用于诊断肺癌侵袭性和遗传不稳定性的标记
阅读：42发布：2023-01-05
专利汇可以提供用于诊断肺癌侵袭性和遗传不稳定性的标记专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于从患者的 肺 癌样本来诊断在所述患者中肺癌侵袭性的方法，包括：a)体外检测DNA复制应 力 标记的表达谱，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因；以及任选地RAD51；b)将所述表达谱与参考表达谱进行比较；以及d)从所述比较中诊断癌的侵袭性。还描述了专用微阵列和 试剂 盒 ，以及选择或调整合适 治疗 的方法。，下面是用于诊断肺癌侵袭性和遗传不稳定性的标记专利的具体信息内容。
1.一种用于诊断患者中肺癌侵袭性的方法，其包括以下步骤：
a)从所述患者的生物样本检测DNA复制应力基因标记的表达谱，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因；
b)将步骤a)的表达谱与至少一种参考表达谱进行比较；以及
c)从所述比较中诊断肺癌为侵袭性或非侵袭性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记还包括RAD51基因。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中通过测量所述标记的每个基因的表达水平进行根据步骤a)的表达谱检测。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过测量在参考样本中所述标记的每个基因的表达水平获得所述参考表达谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述参考表达样本是来自所述患者的健康肺组织样本。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中对于所述标记的每个基因通过计算在测试生物样本中的表达水平和参考样本中的表达水平之间的表达水平比来进行步骤b)的比较。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中通过将获得的表达水平比与相应阈值进行比较来获得诊断。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括将所述标记的每个基因的表达水平对于对照基因的表达水平进行归一化的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述对照基因是管家基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述管家基因是选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、
18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述表达水平在mRNA水平测量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述表达水平使用定量PCR或微阵列技术进行测量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述表达水平在蛋白水平测量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述表达水平使用特异性抗体进行测量。
16.一种用于确定肺癌是否对使用放射疗法和/或化学治疗剂的治疗易感的方法，其包括：
a)使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及
b)如果所述肺癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则确定所述肺癌对使用所述放射疗法或化学治疗剂的治疗易感。
17.一种用于在患者中选择肺癌的合适治疗的方法，其包括：
a)使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述癌是或不是侵袭性，以及
b)如果所述癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则向外科治疗中增加辅助的放射疗法或化学治疗剂。
18.一种用于为患肺癌的受试者设计使用放射疗法和/或化学治疗剂进行治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及
b)根据步骤a)的诊断确定放射疗法或化学治疗剂治疗的剂量。
19.一种调整患肺癌受试者的治疗的方法，所述治疗使用放射疗法或化学治疗剂，方法包括：
a)使用根据权利要求1至15中任一项所述的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及
b)根据步骤a)的诊断调整放射疗法或化学治疗剂治疗。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述化学治疗剂是DNA修复的抑制因子、DNA复制/损伤检验点的抑制因子、或DNA复制许可/起始的抑制因子。
用于诊断肺癌侵袭性和遗传不稳定性的标记
技术领域
[0001] 本发明涉及肺癌管理领域，包括诊断所述癌的侵袭性和选择合适的治疗。本发明基于以下发现：过表达的标记，包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因，以及任选地RAD51基因，与肿瘤的侵袭性高度相关，因此与患者的生存高度相关。
背景技术
[0002] 癌症是多元的疾病，其中一组细胞显示出不受控的增长、侵入并摧毁相邻组织的浸润，并且有时经由淋巴或血液转移或扩散至身体的其它部位。癌的这三种恶性性质将其与不浸润或转移的良性肿瘤区分开来。
[0003] 肺癌-主要为非小细胞肺癌(NSCLC)-是全世界癌症死亡的首要原因，其导致每年约100万人死亡。尤其是对于不吸烟的女性，它的发病率上升。虽然在预防、筛查、切除方法和化学疗法方案上的进步，只有约15％的患者存活5年以上。
[0004] 对于患者，选择合适的治疗至关重要。有必要知道什么时候立刻使用剧烈的积极治疗操作以防止侵袭性癌的扩散。相反地，当患者所携带的肿瘤没有必要的时候进行剧烈的积极治疗，对于患者也是不利的。事实上，剧烈的积极治疗常常导致不利的毒性，可能严重影响患者的生活质量。此外，这种剧烈的积极治疗通常非常昂贵，因此仅应在必须时才进行。
[0005] 目前，对实体瘤的治疗选择基于肿瘤分期(staging)，其通常使用来自美国癌症联合委员会(AJCC)的肿瘤/结节/转移(TNM)测试进行。TNM系统基于三种类别分配一个数字。“T”表示肿瘤大小，″N″表示淋巴结参与的程度，以及“M”表示转移程度。癌症更宽的分期通常被引作数字I、II、III、IV，其源自根据预后分组的TNM值；更高的数字代表更多进展的癌症和可能更坏的结果。
[0006] 在患者诊断患有实体癌的分期中，尽管此测试和分期系统提供了一些关于分期的有价值信息，通常认为其不精确和不充分。特别是，其不能鉴定肿瘤进展的最早期。另外，TNM测试不能给出肿瘤侵袭性的信息，因而其对预后的用处受到限制。根据临床医师和病理学家，因此目前的临床分期“肿瘤结节转移”(TNM)系统对于预测患者的结局不充分。
[0007] 真正需要更好的癌症预后测试，其不仅仅改善患者的全面生存，还改善了他们的生活质量，并且使真正能从积极的高花费化学疗法受益的患者坚持该化学疗法。特别是，需要能够可靠地用于肺癌预后的新的强大预后标志物。
[0008] 在试图鉴定患者预后和对治疗反应的预测因子(predicator)中，许多描述在肺癌中基因表达的研究已经完成或正在进行中。到目前为止，这些遗传测试为标准预测方法添加了适度的预后信息。事实上，这些多基因标记大多获自数以千计基因的基于无偏倚微阵列分析的筛选，因此大多数包括“终点”选择的细胞增殖相关基因，即在肿瘤发生的最后阶段驱动细胞周期进展或肿瘤分化的基因。然而，后两者的这些特征已经通过标准的临床病理标志物，如组织学分级、有丝分裂计数、Ki67指数等得以评估，所述临床病理标志物也捕获增殖状态。
