对于给出最大测量值 的最小的槲皮素反应的事实，建立起质量控制规范。一旦有足够的实施例继 续支持该结果，针对这些类型结果的取样率可以降低。
表14槲皮素溶出实验
时间 AO槲皮素* 二氧化硅槲皮素** AO槲皮素片*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ +
*纯槲皮素与Ambrotose以1∶2的比例混合。
**纯槲皮素与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-槲皮素混合，压缩至10,000psi，重新研磨并制成胶囊(蔬菜)。
表15葡萄皮
时间 AO葡萄籽* 二氧化硅葡萄籽** AO葡萄籽片*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ -/+
*纯葡萄皮提取物与Ambrotose以1∶2的比例混合。
**纯葡萄皮提取物与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-葡萄皮提取物混合，压缩至10,000psi，重新研磨并制成胶囊 (蔬菜)。
表16式A所示抗氧化剂
时间 AO和式A* 二氧化硅式A** AO式A片剂*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ ++
*纯式A与Ambrotose以1∶2的比例混合。
**纯式A与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-式A混合，然后压缩至10,000psi，重新研磨并且形成胶囊(蔬 菜)。
表17式B所示抗氧化剂
时间 AO和式B* 二氧化硅式B** AO式B片剂*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ ++
*纯式B与Ambrotose以1∶2比例混合。
**纯式B与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-式B混合，然后压缩至10,000psi，重新研磨并制成胶囊(蔬 菜)。
因此，利用同样的条件：胶囊，重量等，针对被倒空后重新填满的 Ambrotose AO胶囊，检验槲皮素随时间溶出(以确保对所有样品的胶囊的 压缩是一致的)，使用除了没有被碾压之外同样组成的胶囊。碾压过的 Ambrotose AO在到达Qmax时具有4x-8x的增加值(最大量槲皮素溶出)。松 散形式的Ambrotose立即释放。可视化的对比显示碾压的胶囊经过非碾压形 式的崩溃点后保持其形式完整。不希望受理论的束缚，很可能是Ambrotose 的长链多聚物象链一样发挥作用，槲皮素(或任何其它具有这样活性的生物 分子)以可控速度“浸出”。同样的，长链多糖，例如具有从2到约50,000 个糖单体的链与一种或多种营养上有效量的抗氧化剂、维生素、矿物质、氨 基酸、核酸、糖及其混合物和组合一起在于介于约100、500、1000、2000 或甚至10,000psi压力下被压缩。
可以理解在此描述的特定实施方案仅仅示用于说明、而非作为对本发明 的限制。在不偏离于本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各 种实施方案。本领域的技术人员会意识到，或仅仅使用常规实验就能够确定 在此描述的特定步骤的许多等同方式。这些等同方式被认为落入本发明的范 围之内并且被权利要求所覆盖。
说明书中提到的所有出版物和专利申请都显示了本发明所属领域的技 术人员的技术水平。这里引用所有出版物和专利申请作为参考，并指明其引 用的程度相当于每篇单独的出版物或专利申请都特别地、单独地被引用来作 为参考。
这里披露和声称的所有组合物和/或方法可以按照本发明披露的内容来 制备和实施而不需要过多的实验。当本发明的组合物和方法以优选的实施方 案的方式进行描述时，对本领域技术人员而言，很明显可以对组合物和/或方 法进行变化，这里描述的方法的步骤或步骤的顺序的变化不背离本发明的思 想、精神和范围。更特别的是，显然某些化学上和生理上相关的试剂可以被 替代为在此描述的试剂，同时获得相同或类似的结果。所有这些对于本领域 的技术人员而言是明显的类似替代和改进都被视为落入本发明所附的权利 要求书所限定的精神、范围和思想之内。
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生物系统已经进化出对抗自由基和其它促氧化物质的作用的抗氧化 剂系统。抗氧化剂是指任何显著延迟或防止可氧化物氧化的物质，与可氧 化物相比其以较低浓度存在。酶可以是抗氧化剂，例如超氧化物岐化酶和 过氧化氢酶，许多有机体都编码这些酶。例如维生素C和植物酚的物质 是通过饮食进入生物系统的抗氧化剂。有建议称通过体内产生或者正常饮 食吸收而自然形成的这些物质的水平并不充足。正常饮食经常无法提供足 够的抗氧化剂，这是因为水果和蔬菜中缺乏和/或饮食中的水果和蔬菜由于 现代的加工方法使它们的抗氧化剂被耗尽。正常饮食可以被改善，然而当 今的生活方式以及西餐单调的组成使得添加营养成为输送人体所需抗氧 化剂的最可行的方法。为了对正常的饮食进行补充，必须要确定添加剂中 所包含的成分的抗氧化能力。
发明概述
本发明包括用于营养上有效量的如抗氧化剂、维生素、糖、矿物质、 氨基酸、核酸及其混合物和组合的改进释放的组合物、方法和制剂，其中 添加剂在长链多糖的存在下，在大于100psi的压力下被压缩。发现使用同 样的条件：胶囊、重量等，利用例如抗氧化剂的营养物指示剂，当与长链 多糖一起被压缩时，本发明使得营养物随时间溶出。作为营养补充养生法 的一部分，长链多糖的例子可以是具有例如2至约50,000糖单体长度的单 体亚单位，其可以在约100、500、1000、2000或者甚至10,000psi或更大 的压力下被压缩。与现今使用的大多数迅速释放的营养补充剂不同的是， 本发明使得一种或多种抗氧化剂、维生素、矿物质、氨基酸、核酸、糖、 及其混合物和组合更自然地释放。与食物不同的是，本发明可以被用于以 一种既科学又更天然的方式来补充基本营养物特定的缺失。
添加剂可以被置于胶囊、蔬菜胶囊或硬明胶明胶胶囊中。当在更高的 压力，例如大于5000psi时被压缩，发现超过85％的营养补充剂从约1至 约8小时被释放，在其它制剂中超过85％的营养补充剂从约2至约6小时 被释放。长链多糖可以包括选自半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、 甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳 糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿拉伯糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖及其混合物或组合的单体。添加剂可以通 过碾压在约2000到10,000；5,000到10,000；或大于10,000psi的压力下 被压缩。一种或更多种长链多糖可以含有重量百分比为约0.1％到约75％ 的，例如半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、 N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿 拉伯糖、阿拉伯半乳聚糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖 及其混合物或组合。
添加剂可以包括一种或多种选自半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰 化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木糖 的长链多糖，其来源于例如分离和纯化的黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、 甘蔗、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、刺梧桐 树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树胶(gum ghatti)、淀 粉、纤维素、降解的纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、果胶、甲壳质、阿 拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、藻酸、角叉菜胶、右旋糖 苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、葡聚糖、香 菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖及其混合物 或组合。在一个特定实施例中，长链多糖和/或营养上有效量的一种或多种 糖包括每种的重量百分比为约1％到约10％的分离和纯化的半乳糖、半乳 糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、 岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺、阿拉伯糖、阿拉伯半乳 聚糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、木糖及其混合物或组合。
在本发明的另一个实施方案中，改进释放的膳食添加剂包括一种或多 种分离和纯化的长链多糖，其选自分离和纯化的黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、 米粉、甘蔗(sugar cane)、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐 豆胶、蚤草、刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树 胶达瓦树胶、淀粉、纤维素、降解的纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、果 胶、甲壳质、阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、藻酸、角 叉菜胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽 糖、葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、 乳糖及其混合物或组合；以及一种或多种选自抗氧化剂、维生素、矿物质、 氨基酸、核酸、糖及其混合物和组合的营养补充剂，其中长链多糖和营养 补充剂在大于2,000psi的压力下被碾压。
本发明的另一种改进释放的膳食添加剂包括一种或多种营养上有效 量的分离和纯化的长链多糖，一种或多种亲脂性抗氧化剂，以及一种或多 种疏脂的抗氧化剂，其中添加剂在大于5,000psi的压力下被碾压。
本发明还包括一种制备改进释放的膳食添加剂的方法，其是通过混合 一种或多种长链多糖和营养上有效量的一种或多种选自抗氧化剂、维生 素、矿物质、氨基酸、核酸、糖、草药提取物及其混合物和组合的营养补 充剂，并且在大于100、500、1,000、2,000、5,000或10,000psi的压力下 被压缩而成的。上述方法可以被用于制造改进释放的膳食添加剂，其包括 营养上有效量的一种或多种来源于黄蓍胶、瓜尔胶、谷物粉、米粉、甘蔗 (sugar cane)、甜菜糖、马铃薯、牛奶、琼脂、褐藻胶、刺槐豆胶、蚤草、 刺梧桐树胶、种子胶、落叶松提取物、芦荟提取物、达瓦树胶达瓦树胶(gum ghatti)、淀粉、纤维素、降解的纤维素、果糖、高果糖玉米糖浆、果胶、 甲壳质、阿拉伯树胶(acasia)、阿拉伯树胶(gum arabic)、藻酸、角叉菜 胶、右旋糖苷、黄原胶、硫酸软骨素、蔗糖、乙酰化聚甘露糖、麦芽糖、 葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖、果聚糖、半纤维素、菊糖、果聚糖、乳糖 及其混合物或组合的分离和纯化的多糖，以及一种或多种选自抗氧化剂、 维生素、矿物质、氨基酸、核酸及其混合物和组合的营养补充剂，其中多 糖和营养补充剂在大于2,000psi的压力下被压缩。
本发明还包括抗氧化传感器以及直接测定总样品的氧化水平和抗氧 化剂对总样品的氧化状态的影响的方法。本发明还包括用于为实现最佳健 康状态而向个体提供有效量抗氧化剂的组合物和方法。本发明披露的装置 和方法能同时地、实时地并直接地检测样品的总抗氧化能力。本发明人认 识到该技术已经人工地创造了两种相互独立类别的抗氧化剂(亲脂性和疏 脂性)并且分别测定它们。此外，该技术还经常使用一种可检测的报告分 子间接地测定了自由基的存在。
本发明通过使用快速的，便宜的且直接的检测系统克服了现有技术中 检测器和方法的局限性。为了突破这些局限，本发明人研发了本发明披露 的氧自由基吸收能力-氧(ORAC(o))装置和方法。利用ORAC(o)装置， 本发明人能够首次同时地、实时地测量亲脂性和疏脂性抗氧化剂对溶解氧 水平的效果的影响。利用ORAC(o)分析，发明人还能够开发出一种具有协 同效应的抗氧化组合物，其可以单独或者与一种或更多种抗氧化增效剂联 合使用。
更特别的是，本发明包括直接检测亲脂性和疏脂性抗氧化剂的抗氧化 活性的装置，该装置包括与在溶剂/水/表面活性剂混合物中的样品和氧自 由基敏感性分子通过流体相联系(communication)的溶解氧传感器，其中 氧自由基敏感性传感器同时检测溶剂/水/表面活性剂混合物中的亲脂性和 疏脂性抗氧化剂。氧自由基敏感性分子可以是与氧反应的分子，例如具有 共轭双键的分子；或含氮或硫的化合物。氧自由基敏感性分子的例子，例 如荧光素、β-藻红蛋白(β-PE)，谷光甘肽-S-转移酶、亚油酸或其组合。 氧自由基的水平可以通过溶解氧测定仪或传感器在溶剂/水/表面活性剂混 合物中直接确定。溶解氧水平可以利用氧传感器，例如电化学、化学发光、 表面等离子共振、红外线、电容耦合、染料偶合光纤(dye-coupled fiber optic) 或高光谱氧传感器(hyperspectral sensor)来测定。溶解氧测定仪或传感器 可以设置为在线进行高通量分析，也可以作为单独的样品检测器和/或适用 于办公室或者甚至家庭使用。溶剂可以是有机溶剂，例如丙酮。表面活性 剂可以是去污剂，例如非离子去污剂吐温-20。溶剂/水/表面活性剂混合 物中的溶剂通常至少占溶剂/水/表面活性剂混合物的体积的约10到90％， 如33％。溶剂/水/表面活性剂混合物中的水通常至少占溶剂/水/表面活性剂 混合物的体积的约10到90％，如33到67％。溶剂/水/表面活性剂混合物 中的表面活性剂(或去污剂)通常至少占溶剂/水/表面活性剂混合物的体 积的约0.1到10％，并且可以溶于水中储存。在一个特定的实施例中，溶 剂/水/表面活性剂的比率是1∶1∶1。
装置可以进一步包括一个或多个处理器，例如计算机，其可以控制检 测器、采集数据、存储数据、基于数据和/或信息数据库进行运算，和/或 以表格、曲线图、图表等形式显示数据或数据的概要。处理器/计算机还可 以连接并且甚至控制流控系统，该流控系统与氧传感器和溶剂/水/去污剂 混合物通过流体相联系。本发明测量的曲线下面积涉及由接受抗氧化能力 检测的样品的活性导致的氧相对消失，以及观察到的作为已知标准品的活 性结果的氧相对消失。利用本发明和本发明记载的方法，可以同时在包括 亲脂性和疏脂性抗氧化剂的溶液中直接测量溶解氧的水平。计算AUC的 公式的例子可以是
其中AUCsMP是样品的曲线下面积；其中AUCBLNK是空白的曲线下面 积；其中AUCTRLX是Trolox的曲线下面积；并且其中SMP是样品。
本发明还包括一种直接测定抗氧化剂活性的方法，其包括如下步骤： 在有一种或多种抗氧化剂和目标氧自由基存在下，测定溶解在溶剂/水/表 面活性剂混合物中的待测溶液的溶解氧水平，其中用氧检测器测量水溶性 和脂溶性抗氧化剂的活性。溶解的氧自由基水平可以利用氧检测器测定， 氧检测器例如电化学、化学发光、表面等离子共振、电容耦合、染料偶合 光纤(dye-coupled fiber optic)或高光谱氧传感器(hyperspectral sensor)。 抗氧化剂活性可以在37℃下测量。自由基引发剂的实例包括，例如2，2′- 偶氮二[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐，2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷) 二盐酸盐(AAPH)，2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)[2-(N-硬脂酰)脒基丙烷] 二盐酸盐(SA-1)，2，2′-偶氮(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)-[2-[2-(4-正辛基)咪唑啉 -2-基]-丙烷]二盐酸盐(C-8)，2，2′-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈) (MeO-AMVN)，2，2′-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)(AMVN)，偶氮二异丁 基腈，2，2′-偶氮二(2-甲基丙酸盐)(DAMP)和2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)， 及其盐、混合物或等同物。检测器甚至可以是一次性的。
