对于生产者、商业和消费者来说，测定新鲜农产品和园艺产品的 品质变得越来越重要。对品质的重要性的认识也明显增加。对可食用 产品的新鲜度，外部特征，气味和香味提出了严格的要求。为了尽可 能的保证品质，在商业生产链中引入了“跟踪与追溯”系统，为了满 足这些更加严格的要求，对采后途径进行了优化。由于运输和储存条 件不断变化，迫切需要允许客观测定质量特性(质量参数)的测试系 统来确定品质，预测将来品质或改善品质。
品质是硬(很好测定)品质因素和软(难以测定并且经常很主观) 品质因素的结合体。软因素，例如受损坏程度，味道、气味或香味， 症状和健康以及疾病的内容有时很容易主观上确定，但通常很难量 化。硬因素，例如颜色、酸度(pH)、硬度、糖含量，尺寸或长度以 及重量通常可被适当地定量测定。一些品质因素，例如休眠状态(睡 眠深度)或发展阶段只有在它们根据例如特定阶段或特定状态可测的 分子标记物是可被定量测定时才是硬因素。软因素如果与一个数量范 围相关才是有用的。例如其可以通过将品质参数和参考数值进行对比 而作出，例如良好品质被设置为100％的参考值和不好品质被设置为 0％的参考值。然后通过测定相对于该参考值的相对值获得该参数的 一个(部分)品质值的数量范围。然后确定自由市场过程中，特定品 质参数和特定农产品和园艺产品的软品质参数和硬品质参数，什么数 值范围是可以接受的。
产品品质主要通过一个以上的品质参数，经常是很多个参数来确 定。这并非必需，因此在某一特定时刻，或在经过特定的采后处理之 后，不同品质参数的值全部落在该待测产品的最佳范围内。例如，最 佳的味道并不必与最佳重量或最佳颜色紧密联系在一起。通常，总的 产品品质是全部品质因素值的折中。产品品质还取决于所需市场或在 一年中的时段。产品可能在当地交易，以致其他的品质因素比产品被 储存或运输时更相关。而且，被认为是最佳品质参数的范围可以变动。 然而，根据品质参数，数值范围可被表示为那种特定状况下认为是最 佳的范围。但是，这些范围在另外的状况下不一定是最佳值，这是因 为总的产品品质由许多品质因素确定。在一种具体情况下，一种特定 的质量参数排名较低，因为在这种特定情况下另一个参数更加重要， 以致于第一个质量参数在那时最终无法达到最佳值。
采后途径对不同品质参数有很大的影响。采后途径可以非常多样 化，这取决于农产品或园艺产品的品种、产地和/或市场所在地。此 外，也可能是农产品或园艺产品在这年的一个特定时刻采收，却在这 年的另一个时间销售，因此采后途径的持续时间也会发生变化。在采 后途径中，可包含各种存储方式，可在室温存储、降温存储和有时甚 至是深度冻结的存储中变化。存储或保藏可包含改良/控制大气的存 储/包装，可添加抑制剂，例如可抵消某种植物激素作用的物质。采 后途径中的所有这些措施和条件都会影响农产品或园艺产品的品质 参数。此外，对于农产品或园艺产品的不同品种，不同的品质参数可 以是相关的或者最佳值可以不同。农产品或园艺产品的最佳收获时间 在很大程度上取决于采后途径，也要考虑品质参数。对于一种具体产 品，与质量参数相关的最佳收获时间(期间收获的产品的一种特定品 质参数具有最佳值的时间段)取决于选择的采后途径以及市场设定的 标准。因此，观察总的产品品质或者一个具体的品质参数，并不是所 有的情况都在最佳收获窗口。最佳收获窗口也因此由一种情况到另一 种情况，也从一种产品(栽培品种或品种)到另一种产品(栽培品种 或品种)来进行确定。对于品质控制，至关重要的是，采后途径之后 的最重要的品质参数能在收获时或采后途径期间进行预测。然后，根 据该预测，确定在给定条件、给定时间下的一种具体农产品或园艺产 品的最佳收获窗口。
对于具体的水果产品，有两种熟化的水果非常知名：由植物本身 (呼吸跃变型水果)产生的激素乙稀催熟的水果和几乎不依赖激素催 熟的水果(非呼吸跃变型水果)。然而，最近的研究表明，似乎这种 区分太过武断，因为一些水果种类或品种不符合这种分类而是采取了 中间形式(Golding等.，2005，Stewart Postharvest Review 3：5)。在 成熟期间，呼吸跃变型的水果有一个乙稀实际开始产生的时刻。这个 时刻在从生理学上而言是采摘的最佳时刻的呼吸峰之前。然而该时刻 并不一定与商业品质参数最佳的时刻一致，商业品质参数例如水果的 大小、希望的甜度和颜色。如果出于这些商业原因考虑，优选迟一些 采摘，这对于保持品质和保持持续时间会产生直接的后果。对于非呼 吸跃变型水果，采摘时刻目前主要是通过商业品质参数来确定的。
水果采摘后，在水果成熟待售前，即，能被消费者消费前，一般 要花一些时间。这些时间大部分是为了将水果运输到加工(例如包装) 地点用和为了将水果从上述地点运到出售地点，例如拍卖场，和从拍 卖场发给零售商。特别是在，如果将水果例如热带水果从一个洲运到 另一个洲的情况。然而，在此期间，成熟过程继续进行，经常发生当 准备出售时水果过熟或者相反，水果未足够成熟无法出售的情形。第 一种情形下，水果不能出售或者仅能以低价出售，第二种情况下，水 果需要存储直到它完全成熟。因此，两种情形都会导致经济损失。采 后途径也极大影响不良品质特征的发展，例如在一些梨品种中的疾 病，像“中空和褐变”或“颈无力”。
因此，合适的采收时间取决于商业参数和加工和运输水果所需的 采后时间。然而，植物的状况(大小、疾病的影响)以及水果生长期 间的气候状况(温度、日照量)，或栽培情况(例如肥沃程度)与生 理和商业参数一样有决定性影响。因此，永远无法给出适于所有情形 的最佳采收时间。此外，确定最佳采收时间对于栽培者计划和布置人 手非常重要。由于有时，并不是水果的采后途径而是其存储期间或存 储后的既往史导致了疾病的发展，因此能够客观地测定那些参数非常 重要。
水果的成熟由以下因素决定：叶绿素的降解、色素的积聚、通过 主要由细胞壁的降解所引起的质地变化的软化、各种糖和有机酸的积 聚的变化，其中有机酸主要决定味道，而产生提供香味的挥发性物质。 如果水果处于一个达到了完全生长的阶段，其被评估为“成熟”，这 样，在采收和后续处理之后，品质至少最低限度地可被最终的消费者 接受(Reid，M.S.，1992，In：Peaches，Plums和Nectarines： Growing and Handling for Fresh Market.，LaRue，J.H.和Johnson， R.S.(eds.)，Univ.Calif.Dept.Agricult.Nat.Resourc.Publ.No.3331， 21-28)。为了确定这个时刻和/或对期望的质量发表意见，人们正在 寻找一个适当的成熟度指数。多年来，已经提议了水果的各种，经常 是外在的特征作为这样一个指数。Crisoto描述了，对于核果，使用 参数“大小和形状”、“果肉的硬度”、“可溶性固形物浓度”，“酸度” 和“颜色”(Crisoto，C.H.，1994，Postharvest News和Inf..，5 (6)：65N-68N)。对于苹果，Herrera提到特征“基本色”，“可采摘 性”‘果肉硬度”，“可溶性固形物浓度”，“淀粉含量”，“从开花开始 的天数”，“红色”和“种子的颜色”(Herrera E.，1998， http://cahe.nmsu.edu.pubs/h/h314.html)。然而，实践证明这些方法并 不合用，因为各个成熟度指数不够精确或者该指数几乎没有任何关于 特定水果品种的期望品质的预测值。
在具体的产品郁金香(Tulipa gesneriana)中，春天的时候，在 荷兰，将球茎在休眠深度最好的时候拔出来。如果采收过度延迟，土 壤会变得过于湿润(通过雨)，导致感染真菌的风险大大增加，并且 机器也不能再在田里使用了。精确测定采收时候的休眠深度非常重 要。根据天气状况，到休眠最深和实际上只有一个末端的时候确定收 获窗口。在这种情况下需要在收获时确定的品质参数是休眠深度。最 佳的休眠确保了特定的球茎大小，以致在采后途径之后可以获得具有 最大长度和厚度的花茎。在睡眠深度达到最大之后，球茎的大小不再 变化。花茎的品质参数长度和厚度取决于收获时的休眠深度；如果休 眠深度最大就可以获得最佳时刻和与之相关的可能达到的最好值。目 前，在球茎外面的纤维网的褐变时刻被用作指示休眠深度最大，但在 许多情况下，这个似乎不太可靠。分子标记物与花茎的品质参数长度 和厚度的值相关，并因此可以从中得出休眠深度，这在这里非常重要。 在这种情形下，郁金香球茎的采后途径包括在较高温度下储存，直到 球茎的生长点从营养阶段转换到生长阶段。接着，将球茎在较低温度 下存储直到休眠被寒冷的环境彻底解除。最后，在盆栽土中种植球茎 并开始生长(展开花茎然后开花)。
当球茎经受足够的冷冻解除休眠时，为了测定还需要进行分子实 验。就在开始栽培的时刻进行。冷冻周期太短导致休眠解除不充分会 使得品质较差。花茎能达到的最大长度的品质参数在这里也比较重 要。这里也一样，较短的冷冻时间曾经导致花茎的长度更短。在采后 的最终途径中需要测定的品质参数是休眠解除的程度。因此，在采后 途径期间，郁金香花茎的最大长度(和厚度)的最终品质参数取决于 数个品质参数。第一是采收期间的休眠深度，然后是花茎的生长点从 营养阶段到生长阶段的完全转化和最后通过一个降温周期后休眠的 完全解除。类似的需要分子标记物的问题存在于其他的球根状和块茎 状作物中，例如百合、水仙、风信子、小苍兰、洋葱、大蒜和孤挺花。
对于具体的产品插瓶花，与花蕾成熟有关的采收时间对于测定重 要的品质参数“插花寿命长度”非常重要。采收期间的分子标记物， 特别是涉及花老化和与插花寿命的长度有关的基因表达程度和蛋白 质浓度的标记物，可作为好的候选者用于期望的插花寿命长度实验。 在采后途径(postharvest path)期间，应力度影响插花寿命的长度。 对几乎所有插花来说，包括郁金香、玫瑰、六出、虹膜、百合、菊花 (菊花)、非洲菊、香石竹、小苍兰、大花蕙兰和满天星，使用分子 标记物预测插花寿命的期望值非常重要。
