技术领域
[0001] 本
发明属于
真菌培养技术领域，具体涉及一种北冬虫夏草的规模化培育方法。
背景技术
[0002] 北冬虫夏草，也叫蛹虫草或踊虫草、蛹草，是一种久负盛名的食、药用真菌，含有虫
草酸(D～甘露醇)、虫草素(3`～脱
氧腺苷)、虫草多糖和超氧化物歧化酶(SOD)等特殊物质，据《本草纲目拾遗》称北冬虫夏草能治百虚百损，有补
肺益肾之功效。北冬虫夏草除对多种
疾病具有显著疗效外，还有优良的滋补作用，并有抗菌、抗病毒、抗癌、抗疲劳、抗衰老等特殊功效，已越来越受到国内外研究者的重视和消费者的青睐。在我国已有的70多个虫草品种中，研究最为深入的是北冬虫夏草。
[0003] 蛹虫草中富含虫草酸、虫草素、虫草多糖和SOD酶等多种
生物活性物质。虫草酸(甘露醇)有
软化血管，改善微循环，具有降血脂、镇咳、祛痰、平喘的作用。可以显著地降低颅压，促进
机体新陈代谢，因而使脑溢血和脑血栓病症得到缓解。虫草酸是一种具有抗菌活性的核苷类物质：对核多聚腺苦酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA转录mRNA过程中使mRNA成熟障碍，抑制癌细胞的生长。虫草素是一种抗菌、抗癌的活性物质，具有抗生和抑制细胞分裂的作用。对人体的内分泌系统、神经系统有调节作用。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的
抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能
力，为免疫调节剂。
[0004] SOD酶(超氧化物歧化酶)可以消除机体内超氧自由基，具有抗衰老、抗癌抑癌的作用。
[0005] 冬虫夏草是一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能，和抗
肿瘤、抗疲劳等多种功能。由于野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，所以本身资源比较有限。近年来又由于冬虫夏草主产地生态环境遭到人为严重破坏，大量盲目不合理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降。冬虫夏草可以药食两用，人们不断发现其新的药理作用，所以人们对它的需要倍增，价格逐年上涨。目前市场上一等冬虫夏草每公斤高达30万元左右，许多人望而却步。北冬虫夏草虽然药效只有冬虫夏草十分之一，但每公斤价格只有冬虫夏草百分之一是冬虫夏草最理想的代替品。为了满足市场的需求，目前许多地区如吉林、辽宁、山东、江苏、河南等省都相继开展了对北冬虫夏草的研究、栽培工作，但都达不到规模化栽培技术要求。发明的目的是提供一整套规模化生产北冬虫夏草的培育方法，具有成本低、僵化率高、出草齐、生产周期短的优点和特点。
发明内容
[0006] 本发明针对目前人工栽培北冬虫夏草存在的生产技术
缺陷，提供了一整套规模化生产北冬虫夏草先进的、科学的栽培北冬虫夏草技术和方法，通过人工采集野生北冬虫夏草，通过分离、提纯、接种、培养等，培育获得北冬虫夏草新个体。
[0007] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0008] 一种北冬虫夏草的规模化培育方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1北冬虫夏草一级、二级母种斜面培养
[0010] 步骤1.1配置培养基，培养基配方为：土豆200g、琼脂20g、柞蚕蛹100g、
葡萄糖20g、蛋白胨8g、
磷酸二氢
钾1.5g、
