프로바이오틱 저장 및 전달{PROBIOTIC STORAGE AND DELIVERY}

본 발명은 위장계에서 선택된 부위로의 프로바이오틱 물질의 저장 및 전달에 관한 것이다.

프로바이오틱은 인간의 건강에 과학적으로 입증된 유익한 효과를 가지는 살아있는 미생물성 식품 성분이다. 프로바이오틱은 동물의 건강 또는 생산성을 개선하기 위해 동물의 사료에도 사용된다. 이들은 주로 배설물의 불괘한 냄새를 감소시키거나 농도를 개선시키기 위해 애완용 먹이에 사용된다.

시판되는 프로바이오틱 박테리아의 전세계적으로 주된 균주는 비피도박테리아 및 락토바실러스이다. 그러나, 기타 속(genera)의 박테리아도 지구촌 일부에서 사용된다. 예를 들어, 중국은 바실러스 및 클로스트리디움을 포함하는 다수의 기타 속을 사용한다. 엔테로코커스 파에시움도 전세계적으로 사용되나, 이 속은 항생제 내성의 전이와 관련이 있다. 서양에서는, 비피도박테리아 및 락토바실러스 모두 프로바이오틱으로서 사용해도 안전하며 허용가능한 속으로서 강하게 인식되어 있다. 기타 예들이 하기에 거론되어 있다: Mogensen, G., Salminen, S., O'Brien, J., Ouwehand, A., Holzapfel, W., Shortt, C., Fonden, R., Miller, GD., Donohue, D., Playne, M., Crittenden, R., Bianchi Salvadori, Bland R. Zink (2002) 식품 미생물 - 건강 유익성, 안정성 평가 및 식품에서의 사용을 문헌적 역사로 본 균주들, Internat, Dairy Federation Bulletin No: 377: 4-9, 및 Mogensen, G., Salminen, S., O'Brien, J., Ouwehand, A., Holzapfel, W., Shortt, C., Fonden, R., Miller, GD., Donohue, D., Playne, M., Crittenden, R., Bianchi-Salvadori, Bland R. Zink (2002), 식품에서의 사용을 문헌적 역사로 본 미생물 목록, Internat, Dairy Federation Bulletin No: 377: 10-19.

대부분의 건강 효과는 일반적인 대부분의 종들에 의해서가 아닌, 특정 균주에 의해 부여된다는 사실은 연구자들 및 의학 관계자들에게 널리 알려져 있다. 많은 연구진들이 제조, 식품에의 혼입, 장에서의 생존, 및 건강 특성을 위해 유용한 프로바이오틱 특성이 있는 균주를 선택하지만, 인간에서의 성능에 있어서 정보가 부족하다는 것이 상호 검토된 저널에 알려져 있다.

프로바이오틱 식품은 락토바실러스 및 비피도박테리아 모두의 선택된 균주를 포함해야 한다는 증거 사실이 증가하고 있다. 프로바이오틱 락토바실러스가 젊은 사람들 (유아의 장 미소 식물은 이미 자연적으로 비피도박테리아가 충분함)에게 유익하며, 프로바이오틱 비피도박테리아의 섭취는 중장년층에게 더욱 중요해졌다. 다수의 고유 비피도박테리아는 프로바이오틱이 사용되지 않으면 나이가 들어감에 따라 감소한다. 비피도박테리아는 락토바실러스 단독으로는 효과적으로 막아낼 수 없는 병원균에 대해 적당한 보호를 제공한다. 장의 적당한 부분에서 프로바이오틱 박테리아의 적절히 필요한 다수의 균주는 이들이 건강 차원에서 효과적이라면 필수적이다. 대부분의 권위자들은 음식의 그램 당 천만 박테리아가 적당한 식이요법 용량 으로 여기고 있다. 기술적으로, 이는 꽤 용이하게 달성될 수 있다. 그러나, 용량 반응 곡선은 임의의 건강 조건에 대한 프로바이오틱 균주에 대해서는 결과를 보이지 못하였다.