本发明还包括膳食添加剂，该添加剂包括任何分离和纯化的疏脂性抗 氧化剂以及分离和纯化的亲脂性抗氧化剂，其中组合的疏脂性和亲脂性抗 氧化剂具有大于6,000μMol的Trolox当量(Equivalents)(TE)/克的溶 解氧值。技术人员会意识到该数值也可以用液体当量来表达，如6,000μMol 的Trolox当量(Equivalents)(TE)/毫升。疏脂性和亲脂抗氧化剂是随 时间释放的并且可以包括一种或多种选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、ξ2 和σ生育酚(tocopherol)的维生素E，以及α、β、δ和γ生育三烯酚 (tocotrienols)，及其类似物、其药学上可接受的盐和其组合。亲脂性抗氧 化剂的例子包括槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及其衍生物、类似物、 药学上可接受的盐和组合。
包括任何分离和纯化的疏脂性抗氧化剂和任何分离和纯化的亲脂性 抗氧化剂的膳食添加剂还可以包括两种或多种基本的糖，例如半乳糖、半 乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、乙酰化甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、 岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和/或木糖。在一个实施 方案中，添加剂还包括维生素C源，例如含有高水平天然的、可生物利用 的维生素C的植物原料，例如澳大利亚李树灌木(bush plum，Terminalia ferdinandiana)。在一个特定的实施方案中，维生素C是来自维生素C植 物原料的抗氧化活性的增强剂，维生素C植物原料例如野生澳大利亚李树 灌木(bush plum，Terminalia ferdinandiana)，其维生素C的百分含量比农 场生长李树灌木(bush plum)更高。添加剂也可以包括一种或更多种有益 菌种，如乳酸菌(Lactobacillus sp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)。添 加剂也可以被压缩以提供通常不能渗透氧气的表面，例如，碾压的颗粒、 胶囊、片剂、小片剂(mini-tab)、囊片、泡腾片或其组合。
与上述的ORAC(o)装置和方法比较而言，分离和纯化的亲脂性和 疏脂性抗氧化剂具有超过7000μMol的Trolox当量(Equivalents)(TE)/ 克的抗氧化ORAC(fl-lipo)值。本发明被用于开放式实验研究来测定每 个在饮食中摄取抗氧化剂/糖营养素(glyconutrient)混合物的个体的抗氧 化水平的变化，该混合物被中包括本发明的抗氧化剂。当向患者提供疏脂 性和亲脂性抗氧化剂时，通过ORAC(β-PE)测定可知相对于累积的患者 人群的平均基本抗氧化水平，疏脂性和亲脂性抗氧化剂提供了超过13％的 平均增加值。本发明还包括许多组合物。本发明公开的组合物是基于这样 的认识，即目前可获得的膳食添加剂无法将具有高于每种成分预期活性的 可测定活性的亲脂性和疏脂性抗氧化剂组合起来。利用本发明的装置和方 法，本发明人能够开发出不仅含有亲脂性和疏脂性抗氧化剂，还增加了抗 氧化物活性的增效剂的具有协同效应的组合。
目前已经表明如槲皮素这样的类黄酮通过基因的抗氧化反应元件来 增加谷胱甘肽合成中的限速酶，即γ-谷氨酰半胱氨酸(glutamylcysteine) 合成酶的重亚单位的转录。增加的转录随后在组织培养细胞中翻译，增加 了胞内还原(活性)谷胱甘肽水平。槲皮素是红葡萄酒、葡萄皮和洋葱中 的重要组分。对来自于红葡萄酒、葡萄皮和洋葱中的槲皮素的研究表明其 对健康的有益作用。已经显示槲皮素可以被人体很好地吸收。一项研究表 明所有吸收的槲皮素在进食后2个小时被代谢(European Research on Functional Effects of Dietary Antioxidants，September 25-28，2002， Cambridge，UK)。一经发现饮用适量红葡萄酒的受试者的LDL氧化实质 上被降低，研究者就声称保护效果很可能归因于槲皮素及其代谢物的活 性。已经显示槲皮素增强了红血球稳定性。
本发明人意识到由于众多不同的因素影响氧化应激，添加抗氧化剂需 要适应个体的需要和化学方面的要求。此外，已经意识到需要组合生育酚 以满足个体的不同需要。组合生育酚是必须的，因为某些抗氧化剂被机体 “选择”。例如，北美地区饮食中维生素E的主要形式是γ-生育酚，其通 常存在于植物油以及大豆和谷类产品中。然而人体主要保留α-生育酚。已 经发现一种依赖于α-生育酚转移蛋白的特定方法能够调节人体中α-生育 酚的浓度。与现有技术中抗氧化组合物不同，本发明使用混合生育酚向人 体提供多种形式的维生素E，从而实现选择、保持和使用每种形式的优选 剂量。而且，槲皮素和混合生育酚的具有协同效应的组合向人体提供了一 大批抗氧化剂营养物的优良选择，其可以根据个体需要而变化。
本发明人试图通过加入化合物进一步使具有协同作用的槲皮素和混 合生育酚的组合的活性最大化，这些化合物能够增强这些抗氧化剂的活 性。这种增效剂之一是维生素C。这是因为维生素C具有显著的抗氧化剂 活性以及几种非抗氧化剂的营养性功能。许多因素导致维生素C促氧化 (pro-oxidant)特性，特别是在过渡金属的存在下。维生素C的促氧化特 性可以不被完全破坏。然而，其他的研究者证实他们发现维生素C甚至在 未结合的金属存在下仍然作为抗氧化剂。具有抗氧化活性的其它增效剂包 括天然提取物，例如葡萄籽提取物和绿茶提取物。在一项研究中，绿茶表 现出有效的体外抗突变活性，抑制了大鼠结肠内致癌物诱导的癌前病变 (preneoplastic lesions)的发展。绿茶还明显抑制了肠息肉(intestinal polyps)的形成。因此本发明人不仅将天然来源的纯化和分离的抗氧化剂， 例如槲皮素和混合生育酚组合成具有协同效应的组合，而且进一步添加了 提高这些试剂可检测的抗氧化活性的增效剂。
更特别地是，膳食添加剂组合物包括营养上有效量的两种或更多种的 基本糖；分离和纯化的疏脂性氧自由基清除剂；以及分离和纯化的亲脂性 氧自由基清除剂，其中组合的疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂具有大于6， 000μMol的Trolox当量(TE)/克的氧氧自由基清除剂值。在一项试验中， 当给病人提供疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂时，通过ORAC(fl-lipo)测定 的相对于患者人群的基本抗氧化水平，疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂提 供了超过13％的平均升高值。疏脂性和亲脂性氧自由基清除剂被包覆用于 延迟释放，其可以包括一种或多种下述维生素E分子：α、β、δ、ε、γ、ζ、 η、ξ1、ξ2和σ生育酚，以及α、β、δ和γ生育三烯酚(tocotrienols)及 其类似物、其药学上可接受的盐和其组合。亲脂性氧自由基清除剂可以包 括一种或多种下述物质：黄酮醇、槲皮素、山奈酚、杨梅黄酮、芹黄素及 其衍生物、类似物、药学上可接受的盐和其组合。添加剂可以进一步包括 两种或多种选自：半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、 N-乙酰化半乳糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和木糖及其衍生物、类似物、药学 上可接受的盐及其组合的糖。
附图的简要说明
为了更充分理解本发明的技术特征和优点，将附图作为本发明详细描 述的参考，其中：
图1描述了进行ORAC(o)的直接抗氧化剂设备；
图2是本发明的ORAC(o)方法的流程图；
图3是两幅图，即对比ORAC(o)(氧百分比)测定和ORAC(fl)(荧 光)测定中的空白溶液，使用AAPH作为引发剂，Trolox作为标准品，亚 油酸或荧光素分别作为氧自由基靶点；
图4是两幅图，即对比ORAC(o)(氧百分比)测定和ORAC(fl)(荧 光)测定中的抗氧化剂标准品Trolox，使用AAPH作为引发剂，Trolox 作为标准品，亚油酸或荧光素分别作为氧自由基靶点；
图5是两幅图，即对ORAC(o)(氧百分比)测定和ORAC(fl)(荧 光)测量中的空白溶液、标准品和样品，使用AAPH作为引发剂，Trolox 作为标准品，亚油酸或荧光素分别作为氧自由基靶点；
图6是显示通过本发明的ORAC(o)方法测定的5μg/mL槲皮素(Q) 和5μg/mL混合生育酚(MT)的组合的抗氧化剂效果，并与浓度为10μg/mL 单独的每种组分进行对比的图；
图7是显示通过本发明的ORAC(o)的方法测定的5μg/mL槲皮素(Q) 和5μg/mL混合生育酚(MT)的组合的抗氧化剂效果，并以Trolox作为 对照的图；
图8是根据使用测定抗氧化能力的ORAC(o)方法测得的槲皮素和 混合生育酚的滴定率得到的曲线下面积(AUC)图；
图9是根据使用测定抗氧化剂能力的ORAC(o)方法测得的槲皮素 和混合生育酚的滴定率得到的AUC的另一幅图，该图证明了预期结果(线) 和检测到的与槲皮素和混合生育酚的滴定预期结果相比高于该线的协同 作用的程度；
图10是显示在49.18％槲皮素、32.79％混合生育酚以及1.64％李树灌 木(bush plum)存在下，不同比例的葡萄皮提取物和绿茶提取物的ORAC (o)分析结果的图，葡萄皮提取物与绿茶提取物的优选比例是60/40到 80/20；
图11是显示5μg/mL槲皮素(Q)和5μg/mL混合生育酚(MT)的组 合的ORAC(fl)结果，并与浓度为10μg/mL单独的每种组分进行对比的 图；
图12是显示测定槲皮素的滴定度相对溶解在丙酮：水中的生育酚的 ORAC(fl)分析图；
图13是显示测定抗氧化剂活性的ORAC(fl)分析的图，其测定了固 定比例的槲皮素：α-生育酚在溶剂∶水∶去污剂混合物中溶解的比例；
图14是显示测定抗氧化剂活性的ORAC(fl)分析的图，其测定了固 定比例的槲皮素：α-生育酚在两种不同比例的溶剂∶水∶去污剂混合物中溶 解的比例；
图15是显示获自不同比例的槲皮素和混合生育酚的ORAC(o)值的 图；
图16是显示不同比例的葡萄籽提取物和绿茶提取物的ORAC(o)值 的图；
图17是显示具有最大量的槲皮素：混合生育酚和葡萄籽提取物和绿茶 提取物组合的ORAC(o)值的图；
图18是显示被选的用于初次研究的三个模型；以及
图19和20是显示分别经HPLC和UV/Vis测定的槲皮素相对释放的 情况的图。
发明详述
在下文详细讨论本发明的各种实施方案的制定和用途时，应该认识到 本发明提供了许多可应用的发明构思，其可以通过各种特定语境来具体体 现。此处讨论的特定实施方案仅仅是以特定的方式说明本发明的制备和用 途，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，下文定义了许多术语。这里定义的术语具有本 发明涉及的领域的普通技术人员通常所理解的含义。术语例如“a”、“an” 和“the”并不意味着是指仅仅单个的实体，而是包括可以用特定例子来说 明的大类。此处的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是它们的应用 不限制本发明，除非权利要求书中指出。
本发明是部分基于对现有技术已经人为地制造出两种相互独立的抗 氧化剂类别并分别对它们进行测量的认识。而且现有技术还通常间接地测 定自由基的存在，即使用报道分子。本发明提供了不仅检测样品的总抗氧 化剂能力而且同时是直接测定的设备和方法。
本发明使用的术语“基本的糖”是用于定义细胞糖蛋白的寡糖链上常 见的单糖，其不能通过饮食和人体内生化合成方便地获得(参见例如， Harper’s Biochemistry(Murray等，1996)(第8行)和Principles of Biochemstry，Vol II(Zubay等，1995)(第11行))。自然界中已经发现超 过200种单糖，其中11种被认为是对维持哺乳动物健康重要的：半乳糖、 葡萄糖、甘露糖、N-乙酰化神经氨酸、岩藻糖、N-乙酰化半乳糖胺、N- 乙酰化葡萄糖胺、木糖、艾杜糖醛酸、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸。这些糖的 结构是熟知的(参见例如，Stryer’s Biochemstry(Stryer，1995)和Merck Index，12th Editon，1996)。
本发明使用的术语“长链糖”和“长链多糖”是用于描述具有两个或 多个能够以链间氢键结合的糖链的糖。例如，在此引用美国专利 NO.4735935号的相关部分作为参考，其教导了从芦荟(Aloe vera)中分离 长链多糖的方法，其中沉淀、冻干了每个链上具有2-约50,000个单体的 长链多糖。长链多糖可以从多种植物和动物原料中分离，正如这里所教导 和披露的。本发明的长链多糖的分离和纯化以及甚至是特定链长度的长链 多糖或其组合的分离可以通过例如长链多糖水解、特定长度的长链多糖的 大量分离、更长长链多糖的聚合、较短和较长长链多糖组合的筛选、长链 多糖的分离来获得，其中利用了例如电泳、FPLC、HPLC、分子筛(size exclusion)、分子筛色谱(size-exclusion chromatography)、沉淀等。
本发明使用的术语“改进的释放”是用于描述在一段延长的时间周期 内影响营养上有效量的营养物输送的释放状态，这里定义的延长的时间周 期为使用本发明的制剂约60分钟和约2、4、6、8或更多小时。改进的释 放还可以从功能上定义为大约60分钟和约2、4、6甚至8小时以后超过 80-90％的营养物释放。改进的释放还可以通过使营养物在不考虑吸收的 情况下使患者或受试者能够利用来评价，某些活性物质可能从来不被动物 吸收。不同的改进释放剂型可以由本领域技术人员根据这里披露的内容容 易地设计成向小肠和大肠，仅向小肠或仅仅向大肠输送，这取决于包衣材 料的选择和/或包衣材料的厚度。用于长链多糖的改进的例子包括例如改变 长链多糖中糖的类型或组合、化学修饰(有机地或化学地修饰)糖的侧链 (例如乙酰化)、水解长链多糖、选择长链多糖的大小、聚合更长的长链 多糖、选择较长和较短的长链多糖的组合、分离长链多糖，其中利用例如 电泳、FPLC、HPLC、分子筛(size exclusion)、分子筛色谱(size-exclusion chromatography)、沉淀等。可以制备和输送延迟释放制剂以实现在较低肠 道的某些通常可预测的部位的释放，如果没有选择改进的释放，这种释放 将在更末梢的部分实现。
本发明可以单独使用或组合使用一种或多种用于营养物质延迟释放 的方法、技术、机械的、化学的和其它改进方式、包封、包装等，例如胶 囊、凝胶帽或者甚至包衣。胶囊的例子包括动物、植物、聚合物及其混合 物和组合。可以采用足够厚度的包衣(类型、厚度等)以便部分或全部包 衣在pH值在低于约5的胃肠道流体中不溶，但在pH值约5和以上时溶 解。
本发明使用的术语“营养上有效量”是用于定义提供哺乳动物有益的 营养作用或反应的量。例如膳食添加剂中包含的维生素和矿物质的营养反 应根据哺乳动物的不同而不同，其应当被理解为维生素和矿物质的营养有 效量是各自不同的。同样的，已知必需氨基酸、维生素C、铁、碘、各种 维生素、矿物质、糖、脂质等的缺乏会影响生理功能和细胞功能。这里所 披露的抗氧化剂和糖的营养上有效量是指当它们保持和/或提高饮食中这 些重要营养物质水平时是营养上有效的，所述饮食例如是试图为了补充这 些营养物而保持或增加饮食的人的饮食。这样，当一种哺乳动物需要一种 包括上述定义的量的维生素和矿物质的特定方案时，其它哺乳动物可能需 要包括不同定义的量的维生素和矿物质的相同特定方案。