发明内容
[0010] 本发明已经鉴定出DNA复制应力标记，并已经显示这种标记与肺癌中的不良预后相关。更具体地，一组基因，其包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ，在肺癌中过表达，并且这种过表达给出关于患者预后的信息。例如，在93类肺癌的大多数中发现这四个基因过表达。不管进行何种生存期检查(总体生存、无复发生存、无疾病生存)，这种过表达都与患者生存相关。明显地，在这4个基因标记和患者生存之间的统计学相关不依赖于肿瘤分期和治疗，当在这种标记包括RAD51时这种相关性甚至更好。
[0011] 因此，本发明提供用于诊断在患者中肺癌侵袭性的DNA复制应力基因标记，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因。有利地，所述标记进一步包括RAD51基因。在优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因组成。在另一优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因组成。
[0012] 在另一方面，本发明还涉及用于诊断患者中肺癌侵袭性的方法。根据本发明的方法，DNA复制应力基因标记的基因升高的表达水平说明所述癌症的侵袭性。
[0013] 因此，本发明提供一种用于诊断患者中肺癌的侵袭性的方法，其包括以下步骤：
[0014] a)从所述患者的生物样本中检测DNA复制应力基因标记的表达谱，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因；
[0015] b)将步骤a)的表达谱与至少一种参考表达谱进行比较；以及
[0016] c)从所述比较中诊断肺癌的侵袭性或非侵袭性。
[0017] 在本发明方法的优选实施方案中，所述标记进一步包括RAD51基因。在本发明方法的另一优选实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因组成。在一个甚至更优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因组成。
[0018] 如本文所用，术语“癌”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常以失控的细胞生长为特征的病理状态。本文使用的术语“癌”和“癌性的”意为包括该疾病的所有分期。因此，本文所用的“癌”可包括良性和恶性肿瘤两者。
[0019] 根据本发明的“肺癌”是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。优选地，本发明的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。更优选地，本发明的NSCLC选自：鳞状细胞癌、大细胞癌、腺癌、多形性癌、类癌瘤和未分类的肺癌。最优选地，NSCLC是鳞状细胞癌、大细胞癌或腺癌。
[0020] 如本文所用，术语“POLQ”指编码DNA聚合酶θ的人类基因(Entrez基因ID号：10721；mRNA序列参照号:NM_199420.3；蛋白序列参照号:NP_955452.3)；术语“PLK1”指编码polo样激酶1的人类基因(mRNA序列参考号：NM_005030；蛋白序列参考号：
NP_005021.2)；术语“CLASPIN”指编码Chk1的调节因子的人类基因，所述基因也被指定为CLSPN(mRNA序列参考号：NM_001190481.1；蛋白序列参考号：NP_001177410.1)；术语“CDC6”指编码复制起始所需蛋白的人类基因(mRNA序列参考号：NM_001254.3；蛋白序列参考号：NP_001245.1)；以及术语“RAD51”指编码协助修复DNA双链断裂的蛋白的人类基因(mRNA序列参考号：NM_002875；蛋白序列参考号：NP_002866)。
NP_005021.2)；术语“CLASPIN”指编码Chk1的调节因子的人类基因，所述基因也被指定为CLSPN(mRNA序列参考号：NM_001190481.1；蛋白序列参考号：NP_001177410.1)；术语“CDC6”指编码复制起始所需蛋白的人类基因(mRNA序列参考号：NM_001254.3；蛋白序列参考号：NP_001245.1)；以及术语“RAD51”指编码协助修复DNA双链断裂的蛋白的人类基因(mRNA序列参考号：NM_002875；蛋白序列参考号：NP_002866)。
[0021] 此外，本发明包括所述基因的所有同种型。如此处所用的同种型，涉及所述基因的所有不同形式，并可能由突变产生，或可通过可变剪接由相同基因产生。很多同种型由单核苷酸多态性或SNP、相同基因的等位基因间小的遗传差别所引起。这些发生在基因内特定个别核苷酸位点上。在此定义中也包括通过采用不同的启动子从相同基因产生不同版本的信使RNA的情况，其导致转录跳过某些外显子。因而，应当理解本发明的方法不局限于所述CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51本身，也包含一个或几个所述基因中的一个或几个同种型。根据本发明的方法，测量所述基因和/或其一个或几个同种型的表达水平并确定表达谱。
[0022] 根据本发明，肺癌的“侵袭性”意欲指所述肺癌浸润相邻组织并发生转移的倾向以及所述浸润可能出现的速度。
[0023] 根据本发明的方法，当步骤a)的表达谱与步骤b)的至少一种参考表达谱不相同时，那么癌为侵袭性的。例如，假如步骤b)的所述参考谱获自健康、非癌性的样本，如果步骤a)的所述表达谱与步骤b)的所述参考表达谱相比是升高的，那么癌为侵袭性的。换言之，假如，例如步骤b)的所述参考谱获自健康、非癌性样本，如果在来自受测试的患者的样本中本发明标记的基因比在健康、非癌性的、参考样本中表达更多，那么癌为侵袭性的。
[0024] 肺癌的侵袭性与生存明显相关，可以使用上述方法预后患者的生存，其中诊断为侵袭性的病例导致不好的生存预后，而诊断为缺乏侵袭性则产生良好的生存预后。
[0025] 因此，本发明还涉及一种用于评估患肺癌的患者生存方法，其包括以下步骤：
[0026] a)从所述患者的生物样本中检测DNA复制应力基因标记的表达谱，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因；
[0027] b)将步骤a)的表达谱与至少一种参考表达谱进行比较；以及
[0028] c)从所述比较中评价所述患者的生存预后。
[0029] 在本发明方法的优选实施方案中，所述标记进一步包括RAD51基因。在本发明方法的另一优选实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因组成。在一个甚至更优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因组成。
[0030] “表达谱”意为DNA复制应力标记的基因，包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ，以及任选地RAD51的表达水平。在优选实施方案中，所述表达谱由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因组成，因为这些基因的表达模式已经被证明对于评估所述肺癌的肺癌侵袭性是特别相关的。在最优选实施方案中，如果所述肺癌是侵袭性的，那么所述用于诊断的表达谱还包括RAD51基因。