对于具体的产品盆栽植物或庭院植物来说，应力对叶老化过程的 水平有着直接影响。叶老化与叶变黄的程度直接相关。通常来说，盆 栽植物的采收与例如水果的采收不一样，除非这是通过插枝成活发生 的，但采收的特征在于从例如温室中移出植物并转运至例如拍卖场。 对几乎所有的盆栽植物或庭院植物来说，包括竺葵，矮牵牛，菊花(菊 花)，榕树，长寿，龙血树，蝴蝶兰，常春藤，秋海棠，白鹤，八仙 和一品红，在分子标记物的帮助下测量品质(与应力相关)非常重要。
对于具体的产品黄瓜来说，成熟阶段和应力均对黄瓜的品质有消 极作用。对黄瓜而言的(消极)品质因素之一是黄瓜的黄化病。对于 其他的蔬菜作物，这样的品质期望对于例如生菜，菊苣，韭菜，卷心 菜类，如甘蓝，花椰菜，白菜，红甘蓝和其他类型的大白菜和菊苣非 常重要。对于以预切割形式、预包装或未预包装而出售的蔬菜作物而 言，在切割之后，通过分子标记物测量应力的作用，从而监测这些切 割制品的质量非常重要。
对于具体的产品葡萄，在特定时间在葡萄中产生的物质的成分对 于产品(葡萄酒、port葡萄酒、香槟等)非常重要。例如port葡萄酒 的味道品质参数可经过例如一个尝味小组进行量化。采收时，或采后 途径期间，味道与分子标记物水平的关系对于识别在早期阶段终产品 的品质非常重要。这对其他作物，例如草药和香味料、特定类型的浆 果，例如橄榄和杜松浆果，以及其他农产品或园艺产品也适用，其中， 通过分子标记物能确定决定味道的成分的存在，这样就可以预测最终 产品的味道品质。
近年来，分子生物学技术例如基因组和转录组分析已经得到大规 模应用以研究各种在产品品质中起作用的方法。例如已对与水果成熟 有关的过程作了进一步研究，并且为了鉴别酶在其中所起的作用而做 出了努力(参见inter alia Golding J.B.等.，2005，Brummell，D.A.， 2005，and Owino，W.O.等.，2005，all in：Stewart Postharvest Review 3：5)。上述综述性论文中讨论的结果主要用于影响不同的过程，在成 熟过程中，例如通过过表达或者阻断表达某种编码据称在此过程中起 作用的酶的基因制备转基因植物。然而，迄今为止，分子生物学技术 仍未应用于预测一种品质参数的的期望值或用于测定给定情况的最 佳收获窗口。

本发明涉及一种理想的鉴别和分离分子标记物，基因或蛋白的方 法，该方法中，基因活性或者蛋白质浓度的值分别在采收期或采后途 径期的某一特定时刻与在一个具体时刻的具体品质参数相关，和在采 收期间或采后途径期间，测量该标记物值之后，预测在采收、采后途 径期间或采后途径结束时的品质参数值，或者一种具体情况的期望值 的方法。
接下来，本发明详细解释了对水果，尤其是苹果和梨的成熟预期 (或预测)和/或采收时间的确定。当然了，也使用常规技术确定品 质特征的标记物，以及与之相关的，通过分子、生物学技术确定水果 之外的农产品和园艺产品的最佳收获时间。
水果的成熟是一个过程，在此过程中，叶绿素被降解且色素开始 形成，同时水果硬度丧失，由此形成糖，并且由此形成有机酸和挥发 性的芳香物质。这些活动要求在某些水果细胞中具有可以开启或关闭 的生化过程。代谢中研究的最多的一个改变是乙烯的产生和作用，其 主要在呼吸跃变型水果中起作用(例如番茄、甜瓜、苹果、鳄梨、猕 猴桃和香蕉)。在这些水果中，乙烯是成熟的一个先决条件，因为它 像一种激素，能激活转录因子，转而，影响细胞的基因表达(所谓的 乙烯信号通路)。
然而，特别是从本发明中可以看出，对于确定水果的成熟预期以 及合适的采收时间而言，特别是，与水果构造有关的基因原则上应是 一个合适的参数。不过，从上述引用的文献，以及从本发明下述的实 施例中可以得出结论，在水果成熟期间最好对多个成熟指数进行观 察。特别列出与水果硬度变化有关的有研究资格的基因如下：β-木糖 苷酶(βxyl)，聚半乳糖醛酸苷酶I和II(PGI和PGII)，公认的细胞 壁过氧化物酶424/87(87)，木葡聚糖内切转糖苷酶(XET)，肌动 蛋白标记物M8，苹果菌素和葡聚糖酶如内切-β-1，4-葡聚糖酶，辅 酶II依赖性D-山梨醇-6-磷酸脱氢酶(NADP-dependent D-sorbitol-6-phosphate dehydrogenase)和/或α淀粉酶。
本发明的实质首先是为各个品种发展一个定标线，借此在细胞成 熟期间进行上述基因(与水果成熟有关的)或其他基因(与上述提及 的其他质量参数有关的)的表达。本发明可以确定上述基因中哪些与 途径后的品质特征最相关，换言之，即哪些基因决定了与该品质特征 有关的期望值。如实施例所示，在成熟期间，-似乎一些实验的水果 品种在任何情况下-在一个给定的时刻，不同的基因在这种情况下， 与品质特征的硬度最相关。
测定基因和蛋白的表达曲线
为获得可靠的结果和实验，以可重复进行的方式采样是很重要 的。本发明中，基因的“表达曲线测定”按照本技术领域的常规方法 进行，其涉及测定细胞中一种或多种基因的转录状态(mRNA)或翻 译状态(蛋白)的方法。对于从植物中分离出来的mRNA和蛋白来 说，可使用可获得的标准方案。大多数情况下，如果组织具有厚的细 胞壁或含有很多的糖，这些方案需要做一些修改。这些方案和修改是 本领域技术人员的常识。根据所采用的方法，这些测定需要进行全基 因组表达的测定，而且仅需要测定几种基因的表达曲线，这导致了“基 因表达曲线”或“表达曲线”的实现，这些术语将用于下文。“表达 曲线”包含与基因表达产物的相关存在的测定有关的一个或多个值。 这些值包括对RNA水平或蛋白浓度的测定。因此，表达曲线可包括 体现测定基因转录状态或翻译状态的值。关于此点，可参阅专利号为 6,040,138，5,800,992，6,020,135，6,344,316和6,033, 860的美国专利。
样品的转录状态包括RNAs的身份和相关的事件，特别是样品中 存在的mRNAs。优选的，测定足量的基因以确定样品的转录状态。 也可通过现有的基因表达技术测定转录的出现，而适当的确定转录状 态。
翻译状态包括样品中构成蛋白的身份和相关的事件，同样的，本 发明中用于测定样品的翻译状态的蛋白量是足够的。如本领域技术人 员所知，转录状态和翻译状态经常互相关联。本发明中测定和测量的 每个值均是代表基因的绝对或相对表达的一个量度。这些基因的表达 水平可通过本领域公知的用于测定样品中RNA或蛋白水平的方法来 测定。首先，可分析大量基因的表达曲线，为此目的可使用的技术是 直接测序：例如转录组测序(罗氏&454测序)；克隆的单分子阵列 TM(Solexa)；采用electronic Northern计算不同样品中的基因表达水 平；并且其是基于一组cDNA文库中的要鉴别的特定基因的序列数量 的。与其有关的变更是基因表达系列分析(SAGE)，表达的序列标记 片段(TALEST)和cDNA AFLP(扩增片段长度多态性)的串联排列 连接(TALEST)，其能够检测不同表达的转录。
附图说明
图1在5座果园中，梨cv.Bon Chretien随着时间的成熟过程。 图中，使用的标记物总数(βxyl，PG和过氧化酶424/87)的平均值 与时间(按日计)对应标绘。
图2a、采收期间标记物1(PG1)的基因表达与出售的梨cv.Bon Chretien的硬度的相互关系。b、短期储存后标记物6(424/87)的基 因表达和硬度的相互关系。X轴表示在存储(压入水果需要的压力按 N/m2计)结束时的硬度和y轴，对数的，表示标记物的表达水平。 垂直线表示对于预期的市场仍然是可以接受的硬度的临界值。
图3a、采收期间标记物6(βxyl)的基因表达与出售的梨cv.Forelle 的硬度的相互关系。b、短期储存后标记物1(PG1)的基因表达和硬 度的相互关系。X轴表示存储结束时的硬度和y轴，对数的，表示标 记物的表达水平。
图4在5座果园中，苹果cv.Granny Smith随着时间的成熟过 程。图中，使用的标记物总数(βxyl and PG)的平均值与时间(按日 计)对应标绘。
图5a、采收期间βxyl的基因表达与出售的苹果cv.Granny Smith 的硬度的相互关系。b、短期储存后βxyl的基因表达和硬度的相互关 系。X轴表示存储结束时的硬度和y轴，对数的，表示标记物的表达 水平。
图6在5座果园中，苹果cv.Golden Delicious随着时间的成熟 过程。图中，使用的标记物总数(βxyl和PG)的平均值与时间(按 日计)对应标绘。
图7采收期间标记物M8(肌动蛋白)的基因表达与市场上的硬 度的相互关系，X轴表示存储结束时的硬度和y轴，对数的，表示标 记物的表达水平。垂直线表示对于预期的市场仍然是可以接受的硬度 的临界值。
图8在2006和2007季，每周对苹果品种Kanzi取样。x轴为相 对于最佳采收时间(用生理参数确定)的天数。y轴表示β-木糖苷酶 的表达水平。
图9采收期间的苹果cv.Kanzi的果肉标记物和与其对应的存储 (EOS)结束时的硬度。标记物的表达与按千克计的苹果的硬度对应 标绘。A组中是标记物PG，B组中是标记物β-木糖苷酶。
图10采收期间的梨cv Conference的果肉标记物和与其对应的存 储(EOS)结束时的硬度。标记物的表达与按千克计的苹果的硬度对 应标绘。A组中是标记物PG，B组中是标记物β-木糖苷酶。
图11郁金香中GAST的表达(y轴上)与拔出时间的关系。X 轴表示拔出最佳时间的天数。标绘了四年生的cv Apeldoorn和cv Prominence中GAST的表达模式。
图12玫瑰花寿命的品质标记物。插花寿命为5.7天和8.0天的 玫瑰中的GDSL-基序脂肪酶的表达(在y轴上)。保存性好的玫瑰中 的标记物的表达比在保存性差的玫瑰中表达低。切割后立即采收，4℃ 下在水中储存1天和4天。
此外，有技术可用于检测杂交的转录产物的存在，例如微阵列。 这种微阵列可以是DNA阵列，寡核苷酸阵列，或者笼统地，核酸阵 列。本领域技术人员可以从专门供应商(例如Affymetric Corp.，Santa Clara，CA，USA)那里获得自行设计的阵列和相关的阵列读数装置。