本发明使用的“抗氧化剂”是指任何延迟或防止可氧化的目标分子氧化 的分子。抗氧化剂通过清除生物学上重要的活性自由基或其它活性氧物质 (例如，O2 -、H2O2、HOCl、高铁离子(ferryl)，过氧化氢，过氧亚硝酸盐 (peroxynitrite)和烷氧基)来起作用；防止氧自由基形成；或催化自由基或 其它活性氧物质转化成活性较低的物质。抗氧化剂通常被分为两类：(1)脂 质(亲脂性或疏水性)抗氧化剂；以及(2)水性(疏脂性或亲水性)抗氧 化剂。脂质抗氧化剂的例子包括，但不限于类胡萝卜素(例如叶黄素、玉米 黄质、β-隐黄质、番茄红素，α-胡萝卜素，β-胡萝卜素)，其存在于果核 的脂质隔室(compartment)内；和生育酚(例如维生素E、α-生育酚、γ- 生育酚和δ-生育酚)，其存在于脂质隔室的界面；和类维生素A(例如维生 素A、视黄醇和棕榈酸视黄酯)和脂溶性多酚，例如槲皮素。水性抗氧化剂 的例子包括，但不限于抗坏血酸及其氧化形式“脱氢抗坏血酸”、尿酸及其 氧化形式“尿囊素”、胆红素、白蛋白、维生素C和水溶性多酚，例如与磷 脂膜具有高亲和力的儿茶酚、异黄酮和原花青素(procyanidin)。
通常使用的检测氧自由基和抗氧化能力的相对水平的方法是氧自由基 吸收能力(ORAC)分析。在已知的ORAC型分析中，抗氧化剂值是通过测 定氧自由基对例如荧光或其它可检测分子的作用来间接测量，这对由特定氧 自由基引起的氧化来说可能不是一个好的靶点。通常，当抗氧化剂添加到待 测样品中时，与不用抗氧化剂处理的样品(例如对照样品)对比，可以在样 品中观察到可检测的自由基，例如过氧化物或非自由基活性类物质，例如过 氧化氢的量降低。然而，这些间接方法通过测定中间物(例如荧光，β-藻 红蛋白(β-PE)等)来监测抗氧化情况的变化，这种方法是基于自由基对 中间物的作用是对氧化剂和抗氧化剂的相对水平的真实反应的假设。这些分 析的对照是已知浓度的氧自由基产生剂和已知的经测量的抗氧化剂，其被用 作样品的标准品。
本发明使用的术语“自由基”是指包含至少一个未配对电子的分子。绝 大多数分子甚至包含多个电子，它们的共价键通常包括共有的电子对。这些 键的裂解产生两个独立的自由基，每个带有未配对电子(任何的配对电子除 外)。自由基可以是带电的或中性的，是高度活性的并且通常寿命很短。自 由基彼此或与带有未配对电子的原子结合。在与完整分子的反应中，自由基 尽量使它们自己的电子结构完整，产生新的自由基，其继续与其它分子反应 形成链式反应。自由基链反应对高温下的物质分解和聚合反应特别重要。在 人体内，氧化的自由基导致组织损伤。热、紫外线和离子辐射都能产生自由 基。产生自由基是氧化新陈代谢的次级效应。过量的自由基可以压制天然的 保护酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶。自由基例如过氧 化氢(H2O2)、羟基自由基(HO)、单线态氧(1O2)、过氧化物阴离子自由 基(O2 -)、一氧化氮自由基(NO)、过氧化物自由基(ROO)、过氧亚硝酸 盐(ONOO-)可以存在于脂质或水性隔室(compartment)中。抗氧化剂营 养剂(如维生素C和E、硒、多酚)可以降低这些效果。
本发明使用的短语“脂质隔室”是指具有环状或非环状的长链脂肪烃 及它们的衍生物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物。例如，通常 的脂质包括脂肪酸、脂肪、磷脂、类固醇、类花生酸(eicosanoid)、蜡和脂 溶维生素。某些脂质通常可以被分为两组，单纯脂质和复合脂质，如甘油三 酸酯或脂肪和油、甘油脂肪酸酯、蜡、长链醇的脂肪酸酯和类固醇例如胆固 醇和麦角固醇。复合脂质包括，例如磷脂(phosphatide)或磷脂(phospholipid) (含磷的脂质)、糖脂(含糖的脂质)和鞘脂(含鞘氨醇的脂质)。
本发明使用的术语“脂质”包括脂肪或类似脂肪的物质。该术语是描述 性的而不是如蛋白质或糖的化学名称。脂质包括真脂(即脂肪酸和甘油的 酯)，类脂(即磷脂、脑苷脂、蜡)和类固醇(即胆固醇、麦角固醇(ergostrol))。 脂质可以是通过例如自氧化的机制氧化的靶点。在此使用的术语“脂肪酸” 是指一组例如带负电的、通常为线性的烃链。脂肪酸的烃链的长度和氧化状 态是变化的。通常，脂肪酸具有带负电的部分(例如以羧基为末端)，以及 一个“尾”部，其决定脂肪酸的水溶性和两性特征。例如，脂肪酸是包括生 物膜的磷脂的组分，如脂肪，其被用来将能量储存在细胞内，或用来在血流 中转运脂肪。在此使用的术语“磷脂”是指任何种类的磷酸酯，其包括下列 小组(side-group)中的至少一种：脂肪酸、醇和含氮的碱。
本发明使用的术语“脂肪”或“脂肪类”是指任何脂肪酸的甘油酯，例 如脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯形式。甘油三酸酯是指那些不带 电并且完全疏水的分子，即还原的分子。甘油单酯和甘油二酯是磷脂合成过 程中的代谢中间产物，同时甘油三酯形成了用来储存化学能量的以无水的、 紧密状态存在的脂肪分子。在此使用的术语“脂溶维生素”是指例如常见的 脂溶性维生素，包括维生素(A)(视黄醇)、维生素D(例如维生素D3(胆 钙化甾醇))、维生素E和维生素K等。
本发明使用的短语“脂质抗氧化活性”或“脂质抗氧化剂能力”可以互 换使用，是指对来自样品的脂质隔室(compartment)的抗氧化能力的测量值。 在此使用的短语“水性抗氧化剂活性”或“水性抗氧化剂能力”可以互换使 用，是指对来自样品的水性隔室(compartment)的抗氧化剂能力测量值。在 此使用的短语“总抗氧化剂活性”或“总抗氧化剂能力”可以互换使用，是 指对来自样品的脂质和水性部分的抗氧化能力测量值。
本发明使用的短语“水性隔室(compartment)”是指不与脂质隔室 (compartment)相互作用的流体样品的一部分。水性隔室(compartment) 包括生物流体样品，例如血液、血浆、血清、粪便、脑脊液、羊水、组织液、 淋巴液和滑液。例如，流体样品的水性隔室(compartment)例如血清，可以 不仅包括血液凝结后仍然保持的，并且经离心除去血细胞和凝结成分的液体 部分，还包括其它化合物，例如：蛋白质，例如白蛋白和球蛋白；抗体；酶； 少量的营养有机材料，例如氨基酸和葡萄糖；无机物，例如钠、氯化物、硫 酸盐、磷酸盐、钙、钾、碳酸氢盐、镁、碘、锌和铁；少量的废物，如尿、 尿酸、黄嘌呤、肌酸酐，肌氨酸，胆色素和氨；和痕量气体，例如氧气和二 氧化碳。流体样品还可以是非生物样品，例如化学制剂、合成的组合物或食 品和化妆品。
本发明使用的术语“样品”是指液体或流体生物样品、或固体生物样品， 其中利用自由基发生剂(例如亲脂性自由基发生剂或亲水性自由基发生剂) 可以产生自由基，并且可以利用(ORAC(o))监测器和本发明的方法检测。 生物样品包括，例如血液、血浆、血清、脑脊液、尿、羊水、组织液和滑液。 固体生物样品包括，例如组织、细胞、组织培养物、固定化细胞、细胞上清 液或甚至组织或细胞物质的部分(或提取物)。术语“样品”还包括非生物 样品，例如化学溶液、合成的组合物和食品。在此使用的术语“相对ORAC (o)”和“ORAC(o)”是指通过每克或每毫升的Trolox的微摩尔当量测定 的相同的值。ORAC(o)为负值表明比空白获得的自由基清除活性更低的自 由基清除活性，表明组合物是促氧化剂，即促进氧化而不是作为抗氧化剂发 挥作用的试剂。
本发明使用的短语“自由基产生剂”或“自由基引发剂”可互换使用， 是指能够产生自由基的试剂、化合物或分子。自由基产生剂能够产生一定可 测量水平的自由基，例如抗氧化剂或氧化指示剂能够与自由基相互作用产生 可测量的或可检测的输出信号的水平。自由基产生剂的例子包括，例如偶氮 自由基产生剂，其是以已知恒定速率产生自由基流的化合物。偶氮自由基产 生剂的例子包括，例如2，2′-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈) (MeO-AMVN)，2，2′-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)(AMVN)，偶氮二异丁基 腈，2，2′-偶氮二(2-甲基丙酸酯)(DAMP)，和2，2′-偶氮二-(2-脒基丙烷)， 2，2′-偶氮二[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、铁、抗坏血酸和金属离 子。
本发明使用的“受试者”是指任何活的有机体。术语“受试者”包括， 例如鱼、哺乳动物、爬行动物、鸟类和昆虫等。特定的例子包括：人类、非 人类灵长类，例如黑猩猩和其它猿类和猴类；牲畜，例如牛、绵羊、猪、山 羊和马；家养动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠 和豚鼠等。术语不表示特定的年龄或性别。这样，意味着成年的和新生的受 试者以及胎儿，或者雄性或者雌性都被涵盖。
本发明使用的短语“自由基相关的失调”是指产生自由基或暴露在自由 基下的病理状态。在此使用的术语“自由基相关的失调”包括疾病状态的病 理原因是自由基引起的损伤的病理状态，或其中给予自由基抑制剂(如去铁 胺)、清除剂(例如生育酚、谷胱甘肽)，或催化剂(例如SOD、过氧化氢酶) 时显示出产生了可检测的有益效果，这是通过减轻症状、提高存活率或提供 其它可检测的对临床保护或预防病理状态的有益作用来实现的。自由基失调 的例子包括、但不限于缺血再灌注性损伤、炎性疾病、系统性红斑狼疮、心 肌梗死、中风、创伤性出血、脊髓损伤、克罗恩氏病(Crohn′disease)、自 身免疫性疾病(例如风湿性关节炎、糖尿病)、白内障形成、与年龄有关的 黄斑变性、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、眼色素层炎、肺气肿、胃 溃疡、氧中毒、腺瘤、不希望的细胞凋亡和放射病。
本发明使用的术语“氧化应激”是指氧自由基在受试者体内造成的损伤 水平。损伤水平取决于活性氧物质的产生速度和之后的抗氧剂失活以及位置 和修复速度。当在此使用的术语“背离”或“偏离”与氧化状态以及氧化应 激相关时是可以互换使用的，是指样品的抗氧化剂活性的变化。氧化状态的 改变可以是抗氧化剂活性从已知的正常值增加、减少，升高或抑制。例如， 样品的脂质隔室(compartment)、样品的水性隔室(compartment)、或样品 的脂质和水性隔室(compartment)的抗氧化活性升高或降低。
本发明使用的术语营养剂的“药学上可接受的盐”被用来描述在有效的 医学评价范围内的，适合用于人和低等动物组织内、组织上或与组织一同使 用的，而且没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的有益效果 /风险率相当的那些盐。药学上可接受的盐是现有技术熟知的(参见例如， S.M.Berge等，J.Pharmaceutical Sciences，1977，相关部分引入本文作为参 考)。合适的盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间制备，或另外通 过游离功能碱与合适的有机酸反应而制备。代表性的酸加成盐包括，但不限 于醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐，天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸 盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄酸盐、甘油磷酸盐、 半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐，氢溴酸盐、氢碘酸盐、 2-羟基乙磺酸盐(羟乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、 2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味 酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨 酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。在此用作季铵化试剂的含氮碱 性基团的例子包括：低级卤代烷烃(甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化 物和碘化物)；二烷基硫酸盐(二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐)； 长链卤化物(癸基、十二烷基、十四烷基、硬脂基氯化物，溴化物和碘化物)； 芳基烷基卤化物(苯甲基和苯乙基溴化物)等。用来形成药学上可接受的酸 加成盐的酸的例子包括无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及例如草 酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。碱性加成盐也可以在本发明披露的 抗氧化剂化合物最终分离纯化期间用适当的碱进行原位制备，所述碱药学上 可接受的金属阳离子的例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或氨或有机伯胺、 仲胺或叔胺。药学上可接受的盐包括但不限于，基于碱金属或碱土金属的阳 离子，如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及除此之外的无毒的季胺和胺阳 离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵，甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙 基铵、二乙基铵和乙基铵。其它有代表性的用来形成碱加成盐的有机胺包括 乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪等。
本发明使用的术语“增强”是指一种或多种直接或间接提高或增强本发 明疏脂性和/或亲脂性抗氧化剂活性的试剂。这样的一种增效剂是维生素C， 其具有使抗氧化剂再活化和再生的作用，并且其自身也具有明显的抗氧化活 性。在过渡金属的存在下观察到维生素C的促氧化活性。其它的抗氧化剂活 性的增效剂包括天然提取物，例如葡萄籽提取物和绿茶提取物。在一项研究 中，绿茶显示出潜在的体外抗突变活性，并且抑制动物模型中致癌物诱导的 癌前病变(preneoplastic lesion)。同样地，增效剂增强或甚至可以与从天然 来源的纯化分离的抗氧化剂例如槲皮素和混合生育酚产生协同作用。
在此使用的术语“糖营养的(glyconutritional)”或“糖营养素 (glyconutrient)”是指自然界合成的复合碳水化合物或糖或简单糖，它们是 各类信息传递和信号分子的生化合成所必须的，这些分子可以是在间质细胞 液中游离的，具有细胞间信息传递的活性(例如细胞因子、生长因子等)， 或者形成包含细胞膜高特异性分子活性中心(foci)(例如，受体位点、离子 运输通道、抗原识别等)的分子构型。
本发明使用的术语“植物营养的(phytonutritional)”或“植物营养素 (phytonutrient)”是指仅存在于植物中的天然合成的分子，其被生产出来用 于保护植物细胞。植物营养素(phytonutrient)主要具有抗氧化剂、自由基 清除剂和重要的微量营养素的活性。这些分子通过饮食添加剂来提供，其存 在于成熟的植物组织中，而且大多数集中在种皮和种子周围的果实组织中。 在哺乳动物组织中，当这些分子以饮食提供时，它们具有优化细胞微环境中 的生物化学、免疫学和生理学性质的活性。
本发明使用的术语“植物提取物”和“草药提取物”可互换使用，是指 在植物组织中产生的植物化学成分，其可以通过水、极性或石油溶剂来提取， 并且具有某种程度的有益于健康或治疗的活性。绝大多数草药制剂可能是有 毒的，特别是被浓缩时，但是当它们以更传统的方式在茶中使用时通常是安 全的，并且可以作为“治疗疾病和促进健康的民间药物”用于药敷(poultices)。 在此使用的术语“调养身体的草药制剂(herbal body-toning agent)”是指发 明人已经观察到的减少和逆转由于老化或太阳损伤而造成的弹性组织和胶 原纤维损伤的物质，这是通过恢复皮肤圆润(skin turgor)和弹性而有效地 减少或消除皱纹、松弛、色素沉着(hyperpigmentation)，以及逆转其它损害 美容外观的因素来证明的。
本发明膳食添加剂中包括的糖可以从许多种天然和合成的来源获得，例 如灌木、树、植物、酵母、真菌、霉菌、植物胶、树脂、淀粉和纤维素衍生 物以及天然粘蛋白原料。特别是，某些天然原料包括：(a)包含阿拉伯树胶 (acasia)、刺梧桐树胶、黄蓍胶或达瓦树胶达瓦树胶(ghatti)的灌木或树 木渗出液；(b)包括琼脂、褐藻胶或角叉菜胶的海洋胶；(c)包括瓜尔豆、 剌槐豆或蚤草的种子胶；(d)含有果胶或乙酰化聚甘露糖的植物提取物；(e) 淀粉和纤维素衍生物，例如羟乙基淀粉、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙 基甲基纤维素、甲基纤维素，纤维素氧化物；以及含有葡聚糖、黄原胶的微 生物胶。然而，应该意识到本发明的组合物并不被获得的各种糖的来源所限 制。