[0031] 可以通过由本领域技术人员已知的任何技术来确定根据本发明的表达谱。优选地，确定根据本发明的表达谱涉及测量每个DNA复制应力标记基因的表达水平。特别地，可以在基因组和/或核酸和/或蛋白水平测量每个基因的表达水平。在优选的实施方案中，通过测量各基因的核酸转录物的量来确定表达谱。在另一个实施方案中，通过测量每个基因所产生的蛋白质的量来确定表达谱。
[0032] 由于将获得的表达谱与在步骤(b)中的至少一种参考表达谱相比较，得以进行肺癌侵袭性的诊断。
[0033] “参考表达谱”是获自参考样本的预先确定的表达谱。优选地，通过测量在所述参考样本中每个所述标记基因的表达水平来获得所述参考表达谱。根据本发明的“参考样本”是与特定结局分类相关的生物样本。在一个实施方案中，可以从与不良生存结局相关的参考样本获得参考表达谱。例如，这样的参考样本可以由在一个特定的、容易鉴定分期的癌性组织所制成。在另一个实施方案中，参考表达谱可以获自与良好生存结局相关的参考样本。这种与良好生存结局相关的生物样本的一个实例是由健康、非癌性肺组织所制成的生物样本。所述健康、非癌肺组织的组成可以仅有一个受试者的健康肺组织，或者可以是由几个受验者的健康肺组织制成的合并样本。当样本仅由一个受试者的健康肺组织制成时，所述受试者可以是受测试的患者或另一受试者。有利地，从待诊断的肺癌患者中获得所述生物样本。事实上，如上所述，甚至在癌患者中肺组织仍然包含非肿瘤的健康组织。特别地，当肺癌样本取自手术切除治疗时，待诊断患者的相邻的、非肿瘤的、健康的肺组织通常是可获得的并且可用作健康对照样本。在这种情况下，在受测试的癌生物样本和参考健康样本之间在基因表达上所观察到的变化可主要归因于肺癌，而不是人与人之间和/或组织之间在基因表达上的变化。
[0034] 使用待测患者的癌样本来进行上述方法。在一些情况中，根据本发明的方法可进一步包括从患者获取癌样本的预备步骤。通过“癌样本”或“肺癌样本”，是指肺肿瘤样本。甚至在癌性患者中，肿瘤位点的肺组织也包括非肿瘤的健康组织。因而，“癌样本”应当被限定于取自患者的肿瘤组织。所述“癌样本”可以是活检肺样本或取自患者的手术切除治疗的肺样本。
[0035] 另外，根据本发明的方法，在从患者取得样本和如上述限定的步骤a)之间可以包括另一预备步骤，其对应于将癌样本(以及任选地健康的组织样本)转化成mRNA(或相应的cDNA)样本或转化成蛋白质样本，随后其可备用于步骤a)中的体外测量基因表达水平。从组织样本中制备或提取mRNA(以及逆转录为cDNA)或蛋白质仅是本领域技术人员公知的常规程序。
[0036] 一旦获得了即用的癌mRNA(或相应的cDNA)或蛋白质样本，可进行标记基因表达水平的测量，所述标记基因包括或由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ、以及任选地RAD51所组成，这取决于转化和可获得的即用样本的类型，是在mRNA水平(即，基于样本中mRNA的含量)还是在蛋白质水平(即，基于样本中蛋白质的含量)。在某些实施方案中，可以在mRNA水平测量一些基因的表达水平，而在蛋白质的水平测量其它基因的表达水平。在这个情况中，取自患者的癌样本的一部分被转化为mRNA(或相应的cDNA)样本而另一部分被转化成蛋白质样本。在其它实施方案中，在mRNA水平测量或在蛋白质水平测量所有受测试的基因的表达水平。
[0037] 用于定量mRNA的方法是本领域公知的。事实上，当在mRNA水平测量表达水平时，显著地可以使用公知的技术进行，例如定量PCR或核酸微阵列技术(包括cDNA和寡核苷酸微阵列)。这些技术现在已被本领域技术人员常规使用，因此不需要在此详细地描述。使用定量PCR的实施方案的实施例在实验部分描述。可选地，可以使用任何已知或未来技术以便基于mRNA含量来评估基因表达水平。例如，可以使用原位杂交中偶联荧光的组织微阵列。组织微阵列(也称为TMA)由石蜡块组成，其中多达1000个独立的组织核以阵列形式组装以便允许多重组织学分析。在组织微阵列技术中，使用空心针从石蜡包埋的组织(如临床活检或肿瘤样本)的目标区域取出直径小如0.6mm的组织核。然后将这些组织核以精确的空间阵列模式插入受体石蜡包块中。使用切片机对所述包块切片，安装于显微镜玻片上，然后通过任何标准组织学分析的方法进行分析。每个微阵列包块可被切为100-500个切片，其可用于独立测试。在组织微阵列中通常采用的测试包括免疫组织化学和荧光原位杂交。对于在mRNA水平的分析，可以将组织微阵列技术偶联荧光原位杂交。
[0038] 当在蛋白质水平测量表达水平时，尤其可以使用特异性抗体来进行测量，具体地使用公知的技术，如western印迹、ELISA或ELISPOT、抗体微阵列、或偶联免疫组织化学的组织微阵列。其它合适的技术包括FRET或BRET，使用单个或多个激发波长的单细胞显微或组织化学方法，和采用任意合适的光学方法，例如电化学方法(伏安法和电流分析法技术)，原子力显微镜和无线电频率方法，例如共焦和非共焦的多极共振光谱法，荧光检测、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射或折射率(例如，表面等离子体共振、椭圆对称、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉量度分析法)、细胞ELISA、流式细胞术、放射性同位素、磁共振成像、通过质谱分析法(MS)的分析、串联质谱分析法(MS-MS)、MS 3；基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；HPLC-质谱分析法；液相色谱/质谱分析法/质谱分析法(LC-MS/MS)。所有这些技术都是本领域公知的，不需要在此进一步详述。
[0039] 将受测试的患者的表达谱与参考表达谱进行比较允许确定所述表达谱是否相似或不同。本领域技术人员将理解这种比较将取决于所使用的参考样本。例如，如果参考样本由获自已知具有不良预后的受试者的癌性肺组织所制成，并且在表达谱上具有不同(例如，较低的表达水平)，那么受测试的肺癌可被诊断为非侵袭性的，受测试的患者可被预后或分类为良好生存组。同样，如果在那种情况下表达谱是相似的，那么受测试的癌可被诊断为侵袭性的，患者预后或分类为不良生存组。在另一方面，如果参考样本由健康组织所制成，并且在表达谱上具有不同(例如，较高的表达水平)，那么受测试的癌可被诊断为侵袭性的，受测试的患者预后或分类为不良生存组；然而，如果在表达谱中没有不同，那么受测试的癌可被诊断为非侵袭性的，受测试的患者预后为良好生存组。
[0040] 本文所用的术语“差异性表达的”或“差异表达”指在本发明的基因表达水平中的差异，其可通过测量所述基因产物的表达水平来进行分析，例如，所述基因表达的信使RNA转录物水平或表达的蛋白质水平中的差异。在优选的实施方案中，所述差异是统计学上显著的。术语“表达水平中的差异”是指给定基因的可测量的表达水平中的增加或减少，其通过将在测试样本中信使RNA转录物的量和/或蛋白质的量与参考样本中给定基因的可测量表达水平进行比较来测量。本文所用的术语“在表达中的相似性”意思是在测试样本和对照或参考谱之间的生物标志物的表达水平上没有差别或有微小的差别。例如，相似性可以指与对照相比成倍的差异。在优选的实施方案中，在生物标志物的表达水平中没有统计学上显著的差异。
[0041] 可以以多种方式来进行表达谱的比较。可使用统计分析。例如，可使用目的在于提取成分的PLS回归(偏最小二乘法)来进行比较，其是解释变量(基因)的线性组合以便为可变响应建模(例如，如果为非侵袭性，则为0；如果为侵袭性，则为1)。PLS回归分析特别关系在小参考样本的情况下给出预测。也可以使用支持向量机(SVM)、逻辑回归、线性判别分析、随机森林、k-NN(k＝3、4、5、6)或PAM(微阵列预测分析)统计方法进行比较。优选为Fisher的线性判别分析。
[0042] 优选地，对于每个标记基因通过计算在测试生物样本中的表达水平和参考样本中的表达水平之间表达水平比来进行表达谱的比较，所述标记基因包括或由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ、以及任选地RAD51所组成。
[0043] 然后，通过将所获得的表达水平比与相应阈值进行比较可以获得所述肺癌侵袭性的诊断。