硫酸镁0.75g，1000毫升
水；
[0011] 步骤1.2采集野生北冬虫夏草用
质量浓度0.1％的汞溶液消毒，无菌水清洗，取其内部组织1立方毫米的小
块移接至培养基斜面，放入20℃的恒温箱中培养15天即得北冬虫夏草一级母种斜面；
[0012] 步骤1.3选择僵化率高、出草整齐的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级母种斜面。
[0013] 步骤2北冬虫夏草液体菌种的制作与培养
[0014] 步骤2.1配置培养基，按质量分数培养基配方为：活柞蚕蛹10％、葡萄糖1％、蛋白胨1％、速溶奶粉1％、磷酸二氢钾0.15％，
硫酸镁0.075g，1000ml水，1只鸡蛋清；
[0015] 步骤2.2接种二级母种，在21℃恒温箱内静止培养24h后，用150r/min往复式摇床进行振荡培养96h后，选取合格菌种。
[0016] 步骤3注射接种
[0017] 选取蚕蛹在
发酵终了前1d进行注射接种，注入菌种0.08～0.15ml，送发菌室内发菌。
[0018] 步骤4菌丝培养
[0019] 步骤4.1低温避光环境下培养，
温度前3d控制为16℃，3d～8d控制为18℃，湿度60％以上；
[0020] 步骤4.2将僵化好的蚕蛹21～22℃避光条件下培养，促使菌丝后熟，转向生殖生长阶段。
[0021] 步骤5诱导原基形成与出草管理
[0022] 步骤5.1将生殖生长阶段的僵蛹的三分之一处划刀口，划口后的僵蛹不立即见光，在温度21～22℃，湿度80％以上的暗室培养中3天，待僵蛹的环节及划口处长出白色菌丝，再
装瓶见光出草；
[0023] 步骤5.2将菌丝营养生长结束的蚕蛹，用2g/L臭氧水蛹体表面消毒10min，控净表面自由水后在无菌室上瓶，送到出草室培养出草；
[0024] 步骤5.3待原基形成后
温度控制在19～22℃，蛹虫草长到1cm高时，将室内的
相对湿度调高至75％～80％，经过15～17d，蛹虫草生长高度接近
瓶口即可采收；
[0025] 本发明步骤1.1所述的培养基通过以下方法制备：将土豆块和柞蚕蛹加水煮沸至土豆软而不烂时，滤去土豆残渣，在汁液中加入剩余组分并搅拌均匀，加热至琼脂完全溶化2
后分装试管，培养基的量与试管的体积比是1∶5，高压锅灭菌，加热到压力达到0.5Kg/m时，排出冷空气，然后继续加热至125℃时保压35分钟后停止加热降温，排气，并趁热把试管摆成斜面，得固体试管斜面备用。
[0026] 本发明所述的二级母种斜面的培养基与一级母种斜面的培养基相同。
[0027] 本发明步骤2.1所述的培养基通过以下方法制备：将活蚕蛹手撕开放入1000ml冷水中，沸煮25min，收集滤液，开水定溶1000ml，依次加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨和奶粉，充分溶解后，冷却至30℃，加入
泡沫鸡蛋清，充分搅拌均匀，高压灭菌器，在0.137Mpa、125℃条件下灭菌20min，滤出澄清液，加入葡萄糖搅拌溶解后灭菌。
[0028] 本发明步骤2.2所述的合格菌种标准为：菌液澄清不混浊，菌球多，形状一致，发育齐一，晃动后浮起的菌球5min不下沉，经
显微镜检查，无和虫草菌丝不一样的
微生物。
[0029] 步骤3所述的发菌室在使用前3d用3％甲
醛进行消毒，室外过道用1％消特灵水洗刷封闭地面，发菌室的
门窗用黑红布窗帘遮挡。
[0030] 本发明所述的生殖生长的标志为：菌龄达15～17d；蛹体和环节间膜处长出白色菌丝；蛹顶由白色变成淡褐色。
