三聚体稳定性HIV包膜蛋白突变
阅读：1058发布：2020-06-26
专利汇可以提供三聚体稳定性HIV包膜蛋白突变专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了人类免疫 缺陷 病毒(HIV)包膜蛋白，其具有稳定该包膜蛋白的三聚体形式的突变。这些HIV包膜蛋白在包膜蛋白序列中的特定 位置 具有某些 氨 基酸取代。与不具有所指示氨基酸取代中的一个或多个的HIV包膜蛋白相比，此处所述的HIV包膜蛋白具有改进的三聚体形成百分比和/或改进的三聚体产量。还提供了编码这些HIV包膜蛋白的核酸分子和载体，以及含有这些HIV包膜蛋白、核酸和载体的组合物。，下面是三聚体稳定性HIV包膜蛋白突变专利的具体信息内容。
1.一种重组人类免疫缺陷病毒(HIV)包膜(Env)蛋白，其包含以下氨基酸残基中的两个或更多个：
(i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
(ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
(iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
(iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val；
(v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
(vi)位置204处的Ile；和/或
(vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
2.一种重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含以下氨基酸残基中的一个或多个：
(i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
(ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
(iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
(iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val；
(v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
(vi)位置204处的Ile；和/或
(vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
其中该HIV Env蛋白选自下组，该组由以下各项组成：
(1)HIV Env共有序列，例如来自比如包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的进化枝C，或例如来自比如包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列的进化枝B；
(2)合成HIV Env蛋白，例如包含(a)：SEQ ID NO:6的氨基酸序列；或(b)：在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6；或(c)：在位置501和605处的氨基酸突变为Cys残基且位置
559处的氨基酸突变为Pro残基的(a)或(b)；或(d)：具有另外的弗林蛋白酶切割位点突变的(a)、(b)或(c)，例如由RRRRRR(SEQ ID NO:10)替换位置508-511处的氨基酸；或(e)SEQ ID NO:7；或(f)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；以及
(3)亲本HIV Env蛋白，优选为野生型HIV Env蛋白，优选为进化枝C的，包含以至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置的氨基酸残基处的至少一个修复突变，其中该修复突变是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的取代，并且优选地，该修复突变是由存在于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的取代；
并且
其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
3.一种重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含以下氨基酸残基中的一个或多个：
(i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
(ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
(iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
(iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val；
(v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
(vi)位置204处的Ile；和/或
(vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
其中该HIV Env蛋白是包含以下中至少一个的HIV Env蛋白：
(a)位置501和605处的Cys；
(b)位置559处的Pro；
(c)位置501和605处的Cys和位置559处的Pro；以及
这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
4.如权利要求2或3所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含(i)至(vii)中所指示的氨基酸残基中的两个或更多个。
5.如权利要求1、2和4中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含位置
501和605处的Cys或位置559处的Pro，优选位置501和605处的Cys和位置559处的Pro。
6.如权利要求1至5中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含(i)至(vii)中所指示的氨基酸残基中的三个或更多个。
7.如权利要求1至5中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含(i)至(vii)中所指示的氨基酸残基中的四个或更多个。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含位置
651处的Phe、位置655处的Ile、位置535处的Asn和位置589处的Val。
9.如权利要求1至8中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含(i)至(vii)中所指示的氨基酸残基中的五个或更多个。
10.如权利要求1至10中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含以下中的一个或多个：
(viii)位置588处的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp、或Phe，优选Gln或Glu；
(ix)位置64处的Lys、或位置66处的Arg或位置64处的Lys和位置66处的Arg；
(x)位置316处的Trp；
(xi)201和433两个位置处的Cys；
(xii)位置556或558处的或556和558两个位置处的Pro；
(xiii)由具有7-10个氨基酸的环，优选8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ ID NO:12-
17)中任一个的序列的环，替换氨基酸位置548-568处的环(HR1环)；
(xiv)位置568处的Gly、或位置569处的Gly、或位置636处的Gly、或568和636两个位置处的Gly、或569和636两个位置处的Gly；和/或
(xv)位置302处的Tyr、或位置519处的Arg、或位置520处的Arg、或位置302处的Tyr和位置519处的Arg、或位置302处的Tyr和位置520处的Arg、或位置302处的Tyr以及519和520两个位置处的Arg。
11.如权利要求1至10中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变，优选位置508-511处由RRRRRR(SEQ ID NO:
10)进行的替换。
12.如权利要求1至11中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:3、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一项至少95％一致的氨基酸序列。
13.如权利要求1至12中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含：
(xvi)位置658处的选自Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu的氨基酸残基，优选Val或Ile，最优选Val。
14.如权利要求1至13中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白是gp140或gp160蛋白。
15.如权利要求1至14中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白来自进化枝C或进化枝A，优选来自进化枝C。
16.一种三聚体复合物，该三聚体复合物包含如权利要求1至15中任一项所述的重组HIV Env蛋白中的三种的非共价低聚物。
17.一种粒子，优选脂质体或纳米粒子，在其表面上展示如权利要求1至15中任一项所述的重组HIV Env蛋白或如权利要求16所述的三聚体复合物。
18.一种分离的核酸分子，该核酸分子编码如权利要求1至15中任一项所述的重组HIV Env蛋白。
19.一种载体，该载体包含与启动子可操作地连接的如权利要求18所述的分离的核酸分子。
20.如权利要求19所述的载体，该载体是腺病毒载体。
21.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求18所述的分离的核酸分子或如权利要求19或20所述的载体。
22.一种生产重组HIV Env蛋白的方法，该方法包括使如权利要求21所述的宿主细胞生长在适于产生该重组HIV Env蛋白的条件下。
23.一种组合物，该组合物包含如权利要求1至15中任一项所述的重组HIV Env蛋白、如权利要求16所述的三聚体复合物、如权利要求17所述的粒子、如权利要求18所述的分离的核酸分子或如权利要求19或20所述的载体，以及药学上可接受的载剂。
24.一种改进HIV Env蛋白的三聚体形成的方法，该方法包括取代亲本HIV Env蛋白中的一个或多个氨基酸残基，其中该一个或多个取代导致以下氨基酸中的一个或多个：
(i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
(ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
(iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
(iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val；
(v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
(vi)位置204处的Ile；和/或
(vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
25.一种改进亲本HIV Env蛋白的折叠和稳定性(作为增加的三聚体百分比和/或三聚体产量测量的)的方法，该方法包括通过在该亲本HIV Env蛋白中引入至少一个修复突变，优选至少3个修复突变，来修复该亲本HIV Env蛋白的氨基酸序列，其中修复突变是以至少
100个、优选至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置的氨基酸残基处的氨基酸取代，其中该取代是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的，并且优选地，该取代是由存在于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的。
三聚体稳定性HIV包膜蛋白突变
[0001] 发明背景
[0002] 人类免疫缺陷病毒(HIV)影响全世界数百万人，并且即使在广泛的抗逆转录病毒治疗的时代，通过有效疫苗预防HIV仍然具有非常高的优先级。HIV病毒不同毒株和进化枝之间的抗原多样性使得难以开发具有广泛功效的疫苗。HIV-1是该病毒中最常见的并且致病的毒株，其中超过90％的HIV/AIDS病例来源于HIV-1M群的感染。M群进一步细分为进化枝或亚型，其中进化枝C最大。有效疫苗理想地能够引发强大的细胞应答和广泛中和性抗体两者，这些广泛中和性抗体能够中和来自不同进化枝的HIV-1毒株。
[0003] HIV表面上的包膜蛋白刺突(Env)由糖蛋白gp120和gp41的异源二聚体的三聚体组成(图1A)。前体蛋白gp160被弗林蛋白酶切割成gp120和gp41，gp120是刺突的头部，并且包含CD4受体结合位点以及大的高变环(V1至V5)，gp41是包膜蛋白刺突的膜锚定茎。与其他I类促融合蛋白一样，gp41含有N端融合肽(FP)、C端跨膜(TM)结构域和细胞质结构域。HIV和靶细胞膜之间的膜融合需要包膜蛋白的一系列构象变化。HIV疫苗可以基于包膜蛋白进行开发。
[0004] 然而，各种因素使得基于包膜蛋白开发HIV疫苗具有挑战性，包括HIV-1的高遗传变异性、包膜蛋白的致密碳水化合物外壳、以及包膜蛋白刺突结构的相对动态和不稳定的性质。野生型包膜蛋白由于其功能而不稳定。因此，有时将稳定修饰引入到包膜结构中用于产生候选疫苗。包膜蛋白是中和抗体的靶标，并且高度糖基化，其通过屏蔽蛋白表位而降低免疫原性。所有已知的广泛中和抗体(bNAb)确实适应这些聚糖。
[0005] 对于疫苗开发，优选使用可诱导bNAb的包膜蛋白。然而，大多数bNAb在其经历任何构象变化之前仅识别天然包膜蛋白构象。因此，开发稳定的处于其天然样紧密和封闭构象的包膜蛋白同时最小化非天然和(由此)非中和表位的呈递，可以改进产生这种bNAb的效率。以前对生产HIV疫苗的做出的努力集中在开发含有三聚体HIV包膜蛋白gp140的融合前胞外结构域的疫苗。gp140不具有跨膜(TM)和细胞质结构域，但与gp120不同，它可以形成三聚体结构。此外，这些以前的努力主要集中在进化枝A上。然而，已经诱导的中和抗体应答的广度仍然有限。因此，如果稳定的天然包膜三聚体针对多个HIV进化枝可用，也将是有益的。
[0006] 二十多年来，已经尝试开发稳定的处于其融合前三聚体构象的包膜蛋白，仅在产生能够诱导广泛中和抗体应答的包膜蛋白的可溶性稳定三聚体方面取得有限的成功。例如，已经将所谓的SOSIP突变(501C、605C和559P)引入包膜蛋白序列以改进可溶性gp140三聚体部分的形成(Sanders等人,(2002),J.Virol.[病毒学杂志]76(17):8875-89)。所谓的SOSIP突变包括根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号(这是本领域中使用的常规编号方案)的位置501和605处的半胱氨酸残基和位置559处的脯氨酸残基。在三维蛋白结构中彼此接近的位置501和605处的两个半胱氨酸残基的引入导致二硫桥。SOSIP突变体包膜蛋白，例如BG505_SOSIP和B41_SOSIP(来自具有SOSIP突变的HIV毒株BG505和B41(即9032-08.A1.4685)毒株的包膜蛋白)，已经用于疫苗研究中，并且显示诱导2级自体中和Ab(Sanders等人,Science[科学](2015),349(6224):139-140)。
[0007] 然而，即使所谓的SOSIP突变能够稳定包膜蛋白的三聚体形式，此类SOSIP突变体的三聚体部分通常低于10％，仍然产生大量的单体和聚集体。即使SOSIP突变体BG505_SOSIP是迄今已知的在稳定三聚体形式的能力方面最有希望的SOSIP突变体包膜蛋白之一，它典型地仅产生多达25％的三聚体形式(Julien等人,Proc.Nat.Acad.Sci.[美国科学院院报](2015),112(38),11947-52)。此外，在此三聚体部分中三聚体在顶点浮动时并不完全稳定。因此，除了这些SOSIP突变之外，还已经设计了几种额外的取代，例如E64K、A316W和201C-433C，以稳定顶点并防止其浮动(de Taeye等人,Cell[细胞](2015),163(7),1702-
15；Kwon等人,(2015)Nat.Struct.Mol.Biol.[自然结构与分子生物学]22(7)522-31)。
15；Kwon等人,(2015)Nat.Struct.Mol.Biol.[自然结构与分子生物学]22(7)522-31)。
[0008] 因此，需要HIV包膜蛋白的稳定三聚体，其具有改进的三聚体形成百分比、改进的三聚体产量和/或改进的三聚体稳定性。优选地，HIV包膜蛋白的这种稳定三聚体也将展示与广泛中和抗体(bNAb)的良好结合和与非广泛中和Ab(非bNAb)的相对有限结合。本发明的目的是提供具有改进的三聚体百分比并且优选地也具有改进的三聚体产量的HIV Env蛋白。
发明内容
[0009] 本发明涉及来自不同进化枝的重组HIV包膜蛋白，其与先前描述的HIV包膜三聚体相比具有改进的三聚体形成百分比和/或改进的三聚体产量。Env折叠被优化，毒株特异性特征被修复，并且对于融合过程重要的融合前闭合构象的区域被此处所述的突变稳定。这提供了一种通用的方法来优化融合前闭合的HIV-1包膜三聚体的折叠和稳定性。所得的稳定且良好折叠的HIV Env三聚体可用于免疫目的，例如，以改进在施用重组HIV Env三聚体时诱导广泛中和抗体并且减少非中和抗体和弱中和抗体的诱导的机会。本发明还涉及分离的核酸分子和编码重组HIV包膜蛋白的载体，包含这些的细胞，以及重组HIV包膜蛋白、核酸分子、载体和/或细胞的组合物。
[0010] 在一个一般方面，本发明涉及在包膜蛋白序列的鉴定位置处具有特定氨基酸残基的重组人类免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，这些氨基酸残基稳定三聚体的形成。
[0011] 在某些实施例中，本发明的重组HIV包膜(Env)蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少两个处具有指示氨基酸残基的HIV Env蛋白的氨基酸序列，该组由以下各项组成：
[0012] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp；
[0013] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp；
[0014] (iii)位置535处的Asn或Gln；
[0015] (iv)位置589处的Val、Ile或Ala；
[0016] (v)位置573处的Phe或Trp；
[0017] (vi)位置204处的Ile；以及
[0018] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，
[0019] 其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在某些优选的实施例中，位置651处所指示的氨基酸残基为Phe；位置655处所指示的氨基酸残基为Ile；位置535处所指示的氨基酸残基为Asn；和/或位置573处所指示的氨基酸残基为Phe。
[0020] 在某些实施例中，本发明的重组HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0021] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp；
[0022] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp；
[0023] (iii)位置535处的Asn或Gln；
[0024] (iv)位置589处的Val、Ile或Ala；
[0025] (v)位置573处的Phe或Trp；
[0026] (vi)位置204处的Ile；以及
[0027] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，
[0028] 其中该HIV Env蛋白选自下组，该组由以下各项组成：
[0029] (1)HIV Env共有氨基酸序列，例如，来自进化枝C(例如包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列)或进化枝B(例如
[0030] 包含SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列)；
[0031] (2)合成HIV Env蛋白，例如包含(a)：SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或(b)：在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6，或(c)：在位置501和605处的氨基酸突变为Cys残基且位置559处的氨基酸突变为Pro残基的(a)或(b)，或(d)：具有另外的弗林蛋白酶切割位点突变的(a)、(b)或(c)，例如由RRRRRR(SEQ ID NO:10)替换位置508-511处的氨基酸，或(e)SEQ ID NO:7，或(f)镶嵌Env序列，如包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的Env；以及
[0032] (3)亲本HIV Env蛋白，优选为野生型HIV Env蛋白，优选为进化枝C的，包含以至少100个、优选至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率，发现于对应位置的氨基酸残基处的至少一个修复突变，其中该修复突变是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由发现于对应位置的氨基酸残基进行的取代，并且优选地，该修复突变是由发现于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的取代；
[0033] 并且位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在某些优选的实施例中，位置651处所指示的氨基酸残基为Phe；位置655处所指示的氨基酸残基为Ile；位置535处所指示的氨基酸残基为Asn；和/或位置573处所指示的氨基酸残基为Phe。
[0034] 在某些实施例中，本发明的重组HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0035] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp；
[0036] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp；
[0037] (iii)位置535处的Asn或Gln；
[0038] (iv)位置589处的Val、Ile或Ala；
[0039] (v)位置573处的Phe或Trp；
[0040] (vi)位置204处的Ile；以及
[0041] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，
[0042] 其中该HIV Env蛋白是包含至少一个突变的SOSIP突变体HIV Env蛋白，所述突变导致在选自下组的指示位置处的一个或多个指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：
[0043] (a)位置501和605处的Cys；
[0044] (b)位置559处的Pro；以及
[0045] (c)位置501和605处的Cys和位置559处的Pro；以及
[0046] 这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在某些优选的实施例中，位置651处所指示的氨基酸残基为Phe；位置655处所指示的氨基酸残基为Ile；位置535处所指示的氨基酸残基为Asn；并且位置573处所指示的氨基酸残基为Phe。
[0047] 在其他实施例中，本发明的重组HIV Env蛋白还包含在选自下组的指示位置中的至少一个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：
[0048] (viii)位置588处的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe，优选Gln或Glu；
[0049] (ix)位置64处的Lys、或位置66处的Arg、或位置64处的Lys和位置66处的Arg；
[0050] (x)位置316处的Trp；
[0051] (xi)201和433两个位置处的Cys；
[0052] (xii)位置556处的Pro、或位置558处的Pro、或位置556和558处的Pro；(xiii)由具有7-10个氨基酸的环，优选8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ ID NO:12-17)中任一个的序列的环，替换氨基酸位置548-568处的环(HR1环)；
[0053] (xiv)位置568处的Gly、或位置569处的Gly、或位置636处的Gly、或568和636两个位置处的Gly、或569和636两个位置处的Gly；和/或
[0054] (xv)位置302处的Tyr、或位置519处的Arg、或位置520处的Arg、或位置302处的Tyr和位置519处的Arg、或位置302处的Tyr和位置520处的Arg、或位置302处的Tyr以及519和520两个位置处的Arg。
[0055] 在某些实施例中，本发明的重组HIV Env蛋白还包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变，如位置508-511处由RRRRRR(SEQ ID NO:10)进行的替换。
[0056] 在一个实施例中，重组HIV Env蛋白是gp140蛋白。
[0057] 在另一个实施例中，重组HIV Env蛋白是gp160蛋白。
[0058] 在某些实施例中，重组HIV Env蛋白在细胞质区域被截短，例如，该细胞质区域的7个氨基酸后。
[0059] 在另一个一般方面，本发明涉及三聚体复合物，其包含此处所述的任何重组HIV Env蛋白中的三种的非共价低聚物。
[0060] 本发明的另一个一般方面是提供了一种改进亲本HIV Env蛋白的折叠和稳定性(如增加的三聚体百分比和/或三聚体产量测量的)的方法，该方法包括通过在亲本HIV Env蛋白中引入至少一个修复突变，优选至少3个修复突变，来修复亲本HIV Env蛋白的氨基酸序列，其中修复突变是以至少100个、优选至少500个、优选至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置的氨基酸残基处的氨基酸取代，其中该取代是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的，并且优选地，该取代是由存在于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的。本发明还提供了可通过本发明的所述方法获得的经修复的HIV Env蛋白，用于改进HIV Env蛋白的折叠和稳定性(作为三聚体百分比和/或三聚体产量测量的)。本发明还提供了包含所述经修复的HIV Env蛋白的药物组合物。本发明还提供了一种用于产生HIV Env蛋白的方法，包括用于修复此处所述的HIV Env蛋白并且在重组宿主细胞中表达编码经修复的稳定的HIV Env蛋白的核酸的方法。
[0061] 在另一个一般方面，本发明涉及包含与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的重组HIV Env蛋白，其中优选地位置204、535、573、589、
647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、501、508-511、556、558、559、
588、548-568和605在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在其某些实施例中，重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:3至少98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中优选地位置204、535、573、589、647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、501、508-511、556、558、559、