本发明的多糖可以在自然界中以单、寡和/或多糖的形式存在。这样，本 发明的组合物可以含有单体、寡聚体和/或多聚体形式的多糖。为了列出已知 天然的多糖来源及其用途的列表，请参照美国专利申请US2003072770，在 本文中引入其相关部分作为参考。
本发明使用的术语“碳水化合物”可以与术语“糖”、“多糖”、“寡糖” 和“糖”互换使用，其定义对于碳水化合物化学领域的技术人员是熟知的。 虽然本发明的组合物希望包括至少两种或更多种的基本糖，但应该注意的是 糖可以以单、寡和/或多糖的形式存在，例如含有黄蓍胶和瓜尔胶的组合物将 被认为含有半乳糖醛酸、唾液酸、甘露糖和半乳糖。因此，通过控制特定膳 食添加剂中特定胶的含量，可以控制膳食添加剂中各种糖的量。
本发明使用的术语“至少两种形式的维生素E的混合物”被用来描述至 少两种形式的生育酚的混合物，所述生育酚选自α、β、δ、ε、γ、ζ、η、ξ1、 ξ2和σ生育酚和α、β、δ、和γ生育三酚(tocotrienols)及其组合和衍生物。
在一个实施方案中，“至少两种形式的维生素E的混合物”是至少两种形式 的选自α、β、δ和γ生育酚的生育酚混合物。在另一个实施方案中，“至少 两种形式的维生素E的混合物”是α、β、δ和γ生育酚的混合物。“至少两 种形式的维生素E的混合物”可以从例如VITAECAPS，SA，Spain、Henkel 有限公司或Cognis有限公司(Kankakee，IL)获得。COVITOLF-350M从 Cognis购得，其包含天然来源的α-生育酚以及从食用蔬菜油中获得混合生育 酚。包括在本发明的抗氧化剂组合物中的生育酚的特定混合物是通过进行 ORAC(o)抗氧化剂测定来确认的。
生育酚的盐或衍生物包括药学上可接受的盐，例如乙酸盐、硫酸盐、琥 珀酸盐、烟酸盐、脲基甲酸盐(allophanate)、磷酸盐，苯醌(quinone)或 卤化的衍生物；酯；立体异构体等。本发明包括在6-色满醇(chromanol) 环和/或侧链上进行取代、加成以及其它变化的维生素E衍生物，条件是其 衍生物保持维生素E的抗氧化剂活性。例如，生育酚及其衍生物可以根据烷 基基团、双键和其它取代基数目和位置以及环上和侧链上的变化而变化。“烷 基”是环状、支链或直链化学基团，其中仅包含碳和氢，例如甲基、丁基和 辛基。烷基可以是未取代的或者被一个或多个取代基取代的，取代基是例如 卤素、烷氧基、酰氧基、氨基、羟基、巯基、羧基或者苄基。烷基基团可以 是饱和的或者在一个或几个位置上不饱和的。典型的烷基基团包括1-8个 碳、1-6或者1-4个碳原子。通过与不同的其它实体的环状结构或侧链的 耦联可以构建其它生育酚，其它实体例如含氧、氮、硫和/或磷的实体。生育 酚衍生物还可以通过修饰侧链的长度来制备，该侧链存在于原型的生育酚 中，例如α、β、δ和γ-生育酚。生育酚的环结构和侧链上的立体化学和键 饱和度也可以变化。
其它的生育酚衍生物，包括前药，可以通过将糖或其它成分偶联到侧链 或环状结构上来制备。混合的生育酚包括但不限于一种纯生育酚的立体异构 体的混合物(例如α-生育酚的+和-立体异构体)；(+/-)表示消旋体混 合物)或者结构上不同的生育酚的混合物(例如α加上γ-生育酚)。
尽管本发明包括上面所引用的11种基本的糖，但是值得注意的是其它的 糖、营养化合物或生物活性或者惰性化合物也可以包括在本发明的膳食添加 剂中。这类其它营养化合物包括任何一种或多种植物营养素(phytonutrients)、 薯蓣复合物、植物提取物、草药提取物、植物的一部分、草药成分、维生素 或矿物质。这些营养化合物可以被加入到本发明的膳食添加剂中，或者它们 由给予哺乳动物膳食添加剂来单独提供。例如，接受本发明的包含糖营养素 (glyconutrients)的制剂的人还可以接受相同的或者其它形式的植物营养素 (phytonutrients)。惰性化合物包括香料、填充剂、润滑剂、缓冲液、凝胶、 粘合剂、赋形剂、载体和/或其它能够促进本发明膳食添加剂的制剂和给予的 化合物。包含本发明膳食添加剂组合物的所有糖营养素(glyconutrients)，甚 至包含其它化合物、试剂或其它物质的糖营养素(glyconutrients)可以直接 从Mannatech Inc(Coppell，Tex.)获得。
本发明包括直接和同时地测定包括疏脂性和/或亲脂性氧化剂的组合物 的氧自由基吸收能力(ORAC)的装置和方法。使用术语“ORAC(o)”的 原因在于该分析是在直接测定ORAC(o)样品中氧含量的氧自由基吸收能 力实验中，直接追踪氧的消失来测量抗氧化剂清除自由基的能力。目前工业 上的标准分析例如ORAC(fl)和ORAC(β-PE)，是通过间接测量暴露 于氧自由基的荧光化合物(荧光素或β-藻红蛋白)的荧光发射的减弱来测 量抗氧化能力的。这些分析对于亲水性抗氧化剂来说效果好，但是在测量疏 水性抗氧化剂或疏水性和亲水性抗氧化剂的混合物时作用有限。此外，不像 已知的ORAC(fl)和ORAC(β-PE)体系，在此披露的ORAC(o)作为 一种一次性的传感器适用于简便制造。这个体系相当稳定甚至可以在办公室 生产，在家居系统快速测定来自生物样品的待测物的氧化能力。
ORAC(o)设备。图1描述了进行ORAC(o)的抗氧化设备10。正如 所描述的，设备10具有三个基本的部件：一个检测系统12，一个流控系统 14和一个数据处理器系统16，其可以相互连接来提供数据采集、流体控制 和样品控制以及数据处理。检测系统12有一个氧传感器18，其与流控系统 14通过一个或多个管道20与流体联通。使用一个或多个阀22对通过一个或 多个管道20流动的流体进行控制，所述阀可以是手动控制和/或受数据处理 器系统16的控制。在操作时，样品24进入流控系统，被引入检测器18，并 且在数据采集后输送到废物储存库26。流动体系14也可以包括一种或多种 溶液28，通过流控系统14由泵、真空或压力，例如压缩的惰性气体引导溶 液28流动(transit)。流控系统14中的溶液28通常会被预混合或平衡，用 于本发明时，其通常可以包括：水、溶剂，去污剂或水：去污剂的混合物、 氧自由基发生剂、氧化靶点等，并且在输送到氧检测室34之前在混合室30 中混合。流控系统的选择可以依赖于希望的或被选择的自动化程度，这对于 本领域技术人员而言是已知的。样品24可以用于校准氧传感器18的同样溶 液预混合，或者甚至可以在混合室30中预混合。
本发明中使用的氧检测器18的例子包括任何溶解氧传感器，其能够在溶 剂、水和去污剂存在下检测溶解氧。溶解氧传感器的例子包括，例如电化学、 化学发光的，表面等离子体共振、红外线、电容耦合、染料偶合光纤或甚至 是高光谱(hyperspectral)氧传感器。在一个特定的实施例中，溶解氧传感 器是YSI 5300A生物氧传感器(YSI，USA)、SPREETA传感器(Texas Instruments)，PASCOPS2108(Pasco，USA)等。在一个实施例中，溶解氧 传感器具有如下的规格：范围：0-20毫克/升；精度：满标度的±10％；分 辨率：0.01毫克/升；最大采样频率(maximum sample rate)：20sps；默认采 样频率(default sample rate)：2sps；响应：60秒内98％；温度范围：0-50 ℃；温度补偿：10-40℃；阴极：铂；阳极：Ag/AgCl；膜：1毫升硅，可 以用来与生产商提供的软件连接，例如溶解氧EZ(Pasco，USA)。该体系 还可以包括pH，ORP，与流控系统以液体联通的电导率传感器或混浊度传 感器。
在操作中，在此披露的ORAC(o)体系可以具有以下用途：使用者收集 样品并将溶解在ORAC(o)溶剂试剂盒(干式或液体式)中或用ORAC(o) 溶剂试剂盒(干式或液体式)溶解。ORAC(o)传感器，例如手持式表面等 离子体共振氧传感器(参见，例如Texas Instrument SPREETA传感器)被暴 露于一个或多个校准标准品中，然后暴露于使用者样品中。氧传感器与处理 器相连来评价来自传感器的检测器表面的输出值，并向使用者提供读数。读 数可以在屏幕上显示、打印和/或被传输到处理器或存储器等。使用者样品可 以是可能含有氧自由基的尿、唾液、眼泪、粘液分泌物、汗、血液(或血液 产物)、组织、粪便或者其它生物样品。在一个实施例中，样品是一种或多 种通过呼吸器例如封闭式呼吸器收集的呼吸气体(一种或多种吸入的和/或呼 出的气体)。通过传感器检测的数值甚至可以被储存在存储器中(挥发性、 半永久性或永久性)，用于将来作为参考或者与过去或未来的数值进行对比 以评价使用者的氧化状态。
本发明用于测试抗氧化活性的ORAC(o)试验的基本组成部分利用了现 有的ORAC式方法，因此其即便不需要大量培训就可以方便的适用于实验室 使用。简言之，ORAC(o)使用氧传感器，例如血浆氧传感器或溶解氧传感 器来测定促氧化剂活性，例如通过直接测定样品溶液中的一种或多种氧自由 基产生分子的相对活性，并以氧化清除剂(抗氧化剂)作为标准。必须注意 的是某些试剂例如还原剂或挥发剂在自由基源例如AAPH不存在的情况下， 可以导致溶液中氧的吸收和产生，影响了溶液中氧的含量。使用本发明，技 术人员能够通过例如在加入自由基引发剂之前评价溶液中样品的状况来区 分样品的自由基清除和非自由基清除活性。值得注意的是，待测样品的与氧 化状态相关的自由基清除和非自由基清除活性是通过应用本发明来测定的。 氧自由基产生剂和氧自由基清除剂的相对活性可以通过ORAC(fl)、ORAC (fl-lipo)、ORAC(β-PE)等间接方法随时间进行滴定和/或测定。
图2是概括说明本发明方法的基本步骤的流程图50。在步骤52中，在 溶剂∶水∶去污剂混合物的存在下，对溶解氧探针进行平衡和/或校正，并测定 基线。在一个实施例中，溶剂∶水∶去污剂是比例为1∶1∶1的丙酮∶水∶ 吐温-20的混合物。在步骤54中，确定抗氧化剂活性的基线作为阳性对照， 基线用于与使用例如Trolox作为抗氧化剂得到的抗氧化剂活性进行对比。 Trolox及其相关分子的一个优点是这些维生素E的衍生物批与批之间更稳 定，具有较小的批次差异而且是合成的，由此提供了稳定浓度的抗氧化剂活 性。在步骤56中，在加入步骤58中的氧自由基产生剂之前，将步骤54中 的混合物与氧自由基靶点例如亚油酸混合。进行实验操作，在步骤60中通 过随时间测定溶解氧的消失以及储存样品的数值来计算曲线下面积(AUC)。 在系列实验或平行实验中，将样品溶解于溶剂∶水∶去污剂混合物(步骤66)， 随后在步骤68中加入氧自由基靶点。一般地，在步骤56和68中使用相同 类型的氧自由基靶点，在步骤58和70中使用相同类型的氧自由基产生剂。 在步骤72中，检测样品的AUC以及储存样品的数值。由于标准品和样品的 AUC已经被测定，通过减去空白的AUC使数值合理化。合理化的标准品和 样品的AUC数值随后被用于对比和计算样品的抗氧化剂活性水平。
下面的讨论用于帮助说明本发明，但不作为对其保护范围的限制。去污 剂吐温-20可以帮助亚油酸分散。亚油酸提供双键，通过它氧可以被吸收。 Trolox是用作内标的合成抗氧化剂，从所有样品获得的数值都是以Trolox 的数值作为相对背景的。氧自由基产生分子：2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷) 二盐酸化物(AAPH反应物)，其与氧反应产生以碳为中心的自由基。AAPH 产生的自由基造成亚油酸的氧化。作为亚油酸氧化的结果，亚油酸的双键变 成酮基，并与以碳为中心的自由基中的分子结合。采取氧探针的方法测量由 于亚油酸的氧化导致的氧从反应室被除去的速率。偶氮自由基可以与亚油酸 直接反应，引起亚油酸自由基的形成。亚油酸自由基随后与反应室中存在的 氧反应形成酮。根据推测的机理，氧由于亚油酸的氧化而被消耗。抗氧化剂 通过阻止亚油酸的氧化而延缓了反应室中氧的消耗。计算溶解氧曲线下面积 与时距曲线的比值来获得样品的抗氧化剂能力的测量值，该抗氧化剂能力是 通过其延缓亚油酸氧化的能力显示出来的。
氧自由基产生剂。本发明ORAC(o)分析中出现的已知浓度的偶氮自由 基产生剂产生了用于测量抗氧化活性的自由基。偶氮引发剂包括，例如2，2′- 偶氮二[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物、2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷) 二盐酸化物(AAPH)、2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)[2-(N-硬脂酰)脒基丙烷]二 盐酸化物(SA-1)、2，2′-偶氮(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)-[2-[2-(4-正辛基) 咪唑啉-2-基]-丙烷]二盐酸化物(C-8)、2，2′-偶氮二(4-甲氧基-2，4-二甲氧基 戊腈)(MeO-AMVN)、2，2′-偶氮二(2，4-二甲氧基戊腈)(AMVN)、偶氮二 异丁基腈、2，2′-偶氮二(2-甲基丙酸酯)(DAMP)、以及2，2-′偶氮二(2-脒 基丙烷)。
例如，自由基产生剂2，2′-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸化物(AAPH)分 解成氮分子和两个碳自由基。碳自由基结合形成稳定的产物或者与氧分子反 应形成过氧化氢自由基。AAPH的半衰期约为175小时(37℃下，pH值为中 性)。因此，在前几个小时，溶液中自由基的产生率基本上是恒定的。同样 地，被使用的AAPH经常被用于在脂肪酸的水分散液中进行脂质过氧化； 其可以单独使用或与亲脂性和/或疏脂性自由基产生剂组合使用。当设备测定 样品中总氧的时候，这里披露的溶剂系统可以使用亲脂性和/或疏脂性自由基 产生剂。
溶剂系统。用于ORAC(o)的溶剂系统是一种包括溶剂、水相和去污剂 三部分组成的系统。例如，溶剂可以是有机溶剂，其选自醇、胺、酯、乙二 醇醚、乙二醇、萜和/或其混合物。用于配制的有机溶剂系统少于溶剂成分的 约50％，约为30％或33％，少于20％以及在某些情况下少于10％。 在一个实施方案中，溶剂是丙酮，其可以是ORAC(o)溶剂系统的10 ％和90％(体积/体积)，水相约为ORAC(o)溶剂系统的10％和90％(体 积/体积)，去污剂为溶剂系统的0.001％到90％。例如，ORAC(o)溶剂系 统可以是三分之一的水、三分之一的去污剂(“三分之一”溶剂)，样品的浓 度为例如1毫克/毫升。使用相同的溶剂制备稀释液。去污剂可以是非离子去 污剂例如TWEEN(例如TWEEN20)、BRIJ或者TRITON；两性离子 去污剂例如CHAPS；阳离子去污剂；或者阴离子去污剂，例如胆酸盐、脱 氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠或者TWEEN-80；或者表面活性剂。水∶丙酮∶ 去污剂的比例可以分别约5％-90％至90％-5％。ORAC(fl)使用两种成 分的系统，其中二分之一是丙酮，二分之一是水，与之不同的是，ORAC(o) 溶剂系统的去污剂使得允许对总样品的氧进行直接测定。一种变化形式是使 用随机甲基化的β-环糊精的ORAC(fl-lipo)。
ORAC(o)分析的用途：ORAC(o)分析可以被用于测定生物样品的总 抗氧化剂活性以评价本发明的营养补充剂的成分，甚至对本发明的竞争剂和 /或最终膳食添加剂进行测试和评价。对于评价生物样品的用途而言，它们可 以是例如血清、脂溶性血清成分、水溶性血清成分、尿、脂溶性尿成分、水 溶性尿成分、LDL组分、组织匀浆、抗氧化剂添加剂的质量对照品、食物产 品或者防腐剂、新型抗氧化剂添加剂的开发、新型食物产品的开发、新型防 腐剂或者新型抗氧化剂治疗、食物生产和加工的质量控制、评价植物的抗氧 化剂活性、或者检测化妆品抗氧化剂活性。
实施例1：使用ORAC(fl)和ORAC(o)分析比较抗氧化剂活性
使用现有技术中测定荧光ORAC(fl)的氧自由基吸收能力方法，并 且使用本发明的测定溶解氧的方法ORAC(o)来分析抗氧剂组合物组分 的抗氧化剂活性。产品的抗氧化剂活性是指其保护系统免受过氧化氢自由 基引起的损伤的能力。