박테리아 수의 감소는 제조 과정, 동결 건조 및 저장 동안 발생한다. 그러나, 추가의 감소는 위장계를 통해 이동하는 동안 발생한다. 프로바이오틱 배양균 은 위에서 pH 1.2 (속이 빈 위) 내지 pH 5.0 범위의 위산을 만나게 된다. 배양균 은 위에서 대략 40 분 내지 5 시간 동안 머문다. 이들은 또한 위 및 소장에서, 박테리아를 죽일 수도 있는 담즙산염, 지방질분해, 가수분해 및 단백질분해 효소와 만나게 된다. 프로바이오틱 박테리아는 위장에서 보다 높은 pH 지역으로 도달해야 비로소 성장 또는 생존할 수 있게 된다. 이러한 지역은 회장(ileum) 및 창자이다. 이러한 이동 동안, 박테리아도 공간 및 영양분을 위해 고유의 박테리아와 경쟁해야 한다. 이들은 또한 통상의 연동 운동에 의해 씻겨 내려가는 것을 피해야하며, 기타 유기체에 의해 생성된 항미생물에 의해 사멸되는 것을 피해야 한다. 박테리아는 대장의 1/3 지점(근위부 대장)에서 이들의 가장 적합한 성장 조건을 가진다.

따라서, 장의 내부 점액층, 및 상피 세포벽과 같은 표면에의 고착 능력은 프로바이오틱의 중요한 특성이 된다. 사용된 용어 "전이증식(colonization)" 은, 박테리아가 위장의 영역에서 상시로 생존할 수 있는 기작을 가지고 있음을 의미한다. 이는 일반적으로 위장의 미소 식물은 성인에 있어서는 상대적으로 안정적이며, 장 생태계의 조건의 변화에 의해 쉽게 변화되지 않는 것으로 여겨진다.

이에 대한 예외는 항생제의 투여이지만, 이러한 경우라도 장 식물은 통상 비 슷한 종의 조성으로 잠시 후에 재 생성된다.

프로바이오틱 박테리아 작용의 기작은 하기를 포함한다:

·경쟁적 배제 (감염성 종에 의한 전이증식을 예방하기 위한 장 점액성 표면에서 적소의 위치 차지)

·산 조건의 생성 (낮은 장 pH 를 초래하는, 박테리아에 의한 락트산 발효)

·면역 매개 반응에 대한 영향

·부패성 및 유전자 독성의 장내 반응의 감소(낮은 기-발암성 물질 농도를 초래)

·박테리오신과 같은 항미생물의 방출.

많은 설사 질환은 소장의 기능 장애로부터 기인하지만, 프로바이오틱 박테리아는 일부 락토바실러스를 예외로 하고, 이러한 부위에서 다수로 발견되지 않는다. 건강한 인간으로부터 소장 부위의 미생물성 조성물에 대해 알 수 있는 직접적인 증거는 없다. 그러나, 설사 질환의 감소시키는 데 있어서 프로바이오틱 박테리아의 효용성은 아주 잘 정립되어 있다. 이들은 소장을 통한 이동에서 기능하거나, 면역 영향을 통해 작용한다. 대부분의 면역 반응은 대장이 아닌 소잔의 점액성 벽에서 발생하기에, 면역 조절이 작용의 기작으로 여겨지는 경우이면, 프로바이오틱은 소장에 존재해야 한다. 설사 장애의 다른 부위는 대장이다. 프로바이오틱 박테리아는 이 부위에서 꽤 용이하게 정립할 수 있다.

설사 장애 이외에, 프로바이오틱 박테리아는 락토스 과민성을 경감시키는데 효율적인데, 단, 박테리아는 높은 베타 갈락토시다아제 효소 기능을 가지는 것이 선택된다. 락토스 과민성은 창자에 명백히 영향을 미친다. 최근 생겨난 프로바이오틱에 대한 다수의 기타 건강 강조 표시(health claim)가 있다. 이들은 특히 창자 주변, 예를 들어 창자암, 과민성 장 증후군 및 염증성 장 질환(예컨대 크론병)을 중심으로 한다.