588、548-568和605在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在其某些实施例中，重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:3至少98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中优选地位置204、535、573、589、647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0062] 在另一个一般方面，本发明涉及包含与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的重组HIV Env蛋白，其中优选地位置204、535、573、589、
647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、501、508-511、556、558、559、
588、548-568和605在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在其某些实施例中，重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:5至少98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中优选地位置204、535、573、589、647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、501、508-511、556、558、559、
588、548-568和605在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。在其某些实施例中，重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:5至少98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中优选地位置204、535、573、589、647、651和655以及优选地另外的位置64、66、201、316、433、508-511、556、558、588和548-568在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0063] 在这些方面和实施例中，确定％一致性时未考虑的指示位置处的氨基酸中的一个或多个优选地选自此处优选的指示氨基酸，例如位置204处的Ile；位置651处的Phe、Ala、Leu、或Trp等(参见下表1和表2)。
[0064] 在另一个一般方面，本发明涉及重组HIV Env蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、3、4、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一个至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:20、22、24、26、27、28、29、30、31或32是特别优选的。在这方面，优选地位置204、535、573、589、647、651、655和658以及优选地另外的位置64、66、201、
316、433、508-511、556、558、588和548-568在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-
1分离株HXB2的gp160中的编号。也在这方面，确定％一致性时未考虑的指示位置处的氨基酸中的一个或多个优选地选自此处在表1的(i)-(vii)、表2的(viii)-(xv)和/或表1的(xvi)中优选的指示氨基酸，例如位置204处的Ile；位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp等。
316、433、508-511、556、558、588和548-568在确定％一致性时不考虑，其中编号是根据HIV-
1分离株HXB2的gp160中的编号。也在这方面，确定％一致性时未考虑的指示位置处的氨基酸中的一个或多个优选地选自此处在表1的(i)-(vii)、表2的(viii)-(xv)和/或表1的(xvi)中优选的指示氨基酸，例如位置204处的Ile；位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp等。
[0065] 在另一个一般方面，本发明涉及一种粒子，优选脂质体或纳米粒子，例如自组装纳米粒子，在其表面上展示本发明的重组HIV Env蛋白。
[0066] 在另一个一般方面，本发明涉及编码本发明的重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子和包含与启动子可操作地连接的分离的核酸分子的载体。在一个实施例中，该载体是病毒载体。在另一个实施例中，该载体是表达载体。在一个优选实施例中，该病毒载体是腺病毒载体。
[0067] 另一个一般方面涉及包含编码本发明的重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。这些宿主细胞可用于重组蛋白生产、重组蛋白表达或病毒粒子生产。
[0068] 另一个一般方面涉及产生重组HIV Env蛋白的方法，该方法包括使包含编码本发明的重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子或载体的宿主细胞生长在适于产生该重组HIV Env蛋白的条件下。
[0070] 当连同附图一起阅读时，会更好地理解先前概述以及以下本发明的详述。应理解的是本发明不限于附图中示出的准确实施例。
[0071] 在附图中：
[0072] 图1A和1B显示了HIV包膜(Env)蛋白的结构的示意图；
[0073] 图1A显示了全长HIV Env蛋白；并且
[0074] 图1B显示了根据HIV-1分离株HXB2(SOSIP.644序列)的gp160中的编号，含有所谓的SOSIP突变和C端截短(开始于残基664)的可溶性HIV Env蛋白；
[0075] 图2A和2B显示了如实例3所述通过AlphaLISA测定测量的根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的三聚体形成百分比(图2A)和三聚体产量(图2B)。测试的重组HIV Env蛋白含有引入骨架HIV Env共有进化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)的单、双或三氨基酸取代；基于三聚体特异性单克隆抗体(mAb)PGT145与每种重组HIV Env蛋白的结合确定三聚体百分比和三聚体产量；将本发明的每种重组HIV Env蛋白的三聚体产量和三聚体形成百分比与具有无此处所述的任何额外三聚体稳定突变的骨架ConC_SOSIP序列的包膜蛋白的情况进行比较；
[0076] 图3显示了根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的具有多角度光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)分析的色谱图；测试的重组HIV Env蛋白含有引入骨架HIV Env共有进化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)的单氨基酸取代，并如实例2所述通过凝集素亲和色谱纯化；如实例3中所述进行了SEC-MALS分析；对应于三聚体形式的峰在色谱图的每个中指示出；
[0077] 图4显示了根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的热稳定性，报道为热处理后余下的三聚体的百分比；测试的重组HIV Env蛋白含有引入骨架HIV Env共有进化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)的单、双或三氨基酸取代；使重组HIV Env蛋白经受热处理，并且热处理后余下的三聚体的百分比如实例4所述通过AlphaLISA测定来确定；还显示了具有无任何额外三聚体稳定突变的骨架ConC_SOSIP序列的包膜蛋白的热稳定性；
[0078] 图5A-5B显示了与具有无如实例5所述的本发明的任何额外三聚体稳定突变的骨架ConB_SOSIP序列的包膜蛋白相比，根据本发明的实施例的具有引入到骨架HIV Env共有进化枝B序列ConB_SOSIP(SEQ ID NO:5)中的单个氨基酸取代的重组HIV Env蛋白的三聚体形成百分比(图5A)和三聚体产量(图5B)；三聚体产量和三聚体形成百分比是通过AlphaLISA测定来确定；
[0079] 图6A-6B显示了如实例6所述的根据本发明的实施例的具有引入到骨架合成HIV包膜蛋白序列DS_sC4_SOSIP_E166R中的氨基酸取代的重组HIV Env蛋白的三聚体形成百分比和三聚体产量；通过AlphaLISA测定来确定三聚体形成百分比和三聚体产量。
[0080] 图7显示了根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的具有多角度光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)分析的色谱图；测试的重组HIV Env蛋白含有单个K655I突变，在每个贴近的变体中，在骨架HIV Env共有进化枝C序列ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)中引入一个额外突变，并如实例2所述通过凝集素亲和色谱纯化；如实例3中所述进行了SEC-MALS分析；表示ConC_SOSIP中gp140单体的峰由阴影框指示，在三聚体峰右侧。下图显示了图形下部的放大，从而可以看出，每个额外突变引起gp140单体峰的高度进一步下降。
[0081] 图8A-8B显示了与具有无如实例9所述的本发明的任何额外三聚体稳定突变的骨架BG505_SOSIP序列的包膜蛋白相比，具有根据本发明的实施例引入的单氨基酸取代和取代的组合的BG505_SOSIP(衍生自野生型进化枝A毒株)的三聚体形成百分比(图8A)和三聚体产量(图8B)。三聚体产量和三聚体形成百分比是通过AlphaLISA测定来确定。
[0082] 图9显示了根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的具有多角度光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)分析的色谱图；对Env转染细胞的培养上清液进行SEC-MALS分析。对应于三聚体形式的峰在7和7.5分钟之间洗脱。深灰色线为BG505_SOSIP(衍生自野生型进化枝A毒株)，并且浅灰色线为具有L556P、K655I、M535N、N651F、D589V、K588E取代的BG505_SOSIP。
[0083] 图10A-10B显示了实例10中所述的C97ZA_SOSIP变体的三聚体产量。具有三个稳定取代(L556P、T651F和M535N)的C97ZA的三聚体产量(图10A和B)。在图10B中，通过添加来根据图12中描述的概念框架修复C97ZA Env序列的额外突变(21个额外突变)并通过引入额外的稳定取代(K655I、D589V、A204I和K588E)进一步优化Env序列。三聚体产量和三聚体形成百分比是通过AlphaLISA测定来确定。将信号针对设置为1的ConC_SOSIP信号归一化。PNGS是潜在的N-糖基化位点。
[0084] 图11.具有四个稳定取代(详见实例11)的HIV-1Env毒株DU422的三聚体产量。将所有数字针对设置为1的ConC_SOSIP(未显示)归一化。
[0085] 图12.用于修复针对毒株C97ZA所示的HIV-1Env序列的通用概念。从C97ZA残基位置的低至高百分比分选在总HIV-1数据库(顶部条)和毒株C97ZA残基(底部条)中发生频率最高的残基(此处称为‘共有残基’)。基于以下标准选择要取代为共有残基的C97ZA序列位置：在Env数据库序列(黑色条)中具有C97ZA残基的发生小于2％的位置。具有C97ZA残基的在Env数据库序列中发生在2％至7.5％之间并被埋入或部分埋入(深灰色条)的位置。在C97ZA和亲水性共有残基(两个最浅的灰色条)中暴露和疏水的位置和潜在的N-糖基化位点(PNGS)共有残基(S234N)的位置。
[0086] 图13.通过序列修复和突变稳定而在融合前闭合的的HIV ENV_SOSIP三聚体。对于广泛中和抗体，所有SOSIP变体的细胞培养上清液中的AlphaLISA信号均针对ConC_SOSIP归一化。
[0087] 图14.在转染后使用细胞培养上清液，对照Env_SOSIP变体(骨架SOSIP)、根据实例12和图12中描述的概念的经修复的Env变体和具有根据表3的额外稳定取代的Env变体的分析SEC特征曲线。从所有特征曲线中减去细胞培养上清液的模拟信号。三聚体峰用*指示。
[0088] 图15.无稳定SOSIP修饰的HIV-1Env ConC变体的三聚体产量。
[0089] 图16.在位置589、647、651和655处突变为甲硫氨酸的ConC_SOSIP的三聚体产量(A)和三聚体百分比(B)。将所有数字针对设置为1的ConC_SOSIP(未显示)归一化。误差条显示在这些条的右端。
[0090] 图17A-17D显示了通过AlphaLISA测定来测量的具有如实例15所述的指示突变的重组HIV Env蛋白的三聚体形成百分比(针对不同实验为图17A、B)和三聚体产量(针对不同实验为图17C、D)。
[0091] 图18显示了具有如实例15所述的指示突变的重组HIV Env蛋白的SEC-MALS色谱图。
具体实施方式
[0092] 在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一篇均通过引用以其整体结合在此。包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、物品或类似物的讨论用于提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
[0093] 除非另外定义，在此所使用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，在此所使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。此处引用的所有专利、公开专利申请和出版物如同完全列出一样通过引用结合在此。必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如在此和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
[0094] 除非另有说明，任何数值，如此处所述的浓度或浓度范围，应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值典型包括列举值±10％。如在此所使用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的这些范围内的整数和分数，除非上下文另有明确指示。
[0095] 在整个披露中引用了氨基酸。有20种天然存在的氨基酸以及许多非天然存在的氨基酸。每种已知的氨基酸(包括天然和非天然氨基酸)都具有全名、一字母的缩写代码和三字母的缩写代码，所有这些都是本领域普通技术人员所熟知的。例如，用于20种天然存在的氨基酸的三字母和一字母的缩写代码如下：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬氨酸(Asp；D)、天冬酰胺(Asn；N)、半胱氨酸(Cys；C)、甘氨酸(Gly；G)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)以及缬氨酸(Val；V)。氨基酸可以通过其全名、一字母的缩写代码或三字母的缩写代码来引用。
[0096] 除非上下文有明确规定，否则在此所使用的HIV包膜蛋白的氨基酸序列中位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号，例如以下中所列出的，Korber等人(Human Retroviruses and AIDS 1998:A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences[人类逆转录病毒与AIDS 1998:核苷酸和氨基酸序列的汇编与分析],Korber等人编辑洛斯阿拉莫斯国家实验室理论生物学和生物物理学组,新墨西哥州洛斯阿拉莫斯[Theoretical Biology and Biophysics Group,Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,N.Mex.])，其通过引用以其整体结合在此。根据HXB2的编号在HIV Env蛋白领域是常规的。HIV-1分离株HXB2的gp160具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。可以使用感兴趣的HIV Env序列与此序列的比对来找到感兴趣的序列中对应的氨基酸编号。
[0097] 短语“包含在选自下组的指示位置中的至少一个处具有指示氨基酸残基的HIV Env蛋白的氨基酸序列，该组由以下各项组成”和“包含以下(氨基酸残基)中的一个或多个”在此处互换使用。
[0098] 术语“百分比(％)序列一致性”或“％一致性”描述了两个或更多个经比对的氨基酸序列与组成这些氨基酸序列的总长度的氨基酸残基数相比而言一致的氨基酸的匹配(“命中”)数。换言之，使用比对，对于两个或更多个序列，当将这些序列针对最大对应(如使用本领域已知的序列比较算法测量的)进行比较和比对时，或者当手动比对和视觉检查时，可以确定相同的氨基酸残基的百分比(例如95％、97％或98％一致性)。因此，进行比较以确定序列一致性的序列可以通过一个或多个氨基酸取代、添加或缺失来区分。用于比对蛋白序列的适合程序是本领域技术人员已知的。蛋白序列的百分比序列一致性可以例如用程序如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST来确定，例如使用NCBI BLAST算法(Altschul SF等人(1997),Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。
[0099] 如在此所使用，‘HIV Env序列的集合’是可以来自相同进化枝(例如进化枝C)或来自不同进化枝(例如进化枝A、B、C等)的野生型HIV Env蛋白的代表性数目(例如至少100、或500、或1000、或更多)的随机序列的集合。这样的序列的适合集合可在数据库中获得，或者子集合可以从其中提取，例如HIV序列数据库(洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos National Laboratory))。这样的集合优选包含至少100个HIV Env蛋白序列、1000个HIV Env蛋白序列、至少10000个HIV Env蛋白序列、至少50000个HIV Env蛋白序列，并且可以含有超过90000个HIV Env蛋白序列。
[0100] HIV Env蛋白中的‘对应位置’是指当比对至少两个HIV Env序列时氨基酸残基的位置。除非另有指示，否则按照本领域惯例，用于这些目的的氨基酸位置编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0101] 如在此所使用，‘稳定突变’是如表1中的条目(i)-(vii)或(xvi)，或表2的(viii)-(xv)中任一项所述的突变，与亲本分子相比，当通过在所述亲本分子中取代对应的氨基酸而引入突变时，所述突变增加了HIV Env蛋白的三聚体百分比和/或三聚体产量(其可以例如根据此处所述的AlphaLISA或SEC-MALS测定来测量)。由这样的稳定突变得到的氨基酸典型在野生型HIV分离株的Env蛋白中很少发现(如果会有的话)。
[0102] 如在此所使用，‘修复突变’是亲本HIV Env蛋白中的氨基酸残基的取代，该氨基酸残基以HIV Env蛋白序列的集合中小于7.5％、优选小于2％存在于对应位置，其中该取代是通过更频繁地在所述集合中存在于对应位置的氨基酸进行，例如在所述集合中至少10％的HIV Env蛋白中，并且该取代优选地通过以所述集合中至少20％的HIV Env蛋白存在于对应位置的氨基酸或者是所述集合中对应位置处最常发生的氨基酸进行。由这样的修复突变得到的氨基酸典型以野生型HIV分离株的相对高百分比的Env蛋白发现，并且在几种情况下可以与共有HIV Env序列中对应位置处的那些相同。
[0103] 如在此所使用，与亲本HIV Env序列相比，‘经修复的和稳定的’HIV Env序列典型含有至少一个修复突变和至少一个稳定突变，优选多个修复突变和多个稳定突变。
[0104] 当提及HIV毒株(或来自它的Env蛋白)时，术语‘天然’或‘野生型’可互换使用，并且指自然界中存在的HIV毒株(或来自它的Env蛋白)，例如，如感染HIV的患者中的。
[0105] 本发明一般涉及在包膜蛋白序列中指示位置处包含稳定包膜蛋白的三聚体形式的某些氨基酸取代的重组HIV包膜(Env)蛋白。将本发明的一个或多个鉴定的氨基酸取代引入HIV包膜蛋白的序列中可以导致三聚体形成百分比增加和/或三聚体产量增加。这可以例如使用三聚体特异性抗体、融合温度、尺寸排阻色谱法和与结合到正确折叠的(稳定三聚体)Env蛋白的抗体的结合或可替代地结合到错误折叠的(非稳定或非三聚体)Env蛋白的抗体的结合来测量，并且增加的三聚体百分比和/或三聚体产量被认为指示稳定的、天然的、正确折叠的Env蛋白。
[0106] 人类免疫缺陷病毒(HIV)是慢病毒属(Lentivirinae)的成员，其是逆转录病毒科(Retroviridae)的一部分。两种HIV感染人类：HIV-1和HIV-2。HIV-1是最常见的HIV病毒毒株，并且已知比HIV-2更致病。如在此所使用，术语“人类免疫缺陷病毒”和“HIV”是指但不限于HIV-1和HIV-2。在优选的实施例中，HIV是指HIV-1。
[0107] HIV被分类为具有高度遗传趋异的多个进化枝。如在此所使用，术语“HIV进化枝”或“HIV亚型”是指根据它们的遗传相似性程度进行分类的相关人类免疫缺陷病毒。最大的一组HIV-1分离株被称为M组(主要毒株)，并且由至少从A至J的十个进化枝组成。
[0108] 在一个一般方面，本发明涉及重组HIV包膜(Env)蛋白。当有关于蛋白使用时，术语“重组”是指通过重组技术或通过体外化学合成产生的蛋白。根据本发明的实施例，“重组”蛋白具有人工氨基酸序列，因为其含有在对应的天然存在的序列中未发现的至少一个序列元件(例如，氨基酸取代、缺失、添加，序列替换等)。优选地，“重组”蛋白是非天然存在的HIV包膜蛋白，其针对一种或多种天然存在的HIV毒株诱导免疫应答或产生免疫。
[0109] 术语“HIV包膜蛋白”、“HIV Env”和“HIV Env蛋白”是指蛋白或其片段或衍生物，其本质上在HIV病毒粒子的包膜上表达，并使HIV能够靶向和附着于HIV感染细胞的质膜。在整个披露中，术语“包膜”和“Env”可互换使用。该HIV env基因编码前体蛋白gp160，该前体蛋白gp160被蛋白质水解性地切割成两种成熟的包膜糖蛋白，即gp120和gp41。该切割反应由宿主细胞蛋白酶、弗林蛋白酶(或弗林蛋白酶样蛋白酶)在逆转录病毒包膜糖蛋白前体中的高度保守的序列基序处介导。更具体地，gp160三聚化为(gp160)3，并且然后经历切割成为两个非共价缔合的成熟糖蛋白gp120和gp41。病毒进入随后由gp120/gp41异源二聚体的三聚体介导。Gp120是受体结合片段，并且结合到靶细胞上的CD4受体(和共受体)上，该靶细胞具有这样的受体如，例如T-辅助细胞。非共价结合至gp120的Gp41是融合片段并且提供HIV进入细胞的第二步骤。Gp41最初埋在该病毒包膜内，但当gp120与CD4受体和共受体结合时，gp120改变其构象，从而导致gp41暴露，其中它可以帮助与宿主细胞融合。Gp140是gp160的胞外结构域。
[0110] 根据本发明的实施例，“HIV包膜(Env)蛋白”可以是gp160或gp140蛋白，或其组合、融合物、截短物或衍生物。例如，“HIV包膜蛋白”可以包括与gp41蛋白非共价缔合的gp120蛋白。“HIV包膜蛋白”还可以是截短的HIV包膜蛋白，该截短的HIV包膜蛋白包括但不局限于包含在胞外结构域(即，延伸至细胞外空间的结构域)中的C端截短、在gp41中的截短物(如在gp41的胞外结构域的截短物，在gp41的跨膜结构域中的截短物，或在gp41的细胞质结构域中的截短物)的包膜蛋白。HIV包膜蛋白也可以是gp140，对应于gp160胞外结构域，或gp140的延伸或截短形式。已经在几个公开(例如Zhang等人,2001；Sanders等人,2002；Harris等人,2011)中描述了gp140蛋白的表达，并且该蛋白也可以不同的变体例如基于不同的HIV毒株从服务提供商订购。根据本发明的gp140蛋白可以具有切割位点突变，使得gp120结构域和gp41结构域不被切割和共价连接，或者可替代地gp120结构域和gp41胞外结构域可被切割和共价连接，例如，通过二硫桥(例如比如在SOSIP变体中)。“HIV包膜蛋白”还可以是天然存在的HIV包膜蛋白的衍生物，该HIV包膜蛋白的衍生物具有例如在弗林蛋白酶切割位点中的序列突变、和/或所谓的SOSIP突变。根据本发明的HIV包膜蛋白也可以具有切割位点，使得gp120和gp41胞外结构域可以非共价连接。
[0111] 在本发明的优选实施例中，HIV Env蛋白是gp140蛋白或gp160蛋白，并且更优选gp140蛋白。在其他优选实施例中，Env蛋白被截短，例如，通过与天然Env蛋白相比在细胞质区域的第7个残基后的残基的缺失。
[0112] 根据本发明的实施例，“HIV包膜蛋白”可以是三聚体或单体，并且优选为三聚体。三聚体可以是同源三聚体(例如，包含三个一致的多肽单元的三聚体)或异源三聚体(例如，包含不完全一致的三个多肽单元的三聚体)。优选地，三聚体是同源三聚体。在切割的gp140或gp160的情况下，它是gp120-gp41二聚体的多肽单元的三聚体，并且在这些二聚体中所有三种都相同的情况下，这被认为是同源三聚体。
[0113] “HIV包膜蛋白”可以是可溶性蛋白或膜结合蛋白。膜结合包膜蛋白典型包含跨膜结构域，例如在包含如图1A所示的跨膜结构域(TM)的全长HIV包膜蛋白中。膜结合蛋白可以具有细胞质结构域，但不需要细胞质结构域被膜结合。可溶性包膜蛋白包含跨膜结构域的至少部分或完全缺失。例如，可以截短全长HIV包膜蛋白的C端末端以缺失跨膜结构域，从而产生可溶性蛋白，如图1B所示。然而，HIV包膜蛋白仍然可以是可溶性的，相对于图1B所示的那些，具有较短截短和可替代的截短位置。可以在不同位置进行截短，并且非限制性实例是在氨基酸664、655、683等之后，这些都导致可溶性蛋白。与天然Env蛋白相比，根据本发明的膜结合Env蛋白可以包含完整或部分C端结构域(例如，通过部分缺失C端细胞质结构域，例如在某些实施例中，在细胞质区域的第7个残基之后)。
[0114] 信号肽在表达时典型存在于HIV Env蛋白的N末端，但被信号肽酶切除，并且因此不存在于成熟蛋白中。信号肽可以与其他信号序列互换，并且信号肽的一些非限制性实例在此处提供于SEQ ID NO:11、18、33和34中。
[0115] 根据本发明的实施例，HIV包膜蛋白例如gp160或gp140可以衍生自来自任何HIV进化枝(或‘亚型’)的HIV包膜蛋白序列，例如进化枝A、进化枝B、进化枝C、进化枝D、进化枝E、进化枝F、进化枝G、进化枝H等或其组合(例如，‘循环重组形式’或衍生自不同亚型病毒之间的重组的CRF，例如BC、AE、AG、BE、BF、ADG等)。HIV包膜蛋白序列可以是天然存在的序列、镶嵌序列、共有序列、合成序列或其任何衍生物或片段。“镶嵌序列”含有衍生自一个或多个HIV进化枝的至少三个HIV包膜序列的多个表位，并且可以通过优化T细胞表位覆盖的算法来设计。镶嵌HIV包膜蛋白的序列的实例包括例如Barouch等人,Nat Med[自然方法]2010,16:319-323；和WO 2010/059732中所述的那些，例如SEQ ID NO:8和9所示的那些。如在此所使用，“共有序列”是指基于同源蛋白的氨基酸序列比对的人工氨基酸序列，例如，如通过同源蛋白的氨基酸序列的比对(例如，使用Clustal Omega)所确定的。它是基于来自至少1000个天然HIV分离株的Env的序列，在序列比对中每个位置处发现的最常见的氨基酸残基的计算顺序。“合成序列”是非天然存在的HIV包膜蛋白，其针对超过一种天然存在的HIV毒株诱导免疫应答或产生免疫。镶嵌HIV包膜蛋白是合成HIV包膜蛋白的非限制性实例。在本发明的优选实施例中，HIV Env蛋白是具有根据本发明的指示位置(i)-(vii)处的指示氨基酸中至少一个的共有Env蛋白或合成Env蛋白。特别优选的是具有根据本发明的指示位置(i)-(vii)处的指示氨基酸残基中至少一个、优选至少两个的共有Env蛋白，优选具有如下所述的另外的SOSIP和/或弗林蛋白酶切割位点突变。
[0116] 在本发明的某些实施例中，HIV包膜蛋白(无论天然存在的序列、镶嵌序列、共有序列、合成序列等)包含额外的序列突变，例如在弗林蛋白酶切割位点中，和/或所谓的SOSIP突变。