现有技术测定抗氧化剂活性的方法用于对比。对于ORAC(fl)分析 来说，使用Ou等(Ou，B.，Hampsch-Woodill，M.和Prior，R.L.，J.Agric. Food Chem.2001，49，4619-4626)的方法。与公开的Ou方法的区别包括振 荡摇床(orbital shaker)的速度(Ou，400rpm；本发明280rpm)，离心速 度(Ou，14,000rpm，15分钟；本发明3200rpm，15分钟)和分析时间(Ou， 30分钟；本发明100分钟))。荧光素、钠盐来自于Aldrich(Milwaukee， WI)。对于Ou的方法而言，将标准量的荧光素加入到待检测的抗氧化剂 产品中，测定初始荧光水平。加入游离的自由基引发剂，测定荧光消失的 时间和程度。Trolox，6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸，是维 生素E的细胞可渗透的水溶性衍生物，其具有潜在的抗氧化剂性质。 Trolox避免了大鼠胸腺细胞中过亚硝酸盐(peroxynitrite)介导的氧化应激 和凋亡，是批与批之间一致的合成的抗氧化剂，被用来作为标准并与每一 种样品进行比较。在计算每种样品的ORAC(o)值时，使用的空白(对 照)可以包括在每次操作中。绘制荧光：时间图。每个曲线需减去空白(对 照)。抗氧化剂曲线下的净面积与Trolox曲线下的净面积进行比较。曲线 下的净面积越大，样品中分子的抗氧化剂能力就越大。所有ORAC(fl) 分析都在COBAS FARA II离心分析仪(Roche Diagnostic System Inc.， Branchburg，NJ；激发波长＝493nm和发射滤波器(emission filter)＝515nm) 上进行。结果以每克样品的微摩尔Trolox当量形式给出。
测定抗氧化剂活性的方法。在操作中，本发明的ORAC(o)分析被 用来评价抗氧化剂组合物、组合和类似溶液，它们在与空气达到平衡的氧 存在下对抗目标分子(亚油酸)。加入自由基引发剂，测定氧消失所消耗 的时间以及形成的消耗率。Trolox被作为标准品使用，空白作为对照进行 操作。绘制溶解氧的量：时间曲线，并将曲线下的净面积进行直接对比。 一种具体的方法如下：缓冲液(K2HPO4(分子量174.2)，NaH2PO4(分子 量120.0))购自Sigma(St.Louis，MO)。亚油酸99％、Trolox(6-羟基 -2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸)97％、TWEEN20和2，2′-偶氮二(2- 甲基丙脒)二盐酸化物97％(AAPH)购自Aldrich(Milwaukee，WI)。 HPLC级丙酮购自Fisher(Hampbton，NH)。YSI 5300A生物氧测定仪购 自YSI(Yellow Springs，Ohio)，根据生产商的说明使用。
ORAC(o)方法。使用如下的储备溶液。制备磷酸盐缓冲液 (75Mm，pH7.4)；750mM K2HPO4(F.W.174.2)；称取65.33克放入500毫 升容量瓶中，加入dH2O至刻度。浓度为750mM。在配备有校准温度计的 冰箱(2至8℃)中存储750mM K2HPO4储备液。目标温度是4℃。750mM NaH2PO4(F.W.120.0)；称取45.00克放入500毫升容量瓶中，加入dH2O 至刻度。浓度为750mM。在配备有校准温度计的冰箱(2至8℃)中存储 750mM NaH2PO4储备液。目标温度是4℃。混合40毫升750Mm K2HPO4 存储液和10毫升750Mm NaH2PO4储备液(4比1的比例)。由此制成50 毫升ORAC存储缓冲液。在配备有校准温度计的冰箱(2至8℃)中存储 储备液。目标温度是4℃。用dH2O(1∶9)稀释混合物来制备ORAC缓 冲液的工作溶液，测量pH值。其pH值应为7.4。在室温下加盖保存备用。
制备吐温。称取10克吐温20，加入90克去离子水。加盖并搅拌混合 物过夜。吐温储备液保留一周，置于工作台面上。
制备溶剂。混合25毫升丙酮，25毫升去离子水和25毫升吐温20。 使用该溶剂制备样品。在进行操作之前，应特别留意膜，用探针检查破损， 如果需要就进行替换。探针应该带尖(tips)储存在去离子水中。该实验 中只能使用一个探针和一个反应室。每8个小时对空白和Trolox(10μg/ml 或0.03995μmol/ml)进行操作。样品在10μg/ml的浓度下进行操作。样品 浓度和Trolox浓度应该相同。
称取1毫克样品并加入1毫升用于进行最初提取的溶剂来制备稀释 液。振荡1小时，将0.5毫升的最初提取液置于玻璃闪烁管(scintillation vial) 中，然后加入4.5毫升的溶剂，制备第一稀释液。将第一稀释液漩涡振荡 约30秒。其浓度为0.1mg/ml或100ppm。取0.5毫升第一稀释液置于另一 个玻璃闪烁管中，然后加入4.5毫升的溶剂，漩涡振荡约30秒，其浓度为 0.01mg/ml或10ppm。取0.5毫升管中样品置于另一个玻璃闪烁管中，然 后加入4.5毫升的溶剂，漩涡振荡约30秒，其浓度为0.01mg/ml或10ppm。 将闪烁管置于4℃冰箱。在37℃水浴中使亚油酸解冻，通过向70.8毫克亚 油酸中加入0.18毫升吐温储备液、0.18毫升缓冲液以及0.44毫升去离子 水制备亚油酸溶液(避光)。用箔片包裹溶液管。每8小时制备新鲜的亚 油酸溶液。为了制备氧自由基产生剂，称取67.8毫克AAPH溶于0.9毫升 缓冲液中。保持AAPH冷冻使其可以在8小时后使用。振荡1小时。Trolox 溶液应该一直保持冷冻。为了开始测定抗氧化剂活性，向每个反应容器中 加入1.86毫升缓冲溶液，向37℃下的闪烁管中加入2.36毫升水，搅拌3 分钟至反应基质(matrix)达到所需温度。加入0.284毫升样品，将探针尖 (tip)放入到容器中，不要接触反应溶液，进行搅拌1分钟。上述测定最 好在不透光的环境中进行。
获得数据后，从反应室(chamber)移去探针，每个加入0.357毫升亚 油酸溶液，立即将替换的探针末端置于反应室(chamber)中。加入0.357 毫升AAPH溶液，将探针小心放入到溶液试管中，但要迅速以使反应区不 留下气泡，探针盒的防溢出突起(overflow ridge)上没有溶液。接着，将 探针放入溶液中进行读数。获取数据计算抗氧化剂活性。
在“三分之一溶剂(one-third solvent)”(也称为ORAC(o)溶剂体系) 中制备浓度为1mg/ml的样品。“三分之一溶剂”是等量的水、丙酮和 TWEEN20溶液用水稀释成1∶9。样品的振荡摇床上以280rpm、室温下 振荡1小时。样品溶液在进一步用“三分之一溶剂”稀释后(一般稀释到 10μg/ml)准备进行分析。也可以使用“三分之一溶剂”作为空白。
使用YSI 5300A生物氧测定仪进行ORAC(o)分析。通过向70.8毫 克亚油酸中加入0.18毫升75mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)，0.18毫升10 ％重量的TWEEN20储存液和0.44毫升去离子水来制备亚油酸。通过向 67.8mg的AAPH中加入0.9毫升缓冲液制备AAPH。在最终的反应体积 (5.218毫升)中，使用亚油酸(21.59mM)作为游离的自由基攻击的目 标，使用AAPH(19.00mM)作为过氧化氢自由基发生剂。Trolox(10μg/ml) 作为标准。每秒读取数据直至读数为零。
计算ORAC(o)值的公式(氧自由基吸收能力氧特定电极)是：
可选择的，当评价液体剂型时Trolox可以以微升计算。已知这种计 算得到的数值是以每克样品的Trolox当量的微摩尔数表示。负的ORAC (o)值反映出与空白获得的自由基清除活性相比较低的自由基清除活性， 这表明组合物是促氧化剂，例如促进氧化的试剂，而不作为抗氧化剂发挥 作用。ORAC(o)分析是假设氧不被吸收或者样品不释放氧，当然，可以 评价对样品氧水平的任何影响并用来补偿计算出的抗氧化剂值。
ORAC(o)和ORAC(fl)分析参数的比较。经比较ORAC(o)与 ORAC(fl)相比的优势是对抗氧化剂潜能的直接测定，而不是间接测量。 ORAC(fl)是一种间接检测氧自由基的方法，因为它依赖于荧光素(目标 分子)是唯一的被检测的荧光成分的假设。然而，许多抗氧化剂化合物自 然发出荧光(例如蓝莓(blueberry))；并且自由基-自由基反应中的这些 化合物的组合也发出荧光。因此，样品的荧光与基于荧光的分析结果不一 致。另一方面，ORAC(o)方法是一种直接测定氧吸收，即直接测定氧消 失成为自由基的方法。这种测定抗氧化剂能力的方法不依赖于氧是否附着 于水溶或脂溶成分。表1提供了ORAC(fl)和ORAC(o)方法分析参数 的比较。
表1：ORAC(fl)与ORAC(o)的分析参数比较
试验中的分析 参数 ORAC(fl) ORAC(o) 温度 37℃ 37℃ AAPH浓度 磷酸缓冲液中，1.28x10-2M 磷酸缓冲液中，19.00mM 目标分子浓度 荧光素，磷酸缓冲液中， 43.8nM 21.59mM亚油酸，在10％TWEEN20、缓 冲液和水(0.18毫升，0.18毫升，0.44毫 升)的混合物中 样品浓度 初始时20毫升中含有 500mg，将上清液用缓冲液稀 释至10μg/ml 初始时为1mg/ml，稀释至10μg/ml 样品溶剂 丙酮/水，用磷酸缓冲液稀释 至50/50(v/v) 水/丙酮/10％重量的TW EEN20，v/v/v (“三分之一”溶剂)，以“三分之一”溶 剂稀释 分析用缓冲 液，浓度 75mM磷酸盐，pH7.4 75mM磷酸盐，pH7.4 最终的分析体 积 400μl 5.218ml 空白(对照) 缓冲液 “三分之一”溶剂 标准 缓冲液中62.5μMTrolox “三分之一”溶剂中10μg/ml Trolox (38.7550μM 测定样品抗氧 化剂能力的方 法 荧光素被自由基氧化时产生 的荧光减少，抗氧化剂保护 和延迟降低 氧被自由基引发剂、亚油酸碳自由基占 据；抗氧化剂保护和减少氧的吸收
本发明一个明显的优势是使用者不需要学习新技术或购买设备用来将现 在的设备和方法引进他们的实验室环境中。例如，当测量样品饱和度时，本 发明使用与由例如Ou等开发的成熟的间接测量体系中许多相同的缓冲液、 条件、提取和/或分离步骤。Ou等在丙酮/水(50∶50，v/v)中制备每20毫 升500mg浓度的样品，在旋转振荡器(rotary shaker)上以400rpm速度旋转 1小时，以14,000rpm离心15分钟，用pH7.4的75mM磷酸钾缓冲液稀释(Ou 等，利用随机甲基化的β-环糊精作为增溶剂测定亲脂性抗氧化剂的氧自由基 吸收能力试验的发展和确认(Development and Validation of Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay for Lipophilic Antioxidants Using Randomly Methylated-β-Cyclodextrin as the Solubility Enhancer)，J.Agric.Food Chem.2002，50，1815-1821)。本发明人发现在Ou的条件下(ORAC(fl)条件)， 很多待测样品不会进入溶液，更易溶的组分代替了不易溶的组分。结果，只 有在ORAC(fl)条件下溶解的部分样品才被包括在ORAC(fl)样品中并被测 定。因此，根据ORAC(fl)分析方法制备的上清液不可能代表实际样品的总 抗氧化剂活性。因为ORAC(fl)缓冲液中的样品溶液并不总是反映样品的含 量，所以使用ORAC(fl)得到的结果是有偏差的。
已经意识到样品不溶的问题，并且当采用ORAC(fl)时，观察到混合生育 酚对以槲皮素和混合生育酚的混合物进行的抗氧化剂测定缺少贡献。如图7 所述，利用ORAC(o)体系，与10μg/ml的单独的每种组分相比，发现了5μg/ml 槲皮素和5μg/ml混合生育酚的组合的抗氧化剂效果。相反地，间接的 ORAC(fl)体系显示相对于单独的槲皮素的数值，同样的组合没有进一步的效 果(见图11)。由于样品的浓度是更低并且样品的溶剂含有溶解样品的所有 成分的丙酮、水和去污剂，ORAC(o)方法中不存在这种含有混合生育酚的组 合的活性缺失和饱和度问题。样品溶剂中含有TWEEN20促成了混合生育 酚的活性检测。Trolox活性作为对照，图7显示了5μg/ml槲皮素和5μg/ml 混合生育酚的组合与单独的10μg/ml的每种组分对比的情况，而且包括 Trolox对照，表明ORAC(o)随时间检测样品中残留的氧自由基水平的能力。
与更昂贵的ORAC(fl)(自动式约250,000美元；非自动式约50,000美元)) 相比，ORAC(o)明显更节省。相反地，在此披露的ORAC(o)设备利用了现成 的氧传感器系统，所述氧传感器系统易于小型化和/或自动化，这样可以针对 商用开发出用于诊室甚至是家庭且其价格仅为大性荧光检测系统成本的一 部分的系统。根据公职分析化学工作者协会(AOAC)的关于单一实验室验 证的准则进行验证，结果见表2、3和4。
表2为期5天的精密度实验(重现性)
曲线下面积(AUC) 第1天 第2天 第3天 第4天 202.65544793963 212.901122995373 187.01466464995 202.856617129109
第5天(第二次分析) 五天的平均值 标准偏差 相对标准偏差 HORRAT值 213.124092629655 203.710389068730 10.649840914564 5.23％ 1.981060606061
每天的数值是浓度为10μg/ml的槲皮素样品进行3次实验的平均值。 HORRAT值是观察到的RSDR值与由本领域技术人员已知的Horwitz方程式 测算的RSDR值的比值，其被认为是在考察方法的精确度时，对方法的可接 受性的表征。在一项单独的实验效能研究中，一系列介于0.5和2.0之间的 HORRAT比率表明方法的精密度是可以接受的。为期5天实验的HORRAT 值是1.98。表3提供了作为线性范围的分析范围的测定值。
表3分析范围的确定
样品(μg/ml) 曲线下面积 1 124.567114093960 10 209.388111888112 100 693.611111111111 500 2327.96518987343 1000 2870.09540636041
y＝2.8335x+332.16；R2＝0.9231针对1-1000的点
y＝4.3353x+176.66；R2＝0.9967针对0-500的点
当样品浓度接近1000μg/ml时，线性完整性开始下降。测定作为线性范 围的分析范围的同时对可变浓度高达500μg/ml的曲线下面积值进行测定。
表4提供了单日结果精密度的结果。
表4单日精密度实验(重现性)
曲线下面积 第1次实验 207.369402985075 第2次实验 198.18118466899 第3次实验 205.035211267606 第4次实验 201.586572438162 第5次实验 202.110714285714
5次实验的平均值 202.856617129109 标准偏差 3.505016471434 相对标准偏差 1.73％ HORRAT值 0.654480870834
单日精密度实验包括对浓度为10μg/ml的槲皮素进行5次单独的实验。 表4中ORAC(o)方法的HORRAT值是0.65448。ORAC(o)分析被用于优化 实施例2提出的抗氧化剂组合物中各组分的比例。一种组合物的实施方案具 有以下重量比例：49.18％槲皮素；32.79％混合生育酚；9.84％葡萄皮提取物； 6.56％绿茶提取物；以及1.64％李树灌木(bush plum)，采用每克17,254微 摩尔Trolox当量的ORAC(o)得出了抗氧化剂值。采用每克5,281微摩尔 Trolox当量的ORAC(fl)得出了相同组合物的抗氧化剂值。这些数据表明测 定抗氧化剂活性的ORAC(o)和ORAC(fl)方法获得的结果因为间接ORAC(fl) 方法的局限性而不同。
实施例2：具有协同效应的抗氧化组合物。
根据本发明的膳食添加剂，将五种组分组合成抗氧化剂组合物，其中每 种组分都是在世界各地长寿人群的饮食中有特色的。本发明人根据对已知的 长寿区域的饮食的全面研究来选择组分。本发明人意识到这些区域的饮食中 富含黄酮醇和生育酚。发明人进一步意识到某些天然化合物与能够活化其抗 氧化剂活性的分子例如维生素C积极地相互作用。事实上，大量研究证实了 维生素C在例如α-生育酚的再生中的作用(Pizzorno和Murray，Textbook of Natural Medicine，1999，2ndEd.New York，Churchill Livingston)。
基于这种研究，本发明人将分离和纯化的天然提取物和其它原料组合成 制剂，其它原料包括高含量的来自不同的各种长寿人群居住区域的生物可利 用化合物。本发明的一个实施例中，选择如下的基本组分：黄酮醇、混合生 育酚、葡萄皮提取物、绿茶提取物或者厄瓜多尔的Vilcabamba的Andean村、 克什米尔喀喇昆仑地区的洪扎(Huza)地区、或者前苏联的格鲁吉亚共和国 的阿布哈西亚地区居民饮食中有特色的李树灌木，例如Leaf A.，Launois J 中所引述的：“A Scientist Visits Some ofthe World’s Oldest People，”National Geographic.1973年1月；意大利的撒丁岛(Koenig R.“Sardinia’s Mysterious Male Methuselahs，”Science.2001年3月16日)，以及澳大利亚人的居民饮 食中有特色的李树灌木(bush plum)。