为监测少量转录产物，可采用Northern分析，其是用于检测和量 化mRNA水平的一种标准技术中。通过这种技术，可以检测mRNA 的大小和任何选择性剪接以及多基因家族。通过反转录聚合酶链式反 应(RT-PCR)分析，由于发生转录产物的指数扩增，可高敏感度地检测 到mRNA分子，这种技术又称为定量PCR检测。这种技术特别适用 于mRNA转录产物的高度精确量化。由于通过这种技术，可以分析 极大数量的样品，并且这种技术也可以实现自动化(Applied Biosystems 7900HT system Foster City，USA)，因此其是目前分析转录 产物的首选。此外，也可以采用其他技术平台，比如 (Pamgene，Den Bosch，the Netherlands)或者BioTrove OpenArrayTM技 术(BioTrove Inc.，Woburn，USA)。如果技术人员不熟悉特定的平台， 可由制造商提供有关各平台的操作知识。
在这些技术中，通过选择性地扩增该基因，确定特定标记基因的 存在。这通常借助于引物来完成。一般而言，术语“引物”指可以开 始合成DNA的DNA链。没有引物，DNA聚合酶无法重新开始合成 DNA：它只能在反应中延长现有的DNA链，其中以互补链为模板按 序合成核苷酸链。引物用作DNA聚合酶扩增反应的起始点。因此， 引物通常是长度为约10～50个核苷酸的短核苷酸链(寡核苷酸)。这 些引物与待扩增的基因序列是互补的，因此，以单链形式结合单链 DNA或RNA，通过杂交与目标序列形成双核苷酸链。理想地，在杂 交中需要完全互补的核苷酸链，然而即使不是全部核苷酸是互补的， 也能够实现充分杂交，即所谓的“错配”。除了互补的程度之外，引 物与目标序列杂交的能力也与杂交发生反应的条件有关。
DNA扩增：术语DNA扩增用于表示借助于PCR或类似的扩增 体系体外合成双链DNA分子。本发明要求的扩增可以利用多种扩增 方法，比如聚合酶链式反应(PCR；Mullis 1987，U.S.Pat.No.4,683,195， 4,683,202和4,800,159)或连接酶链式反应(LCR；Barany 1991，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193；EP Appl.No.320,308)，自持序列复制 (3SR；Guatelli等.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)， 链置换扩增(SDA；U.S.Pat.Nos.5,270,184，和5,455,166)转录扩增 系统(TAS；Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)，Q-Beta 复制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 6：1197)，滚环扩增(RCA；U.S. Pat.No.5,871,921)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，裂解酶片段长 度多态性分析(U.S.Pat.No.5,719,028)，等温以及嵌合引物起始的核 酸扩增(ICAN)，分歧延伸扩增方法(RAM；U.S.Pat.Nos.5,719,028 和5,942,391)或者其他适合用于扩增DNA的方法。对于扩增引物进 行DNA扩增有少量错配的，扩增反应可以在严格性稍低的条件下进 行(换言之，PCR反应使用38℃或在3.5mM MgCl2的条件下退火)。 技术人员可以选择适合的严格条件。
允许引物中少数错配意味着用于特定目标序列的引物在测定几 种不同类型的生物体中是可用的。这是由于不同的生物体，尤其是不 同种和甚至同种中的不同个体，其蛋白的氨基酸序列和/或编码该蛋 白基因的核苷酸序列经常表现出差异。通过允许少量差异，一个和相 同的引物可用于测定几种不同的生物体。在实施例中，例如所示引物 很适合于测定同种的不同个体(如苹果)和甚至不同种(如苹果和梨) 中的标记基因和/或“管家基因”。
相对转录水平的计量与存在于样品中的适当的对照有关。例如这 种对照是组成型表达基因，比如特殊的“管家”酶。特别优选的是组 成型标记磷酸甘油酸激酶(PGK，EC 2.7.2.3)或延伸因子1α(eF1α)， 参见实施例。
此外，可基于蛋白图谱测定表达谱。在本发明中，也可以运用 技术同时检测大量蛋白图谱。它的一个实例是凝胶电泳。在这里，首 先基于蛋白质的分子量分离蛋白。随后基于蛋白质的等电点(pH梯 度)任选采用二维电泳(2D)进行二次分离。随即，通过质谱分析 可以测定不同表达蛋白的氨基酸序列。另一种用于同时检测大量蛋白 质的技术是所谓的蛋白质阵列(Ciphergen Biosystems，Fremont，CA， USA)，借此可以定量大量的不同蛋白质和蛋白肽。在这里，借助于 质谱分析，可以测定蛋白质的氨基酸序列。在该实施方案中，表达谱 中的数值是通过测定标记基因表达的蛋白产物的浓度而获得的。这些 蛋白产物的浓度可以通过使用例如这些蛋白产物的特定抗体而测定。 本发明使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即 抗原结合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例，比如F(ab) 和F(ab’)2片段，可通过使用酶例如胃蛋白酶处理抗体而生成。该抗 体可以是多克隆的，单克隆的，重组体和例如嵌合体或“单链”抗体。 通过将抗体偶联到可检测到的物质(即标记抗体)上可以很方便地检 测基因产物。可检测到的物质的实例，尤其是各种酶，辅基，荧光物 质，发光物质，生物发光物质和放射性物质。合适酶的实例，尤其是 辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-牛乳酶和乙酰胆碱脂酶；合适辅基 的实例，尤其是链霉亲和素或抗生物素蛋白和生物素；合适荧光物质 的实例，尤其是伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯代 三嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素，丹磺酰氯和藻红蛋白；发光 物质的实例，尤其是荧光素酶，虫荧光素和水母发光蛋白；合适放射 性物质的实例，尤其是125I，131I，35S和3H。
目前，蛋白检测大多借助于抗体进行和为此目的，使用不同的检 测系统，比如横向流动分析(lateral flow assays)，也采用化学发光检 测装置比如GeneGnome(Syngene，Cambridge，United Kingdom)。也 可以采用例如，BiacoreTM(Biacore AB Corp.，Uppsala，Sweden)或IBIS iSPR(IBIS technologies，Hengelo，the Netherlands)或顺磁性的粒子 (paramagnetic particles)(European Pat.Applic.No.20040744572)来 测定抗体和蛋白之间的相互作用。根据蛋白标记的数量，由技术人员 选择最好的检测平台。如果技术人员不熟悉特定的平台，也可由制造 商提供有关各平台的操作知识。
基本上，对于能够客观测定的任何品质特征，可以确定校准线， 在校准线上将标记物的(mRNA或蛋白质)表达相对于品质特征进行 标绘。这可以在收获前，收获中或收获后进行。基于标记和特征的相 互关系，可以确定标记与哪个时间周期最具相关性(因此作为预测因 子最可靠)。可考虑品质特征，例如：水果的硬度，球根作物打破休 眠的时间和插瓶花的瓶插寿命以及引言中提到的其他参数。尽量保持 收获前和收获后以及后续条件的一致性当然是重要的。这可理解为， 例如，在4℃下储存水果形成的校准线和在20℃或室温下储存水果 形成的校准线是不同的。然而，由于测定的表达表明成熟的程度，因 此4℃下形成的校准线，可用于预测水果在其他温度下的成熟。不能 从校准线中得出，于是产生误差，因为在其他条件下储存的时间仍是 必需的(由于成熟的速度是不同的)。因此专门用于特定环境下的校 准线是首选的。校准线应该进一步表明何时产物达到特定的质量标 准。这可能意味着，例如，标记能为水果可于凉爽条件下储存的时间， 或球茎在打破冬眠前仍需保持在寒冷条件下的时间给出一个预期。当 样品在无对照的条件下，这对于常规采样以及测定表达谱以调整和优 化预期值自然是重要的。由于样品可能是基于不同的条件下生长得过 快，或相反地，生长得过慢。实际上，基于新环境的校准线可能更陡 峭或更平缓。应理解基于在热、干燥的夏天成熟的水果而生成的校准 线，无法得出在凉爽、潮湿的夏天水果成熟的准确预测。然而，已经 提到与储存条件的不同有关，由于测定的表达值的确表明了水果的成 熟条件，仍可以基于和校准线的比较确定是否水果达到可采摘的成熟 度。实施例中还显示出，对于特定的品质特征已经生成校准线。
在插瓶花中，通过结合与收获途径后瓶插寿命的长短有关的花衰 老标记和应激度标记，，可以预测瓶插寿命的长短。为此目的，可以 使用半胱氨酸蛋白酶和GDSL-基序(motif)脂肪酶。
如上所述，盆栽植物叶片的泛黄是重要的品质参数。在收获期， 或收获途径后，这一不良品质参数(其直接取决于叶片的年龄)可通 过将包含在叶片老化过程中的标记，其与叶片泛黄的程度有关，任选 地与在老叶片中比在新叶片中具有更高表达量并与叶片泛黄程度有 关的标记相结合进行预测。黄瓜中“泛黄”的品质参数可以按照与盆 栽植物相同的方式，通过在收获期或收获途径后的分子标记来预测。
相似地，对于葡萄，如果为味道提供一个可以再现的品质特征， 通过结合包含在味道组分生物合成中的标记，其基因表达量与味道的 程度有关，在收获期或收获途径后可以预测味道。