따라서, 소장의 나머지 절반에서의 프로바이오틱 락토바실러스의 방출이 바람직하다. 비피도박테리아의 방출은 통상 대장에서 일어나는 것을 목적으로 한다. 보다 큰 면역 반응은 락토바실러스 보다는 비피도박테리아와 일어나는 경향이 있어, 소장 부위에서 비피도박테리아가 아주 중요한 것인지에 대해서는 논쟁의 여지가 있다.

박테리아는 충분한 수(일부의 락토바실러스는 예외)로 장벽에 고착할 수 없기 때문에, 목표 부위가 소장에 있는 경우 프로바이오틱의 일일 소모는 필수적이다. 그러나, 일일 소모는 박테리아의 성장 및 전이증식이 발생할 수 있기 때문에, 목표 부위가 대장인 경우에는 필수적이지 않을 수 있다.

질환 및 기타 조건에 대한 효율성의 양호한 특성을 가지는 프로바이오틱 박테리아는 양호한 생존 특성(예를 들어 낮은 pH, 담즙산염, 단백질분해 및 가수분해 효소에 대한 내성, 항생제에 대한 내성, 세포벽 고착)을 가지지 않을 수 있다. 목표 부위로 이동하는 동안에 박테리아의 보호는 통상 필수적이다.

보호는 여러 방법으로 달성될 수 있다: 서방형 약학 화합물로의 캡슐화; 고무질 또는 알지네이트(alginate)로의 캡슐화; 난소화성 전분 또는 고무질과 조합된 이눌린으로의 캡슐화; 난소화성 전분을 포함하는 식품에 포함시킴에 의한 보호; 또 는 단백질과 지방이 일부 보호를 제공할 수 있는 낙농 식품.

USA 특허 5422121 은 친수성기를 가지는 막 형성 중합체 및 결장으로 투여량을 전달하는 데 유용한 결장에서 분해가능한 다당류를 포함하는 코팅을 개시한다.

USA 특허 5840860 은 단쇄 지방산을 탄수화물 담체에 공유결합시켜 결장으로 전달하는 것에 대해 개시한다.

USA 특허 6060050 은 비피도박테리아와 같은 프로바이오틱 박테리아와 위장계의 대장 또는 기타 부위에서 성장 또는 유지 매질로서도 작용할 수 있는 담체로서 고아밀로스 함유 전분의 조합을 개시한다.

USA 특허 출원 20030096002 는 미생물의 제어된 방출에서의 사용을 위한 매트릭스를 개시한다. 매트릭스는 소수성 왁스 및, 다당류, 전분, 조류 유도체 또는 중합체로부터 선택된 방출 조절제로 형성된다.

USA 특허 6413494 는 펙틴과 같은 다당류로 이루어진 결장성 약물 전달 비히클을 개시한다.

일부 프로바이오틱은 가공 뿐만 아니라 위장계로의 전달 동안 보호를 필요로 한다. 이들은 물 또는 산소 민감성이며 저장 가공 및 운송 동안 생존을 유지하기 위해 보호를 필요로 한다.

유럽 특허 1213347 는 효모 및 미생물을 물을 흡수하는 매트릭스 물질과 혼합함으로써 건조 및 보존하는 방법을 개시한다.

본 발명의 목적은 프로바이오틱을 가공 및 저장 동안 변형으로부터 보호하고 이들을 위장계 내의 특정 부위로 전달시킬 수 있게 하기 위해 프로바이오틱을 캡슐 화하는 방법을 제공한다.

발명의 개요

이러한 목적을 위하여 본 발명은 하나 이상의 프로바이오틱 미생물이

a) 단백질 및 탄수화물의 수성 현탁액

b) 막 형성 단백질 및 탄수화물 및 지방의 수중유 에멀전, 또는

c) 막 형성 단백질 및 탄수화물에 후속 분산된 오일

중에 분산된, 프로바이오틱 박테리아 제제를 제공한다.