[0117] 在本发明的一些实施例中，HIV包膜蛋白是“SOSIP突变体HIV Env蛋白”。所谓的SOSIP突变是包括‘SOS突变’(位置501和605处的Cys残基，其导致在新产生的半胱氨酸残基之间引入可能的二硫桥)和‘IP突变’(位置559处的Pro残基)的三聚体稳定突变。根据本发明的实施例，SOSIP突变体Env蛋白包含选自下组的至少一种突变，该组由以下各项组成：位置501和605处的Cys；位置559处的Pro；并且优选位置501和605处的Cys和位置559处的Pro。SOSIP突变体HIV Env蛋白还可包含其他序列突变，例如在弗林蛋白酶切割位点中。此外，在某些实施例中，可以进一步添加突变，使得Env蛋白包含位置556或位置558或位置556和558处的Pro，其在此处被发现不仅可以充当SOSIP变体中位置559处的Pro的替代物，还可充当额外的突变，所述突变可进一步改进已经具有位置559处的Pro的SOSIP变体的三聚体形成。
[0118] 在本发明的某些优选实施例中，SOSIP突变体HIV Env蛋白包含位置501和605处的Cys和位置559处的Pro。
[0119] 在某些实施例中，本发明的HIV包膜蛋白还包含弗林蛋白酶切割位点中的突变。弗林蛋白酶切割序列中的突变可以是氨基酸取代、缺失、插入或一个序列被另一个替换或接头氨基酸序列进行的替换。优选地，在本发明中，使弗林蛋白酶切割位点突变可用于优化切割位点，使得弗林蛋白酶切割比野生型有所改进，例如通过用RRRRRR(SEQ ID NO:10)替换残基508-511处的序列)[即用四个精氨酸残基替换位置509-510处的典型氨基酸序列(例如EK)(即两个替换和两个添加)，而在位置508和511处，大多数HIV Env蛋白中已经存在精氨酸残基，因此这些典型不需要被替换，但是由于文献中的最终结果常被称为氨基酸序列RRRRRR，我们在此保留了这一命名]。改进弗林蛋白酶切割的其他突变是已知的，并且也可以使用。可替代地，可以用接头替换弗林蛋白酶切割位点，使得弗林蛋白酶切割不再是必要的，但是蛋白将采用天然样构象(例如描述于(Sharma等人,2015)和(Georgiev等人,2015)中)。
[0120] 在本发明的具体实施例中，本发明的HIV包膜蛋白还包含所谓的SOSIP突变(优选位置501和605处的Cys和位置559处的Pro)和弗林蛋白酶切割位点中的序列突变，优选用RRRRRR(SEQ ID NO:10)替换残基508-511处的序列。在某些优选实施例中，HIV Env包含指示SOSIP和弗林蛋白酶切割位点突变，并且此外还包含位置556或位置558、最优选地位置556和558处的Pro残基。
[0121] 在本发明的优选实施例中，HIV包膜蛋白的氨基酸序列是共有序列，如HIV包膜进化枝C共有序列或HIV包膜进化枝B共有序列。在特别优选的实施例中，HIV包膜蛋白的氨基酸序列是HIV包膜进化枝C共有序列。
[0122] 可用于本发明的示例性HIV包膜蛋白包括HIV包膜进化枝C共有序列(SEQ ID NO:2)和HIV包膜进化枝B共有序列(SEQ ID NO:4)。这些HIV包膜进化枝C和进化枝B共有序列可以包含例如增强稳定性和/或三聚体形成的额外突变，如例如所述的所谓SOSIP突变和/或如上所述的弗林蛋白酶切割位点中的序列突变，如例如SEQ ID NO:3所示的ConC_SOSIP序列和SEQ ID NO:5所示的ConB_SOSIP序列中。
[0123] 可用于本发明的优选HIV包膜蛋白序列的其他非限制性实例(如‘背景’或‘亲本’分子，其中然后引入本发明的一个或多个突变)包括合成HIV Env蛋白，例如包含SEQ ID NO:6或在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6的氨基酸序列，两者之一任选地具有如上所述的另外的SOSIP和/或弗林蛋白酶切割位点突变。另一个非限制性实例是SEQ ID NO:7。另外的非限制性实例是镶嵌HIV包膜蛋白，例如具有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的那些。
[0124] 在某些实施例中，亲本分子是野生型HIV Env蛋白，其中根据此处所述的方法修复了一个或优选多个氨基酸。这样的亲本分子包含以至少100个、优选至少500个、优选至少1000个、优选至少10000个、优选至少20000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置的氨基酸残基处的至少一个修复突变，其中该修复突变是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的取代。优选地，所述取代是以在所述集合中至少15％、至少20％、至少25％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的。优选地，所述取代是在所述集合中最常见的由存在于对应位置处的氨基酸残基进行的。在某些优选实施例中，所述亲本分子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20个这样的修复突变。优选地，与野生型Env蛋白相比，在亲本分子中以所述集合中小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置处的氨基酸残基的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％或全部被修复。在某些实施例中，与野生型Env蛋白相比，在亲本分子中以所述集合中小于7.5％的HIV Env序列的频率存在于对应位置处的氨基酸残基的10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％或全部被修复。在某些实施例中，野生型HIV Env蛋白来自进化枝A、B或C毒株，优选来自进化枝C毒株。作为这种修复突变的结果，亲本分子将显示比原始野生型毒株更相似于HIV Env共有序列，因此经修复的氨基酸残基在此处有时被称为‘共有氨基酸’或‘共有残基’。这种修复活性的结果是所得亲本分子的关于折叠、三聚化、表达和/或稳定性的大大增强的性质，并且所得分子在此处称为‘经修复的Env蛋白’。向这样的亲本分子中添加本发明的稳定突变(例如(i)-(vii)(表1)和/或(xvi)(表1)和/或任选地(viii)-(xv)(表2)中的一个或多个)导致三聚体百分比、三聚体产量、稳定性、广泛中和抗体结合、折叠中的一项或多项的进一步改进，并且衍生自野生型HIV Env蛋白的所得分子此处被称为‘经修复的和稳定的Env蛋白’本领域技术人员将清楚，引入稳定突变实际上将得到的序列从共有序列中转移一点，因此经修复的和稳定的HIV Env分子的大大增强的性质的净结果是基于两个完全不同的概念。
90％或全部被修复。在某些实施例中，与野生型Env蛋白相比，在亲本分子中以所述集合中小于7.5％的HIV Env序列的频率存在于对应位置处的氨基酸残基的10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％或全部被修复。在某些实施例中，野生型HIV Env蛋白来自进化枝A、B或C毒株，优选来自进化枝C毒株。作为这种修复突变的结果，亲本分子将显示比原始野生型毒株更相似于HIV Env共有序列，因此经修复的氨基酸残基在此处有时被称为‘共有氨基酸’或‘共有残基’。这种修复活性的结果是所得亲本分子的关于折叠、三聚化、表达和/或稳定性的大大增强的性质，并且所得分子在此处称为‘经修复的Env蛋白’。向这样的亲本分子中添加本发明的稳定突变(例如(i)-(vii)(表1)和/或(xvi)(表1)和/或任选地(viii)-(xv)(表2)中的一个或多个)导致三聚体百分比、三聚体产量、稳定性、广泛中和抗体结合、折叠中的一项或多项的进一步改进，并且衍生自野生型HIV Env蛋白的所得分子此处被称为‘经修复的和稳定的Env蛋白’本领域技术人员将清楚，引入稳定突变实际上将得到的序列从共有序列中转移一点，因此经修复的和稳定的HIV Env分子的大大增强的性质的净结果是基于两个完全不同的概念。
[0125] 导致根据本发明的位置(i)-(vii)处的指示氨基酸的突变也可用于其中不存在SOSIP突变(例如，在Env共有序列中或在来自野生型HIV分离株的Env蛋白中)的HIV Env蛋白，并且可能也改进其三聚化，因为本发明的突变独立于SOSIP突变，并且此外还显示在几个不同的HIV Env蛋白骨架中起作用。确实，此处显示根据本发明的突变可以在不存在SOS突变的情况下以及在不存在IP突变的情况下起作用，以改进HIV Env三聚化性质。
[0126] 根据本发明的实施例的重组HIV包膜蛋白包含在HIV包膜蛋白的氨基酸序列中的特定位置处具有某一个或多个氨基酸残基的HIV包膜蛋白。具体地，鉴定了包膜蛋白中的七个位置，以及在每个鉴定位置处理想的具体氨基酸残基。包膜蛋白序列中的鉴定位置包括(i)位置651，(ii)位置655，(iii)位置535，(iv)位置589，(v)位置573，(vi)位置204和(vii)位置647，其中位置的编号根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。根据本发明的HIV Env蛋白在指示位置(i)-(vii)中的至少一个、优选在指示位置(i)-(vii)中的至少两个、更优选在指示位置(i)-(vii)中的至少三个位置中具有一个或多个特定氨基酸残基。根据本发明的实施例，在每个鉴定位置处理想的具体氨基酸残基示于表1中。这些选项的优选位置是(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(vi)和/或(vii)。这些选项的特别优选位置是(i)、(ii)、(iii)、(iv)、和/或(vii)。额外优选的选项是(xvi)，此处稍后将会更详细一些地提及。
[0127] 表1：根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的指示位置处理想的氨基酸[0128]
[0129]
[0130] 1根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号
[0131] 其中在一个或多个指示位置处引入一个或多个更理想的氨基酸(或指示氨基酸)取代的HIV包膜蛋白的氨基酸序列被称为“骨架HIV包膜序列”或“亲本HIV包膜序列”。例如，如果SEQ ID NO:3的ConC_SOSIP序列中的位置651突变为Phe，则ConC_SOSIP序列被认为是“骨架”或“亲本”序列。可以使用根据本发明的实施例可以引入新颖的稳定突变的任何HIV包膜蛋白作为“骨架”或“亲本”序列，单独或与其他突变组合，例如所谓的SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点中的突变。可用作骨架的HIV Env蛋白的非限制性实例包括来自天然HIV分离株的HIV Env蛋白、合成HIV Env蛋白或共有HIV Env蛋白，并且在某些非限制性实例中包括包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的那些。
[0132] 根据本发明的实施例，HIV包膜蛋白可以在选自下组的指示位置中的至少一个处具有指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：位置651、655、535、589、573、204和647，如在一个、二个、三个、四个、五个、六个或七个位置处的指示氨基酸残基。优选地，HIV包膜蛋白在指示位置中的一个、两个或三个处被取代，并且更优选地，HIV包膜蛋白在指示位置中的至少两个处被取代。甚至更优选地，HIV Env蛋白在指示位置中的三个、指示位置中的四个、指示位置中的五个、指示位置中的六个、或指示位置中的所有七个处被取代。优选地，HIV包膜蛋白在指示位置中的至少两个处含有指示氨基酸残基。更优选地，HIV包膜蛋白在指示位置中的三个处含有指示氨基酸残基。在其他优选的实施例中，HIV包膜蛋白在指示位置中的四、五、六或全部七处含有指示氨基酸残基。
[0133] 在多个位置处具有指示氨基酸的HIV Env蛋白的实施例(根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号对位置进行编号，随后是在该位置上存在的残基的一字母氨基酸代码，在一个HIV Env蛋白实施例内的位置被逗号分开[例如具有位置651处的Phe和位置655处的Ile的Env蛋白的实施例被描述为651F，655I]，而不同的实施例(即不同的HIV Env蛋白)被分号分开)包括以下。
[0134] 在两个位置具有指示的氨基酸的Env蛋白：651F，655I；651F，655F；651F，655M；651F，655W；651F，535N；651F，535Q；651F，589V；651F，589I；651F，589A；651F，573F；651F，
573W；651F，204I；651F，647F；651F，647I；651F，647M；651L，655I；651L，655F；651L，655M；
651L，655W；651L，535N；651L，535Q；651L，589V；651L，589I；651L，589A；651L，573F；651L，
573W；651L，204I；651L，647F；651L，647I；651L，647M；651M，655I；651M，655F；651M，655A；
651M，655L；651M，655W；651M，535N；651M，535Q；651M，589V；651M，589I；651M，589A；651M，
573F；651M，573W；651M，204I；651M，647F；651M，647I；651M，647M；651W，655I；651W，655F；
651W，655M；651W，655W；651W，535N；651W，535Q；651W，589V；651W，589I；651W，589A；651W，
573F；651W，573W；651W，204I；651W，647F；651W，647I；651W，647M；655I，535N；655I，535Q；
655I，589V；655I，589I；655I，589A；655I，573F；655I，573W；655I，204I；655I，647F；655I，
647I；655I，647M；655F，535N；655F，535Q；655F，589V；655F，589I；655F，589A；655F，573F；
655F，573W；655F，204I；655F，647F；655F，647I；655F，647M；655M，535N；655M，535Q；655M，
589V；655M，589I；655M，589A；655M，573F；655M，573W；655M，204I；655M，647F；655M，647I；
655M，647M；655W，535N；655W，535Q；655W，589V；655W，589I；655W，589A；655W，573F；655W，
573W；655W，204I；655W，647F；655W，647I；655W，647M；535N，589V；535N，589I；535N，589A；
535N，573F；535N，573W；535N，204I；535N，647F；535N，647I；535N，647M；535Q，589V；535Q，
589I；535Q，589A；535Q，573F；535Q，573W；535Q，204I；535Q，647F；535Q，647I；535Q，647M；
589V，573F；589V，573W；589V，204I；589V，647F；589V，647I；589V，647M；589I，573F；589I，
573W；589I，204I；589I，647F；589I，647I；589I，647M；589A，573F；589A，573W；589A，204I；
589A，647F；589A，647I；589A，647M；573F，204I；573F，647F；573F，647I；573F，647M；573W，
204I；573W，647F；573W，647I；573W，647M；204I，647F；204I，647I；201I，647M。根据本发明，那些实施例中的每个可以存在于任何HIV Env序列中，例如野生型分离株或SOSIP突变体HIV Env蛋白或共有HIV Env蛋白或合成HIV Env蛋白。那些实施例中的每个可以与来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第三位置处的根据本发明的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的三个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第四位置处的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的四个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第五位置处的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的五个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第六位置处的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的六个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第七位置处的优选氨基酸之一组合，使得Env蛋白在根据本发明的所有七个位置(i)-(vii)都具有根据本发明的优选氨基酸。在本发明的位置(v)-(vii)中的位置中的三、四、五、六或七个处具有本发明的优选氨基酸的这些另外的实施例中的任一个可以存在于任何HIV Env蛋白中，如来自野生型分离株、SOSIP变体、共有HIV Env蛋白、合成HIV Env蛋白等。
573W；651F，204I；651F，647F；651F，647I；651F，647M；651L，655I；651L，655F；651L，655M；
651L，655W；651L，535N；651L，535Q；651L，589V；651L，589I；651L，589A；651L，573F；651L，
573W；651L，204I；651L，647F；651L，647I；651L，647M；651M，655I；651M，655F；651M，655A；
651M，655L；651M，655W；651M，535N；651M，535Q；651M，589V；651M，589I；651M，589A；651M，
573F；651M，573W；651M，204I；651M，647F；651M，647I；651M，647M；651W，655I；651W，655F；
651W，655M；651W，655W；651W，535N；651W，535Q；651W，589V；651W，589I；651W，589A；651W，
573F；651W，573W；651W，204I；651W，647F；651W，647I；651W，647M；655I，535N；655I，535Q；
655I，589V；655I，589I；655I，589A；655I，573F；655I，573W；655I，204I；655I，647F；655I，
647I；655I，647M；655F，535N；655F，535Q；655F，589V；655F，589I；655F，589A；655F，573F；
655F，573W；655F，204I；655F，647F；655F，647I；655F，647M；655M，535N；655M，535Q；655M，
589V；655M，589I；655M，589A；655M，573F；655M，573W；655M，204I；655M，647F；655M，647I；
655M，647M；655W，535N；655W，535Q；655W，589V；655W，589I；655W，589A；655W，573F；655W，
573W；655W，204I；655W，647F；655W，647I；655W，647M；535N，589V；535N，589I；535N，589A；
535N，573F；535N，573W；535N，204I；535N，647F；535N，647I；535N，647M；535Q，589V；535Q，
589I；535Q，589A；535Q，573F；535Q，573W；535Q，204I；535Q，647F；535Q，647I；535Q，647M；
589V，573F；589V，573W；589V，204I；589V，647F；589V，647I；589V，647M；589I，573F；589I，
573W；589I，204I；589I，647F；589I，647I；589I，647M；589A，573F；589A，573W；589A，204I；
589A，647F；589A，647I；589A，647M；573F，204I；573F，647F；573F，647I；573F，647M；573W，
204I；573W，647F；573W，647I；573W，647M；204I，647F；204I，647I；201I，647M。根据本发明，那些实施例中的每个可以存在于任何HIV Env序列中，例如野生型分离株或SOSIP突变体HIV Env蛋白或共有HIV Env蛋白或合成HIV Env蛋白。那些实施例中的每个可以与来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第三位置处的根据本发明的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的三个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第四位置处的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的四个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第五位置处的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的五个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第六位置处的优选氨基酸之一组合。在指示位置(i)-(vii)的六个位置处具有优选氨基酸残基的这些实施例可以与在来自根据本发明的(i)-(vii)的其他指示位置之一的第七位置处的优选氨基酸之一组合，使得Env蛋白在根据本发明的所有七个位置(i)-(vii)都具有根据本发明的优选氨基酸。在本发明的位置(v)-(vii)中的位置中的三、四、五、六或七个处具有本发明的优选氨基酸的这些另外的实施例中的任一个可以存在于任何HIV Env蛋白中，如来自野生型分离株、SOSIP变体、共有HIV Env蛋白、合成HIV Env蛋白等。
[0135] 根据本发明在两个位置具有指示的氨基酸的优选Env蛋白是：651F，655I；651F，535N；651F，589V；651F，589I；651F，573F；651F，204I；651F，647F；655I，535N；655I，589V；
655I，589I；655I，573F；655I，204I；655I，647F；535N，589V；535N，589I；535N，573F；535N，
204I；535N，647F；589V，573F；589V，204I；589V，647F；589I，573F；589I，204I；589I，647F；
573F，204I；573F，647F；204I，647F。根据本发明在至少两个位置具有优选的氨基酸的特别优选的Env蛋白包括：651F，655I；655I，535N；655I，589V；535N，589V；535N，647F。
655I，589I；655I，573F；655I，204I；655I，647F；535N，589V；535N，589I；535N，573F；535N，
204I；535N，647F；589V，573F；589V，204I；589V，647F；589I，573F；589I，204I；589I，647F；
573F，204I；573F，647F；204I，647F。根据本发明在至少两个位置具有优选的氨基酸的特别优选的Env蛋白包括：651F，655I；655I，535N；655I，589V；535N，589V；535N，647F。
[0136] 在三个位置具有优选的氨基酸残基的一些优选的HIV Env蛋白是：651F，655I，535N；651F，589V，535N；651F，589I，535N；651F，573F，535N；651F，204I，535N；651F，647F，
535N；655I，589V，535N；655I，589I，535N；655I，573F，535N；655I，204I，535N；655I，647F，
535N；589V，573F，535N；589V，204I，535N；589V，647F，535N；589I，573F，535N；589I，204I，
535N；589I，647F，535N；573F，204I，535N；573F，647F，535N；204I，647F，535N；651F，655I，
589V；651F，573F，589V；651F，204I，589V；651F，647F，589V；655I，573F，589V；655I，204I，
589V；655I，647F，589V；573F，204I，589V；573F，647F，589V；204I，647F，589V；651F，655I，
589I；651F，573F，589I；651F，204I，589I；651F，647F，589I；655I，573F，589I；655I，204I，
589I；655I，647F，589I；573F，204I，589I；573F，647F，589I；204I，647F，589I；651F，655I，
573F；651F，204I，573F；651F，647F，573F；655I，204I，573F；655I，647F，573F；204I，647F，
573F；651F，655I，204I；651F，647F，204I；655I，647F，204I；651F，655I，647F；655I，651F，
647F；655I，651F，535N；655I，589V，573F；655I，589V，204I。根据本发明在至少三个位置具有优选的氨基酸的特别优选的Env蛋白包括：651F，655I，535N；655I，589V，535N；655I，
573F，589V；655I，204I，589V；651F，655I，647F。
535N；655I，589V，535N；655I，589I，535N；655I，573F，535N；655I，204I，535N；655I，647F，
535N；589V，573F，535N；589V，204I，535N；589V，647F，535N；589I，573F，535N；589I，204I，
535N；589I，647F，535N；573F，204I，535N；573F，647F，535N；204I，647F，535N；651F，655I，
589V；651F，573F，589V；651F，204I，589V；651F，647F，589V；655I，573F，589V；655I，204I，
589V；655I，647F，589V；573F，204I，589V；573F，647F，589V；204I，647F，589V；651F，655I，
589I；651F，573F，589I；651F，204I，589I；651F，647F，589I；655I，573F，589I；655I，204I，
589I；655I，647F，589I；573F，204I，589I；573F，647F，589I；204I，647F，589I；651F，655I，
573F；651F，204I，573F；651F，647F，573F；655I，204I，573F；655I，647F，573F；204I，647F，
573F；651F，655I，204I；651F，647F，204I；655I，647F，204I；651F，655I，647F；655I，651F，
647F；655I，651F，535N；655I，589V，573F；655I，589V，204I。根据本发明在至少三个位置具有优选的氨基酸的特别优选的Env蛋白包括：651F，655I，535N；655I，589V，535N；655I，
573F，589V；655I，204I，589V；651F，655I，647F。
[0137] 在四个位置具有优选的氨基酸残基的一些优选的HIV Env蛋白是651F，655I，535N，589V；651F，655I，535N，573F；651F，655I，589V，573F；651F，535N，589V，573F；655I，
535N，589V，573F；651F，655I，535N，204I；651F，655I，589V，204I；651F，535N，589V，204I；
655I，535N，589V，204I；651F，655I，573F，204I；651F，535N，573F，204I；655I，535N，573F，
204I；651F，589V，573F，204I；655I，589V，573F，204I；535N，589V，573F，204I；651F，655I，
535N，647F；651F，655I，589V，647F；651F，535N，589V，647F；655I，535N，589V，647F；651F，