除了适用于实施例中提到的水果种类之外，本发明测定成熟度和 收获期的标记以及预测期望的品质特征也适用于各种水果，其收获时 间和成熟后持续时间对于可消费的和可得到水果的条件(运输、储存) 来说，是重要的因素。除了用于苹果和梨之外，本发明还可适用于如 下种类的水果：柑橘属水果如橙，柳橙(mandarin)，柠檬和蜜柑柚 (minneola)，甜瓜，番茄，桃，李子，葡萄，黑醋栗(currant)，醋 栗，黑莓，木莓，樱桃，菠萝，芒果，猕猴桃，荔枝，香蕉，红辣椒 和鳄梨，包括全部种类及其栽培品种。
此外，本发明适用于所有农作物或园艺作物，其品质很大程度上 由收获时间和收获后途径决定。达到这一标准的作物的实例是引言中 已提到的插瓶花，观赏植物，球根植物和黄瓜，但实际上也进一步包 括其他种类的蔬菜和谷物，如莴苣，番茄，马铃薯，紫花苜蓿，芦笋， 木薯，山药，各种洋白菜(花椰菜，羽衣甘蓝，芽甘蓝，皱叶甘蓝， 圆锥形甘蓝等)，菊苣，(婴儿)胡萝卜，冬胡萝卜，pulses，小麦， 玉米，稻米，燕麦，大麦和用作香草的植物，如辣椒，小茴香，山萝 卜，迷迭香等。此外，本发明适于那些不是用于消费而是用于生产商 业上重要产品的作物，如油椰子，橄榄，甘蔗，糖用甜菜，向日葵， 大豆，咖啡豆，可可豆，木材生产植物和如联合国粮食农业组织(FAO) 网站(http://www.fao.org/en http://faostat.fao.org/)上提到的全部作物。
样品中测试标记的实际应用
标记可在应用实验室里(非现场)测试或在简单的(实验室)环 境下进行现场测试。
在将样品送至应用实验室中，存在各种可能性。一种可能性是样 品被完好无损地送至应用实验室。例如送来(未受损的)水果。只要 运输条件不是极端的(温差，样品受压等)，运输将不会影响到测试 结果。当运抵应用实验室时，样品需要尽快固定，例如通过在液氮中 冷冻，或立即处理用于进一步分析。如果是大量样品，抽样，选取及 测定可以自动化进行。
第二种可能性是在现场检测样品。这将不得不限制步骤的数目和 操作的复杂性以允许未接受良好培训的人员来进行测试。第一步，取 来样品。在一些情况下，可涵盖全部的产品，但是在大部分情况下， 涵盖一部分产品。以一部分产品为例，这部分产品需要代表全部的产 品。因此，例如可以选择一块儿果肉或叶片或花朵的一部分。这样， 以水果为例，可以取下一块儿外皮或一块儿果肉进行测试。如果测试 涉及到整个组中的每个产品的品质，需从组中随机选取代表性样品。 随机样品量和批量决定了可靠性。确定随机样品量是实现特定可靠性 所必需的，统计学计算方法可摘自专业文献。然后，基于该随机样品， 进行样品混合或对每个样品进行不同的测试。每个样品的单独测定使 得该组样品能够被逐一测定。之后，固定并提取物质。可通过研磨， 挤压或结合化学物质(如缓冲液)破坏细胞壁，确保样品中的标记不 被破坏。可包括如FTA纸(Whatman International Ltd.，England)，也 可包括含有蛋白酶或RNA酶抑制剂的缓冲液。这取决于样品的类型 并可由技术人员进行操作。对于蛋白标记，通常需要提供比RNA标 记更多的物质。在一些情况下，首先要进行标记的纯化，在其他情况 下，可以直接测定标记。快速检测蛋白的最适方法是横向流动测试， 其使用抗体直接作用于待测蛋白(GenScript Corp.Piscataway，NJ，US； BioGenes GmbH Berlin，Germany)。这些测试可容易地进行操作 (Whatman International Ltd.，England)，并且该技术已广泛应用于商 业，例如消费者可以获得的受孕测试。
在另一个实施方案中，本发明还包括用于测定和预测水果中期望 的品质特征的试剂盒，如水果的硬度，或预测期望的收获期窗口或确 定采摘水果的适宜时间。这种试剂盒对于特定的水果品种具有专一性 并包括量化检测基因的方法，用于预测定水果的种类，预测品质特征 的期望值，连同用于特定水果品种的相关基因表达型的校准线，因此 测定的表达型可与校准线相比较，基于这种比较预测期望的成熟时间 和预测期望的采摘时间。这些校准线也可包含在自动化系统中，因此， 通过测定表达谱产生的数值自动地标绘于这些校准线上，结果是，得 出品质特征期望值的预测。整个过程，包括表达谱本身的测定，可在 自动化系统中进行。该自动化系统包括如下要素：a)用于测定在一 种或多种水果品种中对于测定例如水果硬度非常重要的大量基因或 相关基因的表达的方法，这些相关基因，如β-木糖酶(βxyl)， polygalacturonidase I和II(PGI和PGII)，过氧化物酶424/87(87)， Xyloglucan endotransglycosylase(XET)，棒曲霉素和葡聚糖酶如内 β-1，4-葡聚糖酶，NADP-依赖的D-山梨醇-6-磷酸脱氢酶，α淀粉酶；
b)用于测定调控基因表达的方法，例如管家酶，如磷酸甘油酸 激酶(PGK)或延伸因子1α(eF1α)或其他适当的基因，如Nicot et al.，J.Exp.Botany，56：2907-2914，2005中描述的基因。所有这些基因 必需(可以)考虑用于测定表达型。如果其中的一个基因在全部的测 试样品中具有相同的表达水平，则该基因适于作为组成型基因。
c)用于测定(a)中提到的基因(相对的)表达谱的方法
d)一条或多条校准线，其表示(a)中提到的一种或多种基因表 达谱和一种或多种水果的硬度/成熟度之间的相互关系；以及
e)用于解释测定的与关联的校准线有关的一种或多种水果的表 达谱的方法和基于该表达谱给出有关一种或多种水果成熟度的指示， 该指示还包括直到完全成熟时和/或收获的最佳时间时才需要的时间 指示。
在该自动化系统中，可得到多条校准线，因此该系统可用于测定 几种水果，而无需每次“加载”适当的校准线。另外的可能性是由使 用者为系统提供数据，该数据对应于上述水果收获后的条件，如当地 储存水果的时间，运输持续的时间等，因此系统可以根据这些数据而 变化。
基于描述的方法，还可开发用于预测或确定特定的农业或园艺产 品的特定品质特征值的测试试剂盒。为了达到这一目的，必须得到下 述标记：至少两个标记，优选两者其一为组成型标记(利用该标记可 以完全表达)。将标记和特征间的关系绘制于模型(校准线)中。该 模型描述了即时标记的不同表达水平。该模型可用于计算机程序中以 使测定的表达水平和样品的品质/特征关联起来。mRNA水平的量化 (基因表达)可以通过如定量PCR来进行(Applied Biosystems，US)。 蛋白的量化可以通过在如横向流动免疫测定中使用抗体来进行。测定 的数据随后进入(自动化地或相反地)到计算机模型中，然后生成测 试结果。随后电子显示或用其他方法显示该结果。
本发明还包括大量例如于下述实验中发现的标记，。特别包括标 记M8，其在测定水果硬度中是很重要的；标记GAST(赤霉素引发 的转录)，其在测定提升球茎最佳时间中是很重要的；以及标记GDSL- 基序脂肪酶，其在测定插瓶花的瓶插寿命中是重要的。如实施例所示， 可以仅使用这些标记的部分遗传信息表示存在。事实是如果引物相对 于这些标记目标序列可以充足地合成，这样标记就可以扩增并显示 了。因此本发明包括标记序列M8，GAST和GDSL基序脂肪酶，具 有如实施例和序列表中所示的核苷酸序列(M8：SEQ ID NO：13和 14；GAST：SEQ ID NO：21和22；GDSL-基序脂肪酶：SEQ ID NO： 27和28，其中在各实施例中第一个代表核苷酸序列，第二个代表氨 基酸序列)。如上所述，核苷酸序列和氨基酸序列都可作为标记。由 于事实上，不同种或品种的序列中可能存在较小的差异，本发明还涉 及与SEQ ID NO：14、22和28具有同一性的序列，分别为高于70％， 优选高于80％，更优选高于90％，更优选高于95％，更优选高于98％。 在这里，“相似的序列”通常描述为百分比以及如果两序列彼此进行 最佳地排列，涉及两序列间相似的氨基酸残基或核苷酸的百分比。为 了达到本发明的目的，通过已知的BLAST方法(Basic Local Alignment Search Tool)测定相似序列的相同残基或核苷酸的百分比，公众可通 过美国国家癌症研究所/美国国立卫生研究院(Bethesda，Maryland) 获得该方法，也可通过大量的出版物(参见例如Altschul等，J.MoI. Biol，215(3)，403-10(1990))中的描述获得。通过与BLASTP比较氨 基酸序列，用作BLAST的优选参数为gap open 11.0，gap extend 1， Blosum 62 matrix。
本发明的一部分是使用标记M8，GAST和GDSL-基序脂肪酶测 定植物中的品质参数。特别地，M8用于测定水果尤其是苹果和/或梨 成熟度的测定，GAST用于提升球茎尤其是郁金香的最佳时间的测 定，以及MDSL-基序脂肪酶用于插瓶花尤其是玫瑰花瓶插寿命的测 定。在这些应用中，可使用序列表中所示的片段，或者甚至它们逐一 的片段，而且如果它们在各自种类中自然地产生，可以使用整个基因 和/或蛋白。基于本发明提供的序列信息，技术人员可以在遗传数据 库中容易地找到它们，或容易地将它们从生物体中分离出来。术语“抗 体”进一步涉及抗体的抗原结合形式(例如Fab，F(ab)2)。术语“抗 体”通常指基本上由专一性识别并结合抗原的免疫球蛋白基因或其片 段编码的多肽。尽管不同的抗体片段可由完整抗体的部分进行定义， 技术人员应了解这些片段也可以化学方法或通过重组DNA方法重新 合成。因此，本发明中，术语抗体也包括抗体片段比如单链Fv，嵌 合抗体(即包括不同种类的恒定区和可变区的抗体)，人源化抗体(即 那些包括非来源于人类的CDR(互补决定区))的抗体以及复共轭配合 物抗体(如双特异性抗体)。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
可用作组成型基因/内部控制的管家基因描述于Nicot等，Journal of Experimental Botany，Vol 56：2907-2914，2005中。
实施例1
确定大量苹果和梨品种中的基因表达和水果成熟间的相互关系。