[0031] 本发明的有益效果为：解决了现有人工栽培北冬虫夏草出现僵化率低、出草低、不齐等的技术问题，本发明方法具有成本低、僵化率高、出草齐、生产周期短的优点和特点，便于大规模推广使用，弥补了冬虫夏草由于资源有限、昂贵而出现的市场空白，具有实际的经济和社会效益。
具体实施方式
[0032] 下面结合
实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单
修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0033] 实施例1
[0034] 通过人工采集野生北冬虫夏草，通过分离、提纯、接种、培养等，培育获得北冬虫夏草新个体。
[0035] 为了实现上述目的，本发明北冬虫夏草的培育方法，具体操作步骤如下：
[0036] 一、北冬虫夏草一级、二级母种斜面培养与选择
[0037] 1.培养基配方：
[0038] 配制1000毫升水需要的材料；
[0039] 土豆200g、琼脂20g、柞蚕蛹100g、葡萄糖20g、蛋白胨8g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.75g。
[0040] 2.配制方法：
[0041] 将洗净去皮的土豆切成骰子块和洗净的柞蚕蛹撕开加水1000ml煮沸30分钟，至土豆软而不烂时，用4层纱布滤去土豆残渣，取汁液于锅中加入琼脂20g、蛋白胨8g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.75g并搅拌均匀，继续加热至琼脂完全溶化，趁热迅速分装试管，每个试管装培养基的量与试管的体积比是1∶5，装完后塞上
棉塞，然后把试管每5支或
7支扎成一
捆，用
牛皮纸包好放入高压锅灭菌，加热到压力达到0.5Kg/m2时，开排气
阀，排出冷空气，使
指针回到0点，然后关上排气阀继续加热至125℃时保压35分钟后停止加热降温，使指针回到0点时再打开排气阀放气，5分钟后打开高压锅灭菌锅，并趁热把试管摆成斜面，冷却后得固体试管斜面备用；
[0042] 3.菌种分离培养：
[0043] 将采集到野生北冬虫夏草清洗后用0.1％升汞溶液对其进行消毒3分钟处理，再用无菌水清除其表面的升汞。北冬虫夏草表面消毒处理后，用无菌刀片切去其子座的外层，用接种刀切取其内部组织1立方毫米的小块迅速移接到试管斜面上，并迅速塞上棉塞，然后放入20℃的恒温箱中培养15天左右即得北冬虫夏草一级母种斜面。
[0044] 4.见光选择能出虫草菌种
[0045] 将做好的北冬虫夏草一级母种斜面，在散射光下短时间感光，选留全管变黄快且色深的试管菌株直接进行小区僵化出草试验，再选留试管菌株部分变黄快、变黄深的分离纯化，再进行见光选择，并做小区僵化出草试验。
[0046] 5.北冬虫夏草二级母种斜面的扩大培养：
[0047] 将小区僵化率高、出草齐一的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级母种斜面试管，二级母种斜面试管的培养基与一级母种斜面试管的培养基相同。
[0048] 二、北冬虫夏草液体菌种的制作与培养
[0049] 1.培养基配方：
[0050] 活柞蚕蛹10％、葡萄糖1％、蛋白胨1％、速溶奶粉1％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.075g、每1000ml水放1只鸡蛋的清。
[0051] 2.培养基制作：
[0052] 取活蚕蛹100g，把每个蚕蛹用手撕开，放入1000ml冷水中，煮沸后微沸保持25min，用4层纱布过滤，弃去蛹渣留下滤液，用开水定溶1000ml。依次加入硫酸镁0.075g，磷酸二氢钾1.5g，蛋白胨10g，奶粉10g，充分溶解。然后除沉：作好的液体培养基放在一旁冷却，打一个鸡蛋清于烧杯中，用筷子搅成泡沫，当培养基冷却到30℃左右时，把鸡蛋清倒入培养液中，充分搅拌均匀，装入2000ml三