655I，573F，647F；651F，535N，573F，647F；655I，535N，573F，647F；651F，589V，573F，647F；
655I，589V，573F，647F；535N，589V，573F，647F；651F，655I，204I，647F；651F，535N，204I，
647F；655I，535N，204I，647F；651F，589V，204I，647F；655I，589V，204I，647F；535N，589V，
204I，647F；651F，573F，204I，647F；655I，573F，204I，647F；535N，573F，204I，647F；以及
589V，573F，204I，647F。
535N，589V，573F；651F，655I，535N，204I；651F，655I，589V，204I；651F，535N，589V，204I；
655I，535N，589V，204I；651F，655I，573F，204I；651F，535N，573F，204I；655I，535N，573F，
204I；651F，589V，573F，204I；655I，589V，573F，204I；535N，589V，573F，204I；651F，655I，
535N，647F；651F，655I，589V，647F；651F，535N，589V，647F；655I，535N，589V，647F；651F，
655I，573F，647F；651F，535N，573F，647F；655I，535N，573F，647F；651F，589V，573F，647F；
655I，589V，573F，647F；535N，589V，573F，647F；651F，655I，204I，647F；651F，535N，204I，
647F；655I，535N，204I，647F；651F，589V，204I，647F；655I，589V，204I，647F；535N，589V，
204I，647F；651F，573F，204I，647F；655I，573F，204I，647F；535N，573F，204I，647F；以及
589V，573F，204I，647F。
[0138] 在至少四个位置具有优选的氨基酸残基的优选的HIV Env蛋白的一些实例包括：651F，655I，647F，I535N；651F，655I，573F，589V。在至少四个位置处包含指示氨基酸残基的HIV Env蛋白的优选实例包括535N，589V，651F，655I。这种HIV Env蛋白的非限制性实例在SEQ ID NO:20、22、24、26,27、28、29、30、31和32中提供。优选地，这种HIV Env蛋白是进化枝C HIV Env蛋白或进化枝A HIV Env蛋白，最优选地是进化枝C HIV Env蛋白。在某些实施例中，所述HIV Env蛋白还包含588E，即它包含至少535N，588E，589V，651F，655I。这些HIV Env蛋白的非限制性实例在SEQ ID NO:20、24、26、27、28、29、30、31和32中提供。在某些实施例中，所述HIV Env还包含556P，即它包含至少535N，556P，589V，651F，655I或至少535N，556P，
588E，589V，651F，655I。这些HIV Env蛋白的非限制性实例在SEQ ID NO:22、24、26、27、29、
30、31和32中提供。
588E，589V，651F，655I。这些HIV Env蛋白的非限制性实例在SEQ ID NO:22、24、26、27、29、
30、31和32中提供。
[0139] 在一个实施例中，根据本发明的重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少两个处具有指示氨基酸残基的HIV Env蛋白的氨基酸序列，该组由以下各项组成：
[0140] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp；
[0141] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp；
[0142] (iii)位置535处的Asn或Gln；
[0143] (iv)位置589处的Val、Ile、或Ala；
[0144] (v)位置573处的Phe或Trp；
[0145] (vi)位置204处的Ile；以及
[0146] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile。
[0147] 例如，重组HIV Env蛋白可以具有位置651处的Phe、Leu、Met或Trp之一和位置535处的Asn或Gln，任选地在额外的指示位置处的额外的指示氨基酸残基。优选地，通过氨基酸取代将(i)-(vii)中的氨基酸中的至少一个引入重组HIV Env蛋白中。例如，重组HIV Env蛋白可以由HIV Env蛋白产生，所述HIV Env蛋白不含有以上的(i)-(vii)中的氨基酸残基或仅含有其中一个，使得至少两个指示氨基酸残基中的全部或一个或多个通过氨基酸取代被引入重组HIV Env蛋白中。
[0148] 在某些实施例中，本发明的重组HIV Env蛋白还包含(viii)位置588处的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp或Phe，其中Gln或Glu是优选的。
[0149] 鉴于本披露，引入上述取代的HIV Env蛋白的氨基酸序列可以是本领域已知的任何HIV Env蛋白，如例如来自HIV进化枝A、进化枝B、进化枝C等的天然存在的序列；镶嵌序列；共有序列，例如进化枝B或进化枝C共有序列；合成序列；或其衍生物或片段。在本发明的某些实施例中，HIV Env蛋白的氨基酸序列包含额外的突变，如例如所谓的SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点中的突变。
[0150] 在一个具体实施例中，HIV Env骨架蛋白是包含选自下组的至少一种突变的SOSIP突变体HIV Env蛋白，该组由以下各项组成：位置501和605处的Cys；位置559处的Pro。在优选实施例中，SOSIP突变体HIV Env蛋白包含位置501和605处的Cys和位置559处的Pro。根据此实施例，重组HIV Env蛋白包含该SOSIP突变体HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0151] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp；
[0152] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp；
[0153] (iii)位置535处的Asn或Gln；
[0154] (iv)位置589处的Val、Ile、或Ala；
[0155] (v)位置573处的Phe或Trp；
[0156] (vi)位置204处的Ile；以及
[0157] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile。
[0158] SOSIP突变体HIV Env蛋白还可包含弗林蛋白酶切割位点中的突变，如由SEQ ID NO:10进行的位置608-511处的替换。
[0159] 在另一个实施例中，根据本发明的重组HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0160] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp；
[0161] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp；
[0162] (iii)位置535处的Asn或Gln；
[0163] (iv)位置589处的Val、Ile、或Ala；
[0164] (v)位置573处的Phe或Trp；
[0165] (vi)位置204处的Ile；以及
[0166] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，
[0167] 其中该HIV Env蛋白选自下组，该组由以下各项组成：
[0168] (1)HIV Env共有序列，如进化枝C或进化枝B共有序列，例如包含SEQ ID NO:2、3、4或5的氨基酸序列；
[0169] (2)一种合成HIV Env蛋白，例如包含(a)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6；(c)SEQ ID NO:7；(d)SEQ ID NO:8或9，任选地具有如上所述的另外的SOSIP和/或弗林蛋白酶切割位点突变的(a)、(b)或(d)。
[0170] 优选地，该重组HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少两个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：以上的(i)-(vii)，如两个位置或三个位置。然而，重组HIV Env蛋白可以包含在指示位置中的一个或多个处(如指示位置中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个处)由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代。
[0171] 在一个具体实施例中，HIV Env骨架蛋白是包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的HIV Env共有进化枝C。优选地，SEQ ID NO:2的HIV共有进化枝C序列还包含所谓的SOSIP突变，即位置501和605处的Cys和位置559处的Pro，并且更优选地还包含所谓的SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点中的突变，如例如在位置508-511处由SEQ ID NO:10进行的替换。在特别优选的实施例中，HIV Env骨架蛋白包含SEQ ID NO:3中所示的序列，或与其至少95％一致的序列，其中优选地如由SEQ ID NO:10替换的位置501、559、605和508-511处的氨基酸与SEQ ID NO:3相比未突变。
[0172] 在另一个具体实施例中，HIV Env骨架蛋白是包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的HIV Env共有进化枝B。优选地，SEQ ID NO:4的HIV共有进化枝B序列还包含所谓的SOSIP突变，即位置501和605处的Cys和位置559处的Pro，并且更优选地还包含所谓的SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点中的突变，如例如在位置508-511处由SEQ ID NO:10进行的替换。在特别优选的实施例中，HIV Env骨架蛋白包含SEQ ID NO:5中所示的序列，或与其至少95％一致的序列，其中优选地如由SEQ ID NO:10替换的位置501、559、605和508-511处的氨基酸与SEQ ID NO:5相比未突变。
[0173] 在又另一个具体实施例中，HIV Env骨架蛋白是一种合成HIV Env蛋白，例如包含(a)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6；(c)SEQ ID NO:7；或(d)SEQ ID NO:8或9，任选地具有如上所述的另外的SOSIP(501C、605C、559P)和/或弗林蛋白酶切割位点突变(508-511RRRRRR)的(a)(b)或(d)。
[0174] 在又其他具体实施例中，HIV Env骨架蛋白是来自野生型进化枝A或进化枝C HIV病毒的HIV Env蛋白，任选地包含根据此处所述的方法来修复序列的突变。
[0175] HIV Env蛋白中可以同时取代的两个位置的示例性组合包括残基535，589；535，647；以及589，655；如例如在双突变体I535N，D589V；I535N，E647F；和D589V，K655I中。其他双突变体包括K655I，I535N；N651F，K655I；和K655I，I573F。HIV Env蛋白中可以同时取代的三个位置的示例性组合包括535，589，655，如例如在三突变体I535N，D589V，K655I中。其他三突变体包括K655I，D589V，I573F；和K655I，N651F，I535N。
[0176] 在本发明的某些实施例中，根据本发明的重组HIV Env蛋白还可以包含在选自下组的一个或多个额外的指示位置处的指示氨基酸残基(例如通过取代)，该组由以下各项组成：位置(viii)588，(ix)64或66，(x)316，(xi)201/433，(xii)556或558或556和558，(xiii)548-568，(xiv)568、569和636或(xv)302、519或520，如下表2所示。本发明人发现这些氨基酸取代(例如(viii))中某些与上述根据本发明的突变(组合)(i)-(vii)非常好地组合。这些氨基酸取代中的其他以前在文献中报道过。例如，De Taeye等人(Cell[细胞](2015)163(7),1702-15)报道了具有E64K和T316W双突变的HIV包膜蛋白和具有66R突变的HIV Env蛋白；并且Kwon等人(Nat.Struct.Mol.Biol.[自然结构与分子生物学](2015)22(7)522-31)报道了具有I204C、A433C二硫化物取代的HIV包膜蛋白；并且Guenaga等人(Immunity[免疫力](2017)46,792-803)报道了具有L568G、T569G或N636G以及N302Y、F519R、L520R三重取代的HIV包膜蛋白。然而，就本发明人所知，这些先前描述的突变没有结合此处所述的任何新颖的取代(例如，表1中所列的替换)来描述。这些氨基酸突变与本发明的氨基酸取代组合可以进一步增加三聚体产量和/或三聚体形成百分比。除了在如表1中所述的指示位置中的一个或多个处用指示氨基酸残基进行的取代外，还可将那些氨基酸取代引入此处所述的任何重组HIV Env蛋白中。
[0177] 表2：氨基酸取代和残基取代的额外位置
[0178]
[0179]
[0180] 1根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号
[0181] 在本发明的指示位置[(i)-(vii)，参见例如表1]处鉴定的取代不以天然序列存在或很少以天然序列存在，在以前报道的HIV Env蛋白序列中未组合发现，并且以前没有提出导致改进HIV Env蛋白的三聚化、改进三聚体产量和/或增加三聚体稳定性。表2中的突变(ix)-(xi)(以前由其他人报道)都在三聚体特异性抗体PGT145结合的gp120区域中。这些突变使三聚体在顶点(在分子顶部)保持封闭。取代(xii)和(xiii)都在gp41的HR1中。除了位置204外，表1中本发明的突变都在gp41区域(分子的底部)中，但在HR1区域外。显然，以前描述的突变没有提供针对引入本发明的突变的任何建议，更不必说如通过PGT145结合测量的其对具有封闭顶点的三聚体形成的惊人效果。除了表2中的点突变(viii)-(xii)外，还可以由以下替换Env蛋白的HR1环(野生型序列中的氨基酸残基548-568，根据HXB2分离株的gp160的编号)：具有7-10个氨基酸的较短且少柔性的环，优选8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ ID NO:12-17)中任一个的序列，参见，例如Kong等人(Nat Commun.[自然通讯]2016年6月28日；7:12040.doi:10.1038/ncomms12040)描述了这样的较短的环替换HR1环。在根据本发明的指示位置(i)-(vii)中的至少一个且优选至少两个处另外具有指示氨基酸残基的这样的Env变体也是本发明的实施例。在本发明的某些实施例中，可将(viii)-(xiii)中列出的突变添加到本发明的HIV Env蛋白中，即在(i)-(vii)位置处具有一个或多个指示氨基酸。另外，可以进行组(viii)-(xiii)内的组合，非限制性实例是在(viii)和(xii)处的突变(除了(i)-(vii)的至少一个突变外)的组合(例如I535N、A556P、K588E)。在具有SOSIP突变和位置(i)-(vii)中至少一个和位置(viii)-(xiii)中至少一个处的组合突变的HIV Env背景下制备的双突变体的一些非限制性实例包括：535，588；588，589；655，588；558，535；以及655，556；如例如I535N，K588E；588Q，D589V；K655I，K588E；A558P，I535N；以及K655I，L556P。这样的三突变体的一些非限制性实例包括558，535，588；558，535，589；558，535，655；以及558，535，651，如例如A558P，I535N，K588E；A558P，I535，D589V；A558P，I535N，K655I；以及A558P，I535N，N651F。
[0182] 根据本发明的组合的另外的非限制性实例包括655I，573F，589V，588E；651F，655I，573F，589V，588E；651F，655I，573F，589V，588E，535N；651F，655I，573F，589V，588E，
535N，204I；651F，655I，556P；651F，535N，556P；651F，589V，556P；651F，589I，556P；651F，
573F，556P；651F，204I，556P；651F，647F，556P；655I，535N，556P；655I，589V，556P；655I，
589I，556P；655I，573F，556P；655I，204I，556P；655I，647F，556P；535N，589V，556P；535N，
589I，556P；535N，573F，556P；535N，204I，556P；535N，647F，556P；589V，573F，556P；589V，
204I，556P；589V，647F，556P；589I，573F，556P；589I，204I，556P；589I，647F，556P；573F，
204I，556P；573F，647F，556P；651F，655I，558P；651F，535N，558P；651F，589V，558P；651F，
589I，558P；651F，573F，558P；651F，204I，558P；651F，647F，558P；655I，535N，558P；655I，
589V，558P；655I，589I，558P；655I，573F，558P；655I，204I，558P；655I，647F，558P；535N，
589V，558P；535N，589I，558P；535N，573F，558P；535N，204I，558P；535N，647F，558P；589V，
573F，558P；589V，204I，558P；589V，647F，558P；589I，573F，558P；589I，204I，558P；589I，
647F，558P；573F，204I，558P；573F，647F，558P；655I，589V，535N，556P；651F，655I，535N，
556P；556P，651F；556P，651F，655I，535N；655I，589V，573F，651F，588E，556P；556P，651F，
655I，535N，573F；556P，651F，655I，535N，573F，589V；556P，651F，655I，535N，573F，589V，
204I；556P，651F，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，651F，655I，535N，573F，589V，
204I，588Q，647F；556P，651F，535N，573F；556P，651F，535N，573F，589V；556P，651F，535N，
573F，589V，204I；556P，651F，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，651F，535N，573F，589V，
204I，588Q，647F；556P，655I，535N，573F；556P，655I，535N，573F，589V；556P，655I，535N，
573F，589V，204I；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，655I，535N，573F，589V，
204I，588Q，647F。再次，那些实施例中任一个可以在任何HIV Env蛋白中，例如，野生型分离株、共有Env、合成Env蛋白、SOSIP突变体Env蛋白、含有根据此处所述的概念的修复突变的野生型分离株等。根据本发明的一些优选组合包括655I，589V，573F，651F，588E，535N，
204I；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；204I，535N，556P，588E，589V，651F，655I；
535N，556P，589V，651F，655I；以及535N，556P，588E，589V，651F，655I。
535N，204I；651F，655I，556P；651F，535N，556P；651F，589V，556P；651F，589I，556P；651F，
573F，556P；651F，204I，556P；651F，647F，556P；655I，535N，556P；655I，589V，556P；655I，
589I，556P；655I，573F，556P；655I，204I，556P；655I，647F，556P；535N，589V，556P；535N，
589I，556P；535N，573F，556P；535N，204I，556P；535N，647F，556P；589V，573F，556P；589V，
204I，556P；589V，647F，556P；589I，573F，556P；589I，204I，556P；589I，647F，556P；573F，
204I，556P；573F，647F，556P；651F，655I，558P；651F，535N，558P；651F，589V，558P；651F，
589I，558P；651F，573F，558P；651F，204I，558P；651F，647F，558P；655I，535N，558P；655I，
589V，558P；655I，589I，558P；655I，573F，558P；655I，204I，558P；655I，647F，558P；535N，
589V，558P；535N，589I，558P；535N，573F，558P；535N，204I，558P；535N，647F，558P；589V，
573F，558P；589V，204I，558P；589V，647F，558P；589I，573F，558P；589I，204I，558P；589I，
647F，558P；573F，204I，558P；573F，647F，558P；655I，589V，535N，556P；651F，655I，535N，
556P；556P，651F；556P，651F，655I，535N；655I，589V，573F，651F，588E，556P；556P，651F，
655I，535N，573F；556P，651F，655I，535N，573F，589V；556P，651F，655I，535N，573F，589V，
204I；556P，651F，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，651F，655I，535N，573F，589V，
204I，588Q，647F；556P，651F，535N，573F；556P，651F，535N，573F，589V；556P，651F，535N，
573F，589V，204I；556P，651F，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，651F，535N，573F，589V，
204I，588Q，647F；556P，655I，535N，573F；556P，655I，535N，573F，589V；556P，655I，535N，
573F，589V，204I；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；556P，655I，535N，573F，589V，
204I，588Q，647F。再次，那些实施例中任一个可以在任何HIV Env蛋白中，例如，野生型分离株、共有Env、合成Env蛋白、SOSIP突变体Env蛋白、含有根据此处所述的概念的修复突变的野生型分离株等。根据本发明的一些优选组合包括655I，589V，573F，651F，588E，535N，
204I；556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；204I，535N，556P，588E，589V，651F，655I；
535N，556P，589V，651F，655I；以及535N，556P，588E，589V，651F，655I。
[0183] 在某些优选实施例中，HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:20、22、24、26、27、28、29、30、31和32中任一个至少95％一致，优选至少96％、97％、98％、99％一致，优选100％一致的序列。为了测定％一致性，优选地不考虑表1和2的位置(i)-(xv)，并且优选地也不考虑位置
501、559和605。优选地，这些位置处的氨基酸残基分别是SEQ ID NO:20、22、24、26、27、28、
29、30、31或32的序列中的氨基酸残基。
501、559和605。优选地，这些位置处的氨基酸残基分别是SEQ ID NO:20、22、24、26、27、28、
29、30、31或32的序列中的氨基酸残基。
[0184] 在某些实施例中，本发明的HIV Env蛋白还包含：(xvi)位置658处的选自Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu的氨基酸残基。优选地，位置658处的氨基酸是Val或Ile，最优选Val。发现了Env蛋白的三聚体百分比和三聚体产量的这种强烈增加，单独地或与选自在此所述的表1的(i)-(vii)和/或表2的(viii)-(xv)的突变组合。
[0185] 根据本发明的实施例，与在如表1所示的位置651、655、535、589、573、204和647中一个或多个处不具有指示氨基酸残基的HIV Env蛋白相比，重组HIV Env蛋白具有(a)改进的三聚体形成百分比和(b)改进的三聚体产量中的至少一项。
[0186] 如在此所使用，“改进的三聚体形成百分比”意指当HIV包膜蛋白的骨架序列含有本发明的氨基酸取代中的一个或多个时，与当HIV包膜序列的骨架序列不含有这种氨基酸取代时形成的三聚体的百分比相比，形成更大百分比的三聚体。如在此所使用，“改进的三聚体产量”意指当HIV包膜蛋白的骨架序列含有本发明的氨基酸取代中的一个或多个时，与当HIV包膜序列的骨架序列不含有这种氨基酸取代时获得的包膜蛋白的三聚体形式的总量相比，获得包膜蛋白的三聚体形式的更大总量。
[0187] 可以通过使用与HIV Env蛋白的三聚体形式特异结合的抗体的抗体结合测定来测量三聚体形成。可用于检测三聚体形式的三聚体特异性抗体的实例包括但不限于单克隆抗体(mAb)PGT145、PGDM1400、PG16和PGT151。优选地，三聚体特异性抗体是mAb PGT145。鉴于本披露，可以使用本领域中已知的任何抗体结合测定来测量本发明的重组HIV Env蛋白的三聚体形成百分比，例如ELISA、AlphaLISA等。
[0188] 在具体实施例中，通过AlphaLISA来测量三聚体形成。AlphaLISA是一种基于珠的邻近测定，其中通过供体珠的高能辐射产生的单线态氧分子转移到相对于供体珠粒大约200nm的距离内的受体珠粒。将单线态氧分子转移到受体珠粒引发了递增系列的化学反应，产生化学发光信号，该化学发光信号则可以检测到(Eglen等人Curr.Chem.Genomics[当前化学基因组学],2008,25(1):2-10)。例如，用Flag-His标签标记的重组HIV包膜蛋白可以用三聚体特异性mAb、同与三聚体特异性mAb结合的抗体缀合的供体珠粒、镍缀合的供体珠粒、与抗His抗体缀合的受体珠粒、以及与抗Flag抗体缀合的受体珠粒进行孵育。可以通过测量从同与三聚体特异性mAb结合的抗体缀合的一对供体珠粒和与抗Flag抗体缀合的受体珠粒生成的化学发光信号来测定形成的三聚体的量。可以通过测量由一对镍缀合的供体珠粒和抗Flag缀合的受体珠粒生成的化学发光信号来测定表达的HIV包膜蛋白的总量。例如，可以如实例3中详细描述的通过AlphaLISA测定来测量三聚体的量和表达的总包膜蛋白。可以通过将形成的三聚体的量除以表达的包膜蛋白的总量来计算三聚体形成百分比。
[0189] 也可以使用能够将三聚体形式与其他形式的HIV包膜蛋白(例如单体形式)分离的色谱技术来测定形成的三聚体的量和表达的包膜蛋白的总量。可以使用的这种技术的实例包括但不限于具有多角度光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)。根据某些实施例，使用SEC-MALS测定三聚体形成百分比。根据某些实施例，使用SEC-MALS测定三聚体产量。
[0190] 核酸、载体和细胞