在不同的果园收集两种梨栽培品种，Bon Chretien和Forelle以及 两种苹果栽培品种Golden Delicious和Granny Smith的数据。，所述4 个栽培品种按照南非的条件(收获，短期储存，有条件的输送至如欧 洲市场)在南非收获。收获过后(48小时内)，测定果肉中不同标记 的值。为此目的，采用CTAB法从水果混合样品中分离mRNA(Plant Molecular Biology Reporter Vol.11(2)，1993，pp.113-116)。通过前面介 绍的表达谱技术鉴别不同的标记并通过RT-PCR确认。使用下面设计 的引物测试所有的样品：
         正向引物                   反向引物
PG       GCCCTAATACGGACGGAATTC      AATACAGTCATCACCTGTTCCTATAACC
βXYL    AACTAATTGGTGCTGCTGAGGTT    GTCCGGTCTCTGAACTCTGCTT
424/87   TGGCTCAGGAACATCTTTCATG     CTTGTTGAGTCCAGCAGCAGAG
M8       GGTGGCGGCATGGAGTT          CCCTTTCCCGTAGGCTTCC
EF1a     TGGGTTTGAGGGTGACAACA       TGATCAGGTCAAGAGCCTCAAG
PGK      CCTGAATTCGCCAAGAAGCT       TGCATGAGCCCTATGAGCAGTA
在相同的样品中，采用标准的方法和自动透度计，来测定水果的 硬度。另外，还测定其他的生理参数，如：颜色、淀粉含量、含糖量 和苹果酸浓度。
在南非的储藏期间(对于苹果为几个星期，对于梨约10天)，跟 踪原料。在储藏期后，再一次测定标记值并且进行运输模拟(如集装 箱运输到欧洲)。然后，再进行生理分析。
史密斯老大娘(Granny Smith)(苹果)在早于成熟期之前收获， 没有完全成熟(保留适当的硬度)。Forelle梨收获得也较早但是已经 完全成熟。如果梨没有较早地收获，他们会因为太重而从树上坠落。 金冠苹果(Golden Delicious)和Bon Chretien梨在成熟过程中较晚收 获，可在树上进一步成熟。
对于梨，特别是质地标记β-木糖苷酶(betaxylosidase，βxyl)， 多聚半乳糖醛酸酶I(polygalacturonase I，PG1)和推定的细胞壁过 氧化物酶424/87(87)(Cell Wall peroxidase 424/87(87))是相关的。 通过测定这些标记的基因活性何时开始升高可以确定成熟的开始和 成熟的过程(见图1)。
图1显示了不同的果园在不同时期开始成熟。果园Bo Radyn特 别早于其它果园。较晚的成熟可能是由于使用了特殊的抑制剂如保留 剂(Retain)(乙烯抑制剂)。在图1中的图表中，所有三种标记的活 性已经整合，但是这并不是必需的。原则上，上述的每一种标记是好 测量的。标记的值每一次都通过与结构标记(phosphoglucerate kinase (磷酸甘油酸激酶，PGK)或延伸因子1α(eF1α)的活性来校正。
期望的进入市场区域(如欧洲)时的硬度可以在收获时预估，也 可以在第一个储藏期后，依赖于采后处理，通过测定收获时的或储藏 后的质地标记的值并与校准线比对，校准线由于处理的不同(如冷冻 温度、用乙烯抑制剂处理等等)当然有所区别。看来存在有质地标记 的效力的顺序，取决于成熟过程中的时期。在成熟过程的早期，βxyl 是重要的，然后是PG1，再然后是424/87。
图2清楚地显示出进入市场区域时的硬度和这些测量时的质地 标记的值之间有明确的关系。在成熟早期(收获)M1(PG1)具有最 佳值，然后是424/87(紧随的短暂的储藏)。对于较早收获的Forelle 梨，首先是βxyl具有最佳的关系，然后是PG1。
对于苹果，原则上是一样的。成熟期也可以通过联合的质地标 记来测定。在此情况下，因为Granny Smith成熟进行得较慢，包含 在内的是βxyl和PG1的联合(见图4)。期望的进入市场区域时的硬 度尤其可以通过在收获期和紧随的短暂的储藏的βxyl标记的基因活 性的值来预估。这是因为Granny Smith的成熟过程(尤其是软化) 是十分慢的(见图5)。在苹果品种金冠中，也存在有相似的情形(见 图6)。标记βxyl和PG1具有共同的重要性，当成熟进行得非常快且 在成熟过程后进行收获时，要增加这个品种的另一种标记。这个标记 M8具有下述的序列(SEQ ID NO：13)：
gtacatgttcaccactactgctgaacgggaaattgtccgtgatatgaaggagaagcttgcatatgttgctctggactat
gagcaagaacttgagactgccaagagcagctcttcagttgagaagaactatgagcttcccgatggccaagtcatcacaa
ttggagctgagagattccggtgcccagaagtcctctttcaaccatctcttattggaatggaagctgctggcattcatga
gactacttacaactctatcatgaagtgtgatgtggatatcagaaaagacctatatggaaacatcgtgctcagtggtggg
tcaactatgttccctggtattgcagaccgtatgagccgggagatcactgctcttgctccaagcagcatgaagatcaagg
ttgtagctccaccagagagaaagtacgcggggacgatagccaatcagaaaaagaaaaaggcacaagtccggcaaaaatg
tctgcctcagttatggcttgttccgtgagcctaaaaccatctcccttcactgttcagaagtcagcagtgagaggccttc
cctctctttccaggtcttctgcttcattcaaggtgcaagccagtggcgtcaagaaaatcaagactgccaccccatatgg
aactggtggcggcatggagttgaggaacggtgttgatgcctctgggaggaagcctacgggaaagggtgtctaccagttt
gtagacaagtac.
标记M8与来自于梨的肌动蛋白(actin)有很高的同源性。其 NCBI登录口是：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝60 650116。
图7显示出在第一次储藏后此基因的活性相对于硬度的关系。
实施例2
通过收获时间前后的基因表达与收获后的花的品质的相关性来 确定空运郁金香(lifting tulips)的最佳时机。
在四年中，三种郁金香品种，品种“Apeldoorn”、品种“Leen van de Mark”和品种“Prominence”，每一次在相同的生长点取样。取样 在当季的不同时期进行，在预定的空运日期前的6-7个星期每隔2星 期，在确定空运日期前的至少1个星期，在空运时，和在随后的1个 星期。生长点的每次取样在早晨进行，在白天的其余时间进行采样处 理。从最外层的鳞茎片，取大小为1cm2的一块组织，立即用液氮定 形。然后，在此组织中，在所有标准的季节和每一个品种中测定已确 定的与收获的时间有关的3个标记的可观数量的基因的基因表达。
为了确定采后途径中的空运的最佳时机与产品品质的关系，采自 野外样品的鳞茎的部分用于储藏。在储藏后，这些鳞茎压制后种植用 于评定得到的花和茎的品质和标记的值与得到的花的品质参数的值 之间的的相关性。在评定中的客观的品质参数是花的重量和茎的长 度。
在二个另外的季节期间，标记的确认随后进行，同时也在其他的 生长场所进行取样。为此目的，每次取10个鳞茎的混合样品用于分 离RNA，用定量PCR确定其中标记的浓度。
在PCR过程中，采用下述的引物化合物，其是与品种 “Prominence”中分离出的三种标记的核苷酸序列相对应的：
标记     正向引物                             反向引物
GAST     5′-GGCACCTACGGCAACTATGATAG-3′      5′-CACTTGCGAGCACCATGATG-3′
EIF4a    5′-CGTCCCGTGTCACAAAGTTG-3′         5′-CCATCGTATCGGTCGTAGTGG-3′
EFIA     5′-TTGATATTGCTCTCTGGAAGTTTGAG-3′   5′-AGTTCCAGTAATCATGTTCTTAATGAAGTC-3′
品种“Prominence”和“Apeldoorn”的标记的组合实测值过程如 图11所示。其是从收获的最佳时机的前三个星期直到收获的最佳时 机，在开花试验中测定，标记的过程，绘制其基于时间的对数图，表 现出几乎线性的可重现的图。标记的值与开花品质参数的值有关，决 定了其中哪个标记的值达到了空运的最佳时机。对于特殊的品种，标 记吻合线性过程；在品种之间，存在有线性过程的差异。通过不同年 份的组合实测值，可以确定每一种品种的可靠的校准线。在此校准线 基础上，可以根据取自野外的在空运预计时间2个星期之间的仅仅1 或2个样品的检测来预估新季节的空运的最佳时机。
标记GAST具有下述的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)：
gatcatccagttactaagctaagcaagccctccttcctcaacttatcaatgacttcatccacctccatcc
tgacatcccttgtgcttctcttcctccttgtcggtctcgtcgagccccgcctggagattgaacccggaaa
cgggatagaaaggtctcttctaggtgggctaagtaagcaactcttccgaactatcactaatcagtatgtt