현탁액, 분산액 또는 에멀전은 건조되어 분말로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 프로바이오틱이란 용어는 장의 목표 부위에 바람직하게는 살아있는 상태로 전달되었을 경우, 인간 건강 상에 유익한 효과를 나타내는 별개 또는 조합의 박테리아 또는 진균류와 같은 미생물을 포함하는 것으로 의도된다. 예로서는 비피도 박테리아, 락토바실러스, 사카로마이세스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 프로피오니박테리아 및 숙주에 유익한 효과를 주는 것으로 증명될 수 있는 임의의 기타 미생물을 포함한다. 프로바이오틱은 선생물적(prebiotic) 물질과 혼합될 수 있거나 또는 공생 또는 합성 생물 물질의 일부일 수 있다.

본 명세서에서 선생물적이라는 용어는 프로바이오틱을 위한 영양분을 제공하거나 프로바이오틱을 보조하는 단백질, 펩티드, 또는 탄수화물과 같은 물질을 의미한다. 예를 들어 락토페린은 목적하는 박테리아의 성장을 향상시킬 수 있다. 보통 선생물은 장기의 상부에서는 소화될 수 없다. 선생물적 탄수화물은 난소화성 전분, 감자 전분 또는 스타플러스와 같은 고아밀로스 함유 전분, 개질된 전분 (카르복실화 전분, 아세틸화, 프로피오네이트화, 및 부티르화 전분 포함), 비-소화성 올리고당 예컨대 프럭토-, 글루코-, 자일로-, 대두(soyabean)-, 갈락토-, 유(milk)-, 이눌린-, 아라비노갈락탄, 갈락토마난 또는 이들의 소화 생성물을 포함하나, 선생물적 영향을 낼 수 있는 기타 올리고당을 배제하지는 않는다.

본 명세서에서 공생 또는 합성 생물이라는 용어는 인간 건강 상에 시너지성의 유익한 효과를 함께 가지는 프로바이오틱 및 선생물적의 조합을 의미한다.

프로바이오틱 박테리아는 농축액 또는 동결 건조 형태로서 캡슐화 매질에 주입될 수 있다. 프로바이오틱 박테리아는 오일 중에 분산된 후 수성 현탁액으로 에멀전화 된 후 프로바이오틱을 수반하는 캡슐화된 오일로서 제조될 수 있다. 이는 또한 건조되어 분말로도 제조될 수 있다. 임의의 적절한 건조 기술 예컨대 분무 건조, 동결 건조 또는 굴절창 건조(refractive windows drying)가 사용될 수 있다. 오일 현탁된 프로바이오틱은 프로바이오틱이 수분 민감성인 곳에 바람직할 수 있다. 오일은 바람직하게는 식용 오일이며 에멀전 또는 에멀전을 건조시켜 수득된 분말은 식품 성분 뿐만 아니라 식사 보충물로서 사용될 수 있다.

탄수화물 및 막 형성 단백질의 수성 현탁액 또는 막 형성 단백질 탄수화물 및 오일 혼합물의 에멀전은 캡슐화 단계 이전에 가열하여 당류와 단백질 성분을 반응시킬 수 있다. 당류가 환원당 기를 가지는 경우, 가열 단계는 마일라드(Maillard) 반응 생성물을 생성할 수 있다. 프로바이오틱이 산소 민감성인 경우 가열된 수성 현탁액이 바람직하다.

본 발명의 캡슐화물은 안정된 프로바이오틱을 포함하는 강건한 막 또는 매트릭스를 형성하거나, 프로바이오틱 또는 오일 액적 주변에 막을 형성한다.

오일을 캡슐화하는데 유용한 임의의 단백질은 본 발명의 단백질 성분으로서 사용될 수 있다. 탄수화물은 단백질과 조합된다. 수성 현탁액에서 단백질은 프로바이오틱에 대해서 캡슐화 매트릭스를 형성하기 때문에 막 형성 단백질일 필요는 없다. 그러나 오일을 기초로 한 계에서는 막 형성 단백질이 요구된다.