[0191] 在另一个一般方面，本发明提供了编码根据本发明的重组HIV Env蛋白的核酸分子和包含该核酸分子的载体。本发明的这些核酸分子可以处于RNA形式或处于通过克隆获得或合成产生的DNA形式。该DNA可以是双链或单链的。该DNA可以例如包含cDNA、基因组DNA或其组合。该核酸分子和载体可用于产生重组蛋白、在宿主细胞中表达该蛋白或产生病毒粒子。
[0192] 根据本发明的实施例，编码该重组HIV包膜蛋白的核酸可操作地连接至启动子，这意味着该核酸在启动子的控制下。该启动子可以是同源启动子(即，来源于相同的作为载体的遗传来源)或异源启动子(即，来源于不同载体或遗传来源)。适合的启动子的实例包括人类巨细胞病毒立即早期(hCMV IE，或简称“CMV”)启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，该启动子位于表达盒内的核酸的上游。
[0193] 根据本发明的实施例，载体可以是表达载体。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体和用于将核酸递送至受试者中用于在该受试者的组织中表达的载体，例如病毒载体。适合用于本发明的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、修饰的安卡拉牛痘(MVA)载体、肠系病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒载体等。该载体还可以是非病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。
[0194] 在本发明的某些实施例中，该载体是腺病毒载体，例如重组腺病毒载体。重组腺病毒载体可以例如衍生自人类腺病毒(HAdV或AdHu)、或猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh、或SAdV)或恒河猴腺病毒(rhAd)。优选地，腺病毒载体是重组人类腺病毒载体，例如重组人类腺病毒血清型26，或重组人类腺病毒血清型5、4、35、7、48等中的任一种。在其他实施例中，腺病毒载体是rhAd载体，例如rhAd51、rhAd52或rhAd53。
[0195] 重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。例如，重组腺病毒26载体的制备描述于例如，WO 2007/104792和Abbink等人,(2007)Virol.[病毒学]81(9):4654-63。腺病毒26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。US 2015/0291935中提供了rhAd51、rhAd52和rhAd53的示例性基因组序列。
[0196] 根据本发明的实施例，此处所述的任何重组HIV Env蛋白可由此处所述的任何载体表达和/或编码。鉴于遗传密码的简并性，技术人员将充分意识到可以根据本领域中完全常规的方法来设计编码相同蛋白质的若干种核酸序列。编码本发明的重组HIV Env蛋白的核酸可以任选地是密码子优化的，以确保在宿主细胞(例如，细菌或哺乳动物细胞)中的适当表达。密码子优化是广泛应用于本领域中的技术。
[0197] 本发明还提供了细胞，优选地是包含此处所述的任何核酸分子和载体的分离的细胞。例如，这些细胞可以用于生产重组蛋白，或用于生产病毒粒子。
[0198] 因此，本发明的实施例还涉及制造重组HIV Env蛋白的方法。该方法包括用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的编码根据本发明的重组HIV Env蛋白的核酸；在适合于表达该重组HIV Env蛋白的条件下培养该转染的细胞，并任选地纯化或分离在该细胞中表达的重组HIV Env蛋白。可以通过本领域中已知的任何方法(包括亲和色谱、尺寸排阻色谱等)从该细胞中分离或收集该重组HIV Env蛋白。鉴于本披露，用于重组蛋白表达的技术将是本领域普通技术人员所熟知的。也可以研究表达的重组HIV Env蛋白而不需要纯化或分离该表达的蛋白，例如通过分析用编码该重组HIV Env蛋白的表达载体转染的细胞的上清液，并使之在适合于表达该HIV Env蛋白的条件下生长。
[0199] 在优选实施例中，将表达的重组HIV Env蛋白在允许缔合该蛋白以形成稳定的三聚体复合物的条件下纯化。例如，可以在33℃-39℃(例如37℃)和2％-12％二氧化碳(例如8％二氧化碳)下培养用与启动子(例如，CMV启动子)可操作地连接的编码该重组HIV Env蛋白的表达载体转染的哺乳动物细胞。表达也可以在替代表达系统如昆虫细胞或酵母细胞(都是本领域中常规的)中进行。然后可以例如通过凝集素亲和色谱从细胞培养物中分离表达的HIV Env蛋白，其结合糖蛋白。结合到柱上的HIV Env蛋白可以用吡喃甘露糖苷洗脱。可以按需要使从柱上洗脱的HIV Env蛋白经受进一步的纯化步骤，例如尺寸排阻色谱，以去除任何残留的污染物，例如细胞污染物，还有Env聚集物，gp140单体和gp120单体。也可以使用可替代的纯化方法，非限制性实例包括抗体亲和色谱、用非bNAb进行的阴性选择、抗标签纯化或其他色谱如离子交换色谱等以及本领域已知的其他方法来分离表达的HIV Env蛋白。
[0200] 鉴于本披露，可以通过本领域已知的任何方法制备编码本发明的重组HIV Env蛋白的核酸分子和表达载体。例如，可以使用本领域技术人员熟知的基因工程技术和分子生物学技术，例如定点诱变、聚合酶链式反应(PCR)等，通过将指示位置处的氨基酸取代中的至少一个引入骨架HIV包膜序列来制备编码该重组HIV Env蛋白的核酸。然后可以使用标准分子生物学技术将该核酸分子引入或“克隆”到表达载体中。然后可以在宿主细胞中从表达载体表达该重组HIV包膜蛋白，并且鉴于本披露，通过本领域已知的任何方法从细胞培养物中纯化表达的蛋白。
[0201] 三聚体复合物
[0202] 在另一个一般方面，本发明涉及三聚体复合物，其包含根据本发明的重组HIV Env蛋白中的三种的非共价低聚物。该三聚体复合物可以包含此处所述的任何重组HIV Env蛋白。优选地，该三聚体复合物包含根据本发明的重组HIV Env蛋白的三种一致的单体(或一致的异源二聚体，如果gp140被切割的话)。该三聚体复合物可以与其他形式(例如单体形式)的HIV包膜蛋白分离，或该三聚体复合物可与其他形式(例如单体形式)的HIV包膜蛋白一起存在。
[0203] 组合物和方法
[0204] 在另一个一般方面，本发明涉及包含重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸、载体或宿主细胞以及药学上可接受的载剂的组合物。该组合物可以包含此处所述的任何重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞。
[0205] 载剂可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，如粘合剂、崩解剂、蓬松剂、助悬剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂以及涂层。该载剂或其他物质的确切性质可以取决于给药途径，例如肌内、皮内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如，肠)、鼻内或腹膜内途径。对于液体可注射制剂(例如，悬浮液和溶液)，适合的载剂和添加剂包括水、乙二醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂(例如散剂、胶囊、囊片、软胶囊和片剂)，适合的载剂和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。对于鼻喷雾剂/吸入剂混合物，该水性溶液/悬浮液可以包括作为适合的载剂和添加剂的水、乙二醇、油、软化剂、稳定剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、调味剂等。
[0206] 本发明的组合物可以配制成适合于给予受试者以便于给予并改进功效的任何物质，包括但不限于口服(肠内)给予和肠胃外注射。肠胃外注射包括静脉注射或输注、皮下注射、皮内注射和肌内注射。还可以配制本发明的组合物用于其他给药途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下给药、舌下、从口腔粘膜绕过门脉循环、吸入或鼻内。
[0207] 本发明的实施例还涉及制备该组合物的方法。根据本发明的实施例，生产组合物的方法包括将本发明的重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、分离的核酸、载体或宿主细胞与一种或多种药学上可接受的载剂混合。本领域的普通技术人员将熟悉用于制备这样的组合物的常规技术。
[0208] HIV抗原(例如，衍生自HIV gag、pol和/或env基因产物的蛋白或其片段)和表达该HIV抗原的载体(例如病毒载体)已经用于免疫原性组合物和疫苗中，用于针对HIV感染对受试者进行疫苗接种或在受试者中产生针对HIV感染的免疫反应。如在此所使用，“受试者”是指将向其给予或已经给予根据本发明的实施例的免疫原性组合物的任何动物，优选地是哺乳动物，最优选地是人类。如在此所使用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人类等，优选地是人类。本发明的重组HIV Env蛋白还可以用作抗原，以在有需要的受试者中诱导针对人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫应答。免疫应答可以针对一个或多个HIV进化枝，例如进化枝A、进化枝B、进化枝C等。该组合物可以包含表达该重组HIV Env蛋白的载体，或该组合物可以包含根据本发明的实施例的分离的重组HIV Env蛋白。
[0209] 例如，可以将包含重组HIV蛋白或其三聚体复合物的组合物给予有需要的受试者以在受试者中诱导针对HIV感染的免疫应答。也可以将包含编码本发明的重组HIV Env蛋白的载体(如腺病毒载体)的组合物给予有需要的受试者以在受试者中诱导针对HIV感染的免疫应答，其中该载体表达该重组HIV Env蛋白。此处所述的方法还包括将本发明的组合物与优选由一种或多种载体(例如腺病毒载体或MVA载体)表达的一种或多种额外的HIV抗原(例如，衍生自HIV gag、pol和/或env基因产物的蛋白或其片段)组合给予，包括引发和加强免疫应答的方法。
[0210] 在某些实施例中，该HIV Env蛋白可以展示在粒子如脂质体、病毒样粒子(VLP)、纳米粒子、病毒体或外来体上，任选地与内源和/或外源性佐剂组合。当与其自身的可溶性或单体Env蛋白相比时，这样的粒子典型在体内展示增强的抗原呈递功效。
[0211] 可以制备展示HIV Env蛋白的VLP的实例，例如通过与自组装病毒蛋白如HIV Gag核或其他逆转录病毒Gag蛋白共表达该HIV Env蛋白。VLP类似病毒，但不具有感染性，因为它们不含病毒遗传物质。病毒结构蛋白(例如包膜或衣壳)的表达可导致VLP的自组装。VLP是本领域技术人员所熟知的，并且它们在疫苗中的用途例如描述于(Kushnir等人,2012)中。
[0212] 在某些优选的实施例中，该粒子是脂质体。脂质体是具有至少一个脂质双层的球形囊泡。HIV Env三聚体蛋白可以例如通过静电相互作用(例如通过向HIV Env三聚体的C端2+
添加His-标签)和并入到脂质体中的衍生化脂质的头部基团中的二价螯合原子(如Ni 或Co2+)而非共价偶联到这些脂质体上。在某些非限制性和示例性的实施例中，该脂质体包含
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]的镍或钴盐(DGS-NTA(Ni2+)或DGS-NTA(Co2+))，摩尔比为60:36:4。在优选实施例中，HIV Env三聚体蛋白共价偶联到脂质体表面，例如通过整合在脂质体表面的马来酰亚胺官能团。在其某些非限制性示例性实施例中，该脂质体包含DSPC、胆固醇和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酰胺]脂质，摩尔比为54:30:16。HIV Env蛋白可以与其偶联，例如通过HIV Env蛋白中添加的C端半胱氨酸。共价偶联的变体更稳定，引起高抗原特异性IgG滴度，并且掩蔽了在抗原性上较不相关的‘Env三聚体’底部的表位。用于制备与脂质体偶联的HIV Env三聚体和表征它们的方法是已知的，并且已经在(Bale等人,2017)中描述，该文献通过引用结合在此。本发明还提供了融合到和/或展示在脂质体上的本发明的HIV Env蛋白。
添加His-标签)和并入到脂质体中的衍生化脂质的头部基团中的二价螯合原子(如Ni 或Co2+)而非共价偶联到这些脂质体上。在某些非限制性和示例性的实施例中，该脂质体包含
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]的镍或钴盐(DGS-NTA(Ni2+)或DGS-NTA(Co2+))，摩尔比为60:36:4。在优选实施例中，HIV Env三聚体蛋白共价偶联到脂质体表面，例如通过整合在脂质体表面的马来酰亚胺官能团。在其某些非限制性示例性实施例中，该脂质体包含DSPC、胆固醇和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酰胺]脂质，摩尔比为54:30:16。HIV Env蛋白可以与其偶联，例如通过HIV Env蛋白中添加的C端半胱氨酸。共价偶联的变体更稳定，引起高抗原特异性IgG滴度，并且掩蔽了在抗原性上较不相关的‘Env三聚体’底部的表位。用于制备与脂质体偶联的HIV Env三聚体和表征它们的方法是已知的，并且已经在(Bale等人,2017)中描述，该文献通过引用结合在此。本发明还提供了融合到和/或展示在脂质体上的本发明的HIV Env蛋白。
[0213] 在某些实施例中，本发明的HIV Env蛋白与自组装粒子融合或展示在纳米粒子上。抗原纳米粒子是呈递多个拷贝的抗原(例如本发明的HIV Env蛋白)的多肽的组装，其导致多结合位点(亲合力)并且可以提供改进的抗原稳定性和免疫原性。制备自组装蛋白纳米粒子和其用于疫苗中的用途是本领域技术人员熟知的，参见例如(Zhao等人,2014)，(López-Sagaseta等人,2016)。作为非限制性实例，自组装纳米粒子可以基于铁蛋白、细菌铁蛋白或DPS。在表面上展示蛋白的DPS纳米粒子例如描述于WO 2011/082087中。这种粒子上的三聚体HIV-1抗原的说明已经例如在(He等人,2016)中描述过。其他自组装蛋白纳米粒子及其制备例如在WO 2014/124301和US 2016/0122392中披露，它们通过引用结合在此。本发明还提供了融合到和/或展示在自组装纳米粒子上的本发明的HIV Env蛋白。本发明还提供了包含根据本发明的VLP、脂质体或自组装纳米粒子的组合物。
[0214] 在某些实施例中，佐剂包括在本发明的组合物中或与本发明的组合物共同给予。佐剂的使用是任选的，并且当组合物用于疫苗接种的目的时，可进一步增强免疫应答。适合于共同给予或包含在根据本发明的组合物中的佐剂优选地应该是在人体中潜在安全、良好耐受和有效的佐剂。这样的佐剂是本领域技术人员熟知的，并且非限制性实例包括QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TER酰胺、PSC97B、Adjumer、PG-
026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、铝盐如磷酸铝(例如AdjuPhos)或氢氧化铝以及MF59。
026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、铝盐如磷酸铝(例如AdjuPhos)或氢氧化铝以及MF59。
[0215] 本发明的其他方面涉及包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4(分别代表HIV包膜共有进化枝C和共有进化枝B序列)的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的重组HIV包膜蛋白。这些共有序列在任何天然存在的序列中都没有发现，并且因此被认为是新颖的HIV包膜蛋白。包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的重组HIV包膜蛋白可以任选地另外包含所谓的SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点中的突变，如例如在SEQ ID NO:3所示的那些序列或还包含位置558和/或位置556处的Pro的SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:5或还包含位置558和/或位置556处的Pro的SEQ ID NO:5中。当确定这些序列的％一致性时，优选地不考虑突变的弗林蛋白酶切割位点处和位置501、605、559、556和558处的氨基酸。惊人地发现，这些蛋白以高水平表达并且具有高水平的稳定性和三聚体形成。在某些实施例中，这些HIV Env蛋白可以用作骨架蛋白，其中可以制备上述突变体以获得本发明的分子。本发明也涵盖了编码这些序列的分离的核酸分子，包含与启动子可操作地连接的这些序列的载体，以及包含该蛋白、分离的核酸分子或载体的组合物。
[0216] 实施例
[0217] 实施例1是重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少两个处具有指示氨基酸残基的HIV Env蛋白的氨基酸序列，该组由以下各项组成：
[0218] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
[0219] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
[0220] (iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
[0221] (iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val或Ile；
[0222] (v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
[0223] (vi)位置204处的Ile；以及
[0224] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
[0225] 其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0226] 实施例2是重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0227] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
[0228] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
[0229] (iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
[0230] (iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val或Ile；
[0231] (v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
[0232] (vi)位置204处的Ile；以及
[0233] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
[0234] 其中该HIV Env蛋白选自下组，该组由以下各项组成：
[0235] (1)具有共有序列的HIV Env蛋白，例如来自进化枝C或进化枝B，例如包含(SEQ ID NO:2、3、4或5)的氨基酸序列；或
[0236] (2)合成HIV Env蛋白，例如包含(a)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(b)在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6；(c)SEQ ID NO:7；或(d)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)，其中(a)、(b)或(d)任选地可以具有另外的SOSIP(位置501和605处的Cys和位置559处的Pro)和/或弗林蛋白酶切割位点突变(例如SEQ ID NO:10替换氨基酸508-511)；或
[0237] (3)野生型HIV Env蛋白，优选为进化枝C的，包含以至少100个、优选至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置的氨基酸残基处的至少一个修复突变，其中该修复突变是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的取代，并且优选地，该修复突变是由存在于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的取代；以及
[0238] 其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0239] 实施例3是重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含HIV Env蛋白的氨基酸序列和在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0240] (i)位置651处的Phe、Leu、Met、或Trp，优选Phe；
[0241] (ii)位置655处的Phe、Ile、Met、或Trp，优选Ile；
[0242] (iii)位置535处的Asn或Gln，优选Asn；
[0243] (iv)位置589处的Val、Ile或Ala，优选Val或Ile；
[0244] (v)位置573处的Phe或Trp，优选Phe；
[0245] (vi)位置204处的Ile；以及
[0246] (vii)位置647处的Phe、Met、或Ile，优选Phe,
[0247] 其中该HIV Env蛋白是包含选自下组的至少一个突变的SOSIP突变体HIV Env蛋白，该组由以下各项组成：
[0248] (a)位置501和605处的Cys；
[0249] (b)位置559处的Pro；
[0250] (c)位置501和605处的Cys和位置559处的Pro；以及
[0251] 这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0252] 实施例4是实施例2所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少两个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0253] 实施例5是实施例3所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少两个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0254] 实施例6是实施例1、2和4中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含位置501和605处的Cys或位置559处的Pro，优选位置501和605处的Cys和位置559处的Pro。
[0255] 实施例7是实施例1至6中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少三个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0256] 实施例8是实施例1至6中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少四个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0257] 实施例9是实施例1至6中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少五个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0258] 实施例10是实施例1至6中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的至少六个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0259] 实施例11是实施例1至6中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含在选自下组的指示位置中的七个处的指示氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)至(vii)。
[0260] 实施例12是实施例1、4和5中任一项所述的重组HIV Env蛋白，其中该至少两个指示位置和残基是选自下组的组合，该组由以下各项组成：651F，655I；651F，535N；651F，589V；651F，589I；651F，573F；651F，204I；651F，647F；655I，535N；655I，589V；655I，589I；
655I，573F；655I，204I；655I，647F；535N，589V；535N，589I；535N，573F；535N，204I；535N，
647F；589V，573F；589V，204I；589V，647F；589I，573F；589I，204I；589I，647F；573F，204I；
573F，647F；和204I，647F。
655I，573F；655I，204I；655I，647F；535N，589V；535N，589I；535N，573F；535N，204I；535N，
647F；589V，573F；589V，204I；589V，647F；589I，573F；589I，204I；589I，647F；573F，204I；
573F，647F；和204I，647F。
[0261] 实施例13是实施例7所述的重组HIV Env蛋白，其中该至少三个指示位置和残基是选自下组的组合，该组由以下各项组成：651F，655I，535N；651F，589V，535N；651F，589I，535N；651F，573F，535N；651F，204I，535N；651F，647F，535N；655I，589V，535N；655I，589I，
535N；655I，573F，535N；655I，204I，535N；655I，647F，535N；589V，573F，535N；589V，204I，
535N；589V，647F，535N；589I，573F，535N；589I，204I，535N；589I，647F，535N；573F，204I，
535N；573F，647F，535N；204I，647F，535N；651F，655I，589V；651F，573F，589V；651F，204I，
589V；651F，647F，589V；655I，573F，589V；655I，204I，589V；655I，647F，589V；573F，204I，
589V；573F，647F，589V；204I，647F，589V；651F，655I，589I；651F，573F，589I；651F，204I，
589I；651F，647F，589I；655I，573F，589I；655I，204I，589I；655I，647F，589I；573F，204I，
589I；573F，647F，589I；204I，647F，589I；651F，655I，573F；651F，204I，573F；651F，647F，
573F；655I，204I，573F；655I，647F，573F；204I，647F，573F；651F，655I，204I；651F，647F，
204I；655I，647F，204I；651F，655I，647F；655I，651F，647F；655I，651F，535N；655I，589V，
573F；和655I，589V，204I。
535N；655I，573F，535N；655I，204I，535N；655I，647F，535N；589V，573F，535N；589V，204I，
535N；589V，647F，535N；589I，573F，535N；589I，204I，535N；589I，647F，535N；573F，204I，
535N；573F，647F，535N；204I，647F，535N；651F，655I，589V；651F，573F，589V；651F，204I，
589V；651F，647F，589V；655I，573F，589V；655I，204I，589V；655I，647F，589V；573F，204I，
589V；573F，647F，589V；204I，647F，589V；651F，655I，589I；651F，573F，589I；651F，204I，
589I；651F，647F，589I；655I，573F，589I；655I，204I，589I；655I，647F，589I；573F，204I，
589I；573F，647F，589I；204I，647F，589I；651F，655I，573F；651F，204I，573F；651F，647F，