ggtattcttagagagaagttaaccatagattgttatgatgatcaggctgcggtgcggcgtgcttggtgag
gtgcagcgagtcatcaaggccgaatctgtgcaagagggcgtgcgggacatgctgtgcaaggtgcagctgc
gtcccaccgggcacctacggcaactatgatagctgcccttgttacgcttcactcaccacccatcatggtg
ctcgcaagtgcccttaaacatgaagaataaattggtgtgtcataggtgatgaaagtgggttcgcttgttc
gatatatatatatgtaataaaacgttcaaacaaactcagttattcgaataaagagg
标记GAST的表达在收获时间的前三个星期就可以完全测量到。 在这个时间点之前不能得到此标记可靠的值。在收获前的三个星期， 表达量呈指数增加，并且在收获的最佳时机达到三个待测品种均一致 的值。在收获的最佳时机之后，此标记达到恒值。
其它的标记，EIF4a和EFIA，是结构基因，其表达量在测量的任 何时候即收获郁金香鳞茎的前、中和后期都不会改变。这些标记的均 值用于标准化以获得待测品种之间的比较。
实施例3
玫瑰切花品质和基因表达量之间关系的确定
基因表达量的数据用于预估玫瑰的插瓶寿命。实际上，某些玫瑰 在消费者的花瓶仅能维持5天而其它玫瑰(同样的品种)有时可维持 多达10天。这常是由于它们为了折衷于品质而在还未成熟时收获。
调查发现某个基因或某个基因的表达量和收获的时间和品质之 间显示出良好的相关性。利用基因表达量数据，采用较早提到的方法， 进行与玫瑰的插瓶寿命的相关性研究。测定在收获中和收获后花瓣中 的相对表达量可以大约预估玫瑰的期望的插瓶寿命。用于这个目的的 基因被认为是和结构标记联合的GDSL-基序(motif)脂肪酶，在此 例中，是延伸因子1α，如图12所示。当玫瑰在4℃储存时，插瓶寿 命的差异仍是可测的。不同品种之间、收获的不同年份之间发现的值 是一致的。此标记通过RT-PCR确认。用下述的引物组合来检测所有 的样品：
                    正向引物                    反向引物
GDSL-motif lipase   AGGATTTGAGAACACCAATTTGC     GAGTTCAATGACAAGCTGAATAAGTTG
EF1α               TGGTGTCAAGCAGATGATTTGC      TTCATCGTACCTTGCCTTTGAG
GDSL-基序脂肪酶具有下述的序列(反向互补链编码基因如SEQ ID NO：27所示)：
gtactacaatactactaaataccgtattatcatattgccactccatggtggaagtagaaacatccactgtag
aaagcaaaatgaagacttacctccagaatgcaattctaaacaacctaataagtaataactatacttagttgggcacaaa
caaatatagtagctggggataaagccatatatcaacctatctaaagtgataggaacctagatttataataattttatgc
cctagctttcatatattaattgaaggaaaattaaggaaactgggtcaggacacgtttgactatgtaatcagagatgatc
tggtttgctttctctgtgggatggaaggagtcccagaagatgtatttgcttgcatcagtgcatgtgaacatgttgtttc
ggttgcatgcatatcccatctcaaacattcctgtggcacaacaagccactgatgtcacctcaaaaccgtaaaaagaagg
ccttcttatcatatacaggaaaacaaaataaggatttgagaacaccaatttgcttccaggaagctctttattgaggctg
acggtcaacttattcagcttgtcattgaactccaaagccacatcgttgtaattcgaaatgcagtcatttccatccatga
tattactggttctctctaatggcaagcatcccattggaggcagtcctcccacggaaattttccgagctccgagcttgta
gagttccttcacgaaattcgctgcgattccgatgagaaagtcttggtattgggaggtagtgtattggggatgatcggcc
tgatggtggaaatgtgg
此标记与来源于Arabidopsis(At2g04570)的GDSL-基序脂肪酶/ 水解酶有很高的同源性。在Arabidopsis中此基因在芽和气孔中特别 地表达。
实施例4
基因表达量和大多数种类的苹果和梨的果实成熟之间关系的确 定
收集多个果园的梨品种Conference和苹果品种Kanzi的数据， 这2个品种由于荷兰的位置在荷兰收获(收获，有条件的储藏(4-10 月))。在刚收获后(48小时内)亲自测定各种标记的值。
为此，从果实的混合试样中采用CTAB法(Plant Molecular Biology Reporter Vol.11(2)，1993，pp.113-116)分离mRNA。通过前述 提到的方法确定各种标记的表达型和通过RT-PCR确认。用下述的引 物组合检测所有的样品：
        正向引物                   反向引物
                                                            
PG      GCCCTAATACGGACGGAATTC      AATACAGTCATCACCTGTTCCTATAACC
βXYL   AACTAATTGGTGCTGCTGAGGTT    GTCCGGTCTCTGAACTCTGCTT
EF1a    TGGGTTTGAGGGTGACAACA       TGATCAGGTCAAGAGCCTCAAG
PGK     CCTGAATTCGCCAAGAAGCT       TGCATGAGCCCTATGAGCAGTA
在相同的样品中，采用标准的方法和自动透度计，来测定水果的 硬度。另外，还测定其他的生理参数，如：颜色、淀粉含量、含糖量 和苹果酸浓度。
跟踪在荷兰的低氧浓度的冷库中储藏期间的原料，在约5个月的 储藏期后取样。在这些样品中，再次进行生理测定。
对于梨和苹果，质地标记β-木糖苷酶(βxyl)和多聚半乳糖醛酸 酶I(PG1)特别证明是和荷兰位置相关的。通过测定这些标记的基因 活性何时开始升高可以确定成熟的开始和成熟的过程(见图8)。图8 是在几天内的βxyl的表达量对时间的曲线。由于可以在不同年份之 间比较选用收获的最佳时机作为起始点(用生理参数确定)。图8可 以清楚地显示出不同年份之间的此标记的过程几乎是吻合的和可以 用来很好地确定收获的最佳时机。图8采用了标记，但是PG的表达 量图以同样的方式进行并可任意和βxyl一起使用以获得更好的分辨 率。通过比较标记和结构标记(磷酸甘油酸激酶(PGK)或延伸因子 1α(eF1α)的活性来校正每一次的标记的值。
在收获时期可以预估储藏几个月后离开冷库时的预期的硬度，依 赖于采后处理，通过测定储藏后的质地标记的值并与校准线相比较。 校准线由于处理的不同(如冷冻温度、用乙烯抑制剂处理等等)当然 有所区别。
图9和图10清楚地显示出梨和苹果在储藏后的硬度和他们在收 获时的质地标记的值之间有清晰的关系。其在PG和βxyl中再次体现。
序列表
<110>表现研究有限公司
<120>农作物和园艺作物品质特征的确定
<130>KHP09213183.7
<150>NL 1033431
<151>2007-02-20
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<223>primer EF1a forward
<400>9
tgggtttgag ggtgacaaca                                       20
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EF1a reverse
<400>10
tgatcaggtc aagagcctca ag                                    22
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer PGK fw
<400>11
cctgaattcg ccaagaagct                                       20
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer PGK reverse
<400>12
tgcatgagcc ctatgagcag ta                                            22
<210>13
<211>723
<212>DNA
<213>Malus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(502)
<400>13
g tac atg ttc acc act act gct gaa cgg gaa att gtc cgt gat atg aag   49
  Tyr Met Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp Met Lys
  1               5                   10                  15
gag aag ctt gca tat gtt gct ctg gac tat gag caa gaa ctt gag act     97