[0044] 因此，本发明提供一种用于诊断患者中肺癌的侵袭性的方法，其包括以下步骤：
[0045] a)在所述患者的生物样本中针对DNA复制应力基因标记的每个基因测量表达水平，所述标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因；
[0046] b)在所述患者的参考样本中针对DNA复制应力基因标记的每个所述基因测量表达水平；
[0047] c)针对DNA复制应力基因标记的每个基因计算在测试生物样本中的表达水平和参考样本中的表达水平之间的表达水平比；以及
[0048] d)通过将获得的表达水平比与相应的阈值进行比较来诊断肺癌的侵袭性或非侵袭性。
[0049] 在本发明方法的优选实施方案中，所述标记进一步包括RAD51基因。在本发明方法的另一优选实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因组成。在一个甚至更优选的实施方案中，所述标记由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因组成。
[0050] 因此，当参考样本由健康组织制成时，如果每个基因的比高于其对应阈值，或者当参考样本由癌性肺组织制成时，如果这些基因中每个的比低于其对应阈值，则诊断肺癌为侵袭性的。如上所述，有利地使用来自受测试的患者的健康肺组织所制成的参考样本。在这种具体实施方案中，如果每个所述基因的比高于阈值，则诊断肺癌为侵袭性的。
[0051] 在一些实施方案中，本发明的方法在计算表达水平比之前，还包括将所述标记基因的表达水平对于一个或更多个对照基因的表达水平进行归一化的步骤。根据本发明的“对照基因”是在所有细胞类型中表达的基因。更特别地，根据本发明的对照基因是在肺的所有细胞中表达的基因。在另一方面，对照基因的表达水平不受细胞状态影响，即，在健康肺细胞和癌性肺细胞中对照基因表达为相同的水平。在一个特定的实施方案中，对照基因是管家基因。管家基因是在所有细胞类型中表达的基因，其为所有细胞类型的维持提供所需的基本功能。人类管家基因的列表可见于Eisenberg等人(Trends in Genetics19:362-365,2003)。根据本发明优选的管家基因是选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因。根据本发明，进一步优选的管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC。
[0052] 在本实施方案中，在受测试的肺癌样本和参考样本中也测量所述对照基因的表达水平。然后，针对每个标记基因和每个样本将表达水平相对于对照基因的表达水平进行归一化。然后计算在肺癌样本归一化的表达水平和参考样本归一化的表达水平之间表达水平比。如上所述，通过将获得的表达水平比和相应阈值进行比较来诊断侵袭性。
[0053] 根据本发明，“阈值”意指允许区分样本的值，其中目标基因的表达水平比对应于患者肺癌样本中所述目标基因或低或高的表达水平。特别地，当参考样本由来自受测试的患者的健康肺组织制成时，如果基因表达水平比低于或等于阈值，那么在患者肺癌样本中的这种基因表达水平被认为是低的，而如果基因表达水平比高于阈值，那么在患者肺癌样本中的这种基因表达水平被认为是高的。对于每个基因且根据测量基因表达水平所用的方法不同，最佳的阈值可不同。然而，本领域技术人员基于几种对照癌样本的分析以及比较其与对照基因(例如，管家基因)的表达可以容易地确定阈值，已知在所述对照癌样本中特定基因的表达水平(低或高)。
[0054] 本发明进一步涉及专用于实施根据本发明方法的微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个不同探针，其中至少4个特异性结合至mRNA(或相应的cDNA)或蛋白质，所述mRNA或蛋白质由本发明的DNA复制应力标记基因所产生。
[0055] 在优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优选为至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个不同探针(因此排除例如泛基因组(pangenomic)微阵列)，其中至少4个特异性杂交至mRNA(或相应的cDNA)，其由本发明的DNA复制应力标记基因所产生。因此，在更优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优选为至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个不同的探针、其中至少4个特异性杂交至mRNA(或相应的cDNA)，其由CDC6、CLASPIN、PLK1、和POLQ基因所产生。在甚至更优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含至多
500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多
40、至多30、至多20、至多10个不同探针，其中至少5个特异性杂交至由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因所产生的mRNA(或相应cDNA)。除了探针特异性地杂交至本发明的DNA复制应力标记基因之外，所述微阵列还可以包含至少一个探针，其特异性地杂交至管家基因。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。更优选地，所述管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC基因。根据本发明，“核微阵列”由附着至基质的不同核酸探针所组成，所述基质可以是微芯片、玻片或微球尺寸的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针可以是核酸，例如cDNA(“cDNA微阵列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微阵列”，所述寡核苷酸是约25至约60对碱基对或更少的长度)。
500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多
40、至多30、至多20、至多10个不同探针，其中至少5个特异性杂交至由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因所产生的mRNA(或相应cDNA)。除了探针特异性地杂交至本发明的DNA复制应力标记基因之外，所述微阵列还可以包含至少一个探针，其特异性地杂交至管家基因。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。更优选地，所述管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC基因。根据本发明，“核微阵列”由附着至基质的不同核酸探针所组成，所述基质可以是微芯片、玻片或微球尺寸的珠。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针可以是核酸，例如cDNA(“cDNA微阵列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微阵列”，所述寡核苷酸是约25至约60对碱基对或更少的长度)。