573F；655I，204I，573F；655I，647F，573F；204I，647F，573F；651F，655I，204I；651F，647F，
204I；655I，647F，204I；651F，655I，647F；655I，651F，647F；655I，651F，535N；655I，589V，
573F；和655I，589V，204I。
[0262] 实施例14是实施例8所述的重组HIV Env蛋白，其中该至少四个指示位置和残基是选自下组的组合，该组由以下各项组成：651F，655I，535N，589V；651F，655I，535N，573F；651F，655I，589V，573F；651F，535N，589V，573F；655I，535N，589V，573F；651F，655I，535N，
204I；651F，655I，589V，204I；651F，535N，589V，204I；655I，535N，589V，204I；651F，655I，
573F，204I；651F，535N，573F，204I；655I，535N，573F，204I；651F，589V，573F，204I；655I，
589V，573F，204I；535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，647F；651F，655I，589V，647F；
651F，535N，589V，647F；655I，535N，589V，647F；651F，655I，573F，647F；651F，535N，573F，
647F；655I，535N，573F，647F；651F，589V，573F，647F；655I，589V，573F，647F；535N，589V，
573F，647F；651F，655I，204I，647F；651F，535N，204I，647F；655I，535N，204I，647F；651F，
589V，204I，647F；655I，589V，204I，647F；535N，589V，204I，647F；651F，573F，204I，647F；
655I，573F，204I，647F；535N，573F，204I，647F；以及589V，573F，204I，647F。
204I；651F，655I，589V，204I；651F，535N，589V，204I；655I，535N，589V，204I；651F，655I，
573F，204I；651F，535N，573F，204I；655I，535N，573F，204I；651F，589V，573F，204I；655I，
589V，573F，204I；535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，647F；651F，655I，589V，647F；
651F，535N，589V，647F；655I，535N，589V，647F；651F，655I，573F，647F；651F，535N，573F，
647F；655I，535N，573F，647F；651F，589V，573F，647F；655I，589V，573F，647F；535N，589V，
573F，647F；651F，655I，204I，647F；651F，535N，204I，647F；655I，535N，204I，647F；651F，
589V，204I，647F；655I，589V，204I，647F；535N，589V，204I，647F；651F，573F，204I，647F；
655I，573F，204I，647F；535N，573F，204I，647F；以及589V，573F，204I，647F。
[0263] 实施例15是实施例9所述的重组HIV Env蛋白，其中该至少五个指示位置和残基是选自下组的组合，该组由以下各项组成：651F，655I，535N，589V，573F；651F，655I，535N，589V，204I；651F，655I，535N，573F，204I；651F，655I，589V，573F，204I；651F，535N，589V，
573F，204I；655I，535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，589V，647F；651F，655I，535N，
573F，647F；651F，655I，589V，573F，647F；651F，535N，589V，573F，647F；655I，535N，589V，
573F，647F；651F，655I，535N，204I，647F；651F，655I，589V，204I，647F；651F，535N，589V，
204I，647F；655I，535N，589V，204I，647F；651F，655I，573F，204I，647F；651F，535N，573F，
204I，647F；655I，535N，573F，204I，647F；651F，589V，573F，204I，647F；655I，589V，573F，
204I，647F；以及535N，589V，573F，204I，647F。
573F，204I；655I，535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，589V，647F；651F，655I，535N，
573F，647F；651F，655I，589V，573F，647F；651F，535N，589V，573F，647F；655I，535N，589V，
573F，647F；651F，655I，535N，204I，647F；651F，655I，589V，204I，647F；651F，535N，589V，
204I，647F；655I，535N，589V，204I，647F；651F，655I，573F，204I，647F；651F，535N，573F，
204I，647F；655I，535N，573F，204I，647F；651F，589V，573F，204I，647F；655I，589V，573F，
204I，647F；以及535N，589V，573F，204I，647F。
[0264] 实施例16是实施例10所述的重组HIV Env蛋白，其中该至少六个指示位置和残基是选自下组的组合，该组由以下各项组成：651F，655I，535N，589V，573F，204I；651F，655I，535N，589V，573F，647F；651F，655I，535N，589V，204I，647F；651F，655I，535N，573F，204I，
647F；651F，655I，589V，573F，204I，647F；651F，535N，589V，573F，204I，647F；以及655I，
535N，589V，573F，204I，647F。
647F；651F，655I，589V，573F，204I，647F；651F，535N，589V，573F，204I，647F；以及655I，
535N，589V，573F，204I，647F。
[0265] 实施例17是实施例1至16中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含在选自下组的指示位置中的至少一个处由指示氨基酸残基进行的氨基酸取代，该组由以下各项组成：
[0266] (viii)位置588处的Gln、Glu、Ile、Met、Val、Trp、或Phe，优选Gln或Glu；
[0267] (ix)位置64处的Lys、或位置66处的Arg或位置64处的Lys和位置66处的Arg两者；
[0268] (x)位置316处的Trp；
[0269] (xi)201和433两个位置处的Cys；
[0270] (xii)位置556或558处的或556和558两个位置处的Pro；以及
[0271] (xiii)由具有7-10个氨基酸的环，优选8个氨基酸的环，例如具有选自(SEQ ID NO:12-17)中任一个的序列的环，替换氨基酸位置548-568处的环(HR1环)；
[0272] (xiv)位置568处的Gly、或位置569处的Gly、或位置636处的Gly、或568和636两个位置处的Gly、或569和636两个位置处的Gly；和/或
[0273] (xv)位置302处的Tyr、或位置519处的Arg、或位置520处的Arg、或位置302处的Tyr和位置519处的Arg、或位置302处的Tyr和位置520处的Arg、或位置302处的Tyr和519和520两个位置处的Arg，
[0274] 其中这些位置的编号是根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。
[0275] 实施例18是实施例1至17中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变。
[0276] 实施例19是实施例18所述的重组HIV Env蛋白，其中弗林蛋白酶切割位点中的突变是位置508-511处由RRRRRR(SEQ ID NO:10)进行的替换。
[0277] 实施例20是实施例1至19中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白为gp140或gp160。
[0278] 实施例21是实施例1至20中任一项所述的重组HIV Env蛋白，其中与在选自由(i)至(vii)组成的组的指示位置处不具有指示氨基酸残基中的一个或多个的HIV Env蛋白相比，该重组HIV Env蛋白具有改进的三聚体形成百分比和改进的三聚体产量中的至少一项。
[0279] 实施例22是实施例21所述的重组HIV Env蛋白，其中三聚体形成是通过具有多角度光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)测量。
[0280] 实施例23是实施例1-22中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白还包含位置658处选自Val、Ile、Phe、Met、Ala或Leu的氨基酸残基，优选Val或Ile，最优选Val。
[0281] 实施例24是实施例1至23中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含选自下组的氨基酸的组合，该组由以下各项组成：
[0282] (a)655I，589V，573F，651F，588E，535N，204I；
[0283] (b)556P，655I，535N，573F，589V，204I，588Q；
[0284] (c)204I，535N，556P，588E，589V，651F，655I；
[0285] (d)535N，556P，589V，651F，655I；以及
[0286] (e)535N，556P，588E，589V，651F，655I。
[0287] 实施例25是实施例1至24中任一项所述的重组HIV Env蛋白，该重组HIV Env蛋白包含与SEQ ID NO:3、5、20、22、24、26、27、28、29、30、31或32中任一项至少95％、96％、97％、98％、99％一致或100％一致的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:20、22、24、26、27、28、29、30、
31或32中任一项至少98％一致的氨基酸序列。
31或32中任一项至少98％一致的氨基酸序列。
[0288] 实施例26是一种三聚体复合物，该三聚体复合物包含实施例1至25中任一项所述的重组HIV Env蛋白中的三种的非共价低聚物。
[0289] 实施例27是一种粒子，例如脂质体或纳米粒子，例如自组装纳米粒子，其展示实施例1-25中任一项所述的重组HIV Env蛋白或实施例26所述的三聚体。
[0290] 实施例28是一种编码实施例1至25中任一项所述的重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子。
[0291] 实施例29是一种载体，该载体包含与启动子可操作地连接的实施例28所述的分离的核酸分子。
[0292] 实施例30是实施例29所述的载体，该载体是腺病毒载体。
[0293] 实施例31是一种包含实施例28所述的分离的核酸分子或实施例29或30所述的载体的宿主细胞。
[0294] 实施例32是一种生产重组HIV Env蛋白的方法，该方法包括使实施例31所述的宿主细胞生长在适于产生重组HIV Env蛋白的条件下。
[0295] 实施例33是一种生产重组HIV Env蛋白的方法，该方法包括获得包含与启动子可操作地连接的实施例28所述的分离的核酸的表达载体；用该表达载体转染细胞；使经转染的细胞生长在适于表达该重组HIV Env蛋白的条件下；并在允许形成稳定的三聚体复合物的条件下纯化该重组HIV Env蛋白。
[0296] 实施例34是一种产生根据实施例1至25中任一项所述的重组HIV Env蛋白的方法，该方法包括向骨架HIV包膜蛋白序列引入至少一个指示氨基酸取代，导致在选自下组的位置处的氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)-(vii)。
[0297] 实施例35是根据实施例34所述的方法，其中编码该氨基酸取代的核苷酸序列被引入编码该骨架HIV包膜蛋白序列的核酸中。
[0298] 实施例36是实施例34或35所述的方法，其中该骨架HIV包膜蛋白序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；在位置166处Glu突变为Arg的SEQ ID NO:6；具有位置501和605处的Cys、位置559处的Pro和/或SEQ ID NO:10替换了氨基酸508-511的SEQ ID NO:6；在位置166处Glu突变为Arg的，还具有位置501和605处的Cys、位置559处的Pro和/或SEQ ID NO:10替换了氨基酸508-511的SEQ ID NO:6；具有位置501和605处的Cys、位置
559处的Pro和/或SEQ ID NO:10替换了氨基酸508-511的SEQ ID NO:8；具有位置501和605处的Cys、位置559处的Pro和/或SEQ ID NO:10替换了氨基酸508-511的SEQ ID NO:9；和一种具有如下突变的野生型HIV Env蛋白，所述突变导致至少以下的(a)、(b)或(c)，优选以下的(a)、(b)和(c)中至少两项，最优选以下的(a)、(b)和(c)：
559处的Pro和/或SEQ ID NO:10替换了氨基酸508-511的SEQ ID NO:8；具有位置501和605处的Cys、位置559处的Pro和/或SEQ ID NO:10替换了氨基酸508-511的SEQ ID NO:9；和一种具有如下突变的野生型HIV Env蛋白，所述突变导致至少以下的(a)、(b)或(c)，优选以下的(a)、(b)和(c)中至少两项，最优选以下的(a)、(b)和(c)：
[0299] (a)位置501和506处的Cys和位置559处的Pro，
[0300] (b)SEQ ID NO:10替换氨基酸508-511，和/或
[0301] (c)以至少100个、优选至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率存在于对应位置的氨基酸残基处的至少一个修复突变，其中该修复突变是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由存在于对应位置的氨基酸残基进行的取代，并且优选地，该修复突变是由存在于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的取代。
[0302] 实施例37是一种包含实施例1至25中任一项所述的重组HIV Env蛋白、实施例26所述的三聚体复合物、实施例27所述的粒子、实施例28所述的分离的核酸分子、实施例29或30所述的载体、或实施例31所述的宿主细胞以及药学上可接受的载剂的组合物。
[0303] 实施例38是实施例37所述的组合物，该组合物还包含佐剂。
[0304] 实施例39是一种产生实施例37所述的组合物的方法，该方法包括将该重组HIV Env蛋白、三聚体复合物、粒子、分离的核酸、载体或宿主细胞与一种或多种药学上可接受的载剂混合。
[0305] 实施例40是一种针对HIV感染对受试者进行疫苗接种的方法，该方法包括向受试者给予包含实施例1至25中任一项所述的重组HIV包膜蛋白、实施例26所述的三聚体复合物、实施例27所述的粒子或实施例29或30所述的载体的组合物。
[0306] 实施例41是在有需要的受试者中产生针对HIV感染的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予包含实施例1至25中任一项所述的重组HIV包膜蛋白、实施例26所述的三聚体复合物、实施例27所述的粒子或实施例29或30所述的载体的组合物。
[0307] 实施例42是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其至少95％一致的序列的重组HIV Env蛋白。
[0308] 实施例43是包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其至少95％一致的序列的重组HIV Env蛋白。
[0309] 实施例44是包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其至少95％一致的序列的重组HIV Env蛋白。
[0310] 实施例45是包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其至少95％一致的序列的重组HIV Env蛋白。
[0311] 实施例46是一种编码实施例42至45中任一项所述的重组HIV Env蛋白的分离的核酸分子。
[0312] 实施例47是一种载体，该载体包含与启动子可操作地连接的实施例46所述的分离的核酸分子。
[0313] 实施例48是实施例47所述的载体，该载体是腺病毒载体。
[0314] 实施例49是一种包含实施例46所述的分离的核酸分子或实施例47或48所述的载体的宿主细胞。
[0315] 实施例50是一种包含实施例42至45中任一项所述的重组HIV Env蛋白、实施例46所述的分离的核酸分子、实施例47或48所述的载体、或实施例49所述的宿主细胞以及药学上可接受的载剂的组合物。
[0316] 实施例51是一种改进亲本HIV Env蛋白的三聚体百分比和/或三聚体产量(代表折叠和稳定性)的方法，该方法包括通过在亲本HIV Env蛋白中引入至少一个修复突变，优选至少3个修复突变，来修复亲本HIV Env蛋白的氨基酸序列，其中修复突变是以至少100个、优选至少500个、优选至少1000个、优选至少10000个野生型HIV Env序列的集合中小于7.5％、优选小于2％的HIV Env序列的频率发现于对应位置的氨基酸残基处的氨基酸取代，其中该取代是以在所述集合中至少10％的HIV Env序列的频率由发现于对应位置的氨基酸残基进行的，并且优选地，该取代是由发现于所述集合中最常见的对应位置处的氨基酸残基进行的。
[0317] 实施例52是实施例51所述的方法，其中亲本HIV Env蛋白中的至少50％、优选至少80％的氨基酸残基被修复，这些残基以在所述集合中小于7.5％的HIV Env序列的频率被发现于对应位置处。
[0318] 实施例53是实施例51所述的方法，其中亲本HIV Env蛋白中的至少50％、优选至少80％的氨基酸残基被修复，这些残基以在所述集合中小于2％的HIV Env序列的频率被发现于对应位置处。
[0319] 实施例54是实施例51至53中任一项所述的方法，其中该亲本HIV Env蛋白来自进化枝C。
[0320] 实施例55是实施例51至54中任一项所述的方法，其中该亲本HIV Env蛋白是野生型型HIV Env蛋白。
[0321] 实施例56是实施例51至54中任一项所述的方法，其中该亲本HIV Env蛋白包含以下中的一项或多项：
[0322] (a)位置501和506处的Cys和位置559处的Pro；
[0323] (b)HIV Env蛋白的弗林蛋白酶切割序列中的突变，例如，SEQ ID NO:10替换氨基酸508-511；
[0324] (c)位置651处的Phe；
[0325] (d)位置655处的Ile；
[0326] (e)位置535处的Asn；
[0327] (f)位置589处的Val；
[0328] (g)位置573处的Phe；
[0329] (h)位置204处的Ile；
[0330] (i)位置647处的Phe；
[0331] (j)位置658处的Val；
[0332] (k)位置588处的Gln或Glu；和/或
[0333] (l)位置556、558、或556和558处的Pro。
[0334] 实施例57是通过实施例51至56中任一项所述的方法可获得的重组HIV Env蛋白。
[0335] 实例
[0336] 实例1：HIV包膜进化枝C和进化枝B共有序列的生成
[0337] HIV包膜进化枝C共有序列
[0338] 以骨架序列开发HIV进化枝C包膜(Env)蛋白共有序列用于研究各种突变对HIV Env蛋白三聚体形成的影响。从Los Alamos数据库(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)下载来自已知HIV病毒分离株的3,434个包膜蛋白序列的序列比对。从3,434个序列中，仅选择进化枝C的1,252个序列以生成HIV进化枝C Env蛋白共有序列。在基于比对不能明确鉴定共有残基的位置，通过BLAST搜索使用共有序列来鉴定最接近的野生型序列。然后选择这些位置上的共有残基作为从BLAST搜索鉴定的最接近的野生型序列中的氨基酸。HIV Env进化枝C共有序列显示于SEQ ID NO:2中。使用BLAST，与SEQ ID NO:2具有最高同源性的两个序列是具有Genbank编号ADM30337.1和ADM30340.1的序列，两者都与SEQ ID NO:2具有90％序列一致性。
[0339] 通过引入包括位置501和605处的半胱氨酸残基和位置559处的脯氨酸残基的所谓SOSIP突变以及通过用6个精氨酸残基替换残基508-511处的弗林蛋白酶位点来优化弗林蛋白酶切割位点，进一步修饰HIV Env进化枝C共有序列。另外，位置295的Val突变为Asn(V295N)，以产生存在于大多数HIV毒株中的N-连接的糖基化位点，并且可以改进与在一些实验中使用的某些抗体的结合。此外，C端在残基664处被截短，导致编码可溶性HIV gp140蛋白的序列。上述所有取代/修饰位置均相对于HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号。所得的HIV gp140序列，称为“ConC_SOSIP”，示于(SEQ ID NO:3)中。将ConC_SOSIP序列用作骨架或亲本HIV包膜序列，其中引入了额外的突变，例如单和双氨基酸取代，以产生根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白。
[0340] HIV包膜进化枝B共有序列
[0341] 使用与上述用于生成HIV Env进化枝C共有序列的类似程序生成HIV Env进化枝B共有序列。使用来自已知进化枝B病毒分离株的1,708个进化枝B包膜蛋白序列来生成进化枝B共有序列。HIV Env进化枝B共有序列显示于SEQ ID NO:4中。
[0342] 通过引入所谓的SOSIP突变，通过用6个精氨酸残基替换弗林蛋白酶位点来优化弗林蛋白酶切割位点，并如上所述在残基664处截短C端，来进一步修饰HIV Env进化枝B共有序列，得到编码可溶性HIV gp140进化枝B共有序列的序列。所得的HIV gp140Env蛋白序列，称为“ConB_SOSIP”，示于(SEQ ID NO:5)中。
[0343] 出人意料地发现，基于共有序列的分子与基于天然分离株的分子相比具有改进的表达水平，并且此外已经具有改进的三聚化水平。因此，具有SEQ ID NO:2-5的分子已经具有出人意料的有利性质。
[0344] 实例2：重组HIV Env蛋白的表达和纯化
[0345] 重组HIV Env蛋白以可溶gp140蛋白表达和纯化。将单突变(氨基酸取代)及其组合(即双突变和三突变)引入ConC_SOSIP骨架共有序列，以生成一系列重组HIV Env蛋白变体。
[0346] HIV gp140 Env构建体和变体的生成和表达
[0347] 合成SEQ ID NO:3所示的编码HIV进化枝C Env共有序列ConC_SOSIP的DNA，并在GenScript(皮斯卡塔韦，新泽西州08854)或Gene Art(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中进行密码子优化。然后将密码子优化的序列克隆到载体pcDNA2004中，以生成HIV进化枝C gp140Env构建体，将其用作骨架HIV包膜序列以引入另外的突变。通过在pcDNA2004HIV进化枝C gp140Env构建体上进行定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)，向ConC_SOSIP骨架序列中引入突变。根据制造商的说明书，用90％的编码ConC_SOSIP序列的pcDNA2004载体或其变体和10％的编码弗林蛋白酶的pcDNA2004载体(弗林蛋白酶-pCDNA2004)瞬时转染HEK-Expi293F细胞或HEK293F细胞。将转染的细胞在37℃和10％CO2下培养5天。将培养上清液在1250x g旋转10分钟。随后使用0.22μm真空过滤器无菌过滤旋转过的上清液，并在4℃下储存直至进一步使用。
[0348] 为了在96孔规格中表达，将细胞在37℃和10％CO2下培养3天。将4uL Optimem(培养基)与4uL 100ng/uL DNA和8uL Expi293F混合物(54uL/mL Optimem)混合并孵育20分钟。随后以2.5x 10E6个细胞/mL添加200uL/孔Expi293F细胞。收集培养物上清液并在300g旋转
5分钟以去除细胞和细胞碎片。随后使用0.22μm真空过滤器无菌过滤旋转过的上清液，并在
4℃下储存直至进一步使用。
5分钟以去除细胞和细胞碎片。随后使用0.22μm真空过滤器无菌过滤旋转过的上清液，并在
4℃下储存直至进一步使用。
[0349] HIV gp140 Env蛋白的纯化
[0350] 根据两步纯化方案将从pcDNA2004载体表达的HIV gp140Env蛋白进行纯化，使用雪花莲(Galantus nivalis)凝集素柱(维克特实验室(Vectorlabs)，AL-1243)进行初步纯化，并在随后的步骤中用Superdex200Increase柱(通用电气公司(GE))去除残留污染物。对于使用雪花莲凝集素柱的初始步骤，将培养上清液用缓冲液(40mM Tris，500mM NaCl pH 7.5)稀释，并以每分钟4mL的速率通过4mL CV Tricorn 10-50凝集素琼脂糖柱。随后，用四个柱体积的缓冲液(40mM Tris，500mM NaCl pH 7.5)洗涤柱，并用四个柱体积的40mM Tris、500mM NaCl和1M吡喃甘露糖苷pH 7.5洗脱，上升流量为1.6mL/min，这意味着流动方向从下降变为上升，以增加包膜蛋白洗脱速率并减少洗脱体积。使用旋转浓缩器(50K，Amicon Ultra，密理博公司(Millipore))对洗脱液进行浓缩。
[0351] 将HIV gp140Env在Superdex200柱上进一步纯化，使用50mM Tris、150mM NaCl pH 7.4作为运行缓冲液。从柱洗脱的第二峰含有HIV gp140Env蛋白。合并含有此峰的级分，并使用蛋白质印迹和SDS-PAGE和/或SEC-MALS分析确认该峰的身份为HIV gp140Env蛋白。通过测量280nm处的光密度来确定经纯化的HIV gp140Env蛋白的浓度，并将经纯化的HIV gp140Env蛋白在4℃下储存，直至进一步使用。
[0352] SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
[0353] 在还原或非还原条件下，在4％-12％(w/v)Bis-Tris NuPAGE凝胶，1X MOPS(生命技术公司)上分析含有所表达的HIV gp140Env蛋白和经纯化的HIV gp140Env蛋白样品的细胞培养上清液，并使用iBlot技术(生命技术公司)进行印迹。所有程序均根据制造商的说明书进行。对于纯度分析，将凝胶用Krypton Infrared蛋白质染色(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))或SYPRO Rubi蛋白质染色(伯乐公司(Bio-Rad))进行染色。对于蛋白质印迹分析，用抗6x-组氨酸-标签抗体(抗His-HRP)探测膜。在Odyssey仪器(Li-Cor)上扫描凝胶和印迹膜，并使用Odyssey 3.0软件(Li-Cor)分析图像。
[0355] 使用阴性染色电子显微镜(NS-EM)对具有ConC_SOSIP骨架序列的包膜蛋白的三聚体进行成像，该三聚体使用雪花莲凝集素、随后尺寸排阻色谱进行纯化，并且如Julien等人2015(Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报](2015)112(38)11947-52)描述进行。将三聚体样品在Tris缓冲盐水(TBS)pH 7.4中稀释至0.01-0.5mg/mL之间，并附着于带有碳涂层的