Glu Lys Leu Ala Tyr Val Ala Leu Asp Tyr Glu Gln Glu Leu Glu Thr
            20                  25                  30
gcc aag agc agc tct tca gtt gag aag aac tat gag ctt ccc gat ggc    145
Ala Lys Ser Ser Ser Ser Val Glu Lys Asn Tyr Glu Leu Pro Asp Gly
        35                  40                  45
caa gtc atc aca att gga gct gag aga ttc cgg tgc cca gaa gtc ctc    193
Gln Val Ile Thr Ile Gly Ala Glu Arg Phe Arg Cys Pro Glu Val Leu
    50                  55                  60
ttt caa cca tct ctt att gga atg gaa gct gct ggc att cat gag act    241
Phe Gln Pro Ser Leu Ile Gly Met Glu Ala Ala Gly Ile His Glu Thr
65                  70                  75                  80
act tac aac tct atc atg aag tgt gat gtg gat atc aga aaa gac cta    289
Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu
                85                  90                  95
tat gga aac atc gtg ctc agt ggt ggg tca act atg ttc cct ggt att    337
Tyr Gly Asn Ile Val Leu Ser Gly Gly Ser Thr Met Phe Pro Gly Ile
            100                 105                 110
gca gac cgt atg agc cgg gag atc act gct ctt gct cca agc agc atg    385
Ala Asp Arg Met Ser Arg Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met
        115                 120                 125
aag atc aag gtt gta gct cca cca gag aga aag tac gcg ggg acg ata       433
Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ala Gly Thr Ile
    130                 135                 140
gcc aat cag aaa aag aaa aag gca caa gtc cgg caa aaa tgt ctg cct       481
Ala Asn Gln Lys Lys Lys Lys Ala Gln Val Arg Gln Lys Cys Leu Pro
145                 150                 155                 160
cag tta tgg ctt gtt ccg tga gcctaaaacc atctcccttc actgttcaga         532
Gln Leu Trp Leu Val Pro
                165
agtcagcagt gagaggcctt ccctctcttt ccaggtcttc tgcttcattc aaggtgcaag    592
ccagtggcgt caagaaaatc aagactgcca ccccatatgg aactggtggc ggcatggagt    652
tgaggaacgg tgttgatgcc tctgggagga agcctacggg aaagggtgtc taccagtttg    712
tagacaagta c                                                         723
<210>14
<211>166
<212>PRT
<213>Malus sp.
<400>14
Tyr Met Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp Met Lys
1               5                   10                  15
Glu Lys Leu Ala Tyr Val Ala Leu Asp Tyr Glu Gln Glu Leu Glu Thr
            20                  25                  30
Ala Lys Ser Ser Ser Ser Val Glu Lys Asn Tyr Glu Leu Pro Asp Gly
        35                  40                  45
Gln Val Ile Thr Ile Gly Ala Glu Arg Phe Arg Cys Pro Glu Val Leu
    50                  55                  60
Phe Gln Pro Ser Leu Ile Gly Met Glu Ala Ala Gly Ile His Glu Thr
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu
                85                  90                  95
Tyr Gly Asn Ile Val Leu Ser Gly Gly Ser Thr Met Phe Pro Gly Ile
            100                 105                 110
Ala Asp Arg Met Ser Arg Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met
        115                 120                 125
Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ala Gly Thr Ile
    130                 135                 140
Ala Asn Gln Lys Lys Lys Lys Ala Gln Val Arg Gln Lys Cys Leu Pro
145                 150                 155                 160
Gln Leu Trp Leu Val Pro
                165
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer GAST forward
<400>15
ggcacctacg gcaactatga tag                                           23
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer GAST reverse
<400>16
cacttgcgag caccatgatg                                               20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EIF4a forward
<400>17
cgtcccgtgt cacaaagttg                                               20
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EIF4a reverse
<400>18
ccatcgtatc ggtcgtagtg g                                             21
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EFIA forward
<400>19
ttgatattgc tctctggaag tttgag                                        26
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EFIA reverse
<400>20
agttccagta atcatgttct taatgaagtc                                    30
<210>21
<211>546
<212>DNA
<213>Tulipa sp.