本发明的组合物显示了协同的抗氧化剂活性。不希望被理论束缚，抗氧 化剂组合物的各种组分具有保护细胞内胞浆、细胞膜和细胞外流体的活性， 并因此保护整个身体。李树灌木(bush plum)成分中例如天然维生素C的 含量很高，其可以进入细胞并且是亲水的，可以用来保护胞浆；葡萄皮提取 物和绿茶提取物是亲水的，不能进入细胞，用来保护细胞外流体；混合生育 酚是亲脂的，与既亲水又亲脂的黄酮醇(例如槲皮素)一起保护膜。此外， 任何在饮食中或甚至是在膳食添加剂本身中包含的纤维可以提供充足的清 除载体。
协同效应的抗氧化剂组合物的组分。鉴于本发明的ORAC(o)设备和方法 的有效性，本发明人可以测定亲脂性和疏脂性抗氧化剂以及其它有助于增强 这些试剂抗氧化剂活性的试剂，例如维生素C等的组合的总抗氧化剂活性。 利用ORAC(o)系统，开发了包含黄酮类例如槲皮素、至少两种形式的维生素 E混合物以及任选的葡萄皮提取物、绿茶提取物和澳大利亚李树灌木(bush plum)的具有协同效应活性的抗氧化剂组合物。当槲皮素和维生素E形式的 混合物的重量比例为40/60到90/10％时观察到特别的协同效应。一个组合物 的实施方案包括如下的重量比例：49.18％槲皮素；32.79％混合生育酚；9.84 ％的葡萄皮提取物；6.56％的绿茶提取物；以及1.64％李树灌木(bush plum)。
图6显示了槲皮素、混合生育酚、生育酚和槲皮素的混合物以及合成的 抗氧化标准品Trolox(Hoffman-La Roche)的ORAC(o)分析结果的比较。
黄酮类例如槲皮素。组合物中的黄酮类可以是黄酮、黄酮醇、异黄酮、 异黄酮醇及其类似物、药学上可接受的盐或其混合物。黄酮醇的例子包括槲 皮素，山奈酚和杨梅黄酮。组合物中包括的特定的黄酮类或黄酮类似物或盐 通过进行ORAC(o)抗氧化剂测定来确定。被考虑的类似物提供了槲皮素活性 的80％以内的活性。涉及黄酮类，特别是槲皮素，也指其糖苷配基或糖苷， 其中糖例如是阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖或葡萄糖。已知槲皮素的鼠李糖糖 苷是芦丁或槲皮苷(quercetrin)，已知杨梅黄酮的鼠李糖苷为杨梅苷。槲皮 素的类似物包括那些包含在一个或多个3、5、7、3′和4′位点上除了-OH基 团以外的取代基的化合物。其它取代基包括：少于5个碳原子的烷基、乙酰 基、巯基(sulphyl)或丙二酰基。对于槲皮素类似物来说，仅仅一个或两个 位置被除-OH基团以外的任意基团取代。
黄酮类例如槲皮素可以在体外容易地合成。然而，黄酮类(包括槲皮素) 是现存的，可以从例如天然生成的食物，特别是水果和蔬菜，例如苹果、梨、 葡萄、洋葱、红葡萄酒、甜椒、红醋栗(red currant)、黑加仑(red currant)、 柠檬、樱桃、曼越橘、醋栗、西红柿、橄榄、萝卜、甘蓝、马铃薯和芦笋中 分离和纯化。槲皮素可以从Pharmline(Florida，NY)获得。
李树灌木(bush plum)：澳大利亚李树灌木(bush plum)(Terminalia ferdinandiana)含有约5％维生素C和HPLC色谱显示的多种成分(未显示 数据)。确信这些组分中包括黄酮和类黄酮。HPLC色谱形成条件：采用0.1 ％三氟乙酸和100％甲醇的梯度浓度的反相C18柱，流速为1毫升/分钟，使 用甲醇和水提取的李树灌木(bush plum)粉样品。摸索分离类黄酮和分离维 生素C的条件。在245nm下测定吸光率。
从李树灌木(bush plum)的果实种子中除去果肉和果皮，用水制备成浆。 将浆冷冻干燥并研磨。对于这里的抗氧化剂组合物来说，称量所需量的冷冻 干燥原料。李树灌木(bush plum)在本发明组合物中存在的量是0％到87.9 ％，或在其它的实施方案中，约为2％重量。
葡萄皮提取物。葡萄皮提取物由葡萄皮制得，其中含30-82％多酚并且可 以从Polyphenolics，Madera，CA；Human Kinglong，Bio-Resource Co.Ltd； Changsha Economic Development Zone，China或从Pharmline，Florida，NY 获得。
绿茶提取物。绿茶提取物是Camellia sinensis的叶子的提取物，含有35-95 ％多酚，可以从Amax NutraSource Inc.，Eugene，OR；Blue California，Rancho Santa Margarita，CA；或从PL Thomas&Co.，Morristown，N.J.获得。
其它成分。本发明的抗氧化剂组合物包括一种或多种无毒的药学上可接 受的载体，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸 氢钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇、环糊精、环糊精衍生物等。采用一种或多 种上述载体可以容易地制备胶囊或片剂，并且可以使其易于吞咽或咀嚼。片 剂可以包含适合的载体、粘结剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、矫味 剂、助流剂(flow-inducing agent)或融化剂(melting agent)。可以通过任选 与一种或多种其它的成分一起压片或成型来制备片剂。通过将自由流动形式 (例如粉状，颗粒)的活性组分任选地与粘结剂(例如凝胶、羟丙甲基纤维 素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如乙醇酸淀粉钠、交联羧 甲基纤维素)、表面活性剂或分散剂混合并压片来制备压制片。适合的粘结 剂包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成 胶如阿拉伯胶(acacia)、黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素，聚乙二醇或蜡等。 这些制剂形式中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、 醋酸钠或氯化钠等。崩解剂包括，例如淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土或 黄原胶等。成型片剂可以通过在适当的机器中对用惰性液体稀释剂润湿的粉 状活性组分进行成型而制备。
胶囊或片剂可以任选被包衣或刻痕(scored)，并可以被制成提供缓慢或 控制释放的抗氧化剂组合物制剂。用于试剂控制释放的随时间释放的组合物 一般含有试剂颗粒，所述试剂颗粒与在特定时间内能对抗肠降解和崩解的材 料混合或被该材料包衣。试剂可以通过浸滤(leeching)、腐蚀、破裂、分散 或类似方式释放。
载体可以提高抗氧化剂的稳定性也可以提供延时释放。被称为 AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)的植物碳水化合物混合物可以与 抗氧化剂组合物组合。这样的组合延长了抗氧化剂组合物的保存期限并提供 了延时释放的形式。AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)包含重量/重 量比例约为30/30/20/19/1的阿拉伯树胶(阿拉伯胶)、黄原胶、黄蓍胶，达 瓦树胶，(可以从TicGum获得)以及芦荟凝胶提取物(例如叶内凝胶(inner leafgel)，Carrington Labs，Irving，TX，MANAPOL粉或类似产品)。 AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)与本发明的抗氧化剂组合物以2∶1 到1∶2的重量比例混合。在另一个实施方案中，AMBROTOSE植物配方 (Phyto Formula)与抗氧化剂组合物以2∶1的重量比例混合。
根据特定的剂型，胶囊或片剂可以进一步含有重量百分比小于约0.1％到 90％的植物组分。对于载体而言，载体本身通常对组合物的营养上的重要性 没有影响，然而，这些载体可以对本发明营养上有效量的释放的持续时间、 释放位置和释放曲线有显著影响。例如，本发明的一种或多种抗氧化剂可以 在一种或多种大药丸(boluses)中释放，以便在一系列释放过程中实现例如 血或尿中检测到的抗氧化剂水平的峰值。在另一个实施方案中，抗氧化剂可 以有一些均匀的释放，或甚至可以随血或尿水平达到峰值以梯度方式提供。 事实上，本发明甚至可以包括疏脂性和亲脂性抗氧化剂在消化过程的不同时 间和/或位置上的释放。例如，可以以泡腾剂载体中提供抗氧化剂以使其立即 释放，同时提供的不同的抗氧化剂通过例如胃酸或在肠道释放。
制剂过程。配制碾压的抗氧化剂组合物的过程包括将AMBROTOSE植 物配方(Phyto Formula)与在此提出的抗氧化剂组合物混合。将得到的混合 物转移到碾压器中，在滚筒之间碾压形成压实体。混合时施加的压力增强了 组分间的物理粘合力。随后将压实体研磨成颗粒。然后将颗粒制成希望的剂 型，例如胶囊或片剂。在一个实施例中，Fitzpatrick Chilsonator Model 4LX10D 碾压器可以与跨表面和垂直于滚动面上有刻痕的滚筒一起使用，具有10吨 的固定压力，约0.093的Fitzmill屏。碾压装置可以具有可变的旋转速度、 施力(force application)和缺口宽度容量(gap width capability)，例如Gerteis Polygran干式碾压系统(Gerteis，Germany)。碾压器通过在两个反向旋转的 滚筒间传递混合物，并均一地向混合物施加压力而发挥作用。通过滚筒施加 到混合物上的压力将混合物压成压实体，例如片状或带状，典型地将其研磨 成颗粒。可供选择地，通过腾涌、研磨或根据需要筛分来获得颗粒。选择具 有20#-80#目的颗粒。
碾压后的抗氧化剂组合物与AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula) 的组合具有更长的保存期限，被认为是归因于暴露于氧气中的抗氧化剂组合 物的表面积减少。碾压后的组合还消除了胶囊或片剂制备过程中对赋形剂、 填充剂的需求。本发明提出的抗氧化剂组合物与AMBROTOSE植物配方 (Phyto Formula)的组合的其它优势包括：提供了作为肠道中未配对电子储 库的不溶性纤维，提供了用于调整细胞糖型(glycoform)的结构的单糖，所 述糖型对于在自由基损伤的细胞修复中细胞介导的信息传递很重要。
剂量。用于本发明组合物的给予的有效剂量制剂包括100、200、300、 400、500、600、700、800、900或1000毫克抗氧化剂组合物的胶囊或片剂。 在一个实施方案中，组合物中不添加填充剂、载体或稳定剂。在另一个实施 方案中，AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)与本发明的抗氧化剂组 合物以2∶1、1∶1或1∶2的重量比混合。在另一个实施方案中，AMBROTOSE 植物配方(Phyto Formula)与本发明抗氧化剂组合物以2∶1的重量比混合。 在另一个实施方案中，胶囊或片剂提供混合的500毫克的抗氧化剂组合物和 AMBROTOSE植物配方(Phyto Formula)。对于这个实施方案，每天可以服 用两片或两粒胶囊。适当的包衣可以用来提高适口性或延迟吸收。
图8和图9显示了利用测定抗氧化能力的ORAC(o)方法获得的不同比 例的槲皮素和混合生育酚的曲线下净面积(AUC)结果。针对每个被分析的 百分含量，样品(Q+MT)的总浓度是10μg/ml。例如，槲皮素的含量为0 ％时，混合生育酚的浓度是10μg/ml，样品中没有槲皮素。槲皮素的含量为 10％时，样品中含有1μg/ml槲皮素和9μg/ml混合生育酚。槲皮素的含量为 20％时，样品中含有2μg/ml槲皮素和8μg/ml混合生育酚。槲皮素的含量介 于40-100％之间时很容易观察到协同作用，槲皮素的含量为40-90％时最 容易观察到协同作用。直线代表叠加作用，例如槲皮素的含量为10％，直线 代表90％单独的混合生育酚的活性与10％单独槲皮素的活性的加和。在该 线以上存在协同作用。
本发明组合物最主要的抗氧化组分(以槲皮素代表的类黄酮，以及至少 两种形式的维生素E的混合物)包括从12.1％到100％，30％到85％，或者 在其它实施方案中重量百分比为约82％的五种组分。在一个实施方案中，在 五种组分的总重量中，槲皮素的量是49.18％，维生素E形式的量是32.79 ％。
本发明的组合物包括第二种组分(或增效剂)(葡萄皮提取物、绿茶提取 物和李树灌木(bush plum))，占五种组分重量的0％到87.9％，15％到70 ％，或约18％。如图10所示，在49.18％槲皮素、32.79％混合生育酚和1.64 ％李树灌木(bush plum)存在下，测定葡萄皮提取物和绿茶提取物最佳的比 例。葡萄皮提取物与绿茶提取物的最佳比例是60/40到80/20。在一个实施 方案中，在抗氧化剂组合物的总重量中，葡萄皮提取物是9.84％，绿茶提取 物是6.56％。作为组合物的组分提供的李树灌木(bush plum)(Terminalia ferdinandiana)的量在约0％到87.9％之间，或者在另一个实施方案中的量 是约2％。在图10的实施方案中，李树灌木(bush plum)占组合物的1.64 ％。
ORAC(o)分析显示具有如下重量比例的抗氧化混合物：49.18％槲皮素； 32.79％混合生育酚；9.84％葡萄皮提取物；6.56％绿茶提取物和1.64％李树 灌木(bush plum)，其具有每克17,254微摩尔Trolox当量的抗氧化剂活性。
AMBROTOSE AO的稳定性。AMBROTOSE AO，是AMBROTOSE (Mannatech，USA)与本发明的抗氧化制剂以2∶1重量比例的混合物，其已 经显示出在加速的稳定条件下(40℃，75％的相对湿度)在相当于约6个月 保存期限内保持活性。
通过与ORAC(fl)分析比较对ORAC(o)分析进行确认。图11是ORAC (fl)结果的图，其显示出当α-生育酚以不同比例与槲皮素混合时，其对 AO活性没有贡献。该图显示了在标准的丙酮∶水溶液中进行的ORAC(fl) 分析中，随着槲皮素浓度的升高而AUC直接地成比例升高，呈线性增加。 α-生育酚对AO活性没有贡献可能归因于其无法溶解于丙酮∶水溶液中。
图12A和12B图示了利用混合生育酚获得的ORAC(fl-lipo)结果，利 用溶剂/水/去污剂溶液溶解样品以及同时检测亲脂性和疏脂性抗氧化能力得 到的AUC结果。图11(上述)显示，利用标准的ORAC(fl)方法检测亲 脂性AOs对AO的贡献时，没有检测到α-生育酚具有任何统计学意义上的 显著活性。如图12A所述，以α-生育酚的ORAC(fl-lipo)AUC为标准， 在已公开的ORAC(fl-lipo)方法(丙酮∶水)和丙酮∶水∶吐温-20之间进 行比较，检测到ORAC(fl-lipo)分析的AUC有大幅度的增加。图12B显 示采用已知的ORAC(fl-lipo)方法，没有检测到槲皮素和混合生育酚组合 的协同作用，其结果为一条穿过横坐标的直线，表明采用该分析方法没有显 示协同作用。
基于对文献及其推荐的方法的研究，用已知的分析方法获得的这些结果 并不令人感到奇怪。目前用于评价所谓“高ORAC食品”的标准(参见，例 如，www.ars.usda.gov)表明该标准是用于测定与疏脂性抗氧化剂的潜能， 与测定亲脂性抗氧化剂是分开和独立的。本发明消除了这种对二分法的需 求，研究者已经观察到当把试管ORAC值与对血清ORAC值的影响联系起 来时，二分法可能会导致隔离状态。当测定血清的抗氧化剂作用时，与ORAC (fl)评价进行对比，美国农业部农业研究院(Agricultural Research Service of the USDA)发现，例如在试管ORAC分析中，菠菜的得分低于草莓，但是 菠菜对血清ORAC的影响要大于草莓。采用本发明和在此描述的组合物，本 发明人通过开发一种使不同溶解性的抗氧化剂之间相互作用，从而更好地反 映抗氧化剂在人体中的活性的体系来改变所述隔离状态。间接的ORAC(fl) 和/或ORAC(fl-lipo)方法无法测定总的抗氧化剂活性，也无法检测某些食 品的协同效应。
图13是利用α-生育酚的ORAC(fl)AUC结果的图，其中显示了去污 剂用量的变化对AUC测定的影响。在该项分析中，以完全的三分之一以及 其与少量吐温-20的混合物形式使用“三分之一”溶剂。图14是抗氧化剂活 性的ORAC(fl)分析的图，经测定的该抗氧化剂活性是溶解在两种不同比 例的溶剂∶水∶去污剂混合物中固定比例的槲皮素：α-生育酚的抗氧化剂 活性。图13和14的结果显示，去污剂(吐温20)确实使AUC增加，并且 也显示了与标准的丙酮∶水混合物相比，检测的ORAC(fl)活性是增加的。
实施例3抗氧化剂协同作用和增效作用的ORAC(o)检测