단백질은 바람직하게는 가용성이며 바람직하게는 마일라드 반응의 가열 범위 내에서 안정하고, 카세인, 대두 및 유장 단백질, 젤라틴, 계란 알부민 및 대두 단백질 가수분해물을 포함하는 증가된 유리 아미노산 기로 가수분해된 단백질을 포함한다. 단백질 및 탄수화물을 반응시킬 때는 반응 조건이 단백질의 겔화 또는 응집화를 초래하지 않도록 주의가 필요한데, 이렇게 되면 단백질은 효과적인 막을 형성할 수 없게 된다. 바람직한 단백질은 유 단백질, 특히 카세인 또는 유장 단백질 단리물이다. 카세인은 저가이며, 예를 들어 마일라드 반응 생성물을 형성하기 위한 임의의 열처리 동안 겔화에 대한 큰 내성 때문에 다수의 경우에서 바람직한 단백질이다. 유아 식품 적용에 있어서, 유장 단백질은 바람직한 단백질 공급원이다. 단백질-탄수화물 혼합물 내의 마일라드 반응 생성물의 양은 생성물의 저장 기간 동안 산소 청소 활성을 제공하는데 충분한 양이다. 캡슐화 이전에 단백질과 탄수화물 사이에 요구되는 최소 반응은 캡슐화된 특정 프로바이오틱 균주의 산소 내성에 의존할 것이다. 형성된 마일라드 반응 생성물의 정도는 특히 단백질/탄수화물 조합에 대하여, 발생하는 색 변화 정도에 의해 모니터될 수 있다. 대안적인 측정은 미반응된 당을 분석하는 것이다.

프로바이오틱 박테리아를 위한 효율적인 캡슐화물이 되기 위해 탄수화물 및 단백질이 마일라드 반응을 거치는 것은 필수적인 것은 아니다. 단백질 및 전분을 혼합함에 있어서, 물질들 특히 탄수화물의 미세유동화가 제제의 효율성을 향상시킨다는 것이 밝혀졌다.

바람직한 탄수화물은 단당류 (예. 글루코스, 프럭토스), 이당류 (예. 말토스, 락토스), 삼당류, 올리고당 및 글루코스 시럽으로 이루어진 군으로부터 바람직하게 선택되는 환원기를 가지는 당이다. 벌꿀을 포함하는 임의의 환원당 공급원이 사용될 수 있다. 단백질과 마일라드 반응을 거치지 않은 탄수화물도 사용될 수 있다.

내장 및 결장에서 프로바이오틱의 성장 및 전달을 개선하기 위해 올리고당, 또는 난소화성 전분을 포함하는 전분을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다. 일부 이러한 물질들은 통상 장기 상부에서는 소화되지 않으며 프로바이오틱의 성장을 보조한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명의 바람직한 구체예를 서술할 것이다.

도면에서, 도 1은 분무 건조 동안의 비피도박테리엄 인판티스의 생존을 도식적으로 나타내며;

도 2는 분무 건조 동안의 비피도박테리엄 락티스 Bb-12의 생존을 도식적으로 나타내고;

도 3은 분무 건조 동안의 락토바실러스 아시도필러스 La-5의 생존을 도식적으로 나타내며;

도 4는 위장 이동 시뮬레이션 동안의 비피도박테리엄 인판티스의 생존을 도식적으로 나타내고;

도 5는 25℃ 및 50% 상대습도에서 2주 동안 저장한 후의 비피도박테리엄 인판티스의 생존을 도식적으로 나타내며;

도 6은 25℃ 및 50% 상대습도에서 5주 동안 저장한 후의 비피도박테리엄 인판티스의 생존을 도식적으로 나타내고;

도 7은 25℃ 및 50% 상대습도에서 5주 동안 저장한 후의 비피도박테리엄 락티스 Bb-12의 생존을 도식적으로 나타내며;

도 8은 pH 4.0에서 2 시간 동안 항온 배양한 후의 비피도박테리엄 인판티스의 생존을 도식적으로 나타낸다.