角瓶中，塞棉塞，加牛皮纸札紧瓶口，放入高压灭菌器，用0.137Mpa、125℃保持20min。打开灭菌器用双层纱布将澄清液滤出，放入葡萄糖10g搅拌溶解。
[0053] 装瓶灭菌：取500ml三角瓶，装入上述培养基250ml，放入20粒左右玻璃球，加棉塞盖牛皮纸札紧瓶口，放入高压灭菌器，用0.137Mpa、125℃灭菌35min。
[0054] 3.接种培养：
[0055] 灭菌后的培养基，在无菌室内，按无菌操作规程，用移植铲将斜面母种接入瓶中约2cm2菌片菌丝面朝上，放在恒温箱内(21℃)静止培养24h后，用150r/min往复式摇床进行振荡培养。培养96h取样对菌种进行分析检测。
[0056] 4.合格菌种标准：
[0057] 菌液澄清不混浊，菌球多，形状一致，发育齐一。用手晃动三角瓶，浮起的菌球5min不下沉，能嗅到虫草
香味。菌种制成玻片标本，用显微镜检查，有无和虫草菌丝不一样的微生物。经过一系列的检测，将不被污染的菌种于第5d(发酵终了前1d)对蚕蛹进行注射接种。
[0058] 三、注射接种
[0059] 1.接种前准备：
[0060] 依据发菌室面积大小，按每m2摆栽培架一个，硬质塑料盘32个，装蚕蛹9600粒计算出一次栽培数量，用良叶饱食、蛹期微粒子病毒不超过5％、蛹期滞育天数40天以上的蚕茧做原料。蚕蛹接菌前2～3天割蚕茧，倒出蚕蛹，剔出头部变色蛹、(发育蛹)缩膛蛹、软蛹、翅盖不严蛹、伤蛹、死蛹一同埋掉，剩下的好蛹备。将发菌室
墙壁和天棚用石灰浆粉刷一遍，根据需要，栽培架、盛放蚕蛹塑料盘、出草塑料盒、出草罐头瓶先用1％消特灵水洗刷，2g/L溴氧水洗两次再用摆在室内备用。依据接种人员数目，每人准备10套一次性5ml的针管(带7号针头)，100ml大口三角瓶10个，洗刷干净，瓶口用高压塑料包好札紧，将上述用品用牛皮纸包好，用0.137Mpa灭菌35min备用。
[0061] 2.注射接种：
[0062] 在消毒室内将选好的蚕蛹用空气溴氧机(每小时发生10毫克溴氧)消毒35min，逐盘送入接种室。接种者在超净
工作台内，将大三角瓶内液体菌种倒入小三角瓶内，用带针头的针管吸取菌种，在蚕蛹翅膀和腹部环节交界处，与蛹体平行进针(向头部)，针尖稍向下倾斜，注入0.1ml菌种，(不可少于0.08ml大于0.15ml)，迅速与蛹体平行向后抽出针体(后手不可高抬，否则出血多)，把蚕蛹放在消过毒的塑料盘中，每人每小时约接种蚕蛹350个，接完种后将塑料盘送发菌室内发菌。
[0063] 四、菌丝培养
[0064] 1.低温避光培养：
[0065] 发菌室在使用前3d，用3％甲醛进行消毒，室外过道用1％消特灵水洗刷封闭地面，发菌室的门窗用窗帘(黑红布做)遮挡。将装蛹的塑料盘分层放在栽培架上发菌。发菌室的温度前3d控制在16℃左右，第3d～8d控制在18℃左右，湿度60％以上。蚕蛹逐渐开始僵化，把僵化好的蚕蛹随时挑出，集中放在塑料盘中，转入下一个室内继续培养，未僵化好的蚕蛹放在原发菌室。
[0066] 2.提温增菌，促进早熟：
[0067] 挑出来的僵
化蛹，送进另外一个发菌室，继续在避光的条件下发菌。所不同的是，温度提高，控制在21～22℃，湿度不变，这样再经过7～8d，促使菌丝后熟，尽早结束菌丝营养生长期，转向生殖生长阶段。判断营养生长转向生殖生长的主要标志：菌龄达15～17d；蛹体和环节间膜处长出白色菌丝；蛹顶由白色变成淡褐色，以上这三个指标，菌龄为参数，后两条必须具备，标志着营养生长结束，转向生殖生长阶段，就可转入诱导原基形成阶段。