为了显示ORAC(o)分析能够同时检测亲脂性和疏脂性抗氧化剂活性， 进行一系列研究，表明已知浓度的亲脂性和疏脂性抗氧化剂的特定组合的效 果，以及与单独的葡萄皮提取物和绿茶提取物相比，加入例如葡萄皮提取物 和绿茶提取物的同样的组合的增效作用。图15是显示由不同比例的槲皮素 和混合生育酚获得的ORAC(o)值的图。图16是显示用不同比例的葡萄籽 提取物(GES)和绿茶提取物(GTE)的ORAC(o)值的图。在确定GSE 和GTE具有抗氧化剂活性的最大比例后，两者与优选比例的槲皮素和混合 生育酚组合。图17是显示具有最高的槲皮素：混合生育酚和葡萄籽提取物 以及绿茶提取物比例的组合的ORAC(o)值的图。发现组合的槲皮素和混 合生育酚、GSE、GTE使添加剂的抗氧化剂潜力最大化。
实施例4：AMBROTOSE AO对少量健康个人的抗氧化剂效果，开放的 标记研究，没有安慰剂作为对比。
抗氧化剂被定义为任何能够延迟或防止生物基质氧化的物质。富含含有 抗氧化剂的水果和蔬菜的饮食已经与被认为是由氧化应激造成的病理状况 的发生率降低有联系。然而，添加彼此分离的抗氧化化合物已经被证实在一 些情况下无助于改善健康，在其它情况下还是危险的1，3，4。已经有建议称大 量摄取水果和蔬菜带来的益处不仅仅是单一抗氧化剂的效果，而且还是存在 于这些食品中的不同抗氧化剂的组合的协同作用效果5，6。对于单一抗氧化 剂的关注可能是科学家们使用营养添加剂还没有复制出富含抗氧化剂饮食7 的保护效果的原因。
最近的研究表明糖营养素(glyconutritional，GN)补充剂、营养补充剂 提供维持细胞信号传输和免疫功能的糖，其具有体外和体内的抗氧化剂性 质。在含有GN添加剂的培养基中生长的大鼠肝细胞相对于对照显示出高水 平的还原性谷胱甘肽，因此表明提高了抗氧化剂保护8。
先导(pilot)临床实验研究表明在消耗GN补充剂的人群中，氧化应激 的生物标记减少和氧化防御的生物标记增加。随着日常饮食中每天添加2gr GN补充剂，在76天内观察到总的铁结合能力和叶酸的显著提高，铜/血浆 铜蓝蛋白比例显著降低。观察到的趋势还显示血清alkenals、高半胱氨酸、 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和总胆固醇减少以及氧自由基吸收能力 (ORACβ-PE)提高。
近期研究表明大多数营养物(一些是已知的，其它还没有被确认)赋予 水果和蔬菜抗氧化剂活性10，11，12，13，14。一些已知的有益抗氧化剂包括多酚 和维生素C和E6。某些食物和饮料，包括葡萄(和红葡萄酒)、绿茶和澳大 利亚李树灌木(bush plum)(Terminalia ferdinandiana)含有相对高含量的上 述抗氧化剂6，15，16。该研究测量了由GN补充剂与绿茶、葡萄、混合生育酚、 槲皮素和澳大利亚李树灌木(bush plum)混合物的组合而成的新型营养补充 剂所提供的抗氧化剂保护。
方法：血样由Cover-Tek，Inc.，Dallas，TX采集。所有的血样和尿样由 Genox Corporation，Baltimore，MD分析，并且所有统计分析由Decision Analyst，Arlington，TX来进行。
已经公开了许多测试样品抗氧化剂潜力的方法17。本研究中使用的测试 是对全血清ORACβ-PE的测定。该方法使用β-藻红蛋白，一种荧光探针来确 定血清样品抗氧化剂清除能力，特别是抗过氧化氢自由基的能力，并与已知 标准品Trolox对比。结果以每克微摩尔Trolox当量(TE)来表示18。用于 该项研究的其它标准化分析技术是测定尿脂质过氧化氢物和alkenals(其间 接地涉及自由基对脂质损伤的量)、尿8-OHdG(间接地涉及DNA损伤)19，20，21。
该项研究中使用的抗氧化剂营养补充剂AMBROTOSE AO是利用在体 外对组分的评价而开发的：槲皮素、混合生育酚、葡萄提取物、绿茶提取物 和澳大利亚李树。采用标准的ORACfl方法测定每种组分的体外抗氧化剂值 (使用不同的荧光探针，荧光素)。采用新开发的直接测定溶解氧的ORACo 方法测定组分混合物的抗氧化剂值。由于脂溶性和水溶性抗氧化剂在体内的 作用是一致的，同时测定脂溶性和水溶化合物的贡献和相互作用ORACo是 对以荧光为基础的方法(ORACfl、ORACfl-lipo和ORACβ-PE)的改善。这些方 法，最好单独测定脂溶性或水溶化合物的活性。因此，ORACo更加精确测定 了对水溶性和脂溶性组分的混合物的体外总抗氧化剂活性。将水溶性和脂溶 性组分组合，用ORACo评价来确定混合物最大协同效应和体外最佳的 ORACo值。
随后将混合物与Ambrotose复合物以1∶2比例一起碾压制得Ambrotose AO。Ambrotose中的许多天然胶已经被用来控制化合物的释放以提供持续 的输送。使用标准化实验设计该项研究来确定体内不同量的Ambrotose AO 的抗氧化剂活性，通过血清ORACβ-PE直接确定，通过尿脂质过氧化氢、alkenal 和8-OhdG分析间接确定。Prior和Cao最近建议一组实验而不是任何一个单 独实验是必需的，因为某些病理条件，例如肾衰竭，可以改变任何一个与氧 化应激毫不相关的实验22。
所有参与者都被告知并同意。登记了十二名健康男性和女性成年志愿者 不摄取营养补充剂或任何会干扰研究的药物。研究的受试者为年龄在22-61 岁的四名男性和8名女性，他们消耗增加用量的抗氧化剂补充剂。为了评价 ORACβ-PE随时间的变化以及验证实验结果的重复性，从其它没有摄取补充剂 的受试者中收集血样和尿样。在研究中，参与者继续他们正常的研究以前的 每日作息和饮食。表5提供了研究受试者的信息。
表5 人类志愿者的特征 受试者 性别 年龄 吸烟史 1 F 33 是 2 M 41 否 3 F 34 否 4 F 61 是 5 F 44 是 6 M 22 否 7 F 36 否 8 M 23 否 9 F 38 是 10 F 56 否 11 F 53 否 12 M 31 是
在最初的不使用补充剂的为期两周清除期(washout period)后，对12 名研究受试者进行早晨禁食后的血清ORACβ-PE和尿分析，在两周末增加每 个人的抗氧化剂添加剂用量。在应用添加剂的最初14天(周期1)中，每天 使用的添加剂的量是500毫克(1个胶囊)，在第二个14天期间(周期2) 中，每天使用的添加剂的量是1.0克(2个胶囊)，在第三个14天期间(周 期3)中，每天使用的添加剂的量是1.5克(3个胶囊)。此外，对没有食用 添加剂的个人的血样和尿样进行三次分析以验证分析的精密性。血样和尿样 通过独立的抽血者进行采集，迅速用干冰包装并且转移到一家当地医院的实 验室进行处理。然后经处理的血样和尿样在干冰中连夜船运(shipped)至 Genox，根据Genox的方法进行独立的分析23。然后，所有样品用干冰储存 在Genox，在完成研究的同时进行ORACβ-PE和尿的测定以使任何分析试剂 的可变性最小化。
结果：相对于基线数值的ORAC值和百分比含量变化。表6中给出了十 二名摄取Ambrotose AO的参与者相对于基线的ORACβ-PE值和百分比含量 变化。“基线”表示经2周清除后，周期1表示摄取500毫克两周后，周期2 表示摄取1.0克两周后，周期3表示摄取1.5克的两周后的数值。某些周期2 中的样品的血清瓶标签在船运至Genox期间脱落。ORACβ-PE值只能特别地 归属于该周期的3名研究参与者，不能归属于其余的研究参与者或者其它非 参与研究的人。
表6相对于基线的ORAC值和百分比含量变化
ORAC 相对于基线的变化％ 受试者 基线 周期1 周期2* 周期3 周期1 周期2 周期3 1 3300.3 5709.4 3117.8 73.0％ -5.5％ 2 3754.5 4618.6 6731.8 6189.0 23.0％ 79.3％ 64.8％ 3 3695.0 3867.9 3995.7 4.7％ 8.1％ 4 3954.3 3199.1 2703.8 -19.1％ -31.6％ 5 3107.3 3295.2 4476.2 6.0％ 44.1％ 6 3313.0 5073.8 3156.6 53.1％ -4.7％ 7 3785.5 5069.9 4390.4 33.9％ 16.0％ 8 3341.2 4207.7 4003.2 25.9％ 19.8％ 9 7568.9 6053.2 8977.6 7734.1 -20.0％ 18.6％ 2.2％ 10 4271.8 6132.5 6765.0 43.6％ 58.4％ 11 5619.2 6527.0 6420.0 6844.3 16.2％ 14.3％ 21.8％ 12 5642.9 5025.4 4398.7 -10.9％ -22.0％
原始ORAC数据的统计分析。进行重复的ANOVA测定来确定基线、周 期1、周期2和周期3的原始ORAC数据之间是否存在差异。所有周期之间 全部(F(3，24)＝4.02，p＝0.20)存在显著差异。由此，分析表明周期2与基线 明显不同(t(24)＝-3.47，p＝.002)。周期1和周期2明显不同(t(24) ＝-2.77，p＝.011)。周期2明显不同于周期3(t(24)＝2.87，p＝.009)。
每个时间周期的平均值显示于表7。
表7每个时间周期的平均ORACβ-PE值 受试者时间周期数 ORAC平均分值 基线 12 4279.5 847.9 周期1 12 4898.3 699.1 周期2 3 7376.5 3466.6 周期3 12 4814.6 1053.1
相对于基线ORAC数据的百分比含量变化的统计分析。与上述分析报告 (表6)中使用的原始数据相比，该分析检验了时间周期之间的差异，该差 异是以相对于基线的百分比含量变化来表示。进行重复的ANOVA测定来判 断相对于周期1、周期2和周期3的ORAC数据的基线的百分比含量变化之 间的差异。综合实验表明根本没有出现差异(F(2，13)＝0.71，p＝0.510)。此外， 据此的分析表明周期之间没有显著差异。表8显示了每个时间周期的平均值。
表8相对于时间周期基线的ORACβ-PE百分比含量的变化 时间周期 受试者数量 百分比含量变化平均值 ORAC分值± 周期1 12 19.1％ 18.1％ 周期2 3 37.4％ 90.3％ 周期3 12 14.3％ 19.0％
表9概括了脂质过氧化氢的平均值、总alkenal和8-OHdG值。它们被用 于校正尿浓度的变化，这种变化是根据在相同时间下测定相同样品的尿肌氨 酸酐来区分的。
表9每2周时间周期内尿生物标记的平均值 时间周期 受试者数量 过氧化氢/肌氨酸酐 μM/(mg/dl) alkenal/肌氨酸酐 μM/(mg/dl) 8-OhdG/肌氨酸酐 (mg/ml)/(mg/dl) 基线 12 0.0920 0.0761 0.0724 周期1 12 0.0808 0.0808 0.0861
周期2 12 0.0782 0.0835 0.0740 周期4 12 0.0764 0.0806 0.1025
空气质量。已知空气质量影响氧化应激(oxidative stress)。普通污染物 例如臭氧和二氧化氮的浓度升高会降低空气质量。这造成了更大的生成 ROS.24，25的潜力。表6中显示了美国环境保护局(U.S.Environmental ProtectionAgent，EPA)每两周时间对Dallas/Fort Worth(DFW)地区的受试 者居住地的平均空气质量指数的总结。EPA用颜色对地区空气质量图编码： 绿色：“良好”(每10亿中0-79份[ppb]臭氧)，黄色：“适中”(80-99ppb)， 橙色：“不利于敏感人群健康”(100-124ppb)，红色：“不利于健康”(125 -149ppb)和紫色：“非常不利于健康”(高于150ppb)。通过指定颜色的数 目来计算被研究地区每天每幅EPA图的数值：绿色：1，黄色：2，橙色：3， 红色：4和紫色：5，并根据发布的EPA图上的每种颜色代表的地区估算每 天的平均数值。然后将每天的数值平均分配至该研究的每个两周周期中(表 10)。
表10每个时间周期的平均DFW EPA空气质量指数 时间周期 平均EPA空气质量指数 基线 1.0(范围1.0-1.0) 周期1 1.0(范围1.0-1.1) 周期2 1.4(范围1.0-2.5) 周期3 1.8(范围1.0-2.5)
如上所述，鉴于周期2中的研究参与者的数值分配不确定，对12名研究 参与者可能的最低ORACβ-PE平均值进行计算。假设最低的9个数值来自于 其标签不能被确认属于参与者的血清样品，将其与3个已知数值组合获得了 可能的最低平均值，由此获得了相对于基线的变化的最保守的估计值。9个 最低的ORACβ-PE值是4727.9、5233.9、5104.3、4599.9、5699.9、5364.8、3987.3、 4179.7和4584.9。当与表5中3个已知的周期2的数值组合时，得出的周期 2中12个研究参与者的ORACβ-PE平均值为5467.70。这个数值比基线的平均 值4279.49高出27.8％。
讨论。研究已经显示食用富含水果和蔬菜的饮食具有对氧化应激的保护 作用7，26，27。饮食指南提倡每天食用2-4份水果和3-5份蔬菜28。尽管存 在这样的认识和这些建议，美国没有几个人每天的饮食达到建议的量。在美 国农业部(U.S.Department Agriculture，USDA)资助的临床研究中，研究 者们发现增加对水果和蔬菜的消耗，特别是每天从通常的5份到实验性的10 份，在2周后血清ORACβ-PE值明显升高至约13％7。在目前的研究中，利用 每种添加量获得的血清ORACβ-PE平均值的升高值为：使用500毫克升高19.1 ％，使用1.0克升高37.4％，使用1.5克升高14.3％。这些数据表明在健康 人体中产生血清ORACβ-PE值相对于基线的最大增加值的最佳量是1.0克。据 保守估计，1.0g的Ambrotose AO导致27.8％的增量，这要比公布的关于个 人每天消费5份额外的水果和蔬菜时13％的报道的两倍还多。
尿脂质过氧化氢/肌酸酐值随着使用添加剂而降低。每个用量的降低为： 500毫克时为12.1％，1.0克时为15％，1.5克时为17.0％，这表明在研究范围 内随着添加剂量的增加，对脂质损伤的保护也随之增加。还不清楚为什么脂 质过氧化氢的数据与ORACβ-PE值不十分相关。血清ORACβ-PE是对血液中抗 氧化剂保护的测量，其与测量时清除自由基的能力相关。在过去的一段时间 里，尿脂质过氧化氢是脂质氧化损伤的标志。尿中实际的脂质损伤与脂质过 氧化氢出现之间的时间关系并没有得到很好的说明。很有可能这些时间差异 部分导致了这种偏差。除了尿脂质过氧化氢以外，尿8-OHdG和alkenals也 在每个时间周期内进行测定。没有发现显著性差异，也没有观察到趋势。这 可能再次涉及尿中实际的脂质和DNA损伤与生物标记的出现之间的时间差 异。
研究的参与者生活在DFW地区。公布的EPA对DFW每日空气质量评 价的周期为平均每两周。在研究的过程中空气质量正在恶化，这通常被认为 是ROS升高引起氧化应激升高，并由此增加了氧化性损伤的生物标记，例 如脂质过氧化氢29。相反的，测定的血清ORAC值升高证明保护增加。此外， 尿脂质过氧化氢值以及尿-OHdG和alkenals的稳定性下降的趋势证明了氧化 性损伤减少。总的来说，这些数据表明通过添加获得的抗氧化剂作用要比实 际测定的作用更强。
结论。根据公开的指导意见推荐每个人食用水果和蔬菜，但现实情况是 绝大多数人不会这样做。这些基本的数据表明，如血清ORACβ-PE所测定的， 包含在成品中保持抗氧化剂活性的优选的抗氧化剂成分的营养补充剂提高 了健康个体中的抗氧化剂保护，并且如尿脂质过氧化氢所测定的，降低了脂 质氧化损伤。使用500毫克、1.0克和1.5克的Ambrotose AO两周后，血清 ORACβ-PE相对于基线的提高证明健康人体中的保护要比公开数据中记载的 向饮食中添加5份水果和蔬菜长达两周时的保护要更强(19.1％、37.4％和 14.3％比13％)。
正如这里所显示的，利用对健康人体中氧化应激的四次测量对抗氧化剂 补充剂进行检验，发现血清ORACβ-PE升高。ORACβ-PE值表明：健康受试者 优选的剂量范围是每天1克，研究显示具有低血清ORAC值的个体可以从高 剂量的抗氧化剂补充中受益30。因此遭受氧化应激升高痛苦的人或者其它承 受压力的个体可以从更大剂量中获益。
当ORACo被用于抗氧化剂混合制剂中时，独立实验室使用已知的方法， 即ORACβ-PE来分析人临床实验血浆样品。Ambrotose AO产品的抗氧化剂效 力的体内评价并不依赖于ORACo方法的使用。这些数据证明：正如血清 ORACβ-PE所测定的，本发明抗氧化剂添加剂提高了消费者的抗氧化剂保护， 并且正如尿脂质过氧化氢所测定的，降低了脂质氧化损伤。
实施例5作为生物活性分子随时间释放的试剂的多糖原料在等于或大 于10,000psi压力下进行碾压。本发明人认识到某些用于研究制剂崩解的方 法及其制剂不能象期望那样释放，即例如抗氧化剂槲皮素等成分立即释放， 这些制剂使用了例如Ambrotose AO。研究从熟知的用途和正规的分析技术 开始，其被用于处理这里所示的所有样品。该方法包含两种水平的细节，因 为其最初被设计为完全定量，且抗氧化剂槲皮素作为分析物进行测定。最初 除槲皮素之外的成分的目测分析显示了不希望的释放情况，即经对比是相同 的、但实际结果又是不同的溶解条件。