재료

본 실시예에 사용된 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리아 및 락토바실러스이나, 다른 종의 프로바이오틱 박테리아 및 블렌드도 동일한 방법에 의해 캡슐화될 수 있다.

프로바이오틱 락토바실러스 아시도필러스 La-5(Chr. Hansen, Denmark) 및 환경 조건에 대해 선천적으로 상이한 허용성을 가지는 2 종의 프로바이오틱 비피도박테리아를 마이크로캡슐화 기술의 이점을 평가하는데 사용하였다. 비피도박테리엄 락티스 Bb-12(Chr. Hansen, Denmark)은 낮은 pH, 및 상대적으로 높은 공기내성을 비롯하여, 환경 조건에 대해 상대적으로 높은 허용성을 가지는 상대적으로 강건한 프로바이오틱 종이다. 비피도박테리엄 인판티스(Chr. Hansen, Denmark)는 비피도박테리엄 락티스 Bb-12와 비교하여 상대적으로 환경 조건에 민감하다.

본 실시예에 사용된 단백질은 주로 카세인이나, 제제 중 단백질은 유장 단백질, 대두 단백질, 가수분해된 단백질 등과 같은 다른 단백질로 쉽게 대체될 수 있다.

본 실시예에 사용되는 탄수화물에는, 글루코스, 올리고당, 건조 글루코스 시럽, 난소화성 전분 및 예비가공된 전분이 포함된다. 락토스, 다당류, 말토덱스트린, 천연 전분, 변성 전분 등과 같은 다른 탄수화물도 제제 중에 사용될 수 있다. 지질(식물성유 및 동물성유, 디- 및 트리-글리세라이드, n3- 및 n6-오일 등).

사용된 마이크로캡술화 전략

전략 1 : 반응 또는 미반응된 단백질 및 탄수화물의 수성 현탁액 중의 프로바이오틱 박테리아.

ㅇ 단백질-탄수화물 용액의 혼합물을 60℃에서 준비(이때, 탄수화물은 난소화성 전분을 포함하며, 전분은 그대로 사용되거나 미세유동화에 의해 예비가공될 수 있음). 이 혼합물을 98℃에서 30분 동안 가열. 10℃까지 냉각. 혼합기를 사용하여 동결 건조 박테리아 또는 농축물을 반응된 용액에 분산시킴. 120-160℃ T _i 및/50-70℃ T _o 에서 분무 건조.

ㅇ 단백질-탄수화물 용액의 혼합물을 60℃에서 준비(이때, 탄수화물은 난소화성 전분을 포함하며, 전분은 그대로 사용되거나 미세유동화에 의해 예비가공될 수 있음). 10℃까지 냉각. 혼합기를 사용하여 동결 건조 박테리아 또는 농축물을 이 용액에 분산시킴. 120-160℃ T _i 및/50-70℃ T _o 에서 분무 건조.

전략 2: 막 형성 단백질 및 탄수화물 및 지방의 반응 또는 미반응 유중수 에멀전 중의 프로바이오틱 박테리아.

ㅇ 단백질-탄수화물 용액의 혼합물을 60℃에서 준비(이때, 탄수화물은 난소화성 전분을 포함하며, 전분은 그대로 사용되거나 미세유동화에 의해 예비가공될 수 있음)하고, 오일을 첨가하여 혼합물을 350 bar 에서 균질화. 균질화된 혼합물을 98℃에서 30분 동안 가열. 10℃까지 냉각. 혼합기를 사용하여 동결 건조 박테리아를 반응된 혼합물에 분산시킴. 120-160℃ T _i 및/50-70℃ T _o 에서 분무 건조.