[0056] 或者，在另一实施方案中，所述微阵列可以是一种抗体微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个不同抗体，其中至少4个特异性结合至由本发明的DNA复制应力标记基因所产生的蛋白质。优选地，所述微阵列可以是一种抗体微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个不同抗体，其中至少4个特异性结合至由CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因所产生的蛋白质。更优选地，所述微阵列可以是一种抗体微阵列，其包含至多500、优选至多300、至多200、更优选至多150、至多100、甚至更优选至多75、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10个不同抗体，其中至少4个特异性地结合至由CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因所产生的蛋白质。除了所述抗体特异性地结合由本发明的DNA复制应力标记基因所产生的蛋白质之外，所述微阵列还可以包含至少一种抗体，其特异性地结合管家蛋白。在一个实施方案中，所述管家蛋白选自由B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS基因所产生的蛋白质。在一个优选的实施方案中，所述管家蛋白选自由IPO8、HMBS、GUSB和UBC基因所产生的蛋白质。
[0057] 作为核酸或抗体微阵列技术的替代，可使用定量PCR，因此对待测基因特异的扩增引物对于进行根据本发明的方法也非常有用。因此，本发明还涉及用于从所述患者的肺癌样本诊断患者中肺癌侵袭性的试剂盒，其包括上述专用微阵列或对本发明的DNA复制应力标记基因特异的扩增引物。此处还有，当试剂盒包括扩增引物时，虽然所述试剂盒可包括对其它基因特异的扩增引物，所述试剂盒优选地包括至多100、至多75、50、至多40、至多30、优选至多25、至多20、至多15、更优选至多10、至多8、至多6、甚至更优选至多5、最多4、最多3、或甚至2或1或甚至0对扩增引物，其对其它基因特异而不对本发明的DNA复制应力标记基因特异。例如，除了对本发明的DNA复制应力标记基因特异的引物之外，所述试剂盒可包括至少对至少一个管家基因特异的一对扩增引物。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。在优选的实施方案中，所述管家基因选自IPO8、HMBS、GUSB和UBC基因。
[0058] 如上所述，预后与肺癌侵袭性相关的肺癌进展的能力对于选择适当治疗非常重要，因为除传统的外科治疗外，每次必要时且仅在必要时应当使用具有潜在严重副作用的、剧烈且昂贵的治疗。
[0059] 因而，本发明提供用于确定肺癌是否对使用放射疗法和/或化学治疗剂的治疗易感的方法，其包括：
[0060] a)使用如上所述的根据本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性的，以及
[0061] b)如果所述肺癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则确定所述肺癌对使用放射疗法和/或所述化学治疗剂的治疗为易感的。
[0062] 本发明的化学治疗剂包括而不限制于抗微管剂，例如二萜和长春花生物碱；铂配合物；烷化剂如氮芥、噁唑膦(oxazaphosphorines)、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯；抗生物剂，例如蒽环、放线菌素和博来霉素；拓扑异构酶II抑制剂，例如表鬼臼毒素；抗代谢物，例如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；和细胞周期信号抑制剂。此外，本发明的方法可以与其它抗癌治疗、抗血管生成剂、或化学治疗剂或放射疗法组合。优选的实例是多西他赛(docetaxel)和泰索帝(taxotere)。其它的实例包括吉西他滨、顺铂二萜和长春花生物碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱和长春瑞滨、卡铂、环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥、白消安、卡莫司汀、达卡巴嗪、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、卡莫司汀、达卡巴嗪、抗肿瘤剂，其包括但不限于放线菌素如更生霉素、蒽环霉素(anthrocyclin)如道诺霉素(daunorubicin)和阿霉素、博莱霉素、表鬼臼毒素、鬼臼乙叉甙和替尼泊苷；抗代谢抗肿瘤剂、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、硫基嘌呤、硫鸟嘌呤、喜树碱、盐酸伊立替康(irinotecan HCl)以及盐酸托泊替康(topotecan HCl)。
[0063] 多种不同的化学治疗剂或抗癌多肽也可以选择。信息源例如www.clinicaltrials.gov、www.ncbi.nlm.nih和www.drugs.com，包括可以选择的多肽和试剂的参考文献。
[0064] 优选地，本发明的化学治疗剂已经被至少一个卫生当局批准用于治疗肺癌。这种特别用于治疗肺癌的化学治疗药物的实例包括氨甲喋呤、培美曲塞二钠、贝伐单抗(Bevacizumab)、卡铂(Carboplatin)、顺铂(Cisplatin)、甲氨蝶呤、克里唑替尼(Crizotinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、吉西他滨-顺铂(Gemcitabine-Cisplatin)、吉非替尼(Gefitinib)、紫杉醇(Paclitaxel)、卡铂、培美曲塞(Pemetrexed)、顺铂、克里唑替尼、依托泊苷(Etoposide)和拓扑替康(Topotecan)。
[0065] 在另一优选的实施方案中，化学治疗剂是基因毒性的。本实施方案是特别有利的，因为所述标记的任何基因的过表达被预期干扰DNA复制，从而诱导针对基因毒性剂的超敏反应。优选地，所述基因毒性剂是DNA修复的抑制因子、DNA复制/损伤检验点的抑制因子、或DNA复制许可/起始的抑制因子。
[0066] 根据本发明，“DNA修复抑制因子”意指能够抑制DNA断裂，特别是双链DNA断裂修复的分子。然而，这种表述不应当被理解为限定性的，DNA修复抑制因子的实例包括DNA修复蛋白PARP的抑制因子(参见，例如WO2004080976、WO2005/053662、WO2009/046205)、组蛋白脱乙酰基酶的抑制因子，如PCT申请WO2008/082856中描述的那些、和DNA聚合酶β的抑制因子(参见WO2007/001684)。“DNA复制/损伤检验点抑制因子”是能够阻断参与DNA复制检验点或DNA损伤检验点的任何蛋白质活性的分子。此种蛋白质的实例包括ATM/ATR、Chk2和Chk1。“DNA复制许可/起始抑制因子”是能够阻断参与DNA复制许可的任何蛋白质活性的分子，例如Cdt1、Mcm1-7和其它为技术人员所知的。
[0067] 在另一方面，本发明还涉及用于为患有肺癌的患者选择合适治疗的方法，其包括：
[0068] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及[0069] b)如果所述癌在步骤a)中诊断为侵袭性，则在外科治疗中增加辅助的放射疗法或化学治疗剂。
[0071] 本发明还涉及用于为患肺癌的受试者设计使用放射疗法和/或化学治疗剂的治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
[0072] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及[0073] b)根据步骤a)的诊断确定放射疗法或化学治疗剂治疗的剂量。
[0074] 出于本申请的目的，应当理解当肺癌被诊断为侵袭性时，步骤b)的剂量大于肺癌被诊断为非侵袭性时。
[0075] 任选地，向受试者施用在步骤b)中确定的放射疗法或化学治疗剂的剂量。
[0076] 本发明还涉及化学治疗剂用于制备治疗肺癌的药物的用途，其包括以下步骤：