200Cu网栅(EMS CF200-Cu)上，该Cu网栅在使用前刚在空气中2*10-1毫巴，25mA，30秒辉光放电。随后，将一滴3μL的经稀释的三聚体样品施加于网栅上1min，随后用滤纸(沃特曼(Whatman)1号或4号)吸干。将网栅干燥1分钟，然后用3μL的2.3％乙酸铀酰(UAc)染色60秒。
使用在120keV下操作的FEI Tecnai F20电子显微镜采集数据，放大倍数为25,000倍，得到样品平面上的像素尺寸为 用Gatan BM ultrascan获取图像。
200Cu网栅(EMS CF200-Cu)上，该Cu网栅在使用前刚在空气中2*10-1毫巴，25mA，30秒辉光放电。随后，将一滴3μL的经稀释的三聚体样品施加于网栅上1min，随后用滤纸(沃特曼(Whatman)1号或4号)吸干。将网栅干燥1分钟，然后用3μL的2.3％乙酸铀酰(UAc)染色60秒。
使用在120keV下操作的FEI Tecnai F20电子显微镜采集数据，放大倍数为25,000倍，得到样品平面上的像素尺寸为 用Gatan BM ultrascan获取图像。
[0356] 几乎(这种富含三聚体的材料)图像中所有粒子都是结构良好的封闭三聚体(数据未显示)。
[0357] 实例3：针对三聚体产量和三聚体形成百分比筛选重组HIV gp140Env变体
[0358] 针对三聚体形成筛选实例2中生成的重组HIV Env蛋白变体，以鉴定相对于ConC_SOSIP骨架序列改进三聚体形成百分比和/或改进三聚体产量的那些突变。使用AlphaLISA测定进行三聚体百分比和三聚体产量的高通量筛选，以评价一组广泛中和HIV抗体(bNAb)和非bNAb与重组HIV Env蛋白的结合。通过尺寸排阻色谱与多角度光散射(SEC-MALS)证实了AlphaLISA测定的结果。
[0359] 测定分析
[0360] 通过AlphaLISA测定，在细胞培养上清液中测量HIV gp140Env蛋白的总表达和具有引入到如实例2所述生成的ConC_SOSIP序列中的单氨基酸取代的超过200种HIV gp140变体的正确折叠的天然三聚体的总量。还测试了含有双突变和三突变的HIV gp140变体。测试具有无任何额外突变的ConC_SOSIP序列的HIV Env蛋白以进行比较。
[0361] 特别使用以下单克隆抗体(mAb)用于分析：mAb PGT145、mAb PGDM1400、mAb PG16、mAb PGT151、mAb 35O22、mAb PGT128、mAb PG9、mAb F105、mAb B6、mAb 447-52d、mAb 14e和mAb 17b。MAb 447-52D(AB014)、PG9(AB015)和PG16(AB016)购自Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH(克洛斯特新堡，奥地利)。非中和抗体b6获得自Dennis R.Burton(斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institue)，加利福尼亚州拉荷亚)，并且非中和抗体14e得自James E.Robinson(杜兰大学(Tulane University)，路易斯安那州新奥尔良)。对于mAb PGT145(PDB：3U1S)、PGDM1400(PDB：4RQQ)、PGT151(PDB：4NUG)、35O22(PDB：4TVP)、F105(PDB：1U6A)、PGT128(PDB：3TYG)和17b(PDB：4RQS)，编码这些公开序列的核酸被克隆到表达载体中并生产以用于HIV Env蛋白的评价。除了mAb F105、B6、447-
52d、14e和17b之外，用于分析的抗体是广泛中和抗体(bNAb)。bNAb能够中和多种HIV病毒株。在bNAb中，PGT145、PGDM1400和PG16是顶端粘合剂(apex binder)，并且是三聚体特异性的。PGT151也是三聚体特异性的，但是在gp120和gp41的两个原聚体的界面处结合，并且是切割依赖性的。非bNAb的结合指示不正确的折叠或开放的三聚体构象。
52d、14e和17b之外，用于分析的抗体是广泛中和抗体(bNAb)。bNAb能够中和多种HIV病毒株。在bNAb中，PGT145、PGDM1400和PG16是顶端粘合剂(apex binder)，并且是三聚体特异性的。PGT151也是三聚体特异性的，但是在gp120和gp41的两个原聚体的界面处结合，并且是切割依赖性的。非bNAb的结合指示不正确的折叠或开放的三聚体构象。
[0362] 还通过测量可溶性HIV gp140Env蛋白变体与已知结合该HIV包膜蛋白的共受体结合位点的抗体(mAb 17b)的结合来测试蛋白折叠，该HIV包膜蛋白仅在结合CD4后暴露(数据未显示)。具体地，可溶性受体CD4(sCD4)与mAb 17组合使用以评价CD4诱导的构象变化。在没有预先的CD4结合到该包膜蛋白的情况下，mAb 17b与HIV gp140Env蛋白变体的结合是部分解折叠的或预先触发的包膜蛋白(即，在不存在CD4结合时采取“开放”构象的不稳定Env)的指示。
[0363] 对于AlphaLISA测定，制备含有接头，随后是分选酶A标签，随后是Flag标签，随后是柔性(G4S)7接头并以His标签结束(位于HIV Env蛋白的C端的标签的序列在SEQ ID NO:19中提供)的pcDNA2004载体中的HIV gp140Env构建体。HIV gp140Env构建体在HEK-Expi293细胞中表达，将其在96孔板(200μL/孔)中培养3天。在AlphaLISA缓冲液(PBS+0.05％Tween-20+0.5mg/mL BSA)中将粗上清液稀释120倍。对于基于mAb 17b的测定，将上清液稀释12倍。
然后将10μL的每种稀释液转移到96孔板中，并与40μL受体珠粒、供体珠粒和一种以上列出的mAb混合。将供体珠粒与ProtA(目录号：AS102M，批号1831829，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))缀合，其结合至mAb。将受体珠粒与结合至构建体的His标签的抗His抗体(目录号：
AL128M，珀金埃尔默公司)缀合。为了定量包括所有形式的包膜蛋白的总蛋白产量，使用了用于检测His标签的镍缀合供体珠粒(目录号：AS101M，珀金埃尔默公司)连同用于检测Flag标签的抗Flag抗体缀合受体珠粒(目录号：AL112R，珀金埃尔默公司)的组合。对于与sCD4-His组合使用mAb 17b的测试，使用了ProtA供体珠粒和抗Flag受体珠粒的组合(数据未显示)。将一个样品与供体珠粒和受体珠粒混合以检测三聚体形成，并将相同Env变体的第二个样品与镍缀合供体珠粒和抗Flag缀合受体珠粒混合以测量表达的蛋白的总量(即，总蛋白产量)。
然后将10μL的每种稀释液转移到96孔板中，并与40μL受体珠粒、供体珠粒和一种以上列出的mAb混合。将供体珠粒与ProtA(目录号：AS102M，批号1831829，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))缀合，其结合至mAb。将受体珠粒与结合至构建体的His标签的抗His抗体(目录号：
AL128M，珀金埃尔默公司)缀合。为了定量包括所有形式的包膜蛋白的总蛋白产量，使用了用于检测His标签的镍缀合供体珠粒(目录号：AS101M，珀金埃尔默公司)连同用于检测Flag标签的抗Flag抗体缀合受体珠粒(目录号：AL112R，珀金埃尔默公司)的组合。对于与sCD4-His组合使用mAb 17b的测试，使用了ProtA供体珠粒和抗Flag受体珠粒的组合(数据未显示)。将一个样品与供体珠粒和受体珠粒混合以检测三聚体形成，并将相同Env变体的第二个样品与镍缀合供体珠粒和抗Flag缀合受体珠粒混合以测量表达的蛋白的总量(即，总蛋白产量)。
[0364] 将含有表达的HIV gp140Env蛋白、mAb、供体珠粒和受体珠粒的上清液的混合物在室温下孵育2小时而不摇动。随后，用Synergy NEO读板机仪器(伯腾公司(BioTek))测量化学发光信号。从针对每种HIV gp140Env变体测量的AlphaLISA计数中减去归因于模拟转染细胞的平均背景信号。然后，将整个数据集除以针对具有ConC_SOSIP骨架序列信号的HIV Env蛋白测量的信号，以将针对测试的每种HIV gp140Env变体的信号归一化为骨架。使用每种HIV gp140Env变体与三聚体特异性mAb PGT145的结合数据来确定每种变体的三聚体形成百分比和三聚体产量。使用与其他mAb的结合来评价HIV Env变体与bNAb和非bNAb(未显示)的一般结合模式。
[0365] 通过将从HIV Env变体、mAb PGT145、ProtA缀合供体珠粒和抗His缀合受体珠粒的样品混合物获得的归一化化学发光信号除以从HIV Env变体、抗His缀合供体珠粒和抗Flag缀合受体珠粒的样品混合物获得的归一化化学发光信号来计算每种HIV Env变体的三聚体形成百分比。
[0366] 相对于具有无任何额外突变的ConC_SOSIP骨架序列的HIV Env蛋白的三聚体产量测定每种HIV Env变体的三聚体产量。将从mAb PGT145与ConC_SOSIP包膜蛋白的结合获得的归一化化学发光信号设定为1，并且将从mAb PGT145与每种HIV gp140蛋白的结合获得的归一化化学发光信号归一化为此值。
[0367] AlphaLISA测定分析的结果-三聚体百分比和三聚体产量
[0368] 在ConC_SOSIP骨架序列中，如通过AlphaLISA测定针对来自上表1中的(i)-(vii)列表的几个单、双和三氨基酸取代确定的三聚体形成百分比显示在图2A中。在测试的含有单氨基酸取代的约200种HIV gp140Env变体中，鉴定了七个取代位置，其中三聚体形成百分比相对于无任何额外氨基酸取代的ConC_SOSIP骨架序列的三聚体形成百分比增加至少25％。
[0369] 图2A中所示的结果证明，根据HIV-1分离株HXB2的gp160中的编号，观察到三聚体形成百分比显著增加的七个优选取代位置包括N651、K655、I535、D589、I573、A204和E647。具体地，导致三聚体形成百分比最大改进的单氨基酸取代包括N651F、K655I(F/W)(尽管还有一个实验，其中K655F似乎没有导致改进)、I535N、D589V(/A)、I573F、A204I、E647F。与这些突变中的几种组合测试的一些突变包括K588Q/E、I556P和A558P，并且在本实验中，这些进一步改进在本发明的位置(表1中的(i)-(vii))处具有优选氨基酸的突变体的三聚体百分比。
[0370] 在本实验中测试的所有双取代具有比对应的单取代更高的三聚体形成百分比，并且测试的所有三取代具有比对应的单和双突变更高的三聚体形成百分比(图2A)。这些不可预测和出人意料的结果指示，这些突变可能在这些实验中针对包膜蛋白的三聚化展示出协同作用的形式。
[0371] 除了改进三聚体形成百分比之外，增加三聚体产量也是理想的。因此，通过AlphaLISA测定也确定了ConC_SOSIP骨架序列中含有单、双和三突变的HIV gp140变体的三聚体产量。结果示于图2B中。含有单突变的大多数HIV gp140变体(例外是I535N、D589A和D589I)具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的三聚体产量。然而，如下所述，I535N突变体的更准确的SEC-MALS分析显示三聚体产量增加。此外，与I535N组合的额外突变，如D589V，导致在不存在I535N突变的情况下，针对具有特定额外取代的包膜蛋白观察到相同的三聚体产量。具有双突变的变体的三聚体产量也增加，其中每种单突变变体具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的三聚体产量(图2B)。
[0372] 还测试了先前在文献中描述的在ConC_SOSIP骨架中具有双突变的HIV gp140变体的三聚体形成百分比，所述双取代包括由(De Taeye等人，同上)描述的E64K、T316W双取代和(Kwon等人，同上)描述的二硫双取代I204C、A433C。E64K、T316W双取代导致三聚体形成百分比低于ConC_SOSIP包膜蛋白，即15％(数据未显示)。尽管二硫双取代I204C，A433C将三聚体百分比增加至43％(数据未显示)，但在AlphaLISA实验中，此处所述的新颖双取代如I535N/K588E、K588Q/D589V、K655I/K588E、I535N/D589V、I535N/E647F、D589V/K655I和I535N/K655I(图2A)导致甚至更大的三聚体形成百分比。
[0373] 也向ConC_SOSIP骨架中引入了额外突变(残基558和/或556处的脯氨酸)，并测量了这些HIV gp140Env蛋白的三聚体形成百分比和三聚体产量。除了已经含在ConC_SOSIP骨架中的SOSIP突变(即，位置501和605处的Cys以及位置559处的Pro)之外，在位置558或556处的Pro的单取代以及在位置556和558处的脯氨酸的双取代增加三聚体形成百分比和三聚体产量(数据未显示)。实际上，在另外包含位置558和/或556处的Pro残基的ConC_SOSIP骨架中引入本发明的一个或多个新颖氨基酸稳定取代进一步改进了三聚体形成百分比和/或三聚体产量(例如图2A，例如A558P/I535N、K655I/L556P和几种包括A558P突变的三突变体)。
[0374] HIV gp140Env变体与其他bNAb和非bNAb的结合数据证明，测试的增加了三聚体产量和三聚体形成百分比的大多数单、双和三突变(如图2A和2B中列出的那些)还具有增加的与bNAb的结合和相对于针对具有ConC_SOSIP骨架序列的HIV包膜蛋白观察到的与bNAb和非bNAb的结合量相同或减少的与非bNAb的结合(数据未显示)。对于疫苗开发，优选增加与bNAb的结合和减少与非bNAb的结合。因此，数据证明，在上述表1中所示的(i)-(vii)位置处包含氨基酸取代的HIV包膜蛋白关于广泛中和抗体和非广泛中和抗体的结合模式具有理想的性质。
[0375] SEC-MALS分析
[0376] 也使用SEC-MALS分析来验证使用AlphaLISA测定筛选的HIV gp140变体的三聚体产量和三聚体形成百分比。将HIV gp140变体在30mL标准培养基中表达，并通过在Polyprep重力流动柱(伯乐公司(Biorad)目录号731-1550)中200μ雪花莲凝集素珠粒(维克特实验室目录号AL-1243)上施加无细胞上清液进行纯化。将珠粒用2ml结合缓冲液(40mM Tris，500mM NaCl pH 7.4)洗涤。将蛋白使用250-500μl 40mM Tris、500mM NaCl、1M吡喃甘露糖苷pH 7.4洗脱。使用偶联到Optilab T-rEX折射率检测器(怀亚特公司(Wyatt))的高效液相色谱系统(安捷伦技术公司(Agilent Technologies))和MiniDAWN TREOS仪器(怀亚特公司)进行SEC-MALS实验。总体来说，将100μl凝集素洗脱物或大约30μg蛋白以1mL/min施加到在运行缓冲液(150mM磷酸钠，50mM NaCl，pH 7.0)中平衡的TSK-Gel G3000SWxl柱(东曹生物科学公司(Tosoh Bioscience))上。使用Astra 6软件包分析数据，并从折射率信号推导分子量计算。
[0377] ConC_SOSIP包膜蛋白和含有单突变的HIV gp140变体的SEC-MALS色谱图示于图3中。一般来说，从SEC-MALS分析得到的结果与从AlphaLISA分析得到的结果是可比较的和一致的。ConC_SOSIP包膜蛋白的色谱图具有四个主峰，在约7.3分钟洗脱出的第二个峰是三聚体峰。ConC_SOSIP包膜蛋白被确定是约27％三聚的。聚集体和单体的形成指示与具有ConC_SOSIP共有序列的HIV gp140Env蛋白相关的一些错误折叠和不稳定性。如图3所示的色谱图所证明的，与ConC_SOSIP包膜蛋白的三聚体峰相比，所有单取代都导致相对较高的三聚体峰，指示每种HIV gp140变体的三聚体产量增加。
[0378] 总之，结果证明，此处表1的(i)-(vii)中鉴定的氨基酸取代提供了具有改进的三聚体形成百分比和/或改进的三聚体产量的重组HIV Env蛋白。具体地，在表1的(i)-(vii)的鉴定位置处具有多个取代(如所鉴定的突变中两个或更多个的组合)的HIV Env蛋白变体典型展现出比仅具有单突变的HIV Env蛋白变体甚至更加改进的三聚体产量和/或三聚体形成百分比，其显示了表1的组合突变(i)-(vii)的可能的协同作用。就本发明人所知，这些氨基酸取代的组合都没有在天然发生的HIV包膜蛋白序列中报道过，并且因此所有组合((i)-(vii)之间)都被认为是三聚体稳定突变的新颖组合。具有增加的三聚体形成百分比的HIV包膜蛋白(如本发明的重组HIV包膜蛋白)从制造的角度来说是有利的，如用于疫苗，因为将需要更少纯化和除去制剂中存在的不希望的非天然构象的包膜蛋白。另外，增加的总三聚体表达产量对于制造疫苗产品是有利的。
[0379] 实例4：三聚体HIV包膜蛋白的稳定性
[0380] 通过AlphaLISA和差示扫描量热法(DSC)测试根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白的热稳定性。
[0381] 使用AlphaLISA进行热稳定性测量
[0382] 通过基于与三聚体特异性mAb PGT145的结合测量热处理时的完整三聚体的损失来测试热稳定性。在60℃下，将粗上清液(20μl)加热1小时。然后将样品以最大速度离心5分钟以除去聚集体。如上述在实例3中所述进行AlphaLISA测定。
[0383] 结果示于图4中，并且数据报告为热处理后三聚体保持不变的百分比。从结果可以看出，测试的本发明的单突变体重组HIV gp140Env蛋白的大多数具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的热稳定性。还发现所测试的具有此处鉴定的三聚体稳定双和三取代的HIV包膜蛋白具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的热稳定性。
[0384] 使用DSC进行热稳定性测量
[0385] 通过DSC使用MicroCal毛细管DSC系统测定HIV gp140Env变体的解链温度(Tm)。以100℃/小时的扫描速度进行每次测量，起始温度为20℃，并且最终温度为110℃。每次测量使用浓度为0.5mg/mL(400μL)的蛋白样品。使用Origin J.软件(MicroCal VP-分析工具)分析数据。
[0386] 使用DSC测量的ConC_SOSIP包膜蛋白的解链温度(Tm)被确定为69.8℃，并且解链起始温度为60.1℃。针对ConC_SOSIP包膜蛋白测量的Tm高于BG505_SOSIP包膜蛋白(具有所谓的SOSIP突变的BG505病毒分离株的HIV包膜蛋白)，据报道其Tm为67.0℃(Kwon等人,2015)。这指示具有ConC_SOSIP骨架序列的HIV包膜蛋白关于热稳定性比具有三聚体稳定突变的另一已知HIV包膜序列具有更有利的性质。
[0387] ConC_SOSIP的K655I突变体的Tm被测量为72.3℃，并且解链起始温度为63.7℃，甚至高于ConC_SOSIP包膜蛋白的Tm。ConC_SOSIP的A558P、N651F、I535N突变体的Tm被测量为77.29℃，起始温度为74.87℃。DSC结果因此证实了通过AlphaLISA测定确定的热稳定性结果。
[0388] 总之，结果证明，包含此处所述的至少一个氨基取代的HIV Env蛋白典型比缺少这种突变的包膜蛋白具有更高的热稳定性。结果还证明，所有双取代HIV Env蛋白变体都具有比ConC_SOSIP包膜蛋白更高的热稳定性。三取代HIV Env蛋白变体也比ConC_SOSIP包膜蛋白更稳定。
[0389] 实例5：基于进化枝B包膜蛋白共有序列的重组HIV包膜蛋白变体
[0390] 如实例2所述生成和纯化根据本发明的实施例的包含引入进化枝B共有序列ConB_SOSIP(SEQ ID NO:5)的单氨基酸取代(I535N、D589V、N651F或K655I)的重组HIV Env蛋白。如实例3所述通过AlphaLISA测定来测量三聚体产量和三聚体形成百分比。
[0391] 结果示于图5A(三聚体形成百分比)和图5B(三聚体产量)。报告的值是相对于针对ConB_SOSIP包膜蛋白测量的值(对于三聚体形成百分比和三聚体产量都设置为1)。结果显示，所有测试的突变都增加了三聚体形成百分比。对于所有测试的突变，相对于ConB_SOSIP包膜蛋白，三聚体产量大致相同或被改进。
[0392] 这些结果证明，当引入一个不同的骨架HIV包膜蛋白序列(在本情形下是进化枝B衍生的共有序列)时，这些突变也对包膜蛋白具有稳定作用，例如改进三聚体产量、改进三聚体形成百分比等。
[0393] 实例6：基于合成包膜蛋白序列的重组HIV包膜蛋白变体
[0394] 如实例2所述制备和纯化根据本发明的实施例的包含引入合成HIV包膜蛋白(命名为‘DS_sC4_SOSIP_E166R’，具有SEQ ID NO:7所示的序列)的氨基酸取代的重组HIV Env蛋白。合成HIV包膜蛋白DS_sC4_SOSIP_E166R具有所谓的SOSIP突变(残基501和605处的Cys以及残基559处的Pro)、导致引入二硫(DS)键的残基201和433处的Cys和位置166处的Arg以稳定顶点。此外，该蛋白在位置655处被截短。如实例3所述，通过AlphaLISA测定来测量三聚体形成百分比和三聚体产量。
[0395] 结果示于图6，其比较了针对所测试的每种变体的三聚体形成百分比与针对DS_sC4_SOSIP_E166R骨架的三聚体形成百分比(图6A)和三聚体产量(图6B)。与该骨架序列相比，针对所测试的每种变体观察到更大的三聚体形成百分比。
[0396] 除了E166R外，其他一些很少天然发生的氨基酸在野生型HIV Env蛋白的集合中的对应位置处变成更盛行的氨基酸(A114Q、E117K、T375S和I434M)，以根据以下实例12和图12中更详细解释的框架‘修复’该蛋白。在这种‘经修复的’蛋白中，稳定突变A204I和K655I甚至进一步改进了sC4_SOSIP(图13)。
[0397] 本实例的结果与实例5的结果一致，证明了此处所述的突变也对包膜蛋白具有稳定作用，例如，当引入不同的骨架HIV包膜蛋白序列(在这种情形下是非共有的合成Env序列)时，改进三聚体形成百分比和/或改进三聚体产量等。
[0398] 实例7：HIV Env突变的另外的组合
[0399] 如实例2所述制备和纯化根据本发明的实施例的包含引入ConC_SOSIP(具有SEQ ID NO:3所示的序列)的氨基酸取代的重组HIV Env蛋白。如实例3所述，通过AlphaLISA测定来测量三聚体形成百分比。随后，使用雪花莲凝集素纯化组合的较小选择(以下以斜体描绘的那些和此外的K655I；I535N，D589V；I535N，K655I；D589V，K655I)，并且如实例3所述使用SEC-MALS分析三聚体含量。如实例4所述测量稳定性。
[0400] 针对本实验制备以下突变体：
[0401] K655I，N651F；
[0402] K655I，N651F，E647F；
[0403] K655I，N651F，E647F，I535N；
[0404] K655I，N651F，I535N；
[0405] K655I，I573F；
[0406] K655I，D589V，I573F；
[0407] K655I，D589V，I573F，N651F；
[0408] K655I，D589V，I573F，K588E；
[0409] K655I，D589V，I573F，N651F，K588E；
[0410] K655I，D589V，I573F，N651F，K588E，I535N；
[0411] K655I，D589V，I573F，N651F，K588E，I535N，A204I；
[0412] K655I，D589V，I535N，L556P；
[0413] K655I，D589V，I573F，N651F，K588E，L556P；
[0414] K655I，D589V，A204I；
[0415] L556P，N651F；
[0416] L556P，N651F，K655I；
[0417] L556P，N651F，K655I，I535N；
[0418] L556P，N651F，K655I，I535N，I573F；
[0419] L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V；
[0420] L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I；
[0421] L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q；
[0422] L556P，N651F，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，E647F；
[0423] L556P，N651F，I535N；
[0424] L556P，N651F，I535N，I573F；
[0425] L556P，N651F，I535N，I573F，D589V；
[0426] L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I；
[0427] L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q；
[0428] L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，E647F；
[0429] L556P，K655I，I535N；
[0430] L556P，K655I，I535N，I573F；
[0431] L556P，K655I，I535N，I573F，D589V；
[0432] L556P，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I；
[0433] L556P，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q；
[0434] L556P，K655I，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，E647F；
[0435] L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q，其中SOS突变被去除。
[0436] 在AlphaLISA中，与骨架相比，ConC_SOSIP骨架中测试的所有取代组合都显示更高的三聚体百分比、更高的三聚体产量和在60℃更高的三聚体稳定性(数据未显示)。针对骨架中测试的所有突变，SEC_MALS证实改进的三聚体百分比(数据未显示)。
[0437] 对于包含一个接一个突变一直到九个突变的组，SEC-MALS显示，通过每个贴近的突变的引入，三聚体/单体比率随着单体峰的高度降低而增加，而三聚体峰的高度在SEC图中保持相同(图7)。在SEC-MALS中测试的所有变体中，具有L556P、N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q、E647F取代的变体显示出最高的三聚体百分比(最少的gp140单体和最少的gp120单体)、最高的总蛋白产量和一种较高的温度稳定性。这意味着与骨架相比，这些突变可以组合而不损失三聚体。此外，这表明，一般而言，添加表1的(i)-(vii)中所述的突变，任选地与表2中所述的突变组合，导致进一步改进的三聚化。
[0438] 也测试了具有L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q突变的构建体，其中除去了‘SOS突变’(即，位置501和605处的两个半胱氨酸残基恢复成原本存在于共有进化枝C序列中的氨基酸残基)。尽管其温度稳定性较低，但该突变体具有与其包含SOS突变的对应突变体相当的三聚体百分比和产量。其中除去SOS突变的突变体甚至具有比其对应的含有SOS的对应物(具有L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q突变)结合较少非bNAb的优点。这证明本发明的有利性质(如高三聚化百分比)也可以在不具有所有SOSIP突变的HIV Env蛋白中获得。
[0439] 基于表达水平、三聚体形成和与广泛中和抗体PGT151的结合的有利性质的组合，一种突变体(在ConC_SOSIP骨架中测试的)具有以下突变：L556P、N651F、I535N、I573F、D589V、A204I、K588Q。
[0440] 在ConC_SOSIP背景中，9个最成功的取代是gp41中的L556P、E647F、N651F、K655I、I535N、D589V、I573F和K588E以及gp120中的A204I。所有这9个取代的组合导致增加的稳定性、三聚体含量和三聚体产量。由于在具有9个取代的此变体中添加L556P对改进的三聚体百分比的影响相对有限，并且在此上下文中E647F取代显现阻碍PGT151结合，所以这两个突变并不总是用于其他变体，而具有7个取代的变体(命名为ConC_SOSIP_7mut，有时在此处也被称为‘稳定的ConC_SOSIP’或‘ConC_base’；包括N651F、K655I、I535N、D589V、I573F、K588E、和A204I)被发现比具有以上所示的9个取代的变体稍微更稳定(增加的解链温度)。此变体(稳定的ConC_SOSIP Env，HIV 160544)的完整序列在SEQ ID NO:20中提供。