图18显示被选用于初次研究的3个模型。4种分离的样品通过以下3个 步骤进行检验：槲皮素、葡萄皮和其它两种产物(分子式A所示抗氧化剂和 分子式B所示抗氧化剂)。注意“被控制的分解”步骤对于所有样品都是相 同的。简言之，所述分解是基于证明Ambrotose AO改进释放的方法，其包 括使用槲皮素作为标记的HPLC和UV-Vis。此外，制剂的目测观察与HPLC 和UV-Vis的观察相一致。
许多国家现有的关于膳食添加剂释放水平的规定包括片剂或胶囊形式的 产品在设备中完全崩解的条款，该设备大致地模拟了内脏的物理条件。这些 条件适用美国药典(USP)和英国药典(BP)的相关要求。被记载的最好的 崩解实验可以模拟添加剂原料与消化系统相互作用的生物利用性。成分进入 人体的条件对其利用的速度和效率有影响。营养物的利用速度和效率可以被 描述成“利用率曲线”。窄而集中的曲线可以代表例如静脉注射，而纤维性 营养物质由于更持续的释放形成较宽的曲线，所述纤维性营养物质例如存在 于在其能够利用之前必须经过消化的食物中物质。根据所希望的情形，可以 利用快速作用和按时间释放载体介质研发出分布模型。
利用例如标准低pH或水溶解情况分析法，对本发明的持续释放液体制 剂中的活性试剂的溶解情况进行检验。简言之，在37℃水浴中通过溶解检验 碾压的Ambrotose释放百分比，其中1升去离子水中加入5.0克氯化钾，搅 拌溶解，以每分钟150转(RPMs)的速度混合样品。用注射器(可以在水/KCl 混合物中冲洗)将5毫升待测的液体制剂样品，无杂质地或以滴定方式加入 到水浴中。在如0.5、1、3和8小时取出每等份2毫升的样品。可选择地， 可以通过利用配备了USF Apparatus II(搅拌)的Distek Model 2100B分解水浴 将剂型溶解来检测检溶解情况。搅拌旋转设定为50rpm。溶解介质可以是例 如900毫升的37℃的pH6.8磷酸盐缓冲液。
不幸的是，目前可接受的检测崩解的方法，其遵照了USP和BP制定的 关于在30分钟内总的可见的崩解的规定，由于要花费较长时间使消化道接 受而形成了渐进的曲线，因此不能准确地评价添加剂的利用率。Ambrotose AO胶囊被特别设计成持续释放和可被逐渐利用，其在30分钟内不会完全 崩解。这不能被看作是Ambrotose AO无法在指定的操作时间内成为可被利 用的，而是目前的方法对于快速起效的组分产生了偏差。USP和BP崩解要 求间接限制出相对狭窄的可用性。在某些实际应用中，根据所涉及的组分， 这是不需要的或具有潜在毒性。利用溶解提供了简单的方法，UV-Vis和 HPLC技术显示了期望的Ambrotose AO的延迟释放的活性。主要的目标是 使UV-Vis具有单独测量这种活性的能力，并且更多地涉及使用简单的并与 UV-Vis操作相关的HPLC方法。
方法。在该方法中，选择槲皮素作为分析物，原因在于其在377nm下具 有高UV-Vis活性、在Ambrotose AO中相对高的百分比组成以及良好的色 谱行为。Ambrotose AO制剂中使用的相同的槲皮素储备标准材料被用来提 供在溶解实验期望的浓度范围内的参考曲线。应该注意到该项研究中使用了 一批产自澳大利亚的Mannatech Ambrotose AO作为初次进料，用以证明根 据BP的崩解实验，给予TGA的制剂是失败的。
依据USP和BP建立溶解条件的模型进行类似的分析。一个例外是溶解 设备选择比平均转速更高的速度来保证合理的分析时间同时保持合理的结 果。使用双重测量技术使结果相互关联，尽管实践中可能只选择一种方法， 并且单独的简便UV-Vis方法是理想的。针对同样的待测样品进行崩解实验， 观察到30分钟的崩解实验失败。接着，在特定溶解条件下，针对0.5，1，2， 3，4，和8小时绘制基于槲皮素标记的Ambrotose AO的利用率曲线。这种 简单而一致的方法可以在任何具有适当配备的实验室中重复，如需要可以转 变为用于释放检验的质量保证环境。
设备。溶解系统：本方法使用Hanson SR8-Plus溶解系统。利用具有根据 指定规范校准的搅拌深度的USP II型设备(搅拌)进行操作。根据类似的分 析，溶解介质是每组800毫升去离子(d.i)水(18+Mohm)，水浴温度是 37℃，搅拌速度是200rpm。取样时需要1毫升吸液管以及12x75毫米玻璃 试管(或等同物)，以及准备用于仪器分析的稀释用甲醇。样品的稀释是经 过特定的步骤的，在UV-Vis和HPLC分析的最佳范围内，将实验水浴中槲 皮素浓度设为最大。
UV-Vis分光光度计：使用UV-Vis分光光度计(Cary 50 Bio，Varian)和 石英玻璃比色杯进行测量。读取377nm下单波长读数。所有读数使用同样的 石英比色杯，分别用每种溶解实验水浴的初始T0样品将仪器调零。在准备 UV-Vis读数中，检查系统保持零点不变和在预期的377nm处读数的能力。
HPLC系统。使用Shimadzu LC-VP双泵HPLC系统进行测定。使用的 检测器是Shimadzu PDA SPD-M10A，其以6.25Hz扫描速度在377nm处检测。 使用的色谱柱为Phenomenex Hydro RP，4.6毫米x150毫米，粒径为5μm。 色谱柱和PDA流动池保持在30℃的温度。所有的样品和标准品的进样量为 20微升。在HPLC上进样前，所有的样品和标准品都通过0.2微米的CA过 滤器(Whatman)。为了使峰稳定形成，积分值(Integrations)为自动的。使 用Shimadzu VP 7.2版本软件包来控制HPLC和积分值(integrations)。以下 是分析中使用的梯度方案(gradient program)。溶剂A是0.1％甲酸的去离子 (d.i)水溶液，溶剂B是0.1％甲酸的甲醇溶液。所有溶剂在系统平衡之前 都经过脱气，分析的总运行时间为30分钟。在给定的这些条件下，槲皮素 的洗脱峰预期在约14.8分钟出现。
表11槲皮素HPLC系统的梯度方案
分钟 浓度B％ 0.00 50 5.00 50 20.00 70 20.01 85 22.00 85 22.01 50 30.00 50
标准品和样品。利用Pharmline槲皮素HD(批次#152560)的系列稀释 液得出UV-Vis和HPLC标准品的范围。标准品给出的浓度范围涉及在800 毫升体积的去离子水(～0-100ppm)中单独溶解的Ambrotose AO胶囊。所 有样品取自同样的AUS Ambrotose AO(批次#N04081226)瓶，其释放被 接受而作为可接受的实验批次。标准品和待测样品以同样的方式进行处理， 首先溶解于去离子水中，然后以工艺中记载的方式制备样品，并在各种仪器 分析前用甲醇稀释至1∶3。
在溶出系统的条件稳定后，向每个水浴中加入Ambrotose AO胶囊。建 议至少使用3个水浴以获得溶出活性的精确结果。将胶囊被加入水浴的时刻 时间值设为To，所有的槲皮素利用度曲线的读数都是相对于该初始的To读 数而测定的。然后每隔半小时取样1毫升。此外，在取样后补加体积为1毫 升的去离子水以保持可控体积。一旦胶囊进入水浴就提取To时刻的初始样 品。然后从To开始连续取样至4-6小时，直到胶囊的溶出明显完成。一旦所 有样品完成取样，将它们用甲醇以1∶3比例稀释，在试管中振摇以便于对 它们进行分析。对于槲皮素标准品，以去离子水制成100ppm的溶液，并由 该储存液制成连续稀释液。然后从标准品稀释液中取样1毫升，以甲醇稀释 至1∶3的比例，以与样品相同的方式振摇以便于对其进行分析。根据槲皮 素浓度的预期范围至少取5个标准品连续溶出点。
利用盛满To时刻的被测样品的水浴或测定标准曲线时的75％甲醇的去 离子水溶液的石英比色杯(对于所有读数都是相同的)将光度计调零。以一 定体积的去离子水冲洗石英比色杯，除去前后读数之间任何残留的槲皮素。 溶出的终点被定义为在两次连续读数(1小时的时间)后不能再检测到样品 的UV-Vis活性升高的时间点。这个“高平台(plateau)”标志着所有槲皮素 从胶囊中溶出时的点。如果在UV-Vis读数期间中存在由于颗粒堵塞光源通 道等原因而产生的异常数值(rogue value)，使用Q检验忽略该读数并再次 对其测定。当读数通常地保持相当稳定时，一旦出现上述数值是很明显的。 每个样品至少进行三次读数以获得可接受的平均值。在进行UV-Vis测量后， 将样品过滤，并分别在设定的用于对比的HPLC条件下进行实验。然后将来 自所有仪器的数据与来自标准曲线的反应值联系起来，显示Ambrotose AO 样品的反应逐渐增加。
结果。尽管仪器可能是不同的，将本研究中形成的数据加以总结并作为 参考。其有助于理解Ambrotose AO在给定的实验条件下产生的预期的溶出 行为。以下是表和图，其总结了槲皮素UV-Vis吸光率反应与针对槲皮素标 准品浓度绘制的HPLC曲线下面积相对时间的图之间的联系。预期的来源于 Ambrotose AO的槲皮素活性的范围显示为0-200％。给出了三次独立实验操 作的平均值，所示实验操作是同时进行的。
表12标准品的UV-Vis和HPLC相关性表
以标准的Pharmline槲皮素二水合物HD(84％槲皮素) 测定储备AO的槲皮素的UV/Vis-HPLC相关性 AO槲皮素 最大浓度 ％ 实际的 ppm 377nm下的 UV-Vis(abs) 377nm下的 HPLC(auc) 与abs匹配的绘制的auc (auc/1700000) 12.50％ 3.13ppm 0.0819 139412 0.0820 25.00％ 6.25ppm 0.1628 284334 0.1673 50.00％ 12.50 ppm 0.3924 673170 0.3960 100.00％ 25.00 ppm 0.8283 1393657 0.8198 200.00％ 50.00 ppm 1.6170 2775973 1.6329
基于两个仪器间可见的细小变化，验证了标准品的相关性数值。此外， 发现在根据Ambrotose AO溶出实验预期的整个可能的浓度范围内槲皮素的 反应是线性的。表13显示了给定的曲线相关性的近似对比，所述曲线相关 性是每种样品的UV-Vis吸光率与绘制的HPLC曲线下面积相对时间的图的 相关性。正如所看到的，两个仪器间发现了类似的低偏差。这证明了较简单 的UV-Vis方法可以独立进行，并作为定量测定槲皮素从Ambrotose AO胶 囊中释放的总时间的工具。
表13样品的UV-Vis和HPLC相关性表
Ambrotose AO样品的UV/Vis-HPLC相关性 UV-Vis平均值(abs) HPLC刻度(auc) 原始HPLC(auc) 30min 60min 90min 120min 150min 180min 210min 240min 0.0337 0.1820 0.2937 0.3623 0.4539 0.5269 0.5864 0.6283 0.0470 0.1592 0.2766 0.4012 0.4362 0.5284 0.5458 0.6274 79838 270556 470176 681963 741491 898248 927924 1066522
样品曲线显示渐进的和一致性的升高是与槲皮素溶出相关的反应。对于 所有仪器，同样可以看到这种反应，且没有明显差异。重复实验显示在给定 的溶出条件下，这种升高延续长达平均4小时。可以对不同批次的样品进行 进一步重复实验来获得甚至更多的相关性。表12和13显示的结果分别在图 19和20以图的形式示出。在用研钵和杵重新研磨之前，在10,000psi压力下 处理颗粒至少120秒，并且重新制备胶囊来进行溶出实验。
讨论。在测定随时间变化的吸光率曲线的溶出研究中，相比初始读数， Ambrotose AO提高活性长达240分钟。显示的是Ambrotose AO胶囊逐渐 和一致地崩解进入溶液，由此可以解释在消化道中渐进的利用度。还必须注 意到单独的从压制片或胶囊形式中可见的崩解并不是总体溶出的完成点。某 些微胶囊材料也可以分散到溶液中并与槲皮素结合，结果造成其不易于利 用。
该研究的可视化分析证实在大约T60时，一部分好的胶囊材料从大批胶 囊分离，利用度反应曲线持续升高。这个方法可以用来解释USP和BP通过 胶囊崩解的方法失败的原因，也可以成为一种测定膳食添加剂改进的释放的 手段。特别的是，这些得到的结果支持了Ambrotose AO(澳大利亚)的改 进释放的权利要求，其具有扩大应用于其它改进释放的膳食添加剂片剂或胶 囊的潜力。在简便UV-Vis测定中，该方法还给出了将相似结果运用到更多 涉及HPLC测定中的把握。基于在特定的时间间隔内相对于给出最大测量值 的最小的槲皮素反应的事实，建立起质量控制规范。一旦有足够的实施例继 续支持该结果，针对这些类型结果的取样率可以降低。
表14槲皮素溶出实验
时间 AO槲皮素* 二氧化硅槲皮素** AO槲皮素片*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ +
*纯槲皮素与Ambrotose以1∶2的比例混合。
**纯槲皮素与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-槲皮素混合，压缩至10,000psi，重新研磨并制成胶囊(蔬菜)。
表15葡萄皮
时间 AO葡萄籽* 二氧化硅葡萄籽** AO葡萄籽片*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ -/+
*纯葡萄皮提取物与Ambrotose以1∶2的比例混合。
**纯葡萄皮提取物与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-葡萄皮提取物混合，压缩至10,000psi，重新研磨并制成胶囊 (蔬菜)。
表16式A所示抗氧化剂
时间 AO和式A* 二氧化硅式A** AO式A片剂*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ ++
*纯式A与Ambrotose以1∶2的比例混合。
**纯式A与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-式A混合，然后压缩至10,000psi，重新研磨并且形成胶囊(蔬 菜)。
表17式B所示抗氧化剂
时间 AO和式B* 二氧化硅式B** AO式B片剂*** 0分钟 ++++ - - 60分钟 ++++ ++++ ++
*纯式B与Ambrotose以1∶2比例混合。
**纯式B与硅胶以1∶2的比例混合并制成胶囊(蔬菜)。
***Ambrotose-式B混合，然后压缩至10,000psi，重新研磨并制成胶囊(蔬 菜)。
因此，利用同样的条件：胶囊，重量等，针对被倒空后重新填满的 Ambrotose AO胶囊，检验槲皮素随时间溶出(以确保对所有样品的胶囊的 压缩是一致的)，使用除了没有被碾压之外同样组成的胶囊。碾压过的 Ambrotose AO在到达Qmax时具有4x-8x的增加值(最大量槲皮素溶出)。松 散形式的Ambrotose立即释放。可视化的对比显示碾压的胶囊经过非碾压形 式的崩溃点后保持其形式完整。不希望受理论的束缚，很可能是Ambrotose 的长链多聚物象链一样发挥作用，槲皮素(或任何其它具有这样活性的生物 分子)以可控速度“浸出”。同样的，长链多糖，例如具有从2到约50,000 个糖单体的链与一种或多种营养上有效量的抗氧化剂、维生素、矿物质、氨 基酸、核酸、糖及其混合物和组合一起在于介于约100、500、1000、2000 或甚至10,000psi压力下被压缩。
可以理解在此描述的特定实施方案仅仅示用于说明、而非作为对本发明 的限制。在不偏离于本发明的范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各 种实施方案。本领域的技术人员会意识到，或仅仅使用常规实验就能够确定 在此描述的特定步骤的许多等同方式。这些等同方式被认为落入本发明的范 围之内并且被权利要求所覆盖。
说明书中提到的所有出版物和专利申请都显示了本发明所属领域的技 术人员的技术水平。这里引用所有出版物和专利申请作为参考，并指明其引 用的程度相当于每篇单独的出版物或专利申请都特别地、单独地被引用来作 为参考。
这里披露和声称的所有组合物和/或方法可以按照本发明披露的内容来 制备和实施而不需要过多的实验。当本发明的组合物和方法以优选的实施方 案的方式进行描述时，对本领域技术人员而言，很明显可以对组合物和/或方 法进行变化，这里描述的方法的步骤或步骤的顺序的变化不背离本发明的思 想、精神和范围。更特别的是，显然某些化学上和生理上相关的试剂可以被 替代为在此描述的试剂，同时获得相同或类似的结果。所有这些对于本领域 的技术人员而言是明显的类似替代和改进都被视为落入本发明所附的权利 要求书所限定的精神、范围和思想之内。
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