[0077] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及[0078] b)根据步骤a)的诊断确定化学治疗剂治疗的剂量。
[0079] 任选地，向受试者施用在步骤(b)中确定的化学治疗剂的剂量。
[0080] 本发明还涉及用于治疗肺癌的化学治疗剂，其中化学治疗剂被施用至患肺癌的受试者，所述受试者的肺癌使用根据本发明的方法已被诊断为侵袭性。
[0081] 更具体地，本发明涉及用于在患有肺癌的受试者中治疗结直肠癌的化学治疗剂，其中：
[0082] a)根据本发明的方法确定所述肺癌的侵袭性或非侵袭性，
[0083] b)根据所述鉴定的化学治疗剂反应或非反应表型确定化学治疗剂治疗的剂量，以及
[0084] c)向所述受试者施用在步骤b)中确定的化学治疗剂的剂量。
[0085] 本发明还涉及调整患肺癌受试者的治疗的方法，其中所述治疗使用放射疗法或化学治疗，方法包括：
[0086] a)根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，以及[0087] b)根据步骤a)的诊断调整放射疗法或化学治疗剂治疗。
[0088] 所述化学治疗剂治疗的调整可在于：
[0089] --如果所述肺癌已被诊断为非侵袭性，则降低或压低所述放射疗法或化学治疗剂治疗，或者
[0090] --如果所述肺癌已被诊断为侵袭性，则继续使用所述放射疗法或化学治疗剂进行所述治疗。
[0091] 本发明还涉及用于治疗患有肺癌的患者的方法，其包括根据上述本发明的方法诊断所述患者中所述肺癌是或不是侵袭性，并使所述患者经受放射疗法和/或向所述患者施用有效量的一个或更多个DNA修复抑制因子。
[0092] 除非另有其它说明，本发明实施采用常规技术或蛋白化学、分子病毒学、微生物学、重组DNA技术和药理学，其在本领域技术范围内。这些技术在文献中充分阐明。(参见Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,编,John Wiley & Sons,Inc.New York,1995；Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第 17 版 ,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985；以及Sambrook等人,Molecular cloning:A laboratory manual第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY，美国,1989)。
附图说明
[0094] 图1：CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因表达水平对患者的癌特异性生存的影响。根据在原发肿瘤中的DNA POLQ(A)、PLK1(B)、CLASPIN(C)、CDC6(D)和RAD51(E)的表达水平与相邻正常组织相比，肺腺癌患者的Kaplan-Meier总体生存。患者：n＝93；表明来自每次对数秩(log-rank)检验的p值。
[0095] 图2：在原发肿瘤中CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因的伴随表达。皮尔逊(Pearson)测试分析(A)和等级递增分类(hierarchical ascending classification)(B)。
具体实施方式
[0096] 实施例
[0097] 材料和方法
[0098] 患者、肿瘤样本
[0099] 在2006年至2010年间，在Rangueil-Larrey图卢兹医院(法国)诊断为具有未治疗(在活检时)的从分期I至III的原发性肺腺癌的患者中，手术收集配对的肿瘤样本(n＝93)。样本即刻放于液氮中速冻。从手术标本中在离肿瘤大于3cm远处取得正常的肺组织。合格标准包括我们得到冷冻肿瘤和相邻健康组织以及提取高质量RNA的能力。排除标准包括非腺癌肿瘤、分期IIIb和IV以及肿瘤细胞构成(cellularity)低于70％的肿瘤细胞。由病理学家根据肿瘤、结节、转移(TNM)分期分类分别遵循2010 WHO指南和苏木精-伊红染色从冷冻组织来定义肿瘤分期和形态。在表S1中描述两个群体的患者和肿瘤的特征。
[0100] RNA提取和定量
[0101] 通过使用LElCA CM3050S低温恒温器获得组织的厚冷冻切片。10μm(n＝60)和300μm(n＝3-5)厚切片的冷冻组织通过使用5mm直径不锈钢珠和组织研磨仪(Qiagen)在90s中进行粉碎，然后使用RNeasy提取试剂盒根据制造商(Qiagen)提取总RNA。使用RNA纳米实验室(Nano Lab)芯片、6000纳米分析(Nano Assay)试剂盒(Agilent
Technologies)通过Agilent 2100生物分析仪来评估总RNA的质量(DO260/DO280>1.7)。
用Nanodrop(Thermoscientific)估算其量。使用TaqMan Universal PCR Master Mix、TaqMan低密度阵列技术(Low Density Array technology)(Applied Biosystems)和
7900HT快速实时PCR系统从4份配对的活检中以一式三份地扩增800ng cDNA，之后在TaqMan低密度人类内源(Edogenous)对照阵列(Applied Biosystems)上测试的16个中通过GeNorm和BestKeeper软件，来选择四个最稳定对照管家基因(GUSB、IPO8、HMBS、UBS)。
Technologies)通过Agilent 2100生物分析仪来评估总RNA的质量(DO260/DO280>1.7)。
用Nanodrop(Thermoscientific)估算其量。使用TaqMan Universal PCR Master Mix、TaqMan低密度阵列技术(Low Density Array technology)(Applied Biosystems)和
7900HT快速实时PCR系统从4份配对的活检中以一式三份地扩增800ng cDNA，之后在TaqMan低密度人类内源(Edogenous)对照阵列(Applied Biosystems)上测试的16个中通过GeNorm和BestKeeper软件，来选择四个最稳定对照管家基因(GUSB、IPO8、HMBS、UBS)。
[0102] 为从肿瘤和正常组织中定量RNA，首先在存在3R探针时在TaqMan Preamp Master Mix(Early Access,Applied Biosystems)中预扩增cDNA(TaqMan基因表达分析,Applied Biosystems)。然后使用动态阵列(Dynamic Array)技术(Fluidigm,BioMark)扩增这些产物。在DNA结合样本上样试剂(BioMark)中孵育预扩增的产物，然后将Master Mix(Applied)和探针注射到含纳米管的集成流体通路上样器(Integrated Fluidic Circuit loader)中，然后使用BioMark扩增仪进行扩增。在肿瘤(T)和正常(N)组织中将转录物的水平相对于4个选择的稳定基因的平均水平进行归一化，之后使用GenEx软件来分析Fluidigm数据。以T/N比来表示在肿瘤样本中与相邻正常组织相比的相对表达水平。
T/N>1表示在肿瘤样本中的表达比相邻正常组织中更高。T/N<1表示在癌中比在对照组织中表达更低。
T/N>1表示在肿瘤样本中的表达比相邻正常组织中更高。T/N<1表示在癌中比在对照组织中表达更低。
[0103] 统计分析