[0068] 五、诱导原基形成与出草管理
[0069] 1.划口处理：
[0070] 将分批挑出的僵蛹用臭氧水消毒后晾干，在每个僵化好的蛹上三分之一处划三刀口，使蛹体内菌丝受到刺激，接受新鲜空气，促使原基形成的快。划口后的僵蛹不立即见光，放在温度21～22℃，湿度80％以上的暗室中3天，待僵蛹的环节及划口处长出白色菌丝，再装瓶见光出草。早长出，早上瓶；晚长出，晚上瓶，给出草齐一奠定可靠
基础。
[0071] 2.臭氧水蛹体表面消毒和上瓶、装盒：
[0072] 将菌丝营养生长结束的蚕蛹用2g/L臭氧水蛹体表面消毒10min控净表面自由水后在无菌室上瓶，每个白色透明塑料盒可放蚕蛹60个左右、无色罐头瓶可放蚕蛹7个左右，(以蚕蛹在塑料盒或罐头瓶内平放不重叠为宜)再用塑料簿膜做盖，皮筋做套复盖瓶口和用塑料簿膜套上塑料盒。将装有蚕蛹的塑料盒或罐头瓶送到出草室培养出草。
[0073] 3.出草室要求与管理：
[0074] 3.1出草室
窗户口要用黑布或牛皮纸遮光，屋内棚顶每个出草培养架上按一盏40W日光灯，每个出草培养架前面和后面直立按一盏40W日光灯。
[0075] 3.2出草培养架要单架排放，离墙20公分，过道间距40～50公分。
[0076] 3.3出草培养架尺寸(高2米、宽0.4米、长1米，间隔0.25米)要用无色玻璃做躺板。
[0077] 3.4上完瓶架的出草室要保持1昼夜黑暗，等第2天见光。以后每天早晨6点钟开灯、晚上21点关灯。
[0078] 3.5温湿度控制。长出黄色小芽，形成了原基阶段，白天保持20～21℃，夜间降温16～17℃。湿度保持在65％～70％左右，防止菌丝徒长。每天9点和15点各通
风一次，每次30min。
[0079] 3.6恒温出草。原基形成后室内昼夜温度控制在19～22℃，不可高于22℃或不可低于19℃；待蛹虫草长到1cm高时，可将室内的相对湿度调高到75％～80％，用
喷雾器地面喷水(水中加消毒剂)调湿。在保证室内温度条件下打开房门保证空气新鲜。这样经过15～17d，蛹虫草生长高度已接近瓶口，即可采收。
[0080] 六、采收、加工、保藏
[0081] 当子实体长到9～10cm高，表面出现许多小疙瘩和黄粉时要及时采收。采收时连蛹带草一起从罐头瓶和出草塑料盒中倒出，
整理干净，再把每个北冬虫夏草压50％子实体整齐排放在塑料秧盘上。整齐排放在塑料秧盘上的蛹虫草最好及时放入热风干燥室烘干，(塑料秧盘上的蛹虫草存放时间最长不能超过1天)热风干燥室用50±2℃的温度昼夜进行烘干，直至用手能捏碎蛹虫草成粉状为止。热风干燥好的蛹虫草整理平直后用塑料袋
真空包装，置于
通风、低温、干燥、避光条件下保存。
[0082] 实施例2
[0083] 我们于2011年10月20日-2012年5月20日进行了蛹虫草规模化工厂化生产，现将生产情况列表如下：
[0084] 表1 2011-2012年工厂化生产蛹虫草成绩表
[0085]
[0086] 2011年10月-2012年5月，
申请人在项目推广上，选择6户城镇下岗职工做为推广应用重点，液体菌种由公司提供，共投入原料茧(蛹)73.3万粒。其生产情况列表如下：
[0087] 表2 2011-2012年城镇职工生产蛹虫草情况表
[0088]
[0089] 由表1、2可看出，蛹虫草工厂化培育技术成熟，可靠实用其僵化率和出草率都超过了90％，2011-2012年工厂化生产北冬虫夏草6批、共投入原料茧758万粒(6.9万公斤)，其平均僵化率达92.7％，出草率92.2％，生产北冬虫夏草647万株，成品干草1.07万公斤。推广的六户职工，六批投蛹73.3万粒，其平均僵化率和出草率都达到90.4，％，共采草60.1万株，成品干草1200公斤。