[0441] 此时，基于表达水平、三聚体形成和与广泛中和抗体结合的有利性质的组合，特别优选的突变体[在ConC_SOSIP骨架中测试的，具有以下额外突变：(a)D279N，A281V，A362Q(增加与传播的创始(founder)病毒的相似性，如其他人所述)；(b)Del139-152(缺失可变环以减少诱导针对该环的抗体的几率)；以及(c)V295N(引入存在于大多数HIV毒株中的聚糖位点)]具有本发明的以下稳定突变：N651F、K655I、I535N、I573F、D589V、A204I、K588E。此变体(稳定的ConC_SOSIP.v3Env(HIV170654，ConC_SOSIP.v3))的完整序列在SEQ ID NO:28中提供。
[0442] 在另一变体中，向此构建体添加K658V突变(也参见以下的实例15)，这进一步改进了结果。
[0443] 实例8：展示稳定的HIV Env蛋白的自组装粒子
[0444] 制备铁蛋白和DPS自组装粒子，其以与(He等人,2016)中所述相似的方式展示稳定的Env蛋白。为了做到这一点，gp140蛋白通过短氨基酸接头(例如GSG或AAAGS，但也可以使用其他接头，参见例如He等人,2016)在DNA水平融合到粒子的N端并在Expi293F细胞中表达该融合蛋白。以这种方式制备的粒子的一个实例是基于如下的铁蛋白，所述铁蛋白与具有以下突变：I535N、A558P、D589V、K655I的ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)HIV Env蛋白融合。还制备了带有具有额外的V570D突变的Env蛋白的铁蛋白粒子，其已被报道改进三聚化(Kesavardhana等人，2014)，但是观察到这种突变导致与非中和抗体(17b)的结合强烈增加，这是不希望的。具有这五个突变的Env也与来自幽门螺杆菌和耻垢分枝杆菌的两种类型的DPS粒子融合(参见例如WO 2011/082087，针对DPS粒子的制备)。带有这五个突变和此外引入双突变I201C-A433C的二硫桥的Env也与铁蛋白融合。
[0445] 用PGDM140亲和珠粒从无细胞上清液中纯化粒子，并使用SEC-MALS(用TSKgel G6000PWCL色谱柱)分析这些粒子。SEC-MALS以及Native PAGE(3％-12％)证实形成了具有大约预期尺寸的粒子。
[0446] 以类似的方式，还制备了展示具有以下突变：(L556P，N651F，I535N，I573F，D589V，A204I，K588Q)的组合的ConC_SOSIP序列的HIV Env的铁蛋白和DPS自组装纳米粒子。
[0447] 还制备了另外的脂质体和/或自组装纳米粒子，其展示此处所述的其他HIV Env变体，例如具有SEQ ID NO:20、22、24、26、27、28、29、30、31或32的HIV Env。
[0448] 实例9：基于进化枝A包膜蛋白序列的重组HIV包膜蛋白变体
[0449] 如实例2所述将根据本发明的实施例的包含单氨基酸取代(I535N、D589V、N651F、K655I、I573F、A204I或E647F)的重组HIV Env蛋白引入具有SOSIP修饰(命名为‘BG505_SOSIP’)的野生型进化枝HIV包膜蛋白中。HIV包膜蛋白BG505_SOSIP具有所谓的SOSIP突变(残基501和605处的Cys以及残基559处的Pro)，连同导致引入二硫(DS)键的残基201和433处的另外的Cys，以及位置332上潜在的N-糖基化位点(T332N突变)。蛋白在位置664处被截短。BG505_SOSIP的序列示于SEQ ID NO:21中。
[0450] 如实例3所述，通过AlphaLISA测定来测量三聚体形成百分比和三聚体产量。将针对所测试的每种变体的三聚体形成百分比和三聚体产量与BG505_SOSIP进行比较。与骨架序列相比，针对M535N、D589V、N651F或K655I取代观察到更高的三聚体形成百分比(例如图8A)。例如L556P、K655I和M535N的组合显示出甚至增加更多的三聚体产量和百分比(例如图
8A和8B)。N651F和D589V的组合甚至更多地改进了三聚体产量和百分比(数据未显示)。本实例对于进化枝A病毒的结果与下面实例10和11(进化枝C)和实例5(进化枝B)的结果一致，其中突变I535N、D589V、N651F和K655I还显示出对衍生自野生型毒株的包膜蛋白的稳定作用，例如改进三聚体形成百分比和/或改进三聚体产量。显然，本发明的这些突变也改进了衍生自野生型进化枝A毒株的HIV Env的三聚化。
8A和8B)。N651F和D589V的组合甚至更多地改进了三聚体产量和百分比(数据未显示)。本实例对于进化枝A病毒的结果与下面实例10和11(进化枝C)和实例5(进化枝B)的结果一致，其中突变I535N、D589V、N651F和K655I还显示出对衍生自野生型毒株的包膜蛋白的稳定作用，例如改进三聚体形成百分比和/或改进三聚体产量。显然，本发明的这些突变也改进了衍生自野生型进化枝A毒株的HIV Env的三聚化。
[0451] 此时，特别优选的突变体(在BG505_SOSIP骨架中测试的，基于表达水平、三聚体形成和与广泛中和抗体的结合的有利性质的组合)是具有以下突变的突变体：L556P、K655I、M535N、N651F、D589V(参见例如图9，显示了在SEC-MALS分析中这种突变体的三聚体形成的强烈改进，以及图13，显示了这种突变体的明显改进的与广泛中和抗体的结合)。这种稳定的BG505_SOSIP Env(HIV170863)的序列示于SEQ ID NO:22中。
[0452] 添加突变Q658V提供了小的进一步改进。
[0453] 进一步优选的构建体含有L556P、K655I、M535N、N651F、D589V突变，连同‘DS’突变(位置201和433处的Cys，导致二硫键的引入)，R588E和Q658V。该变体(BG505_SOSIP.v2Env，HIV171814)的序列在SEQ ID NO:29中提供。
[0454] 实例10：基于进化枝C野生型包膜蛋白序列的重组HIV包膜蛋白变体
[0455] 如实例2所述生成和表达根据本发明的实施例的重组HIV Env蛋白，其包含引入WT C97ZA_SOSIP Env序列(SEQ ID NO:23)中的单氨基酸取代T651F，双氨基酸取代T651F、M535N，以及额外取代L556P(C97ZA_SOSIP_L556P)。如实例3所述通过AlphaLISA测定来测量三聚体产量和三聚体形成百分比。
[0456] 结果示于图10A和B。C97ZA_SOSIP_L556P_T651F_M535N的三聚体产量比C97ZA_SOSIP骨架的高五倍。
[0457] 因此，L556P、T651F和M535N取代给出了C97ZA_SOSIP的大大改进，但是针对这种进化枝C野生型衍生变体的与bNAb的结合和三聚体百分比仍然远低于针对ConC_SOSIP骨架的。由于wt Env可以适应于其宿主(可能降低其一般适合性)，并且从而折叠可能被破坏，根据下面在实例12和图12中描述的概念框架Env序列被‘修复’。总共21个残基被改变以修复序列，并且添加了三个潜在的N-糖基化位点(PNGS)以填充所谓的“聚糖孔”(在至少50％的野生型HIV毒株Env蛋白中存在潜在的N-糖基化位点的位置)。针对C97ZA_SOSIP，通过遵循此框架引入的突变在表3‘修复突变’栏中示出。此处披露的稳定突变K655I的添加与D589V，A204I和K588E一样增加了三聚体百分比和产量。
[0458] 这些结果证明，当引入C97ZA_SOSIP(衍生自进化枝C野生型毒株Env蛋白)及其变体中时，此处所述的T651F、M535N和K655I、D589V、A204I和K588E突变也对包膜蛋白具有稳定作用，例如，改进三聚体产量，改进三聚体形成百分比。
[0459] 此时，基于表达水平、三聚体形成和与广泛中和抗体的结合的有利性质的组合，特别优选的变体(在C97ZA_SOSIP骨架中测试的)是具有以下突变的变体：Q567K(以前由其他人描述)；A198T、S243N、K236T、V295N(以填充聚糖孔)；M34L、T46K、T58A、Q171K、G172V、P179L、L183Q、I192R、N209T、M307I、Q350R、N352H、Y353F、D412N、G429E、V455T、I489V、L491I、G500K、S547G、T578A、T651N(以修复该序列)；V505N、E507T、T663N(在分子底部添加的潜在N-糖基化位点)；和A204I、M535N、L556P、K588E、D589V、T651F、K655I(本发明的稳定突变)。针对此变体的数据例如在图13中示出(具体参见其中的‘稳定的和经修复的C97ZA’)，与原始wt C97ZA Env分子相比，显示广泛中和抗体结合的巨大增加。此变体(稳定的和经修复的C97ZA_SOSIP Env(HIV170690))的序列在SEQ ID NO:24中提供。
[0460] 添加突变K658V甚至进一步稳定了此蛋白。
[0461] 另外的优选变体包括‘DS’突变和K658V，并且此变体(C97ZA_SOSIP.v2Env，HIV171810)的序列在SEQ ID NO:30中提供。
[0462] 实例11：基于另一个进化枝C野生型包膜蛋白序列的重组HIV包膜蛋白变体[0463] 在来自进化枝C毒株Du422的Env蛋白中引入SOSIP突变，并通过K295N和D386N突变在位置295和位置386处填充两个聚糖孔。此外，根据实例12和图12(V272I、W456R、G466E和F643Y)中描述的概念框架修复了一些残基，并引入了稳定取代L556P、I535N、N651F和D589V。所有额外的取代导致更高的三聚体产量和三聚体百分比(例如图11)。
[0464] 在具有这四种稳定突变(SEQ ID NO:25)的特定测试变体中，额外的K655I取代进一步将三聚体产量和三聚体百分比分别增加了1.3和1.4倍(数据未显示)。
[0465] 此时，基于表达水平、三聚体形成和与广泛中和抗体的结合的有利性质的组合，特别优选的Du422_SOSIP Env变体是具有以下突变的变体：L556P、K655I、M535N、N651F、D589V、K588E、I201C、A433C、V272I、W456R、G466E、F643Y、D386N、和K295N。此变体(稳定的和经修复的Du422_SOSIP Env(HIV170859))的序列在SEQ ID NO:26中提供。针对此变体的数据例如在图13中示出(参见其中的稳定的和经修复的Du422)，与原始wt Du422Env分子相比，显示广泛中和抗体结合的巨大增加。
[0466] 另外的优选变体此外包含‘DS’突变和K658V，并且此变体(Du422_SOSIP.v1Env，HIV171812)的序列在SEQ ID NO:31中提供。
[0467] 实例12：修复和稳定不同HIV-1Env序列
[0468] 由于从被感染患者分离的病毒的wt序列可能具有阻碍正确折叠的获得性不稳定突变，因此首先修复了进化枝C C97ZA、DU422和镶嵌sC4的wt Env序列。
[0469] 为了在野生型序列中搜索非最佳突变，在UniProt数据库和洛斯阿拉莫斯HIV数据库(约90.000个序列)中比对所有HIV-1Env序列，并计算每种氨基酸的氨基酸分布。通常，根据图12中描述的概念框架，将wt Env序列中的多个相对较少存在的氨基酸取代为更常见的氨基酸(基于数据库中对应位置处的频率)。
[0470] 此外，引入C97ZA_SOSIP的顶点处的两个额外的取代Y353F和Q171K可改进顶点靶向抗体的结合，并且通过D411N、K236T和V295N的取代引入了额外多聚糖位点，因为这些潜在的N-糖基化位点(PNGS)>50％是保守的。接下来，将前述实例中描述的稳定取代转移到经修复的序列。
[0471] 稳定的ConC_SOSIP含有取代A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651F和K655I(稳定的ConC_SOSIP)。稳定的ConC_SOSIP的完整序列在SEQ ID NO:20中提供。
[0472] 表3中提供了一些变体Env蛋白及其突变的概述。
[0473] 表3.HIV Env蛋白变体。
[0474]
[0475]
[0476] 表3.此处描述的几种HIV Env蛋白变体。‘来自文献的突变’栏描述了在这些构建体中使用并且以前由其他人描述的突变。‘添加的PNGS’栏描述了添加潜在的N-糖基化位点(在许多野生型Env蛋白包含这样的位点的位置)的突变。‘前导序列’列描述了如果不是原始(天然)前导序列则使用哪个前导序列用于表达。‘修复突变’栏描述了如实例12和图12所述的改进一些野生型Env蛋白的折叠和稳定性(作为三聚体产量和百分比测量，基于与bNAb的结合)的突变。‘稳定突变’栏描述了如此处所披露的本发明的稳定该蛋白并改进三聚化的突变。‘另外的突变’栏描述了针对一些构建体制定的额外突变。‘端’栏描述了最后一个氨基酸的位置(整个表中的编号是相对于HXB2Env序列)。
[0477] 针对与几种指向顶点的三聚体特异性广泛中和抗体的结合测试了用野生型(wt)经修复的和稳定的Env变体瞬时转染的细胞的上清液。用AlphaLISA(图13)和SEC-MALS(图14)测定，修复取代并且尤其是稳定取代对三聚体含量具有显著的影响(图13和14)。
[0478] 经修复和稳定的DS_sC4Env蛋白(经修复的和稳定的DS_sC4_SOSIP Env(HIV170686))的优选变体的序列在SEQ ID NO:27中提供。
[0479] 其另一种优选的变体在SEQ ID NO:32中提供(经修复的和稳定的sC4_SOSIP.v4Env)。
[0480] 实例13：在不存在SOSIP突变的情况下本发明的稳定突变起作用
[0481] 如前述实例所示，7个突变(A204I、I535N、I573F、K588E、D589V、N651F和K655I)改进了ConC_SOSIP中的三聚体产量和百分比(导致‘ConC_base’或‘稳定的ConC_SOSIP’或‘ConC_SOSIP 7mut’)(例如图13和15)
[0482] 本实例证明不同的SOSIP突变(即‘SOS’突变：在位置501和605处由Cys残基进行的2个取代；和‘IP突变’：在位置559处由Pro残基进行的取代)有助于进一步稳定，但是对于从本发明的突变获得益处而言不是必需的。
[0483] 显示了7个突变也改进不包含稳定的I559P突变(‘IP’突变)的所谓的ConC_SOS中的三聚体产量，如图15所示(比较ConC_SOS与ConC_SOS,7mut)。因此，‘IP’突变对于从此处所述的突变获得益处不是必需的。添加I559P突变导致大的增加，显示除了本发明的7个突变之外，‘IP’突变在此构建体中是有益的。稳定IP突变(I559P)也可以被A558P或L556P替换，这两者也都导致比缺少I559P突变的变体大大增加。
[0484] 另外，含有本发明的上述的7个突变但缺少‘SOS’突变的ConC_IP,7mut仍然显示出非常高的三聚体产量，证明‘SOS’突变对于从此处所述的突变获得益处也不是必需的(例如比较ConC_SOSIP与ConC_IP,7mut)，符合实例7中的观察。添加‘SOS’突变进一步增加了三聚体产量。
[0485] 因此，尽管含有此处所述的稳定突变的Env三聚体可受益于SOSIP突变带来的进一步稳定，但是3种SOSIP突变对于从此处所述的稳定突变获得益处(例如改进的三聚体产量)而言都不是必需的。
[0486] 实例14：位置647、651或655处的甲硫氨酸取代改进三聚体质量
[0487] 又及实例2中所述的突变，在ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)骨架中位置589、647、651和655被Met残基分别取代，并使用如上所述的方法测试三聚化百分比和产量。显示了如实例2所述的突变，位置647、651或655处的Met改进了三聚体的质量(更高的三聚体百分比和产量，增加的bNAb结合)，如可以在图16中看到的。
[0488] 因此，除了在位置651处由Phe、Ala或Trp进行的取代之外，在位置651处由Met进行的取代还改进三聚体形成；除了在位置655处由Phe、Ile或Trp进行的取代之外，在位置655处由Met进行的取代还改进三聚体形成；并且除了在位置647处由Phe或Ile进行的取代之外，在位置647处由Met进行的取代还改进三聚体形成。
[0489] 实例15：在位置658处具有三聚体稳定突变的HIV Env蛋白。
[0490] 制备在ConC_SOSIP(SEQ ID NO:3)骨架中在位置658(根据HIV-1分离株HXB2的gp160进行编号)处具有取代突变的重组HIV Env蛋白。K658突变为Val、Ile、Phe、Leu、Met或Ala。此外，制备了一些双突变体，其中这些突变与上述稳定突变之一K655I组合。如实例3所述，通过AlphaLISA测定来确定三聚体形成百分比。
[0491] 结果示于图17A和B(三聚体百分比，在不同实验中测量，因此是两个图)以及图17C和D(三聚体产量，在不同的实验中测量，因此是两个图)。这些结果证明，在位置658处由Ile、Phe、Met、Leu、Ala或Val进行的取代导致三聚体形成百分比的改进和三聚体产量的改进。在位置658处Ile进行的取代导致与K655I突变大致相同的范围的增加(图17A、C)，K655I突变是上述表1中的突变(i)-(vii)中表现最好的单突变体(参见例如图2A)。在658位置处Val进行的取代导致甚至更高的改进(图17A、C)。
[0492] 结果还证明，在位置658处Ile或Val进行的取代可以与上述突变K655I组合，并且这导致超过每种对应的单突变体的进一步改进(图17A、C)。
[0493] 也使用SEC-MALS测试K658V突变体。使96孔培养物生长三天，如对于AlphaLISA所做的那样。将上清液直接加载在SEC-MALS柱上。从具有Env蛋白的上清液的色谱图中减去针对模拟上清液(具有弗林蛋白酶表达)获得的色谱图。在7至8分钟之间从柱中洗脱三聚蛋白。结果在图18中显示，并证实K658V突变体显示超过背景Env蛋白以及超过K655I突变体Env蛋白的改进的三聚化。
[0494] 本实例证明，在HIV Env蛋白中位置658处由Val、Ile、Phe、Met、Leu或Ala进行的氨基酸取代导致改进的三聚体百分比和三聚体产量。
[0495] 在其中K658V突变与来自此处所述的表1和/或2的其他突变组合存在的HIV Env变体中以及来自进化枝A和B的HIV毒株中，使用AlphaLISA和/或SEC-MALS进行测量变体的三聚体形成的另外的实验。例如，已经显示658V突变改进了如上所述的ConC_SOSIP,7mut(实例7)，以及具有L556P、K655I、M535N、N651F、D589V、K588E的BG505_SOSIP(实例9)以及经修复的和稳定的C97ZA_SOSIP(实例10)。
[0496] 基于上述结果，预期了在不同背景HIV Env蛋白中，位置658处的氨基酸突变成缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸(优选缬氨酸)残基将改进三聚体形成和/或三聚体产量。
[0497] 实例16.用稳定的HIV Env蛋白进行免疫
[0498] 用可溶性Env蛋白和与脂质体偶联的Env蛋白进行兔免疫研究。用稳定的ConC_SOSIP.v3(SEQ ID NO:28)进行引发，并且随后进行四次加强，各用另一种蛋白，即1)经修复的和稳定的sC4_SOSIP.v4(SEQ ID NO:32)；2)经修复的和稳定的C97ZA_SOSIP.v2(SEQ ID NO:30)；3)经修复的和稳定的Du422_SOSIP.v1(SEQ ID NO:31)；和4)稳定的BG505_SOSIP.v2(SEQ ID NO:29)。
[0499] 在连续免疫后分离血清，并针对特异性结合稳定的封闭的融合前构象的Env的诱导抗体(使用ELISA)以及针对诱导bNAb(使用病毒中和测定)进行分析。
[0500] 上述实例证明，本发明提供了一种通用的方法来优化融合前闭合HIV包膜三聚体蛋白的折叠和稳定性。
[0501] 应当理解，此处描述的实例和实施例仅用于说明的目的，并且可以在不脱离其广泛的发明构思的情况下对上述实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所披露的具体实施例，而是旨在覆盖由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的修改。
[0503] SEQ ID NO:1HIV-1分离株HXB2的gp160(信号序列为斜体；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0504]
[0505] SEQ ID NO:2HIV Env共有进化枝C(仅共有序列，不包括任何信号序列、跨膜结构域(664是最后一个氨基酸)、SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点突变；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0506]
[0507] SEQ ID NO:3ConC_SOSIP(具有SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点(斜体)和C端截短的成熟进化枝C共有序列；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0508]
[0509] SEQ ID NO:4HIV Env共有进化枝B(仅共有序列，不包括任何信号序列、跨膜结构域(664是最后一个氨基酸)、SOSIP突变和/或弗林蛋白酶切割位点突变；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0510]
[0511] SEQ ID NO:5ConB_SOSIP(具有SOSIP突变和弗林蛋白酶切割位点(斜体)和C端截短的成熟进化枝B共有序列；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0512]
[0513] SEQ ID NO:6合成HIV包膜蛋白Mos2S Env C4片段；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0514]
[0515] SEQ ID NO:7(DS_sC4_SOSIP_E166R序列；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0516]
[0517] SEQ ID NO:8(Mos1.Env，镶嵌HIV包膜蛋白序列；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0518]
[0519] SEQ ID NO:9(Mos2.Env，镶嵌HIV包膜蛋白序列；在针对根据本发明的突变的位置(i)-(vii)处的氨基酸由灰色阴影指示)
[0520]
[0521] SEQ ID NO:10(弗林蛋白酶切割位点突变体序列)
[0522]
[0523] SEQ ID NO:11(信号序列的实例(例如用于ConC_SOSIP，以及一些野生型衍生的变体))
[0524] (注解：最后的VG可以是成熟蛋白的开始或信号序列的结束)
[0525] SEQ ID NO:12(可替换HR1环的8氨基酸序列的实例)
[0526]
[0527] SEQ ID NO:13(可替换HR1环的8氨基酸序列的实例)
[0528]
[0529] SEQ ID NO:14(可替换HR1环的8氨基酸序列的实例)
[0530]
[0531] SEQ ID NO:15(可替换HR1环的8氨基酸序列的实例)
[0532]
[0533] SEQ ID NO:16(可替换HR1环的8氨基酸序列的实例)
[0534]
[0535] SEQ ID NO:17(可替换HR1环的8氨基酸序列的实例)
[0536]
[0537] SEQ ID NO:18(信号序列的实例(例如用于ConB_SOSIP)
[0538]
[0539] SEQ ID NO:19(在AlphaLISA测定中用于HIV gp140构建体的标签)
[0540]
[0541] SEQ ID NO:20(稳定的ConC_SOSIP，‘ConC_SOSIP_7mut’(HIV160544))
[0542]
[0543] SEQ ID NO:21(BG505_SOSIP Env蛋白(HIV150673))
[0544]
[0545] SEQ ID NO:22(稳定的BG505_SOSIP Env蛋白(HIV170863))
[0546]
[0547] SEQ ID NO:23(具有L535M和Q567K的wt C97ZA_SOSIP Env蛋白(HIV150673))[0548]
[0549] SEQ ID NO:24(经修复的和稳定的C97ZA_SOSIP Env蛋白(HIV170690))
[0550]
[0551] SEQ ID NO:25(经修复的和稳定的Du422构建体的变体(HIV161818))
[0552]
[0553] SEQ ID NO:26(经修复的和稳定的Du422_SOSIP(HIV170859))
[0554]
[0555] SEQ ID NO:27(经修复的和稳定的DS_sC4_SOSIP(HIV170686))
[0556]
[0557] SEQ ID NO:28(稳定的ConC_SOSIP.v3(HIV170654))
[0558]
[0559] SEQ ID NO:29(稳定的BG505_SOSIP.v2(HIV171814))
[0560]
[0561] SEQ ID NO:30(经修复的和稳定的C97ZA_SOSIP.v2(HIV171810))
[0562]
[0563] SEQ ID NO:31(经修复的和稳定的Du422_SOSIP.v1(HIV171812))
[0564]
[0565] SEQ ID NO:32(稳定的和经修复的sC4_SOSIP.v4)
[0566]
[0567] SEQ ID NO:33(信号序列的实例(例如用于DS_sC4_SOSIP变体)
[0568]
[0569] SEQ ID NO:34(信号序列的实例(例如用于BG505_SOSIP变体)
[0570]
[0571] 参考文献
[0572] 1.Sanders等人J.Virol.[病毒学杂志](2002)76(17),8875-89
[0573] 2.Sanders等人Science[科学](2015)349(6224),139-140
[0574] 3.Julien等人Proc.Nat.Acad.Sci.[美国科学院院报](2015)112(38),11947-52[0575] 4.de Taeye等人Cell[细胞](2015)163(7),1702-15
[0576] 5.Kwon等人,(2015)Nat.Struct.Mol.Biol.[自然结构与分子生物学]22(7)522-31
[0577] 6.Eglen等人Curr.Chem.Genomics[当前化学基因组学],(2008)25(1),2-10[0578] 7.Kong等人,Nat Commun.[自然通讯]2016年6月28日；7:12040.doi:10.1038/ncomms12040
[0579] 8.Julien等人Proc.Nat.Acad.Sci.[美国科学院院报](2015)112(38)11947-52[0580] 9.Barouch等人,Nat Med[自然方法]2010,16:319-323
[0581] 10.WO 2010/059732
[0582] 11.欧洲专利申请EP15200138.4
[0583] 12.Sharma SK等人Cell Rep.[细胞通讯](2015)11(4):539-50.doi:10.1016/j.celrep.2015.03.047.
[0584] 13.Georgiev IS等人J Virol.[病毒学杂志](2015)89(10):5318-29.doi:10.1128/JVI.03451-14.
[0585] 14.López-Sagaseta J等人(2016)Computational and Struct Biotechnol J[计算和结构生物技术杂志]14:58-68。
[0586] 15.Zhao L等人(2014)Vaccine[疫苗]32:327-337
[0587] 16.He L等人(2016)Nat Commun.[自然通讯]2016年6月28日；7:12041.doi:10.1038/ncomms12041
[0588] 17.WO 2011/082087
[0589] 18.Kesavardhana A和Varadarajan R(2014)J Virol[病毒学杂志]88:9590-9604[0590] 19.Guenaga J等人(2015)Immunity[免疫力]46:792-803
[0591] 20.Bale S等人(2017)J.Virol.[病毒学杂志]doi:10.1128/JVI.00443-17
[0592] 21.Abbink等人(2007)Virol.[病毒学]81(9):4654-64
[0593] 22.Altschul SF等人(1997)Nucleic Acid Res.[核酸研究]25:3389-3402
[0594] 23.Harris等人(2011)PNAS 108(28):11440-11445
[0595] 24.Kushnir等人(2012)Vaccine[疫苗](31):58-83
[0596] 25.WO 2007/104792
[0597] 26.WO 2014/124301
[0598] 27.US 2016/0122392
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
稳定性热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