[0104] 采用免费统计软件R(版本2.9.2)和Stata SE 11.2软件(Stata公司，College Station，TX，美国)进行统计分析，统计软件R包括“生存”、“DiagnosisMed”和“rpart”程序包(R开发团队，http://cran.r-project.org/)。当在癌组织中比较表达时，主要参数是单个T/N比。通过二项检验来评估观察到50％以上的患者过度表达或低表达3R基因的概率(阈值：对于过表达为T/N>1，以及对于低表达为T/N<1/2)。以相同方式来检验其它阈值(T/N>5或T/N<1/5、T/N>4或T/N<1/4、T/N>3或T/N<1/3以及T/N>2或T/N<1/2)。用皮尔逊相关系数来评估基因之间的相关性。聚类算法也适用：等级递增分类(HAC)。使用将联动(linkage)和相关距离作为度量标准的Ward方法对基因进行聚类。根据T/N分布的百分位点将表达水平分为3类。对于治疗(仅手术、手术-化学疗法-放射疗法、或手术-化学疗法)、肿瘤分级(N或TNM)、肿瘤分化(很少分化、中等分化、或完全分化)、肺栓塞的存在、以及吸烟习惯，通过卡方检验或Fisher精确检验对表达水平进行比较。使用Kaplan Meier方法(总体生存、无疾病生存和无复发生存)来估算生存概率。使用对数秩检验来比较生存曲线。根据Kaplan-Meier方法和多变量Cox比例风险回归模型，在性别、年龄、治疗、肿瘤分级以及Ki67和PCNA基因的表达水平上调整，来估算与表达水平相关的生存率。我们使用递归分割方法探索在基因表达和总体生存之间的关系。看上去，在第一个节点得到最好分割的前三个基因为强关联，并且也已经鉴定为这三个基因与在多变量Cox回归模型中的总体生存显著相关。已经计算最终多变量Cox回归模型以检验这三个基因中任一个的组合，其表达大于由递归分割方法给出的阈值。
[0105] 针对二项检验的P值是单侧的。所有其它的p值是双侧的。对于所有统计检验，在5％水平的差异被认为是显著的。
[0106] 结果
[0107] 在这项研究中，我们在来自一组93个NSCLC患者的原发肿瘤和相邻正常组织中评估78个参与DNA复制的基因表达。我们发现这些基因中的许多在肿瘤中显著下调。更重要地，其中一些的错误调节是手术治疗后生存的决定因素，这不依赖于治疗策略或肿瘤分期。事实上，4个基因标记包括CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ基因，其将患者分为具有显著不同生存的高风险和低风险亚组，并且不依赖于治疗或结节状态(分别为风险比[HR],36.31(95％CI2.6-517.4P＝0.04)；[HR],23.49(95％CI1.9-288.4P＝0.01)；
[HR],18.50(95％CI1.3-267.4P＝0.01)和[HR],20.65(95％CI1.5-275.9P＝0.05))。
[HR],18.50(95％CI1.3-267.4P＝0.01)和[HR],20.65(95％CI1.5-275.9P＝0.05))。
[0108] 大多DNA复制基因在配对的(coupled)肺肿瘤中下调
[0109] 从选择的78个基因中生成在进展的不同早期或中期的93例配对原发性肺腺癌基因表达谱(表1)，所述基因参与基因组复制的过程，即在复制起点的起始/许可、跨损伤(translesional，TLS)或常规的DNA延伸、与DNA损伤反应(DDR)相关的S期、DNA叉保护或复制引发的双链断裂(DSB)的修复(表2)。然后，我们可以鉴定出这些基因中的哪些在肿瘤(T)中与相邻对照组织(N)相比上调或下调。基于在肿瘤中T/N表达比在2以上或是在2以下的肿瘤数目，将下调基因分为两组。已知我们没有发现任何下调2倍以上的基因(数据未显示)，我们还证明了那些显示1/2
[0110] 表1：患者的基线特征(n＝93)
[0111]
[0112]
[0113] ND:未确定
[0114] 作为对照，我们首先确认(表2)已经公开了APC(11)和p53(12)肿瘤抑制基因以及ERCC1 DNA修复基因(13)的抑制。相反地但与预期相符地，参与核糖体生物合成的并为病理学家目前用作增殖标志物的KI67是过表达的。
[0115] 表2：在93例配对NSCLC肿瘤中78个“DNA复制”基因的差异表达
[0116]
[0117]
[0118]
[0119] 双侧二项检验；*通过Benjamini和Yakutieli方法(<0.0087)根据修正的总体关键P值，显著超过50％的群体具有T/N>2或T/N<2。
[0120] 在基因组中分散的约50,000个复制起点上参与DNA复制的“起始”和/或“启动(firing)/许可”的基因，例如SLD5、CYCLIN A、CYCLIN E、CDC45、CDT1、PLK1和CDC6以及在较小程度上的DBF4和MCM7，与对照相比它们主要显著更多地表达在肿瘤中(表2)。不常规的非组蛋白HMGA1和HMGA2基因，其编码与ORC起点感受器相互作用并还直接参与这种事件的蛋白质(15、16)，也过度表达。有趣的是，MCM-装载因子(loader)CDT1的抑制因子即GEMININ和CUL4的表达，相反地分别为未被改变或被抑制。对于ORC4起点感受器也是这种情况，这可能是因为ORC蛋白也起到其它作用，如染色体凝聚(17)。
[0121] 其次，我们研究了DNA聚合酶家族，其负责未损伤基因组的易错复制(POLA、POLD、POLE)，或者通过跨损伤(TLS)核的DNA聚合酶(POLZ、POLK、POLI、REV1、POLH、POLL、POLM、POLB、REV1、POLQ)或线粒体(POLG)DNA聚合酶进行大多数不精确的DNA损伤旁路合成或修复合成。与在结直肠癌(14)和乳癌(18)所观察到的相同，我们发现一种主要伴随缺陷表达的POLG以及除POLB和POLM之外的所有核TLS聚合酶，其生物学作用是分别在碱基切除和非同源末端连接之后进行比修复合成更少的跨损伤(19、20)。SHPRH，其参与PCNA的泛素化并参与将下调的Y-TLS POLH、POLK、POLI和REV1聚合酶招募至DNA损伤上(21)，也被下调。相反地，复制核POLE和POLD DNA聚合酶的表达、以及其PCNA过程的辅因子和MCM8延伸DNA解旋酶(22)的表达是轻微过表达的(表2)。最后，POLQ(WO/2011/058143)是与正常组织相比在肿瘤中显著过代表(over-represented)的唯一DNA聚合酶。
[0122] 然后，我们研究了参与S期内DNA损伤反应(DDR)的基因的表达。DNA损伤感受器被抑制(ATM、RAD17)或轻微改变(53BP1、ATR、RAD9)。可能在S期检验点起作用的新MCM2-8家族成员MCM9(23)、涉及在胁迫细胞中解除DDR抑制的组蛋白分子伴侣ASF1(24)、以及介导DDR的MRGX(25)也下调。关于参与到DNA复制叉的更下游保护的DDR基因(所谓的“介质(mediator)”)，其被DNA损伤所停顿，一些(BACH1、RECQ和SMC5粘连蛋白)低表达，然而其它的上调很多(BLM、RECQ4)或轻微上调(SMARCAL1、SLMC5、FANCM、SLX4、RUVBL1、BRCA2)。
[0123] 最后，除了RAD51重组酶(表2)，参与到复制引起DNA损伤如DNA断裂的DNA修复的基因即TIP60、XLF、LIG4、XRCC1、LIG3、XRCC4、DNAPKcs、LAMIN B的表达，所有参与DNA断裂的传统的或可选择的非同源末端连接的基因，碱基切除修复DNA聚合酶POLB、促进在应力下DNA修复的去乙酰化酶6(SIRT6)(26)、参与组蛋白表达和DDR基因调节的p300和SIRT1(27)的基因表达，这些被抑制或几乎没有变化(表2)。
[0124] 然而精确二项检验表明抑制的基因在肿瘤中与在正常组织相比下调不超过2倍(数据未示出和表2)，与之相反，17个基因在肿瘤中过表达2倍以上(表3)。在一方面，它们包括CYLIN A、RECQ4、POLQ、CLASPIN和CHK1，其以超过3的T/N阈值被显著地表达；以及在另一方面包括CDC45、CDC6、阳性对照KI67、HMGA2和CDT1，其以超过4的T/N阈值被显著地表达。编码的Polo样激酶(PLK1)的PLK1基因，其由S期检验点Timeless蛋白质和磷酸化的CDC6所招募，在有丝分裂退出和DNA复制许可之间的开关中起关键作用(28)，PLK1基因与在健康组织中相比甚至5倍以上地过表达于肺肿瘤中。