<220>
<221>CDS
<222>(49)..(168)
<220>
<221>CDS
<222>(258)..(434)
<400>21
gatcatccag ttactaagct aagcaagccc tccttcctca acttatca atg act tca      57
                                                     Met Thr Ser
                                                     1
tcc acc tcc atc ctg aca tcc ctt gtg ctt ctc ttc ctc ctt gtc ggt      105
Ser Thr Ser Ile Leu Thr Ser Leu Val Leu Leu Phe Leu Leu Val Gly
    5                   10                  15
ctc gtc gag ccc cgc ctg gag att gaa ccc gga aac ggg ata gaa agg      153
Leu Val Glu Pro Arg Leu Glu Ile Glu Pro Gly Asn Gly Ile Glu Arg
20                  25                  30                  35
tct ctt cta ggt ggg ctaagtaagc aactcttccg aactatcact aatcagtatg      208
Ser Leu Leu Gly Gly
                40
ttggtattct tagagagaag ttaaccatag attgttatga tgatcaggc tgc ggt gcg    266
                                                      Cys Gly Ala
gcg tgc ttg gtg agg tgc agc gag tca tca agg ccg aat ctg tgc aag      314
Ala Cys Leu Val Arg Cys Ser Glu Ser Ser Arg Pro Asn Leu Cys Lys
    45                  50                  55
agg gcg tgc ggg aca tgc tgt gca agg tgc agc tgc gtc cca ccg ggc      362
Arg Ala Cys Gly Thr Cys Cys Ala Arg Cys Ser Cys Val Pro Pro Gly
60                  65                  70                  75
acc tac ggc aac tat gat agc tgc cct tgt tac gct tca ctc acc acc      410
Thr Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Cys Pro Cys Tyr Ala Ser Leu Thr Thr
                80                  85                  90
cat cat ggt gct cgc aag tgc cct taaacatgaa gaataaattg gtgtgtcata     464
His His Gly Ala Arg Lys Cys Pro
            95
ggtgatgaaa gtgggttcgc ttgttcgata tatatatatg taataaaacg ttcaaacaaa    524
ctcagttatt cgaataaaga gg                                             546
<210>22
<211>99
<212>PRT
<213>Tulipa sp.
<400>22
Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Leu Thr Ser Leu Val Leu Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Gly Leu Val Glu Pro Arg Leu Glu Ile Glu Pro Gly Asn Gly
            20                  25                  30
Ile Glu Arg Ser Leu Leu Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Leu Val Arg
        35                  40                  45
Cys Ser Glu Ser Ser Arg Pro Asn Leu Cys Lys Arg Ala Cys Gly Thr
    50                  55                  60
Cys Cys Ala Arg Cys Ser Cys Val Pro Pro Gly Thr Tyr Gly Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Ser Cys Pro Cys Tyr Ala Ser Leu Thr Thr His His Gly Ala Arg
                85                  90                  95
Lys Cys Pro
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer GDSL-motif lipase forward
<400>23
aggatttgag aacaccaatt tgc                                           23
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer GDSL-motif lipase reverse
<400>24
gagttcaatg acaagctgaa taagttg                                       27
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EF1a forward
<400>25
tggtgtcaag cagatgattt gc                                            22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer EF1a reverse
<400>26
ttcatcgtac cttgcctttg ag                                            22
<210>27
<211>800
<212>DNA
<213>Rosa sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(540)
<400>27
cca cat ttc cac cat cag gcc gat cat ccc caa tac act acc tcc caa     48
Pro His Phe His His Gln Ala Asp His Pro Gln Tyr Thr Thr Ser Gln
1               5                  10                  15
tac caa gac ttt ctc atc gga atc gca gcg aat ttc gtg aag gaa ctc     96
Tyr Gln Asp Phe Leu Ile Gly Ile Ala Ala Asn Phe Val Lys Glu Leu
            20                  25                  30
tac aag ctc gga gct cgg aaa att tcc gtg gga gga ctg cct cca atg    144
Tyr Lys Leu Gly Ala Arg Lys Ile Ser Val Gly Gly Leu Pro Pro Met
        35                  40                  45
gga tgc ttg cca tta gag aga acc agt aat atc atg gat gga aat gac     192
Gly Cys Leu Pro Leu Glu Arg Thr Ser Asn Ile Met Asp Gly Asn Asp
    50                  55                  60
tgc att tcg aat tac aac gat gtg gct ttg gag ttc aat gac aag ctg     240
Cys Ile Ser Asn Tyr Asn Asp Val Ala Leu Glu Phe Asn Asp Lys Leu
65                  70                  75                  80
aat aag ttg acc gtc agc ctc aat aaa gag ctt cct gga agc aaa ttg     288
Asn Lys Leu Thr Val Ser Leu Asn Lys Glu Leu Pro Gly Ser Lys Leu
                85                  90                  95
gtg ttc tca aat cct tat ttt gtt ttc ctg tat atg ata aga agg cct     336
Val Phe Ser Asn Pro Tyr Phe Val Phe Leu Tyr Met Ile Arg Arg Pro
            100                 105                 110
tct ttt tac ggt ttt gag gtg aca tca gtg gct tgt tgt gcc aca gga     384
Ser Phe Tyr Gly Phe Glu Val Thr Ser Val Ala Cys Cys Ala Thr Gly
        115                 120                 125
atg ttt gag atg gga tat gca tgc aac cga aac aac atg ttc aca tgc     432
Met Phe Glu Met Gly Tyr Ala Cys Asn Arg Asn Asn Met Phe Thr Cys
    130                 135                 140
act gat gca agc aaa tac atc ttc tgg gac tcc ttc cat ccc aca gag     480
Thr Asp Ala Ser Lys Tyr Ile Phe Trp Asp Ser Phe His Pro Thr Glu
145                 150                 155                 160
aaa gca aac cag atc atc tct gat tac ata gtc aaa cgt gtc ctg acc     528
Lys Ala Asn Gln Ile Ile Ser Asp Tyr Ile Val Lys Arg Val Leu Thr
                165                 170                 175
cag ttt cct taa ttttccttca attaatatat gaaagctagg gcataaaatt         580
Gln Phe Pro
attataaatc taggttccta tcactttaga taggttgata tatggcttta tccccagcta   640
ctatatttgt ttgtgcccaa ctaagtatag ttattactta ttaggttgtt tagaattgca   700
ttctggaggt aagtcttcat tttgctttct acagtggatg tttctacttc caccatggag   760
tggcaatatg ataatacggt atttagtagt attgtagtac                         800
<210>28
<211>179
<212>PRT
<213>Rosa sp.
<400>28
Pro His Phe His His Gln Ala Asp His Pro Gln Tyr Thr Thr Ser Gln
1               5                   10                  15
Tyr Gln Asp Phe Leu Ile Gly Ile Ala Ala Asn Phe Val Lys Glu Leu
            20                  25                  30
Tyr Lys Leu Gly Ala Arg Lys Ile Ser Val Gly Gly Leu Pro Pro Met
        35                  40                  45
Gly Cys Leu Pro Leu Glu Arg Thr Ser Asn Ile Met Asp Gly Asn Asp
    50                  55                  60
Cys Ile Ser Asn Tyr Asn Asp Val Ala Leu Glu Phe Asn Asp Lys Leu
65                  70                  75                  80
Asn Lys Leu Thr Val Ser Leu Asn Lys Glu Leu Pro Gly Ser Lys Leu
                85                  90                  95
Val Phe Ser Asn Pro Tyr Phe Val Phe Leu Tyr Met Ile Arg Arg Pro
            100                 105                 110
Ser Phe Tyr Gly Phe Glu Val Thr Ser Val Ala Cys Cys Ala Thr Gly
        115                 120                 125
Met Phe Glu Met Gly Tyr Ala Cys Asn Arg Asn Asn Met Phe Thr Cys
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Ser Lys Tyr Ile Phe Trp Asp Ser Phe His Pro Thr Glu
145                 150                 155                 160
Lys Ala Asn Gln Ile Ile Ser Asp Tyr Ile Val Lys Arg Val Leu Thr
                165                 170                 175
Gln Phe Pro