[0125] 表3：在设置4个不同T/N阈值后精确的二项检验
[0126]
[0127]
[0128] *T/N>Th表示Th倍数以上的过表达。**与通过Benjamini和Yekutielli方法修正的总体p值相比显著过表达(对于Th＝5，p<0.00021；对于Th＝4，p<0.00074；对于Th＝3，p<0.0013；以及对于Th＝2，p<0.0019)。
[0129] 为研究是否这些基因的过表达与或不与癌组织的增殖状态相关，我们使用皮尔逊检验将这些误调水平与Ki67增殖标志物的水平进行比较(数据未显示)。我们发现在过表达基因中，HMGA2(rho＝0.1)以及SLD5、CYCLIN E、RECQ4和HMGA1(全部4个rho＝0.6)在肿瘤中的误调不依赖于这种增殖状态。
[0130] 下调的3R表达与不良预后相关
[0131] 我们研究的终极目标是鉴定出DNA复制基因，其在肿瘤中的表达水平可以告知关于患者生存的信息。对于幸存者函数等式的对数轶检验表明9个DNA复制基因，包括POLQ(p＝0.0008)、PLK1(p ＝0.0062)、RAD51(p＝ 0.007)、CYCLIN A(p＝ 0.0128)、CDC25A(p＝0.0196)、CLASPIN(p＝0.0233)、CDC6(p＝ 0.0404)、POLL(p＝0.0464)和RPA(p ＝0.0458)，与较低的总体生存发病率相关(表4)。对于已经公开的DNA修复ERCC1基因对照(p＝0.0256,(13))，情况也是如此。无疾病生存也与以下显著相关：对照Ki67增殖和预后标志物(p＝0.0051)、以及CLASPIN(p＝0.0005)、TIMELESS(p＝0.0127)、CHK1(p＝0.0003)、CYCLIN A(p＝0.0017)、53BP1(p＝0.0339)、SIRT1(p＝0.0056)、BRCA1(p＝0.0008)和CDC25A(p＝0.011)DDR基因、CDC45(p＝0.0025)、CYCLIN E(p＝0.0405)、CDC6(p＝0.0103)、CDT1(p＝0.0101)、PLK1(p＝0.0001)和GEMININ(p<0.0005)起始/许可DNA复制基因、REV1(p＝0.0215)、PolI(p＝0.0018)和PolQ(p＝0.0033)TLS DNA聚合酶、RAD51(p＝0.0001)、参与到停顿的复制叉保护的SLX4(p＝0.0347)和BLM(p＝
0.0013)基因以及MCM8(p＝0.0418)DNA解旋酶的误调(表4)。当对患者的最终无复发生存进行研究时，我们确认除CYCLIN A和CDC25A(DDR)以外，所有基因再次与患者的结局显著相关(p<0.05，表S2)。相反地，许可MCM7基因的错误表达(P<0.0283)和p300组蛋白乙酰转移酶的错误表达(p<0.0117)与无复发生存率相关，但不与无疾病生存率相关。
0.0013)基因以及MCM8(p＝0.0418)DNA解旋酶的误调(表4)。当对患者的最终无复发生存进行研究时，我们确认除CYCLIN A和CDC25A(DDR)以外，所有基因再次与患者的结局显著相关(p<0.05，表S2)。相反地，许可MCM7基因的错误表达(P<0.0283)和p300组蛋白乙酰转移酶的错误表达(p<0.0117)与无复发生存率相关，但不与无疾病生存率相关。
[0132] 表4：与患者结局相关的DNA复制基因
[0133]
[0134]
[0135]
[0136] 总之，这些数据显示(表5)5个基因，即CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51的表达与低的总体、无病和无复发生存直接(at once)相关。图1显示根据这些基因在原发肿瘤中水平的总体生存的Kaplan-Meir曲线。通过使用皮尔逊检验，我们研究来自此基因簇的给定DNA复制基因在肿瘤中的失控是否可能伴随来自相同组另一个基因的失控。图S2A显示这五个基因的表达是相伴的(rho>0.7)，揭示潜在的5基因DNA复制预后标记。等级递增分类(图S2B)证实这种数据针对5个基因中的4个，即POLQ、PLK1、RAD51和CDC6。甚至CLASPIN的表达在较小程度上也是相关的，而CDC45、CYCLIN E、CYCLIN A和CDC25A(其与无测量的生存特征(free measured survival feature)中的2个相关)有可能包含在这种“元标记物(metamerker)”中。
[0137] 表5：根据3R基因表达水平的患者生存
[0138]
[0139]
[0140] 最后，我们使用Cox多变量回归模型来进一步检查在生存分布和以下协变量之间的关系：年龄、性别、肿瘤分期以及Ki67和PCNA肿瘤增殖临床标志物的表达。表6说明在考虑到每个潜在的混淆因素(confounder)而调整生存数据之后，在患者的总体生存和CDC6、CLASPIN、PLK1和POLQ的表达之间的密切相关仍然存在。非常有趣的是，具有强烈过表达这四个基因的肿瘤的患者，与携带呈现这些基因正常水平的肿瘤的患者相比，具有更高的死亡风险，即分别为36.3倍(95％CI2.6-517.4、P＝0.04)、23.49倍(95％CI1.9-288.4、P＝0.01)、18.50倍(95％CI1.3-267.4、P＝0.01)和20.65倍(95％CI1.5-275.9、P＝0.05)增加的风险(表6)。那么，这种预后效果不依赖于年龄、性别、治疗、分期分类和增殖标志物的表达。
[0141] 表6：考虑到年龄、性别、治疗(3类：无/化学疗法/化学疗法和放射疗法)、T分级(2类：T0或T1/T2或T3)，KI67和PCNA临床标志物，在生存和DNA复制基因表达之间的关系的多变量Cox回归分析。
[0142]
[0143]
[0144] 包含在5基因簇内的DNA复制标志物的预后潜能不依赖于治疗或结节状态
[0145] 最后，我们使用对数轶检验以进一步检查在生存分布和治疗(化学疗法、化学疗法加放射疗法或无辅助治疗)或结节分期(N)之间的依赖性。这种二元(bi-varied)分析未显示以下之间的任何显著相关(p>0.05，表7)：来自所鉴定的DNA复制预后标记的CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ、或RAD51 DNA复制基因的表达和治疗策略或含有转移的结节数目。
[0146] 表7：在复制基因的表达和治疗或分期之间的二元分析
[0147]
[0148]
[0149] 与之相反，分别地，在一方面，其它DNA复制基因，例如CDC25B(p＝0.0307)、GEMININ(p＝0.0263)和对照APC(p＝0.0404)的水平与抗癌治疗相关；在另一方面，其它DNA复制基因，例如CDC25B(p＝0.0344)、SLX4(p＝0.0466)、GEMININ(p＝0.0192)和MCM7(p＝0.0364)的水平与临床分类相关(表8)。
[0150] 表8：在复制基因的表达和治疗或分期之间的二元分析
[0151]
[0152]
[0153] 在这项研究中，我们报道CDC6、CLASPIN、PLK1、POLQ和RAD51基因的过表达与患者的生存相关，不管这种生存以何种手段测量。因为已经证明致癌基因的失控改变复制程序，从而引起在S期期间的DNA损害和产生在缺乏功能性检验点时的遗传不稳定性(1)，这些数据表示这种失控可能影响不同的和非冗余DNA代谢途径，例如DNA损伤的复制旁路(POLQ)、复制后DNA断裂的DNA修复(RAD51)、停顿的DNA复制叉的维持(CLASPIN)、DNA复制/有丝分裂连接(PLK1)，以及复制起点的启动(CDC6、PLK1)。因此，正如在我们的群体中所观察到的，DNA过度复制(增加的启动和DNA延伸)诱导更多DNA损害，其可能在缺乏功能性S期检验点或DNA修复途径时导致遗传不稳定性。与鉴定个体标志物相比，我们的工作还从而鉴定了“DNA复制”基因的子集作为有用的癌症预后“元标志物”。
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