ㅇ 단백질-탄수화물 용액의 혼합물을 60℃에서 준비(이때, 탄수화물은 난소화성 전분을 포함하며, 전분은 그대로 사용되거나 미세유동화에 의해 예비가공될 수 있음)하고, 오일을 첨가하여 혼합물을 250 bar 에서 균질화. 10℃까지 냉각. 혼합기를 사용하여 동결 건조 박테리아를 이 혼합물에 분산시킴. 120-160℃ T _i 및/50-70℃ T _o 에서 분무 건조.

전략 3: 반응 또는 미반응 막 형성 단백질 및 탄수화물에 후속 분산된 오일 중의 프로바이오틱 박테리아.

ㅇ 단백질-탄수화물 용액의 혼합물을 60℃에서 준비(이때, 탄수화물은 난소 화성 전분을 포함하며, 전분은 그대로 사용되거나 미세유동화에 의해 예비가공될 수 있음). 혼합물을 98℃에서 30분 동안 가열. 10℃까지 냉각. 오일 중에 동결 건조된 박테리아를 분산시킴. 혼합기를 사용하여 동결 건조 박테리아 분산물을 반응된 용액에 첨가함. 120-160℃ T _i 및/50-70℃ T _o 에서 분무 건조.

ㅇ 단백질-탄수화물 용액의 혼합물을 60℃에서 준비(이때, 탄수화물은 난소화성 전분을 포함하며, 전분은 그대로 사용되거나 미세유동화에 의해 예비가공될 수 있음). 10℃까지 냉각. 오일 중에 동결 건조된 박테리아를 분산시킴. 혼합기를 사용하여 동결 건조 박테리아 분산물을 이 용액에 첨가함. 120-160℃ T _i 및/50-70℃ T _o 에서 분무 건조.

가공 및 제제 실시예

전략 1

실시예 1 (캡슐화:단백질-당).

단백질-당 매트릭스 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 소듐 카세이네이트, 올리고당 및 건조 글루코스 시럽(Cas-oligo-DGS) 용액을 함유하는 혼합물을 준비. 10℃로 냉각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 용액에 분산시킴. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 2 (캡슐화:단백질-당 MRP)

가열 반응된 단백질-당 매트릭스 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 소듐 카세이네이트, 올리고당 및 건조 글루코스 시럽(Cas-oligo-DGS) 용액을 함유하는 혼합물을 준비. 이 혼합물을 98℃에서 30분 동안 가열. 10℃로 냉각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 반응된 용액에 분산시킴. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 3 (캡슐화:단백질-당-RS(Raw))

단백질-당-고아밀로스 함유 전분 매트릭스 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 15% w/w 소듐 카세이네이트를 준비하고, 당을 첨가. 60℃에서 10% w/w Hylon VII 분산액을 준비. 소듐 카세이네이트-당 용액과 Hylon VII 분산액을 서로 혼합. 10℃로 냉각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 단백질-당-전분 혼합물에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 4 (캡슐화:단백질-당-RS(MF))

단백질-당-미세유동화된 고아밀로스 함유 전분 매트릭스 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 15% w/w 소듐 카세이네이트를 준비하고, 당을 첨가. 60℃에서 20% w/w Hylon VII 분산액을 준비하고, 121℃에서 60분 동안 가열한 후, 냉각하고, 10% w/w 총고형 함량이 되도록 잔여 물을 첨가한 후, 800 bar x 3 통과(pass)로 미세유동화. 단백질-당 용액을 미세유동화된 Hylon VII 분산액과 함께 혼합. 10℃로 냉 각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 단백질-당-전분 혼합물에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

전략 2

실시예 5 (캡슐화:단백질-당-오일 에멀전).

단백질-당-오일 에멀전 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 소듐 카세이네이트, 올리고당 및 건조 글루코스 시럽(Cas-oligo-DGS) 용액을 함유하는 혼합물을 준비하고, 혼합기를 사용하여 오일을 첨가한 후, 250 bar에서 균질화시킴. 10℃로 냉각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 에멀전에 분산시킴. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 6 (캡슐화:단백질-당-오일 MRP 에멀전)

가열 반응된 단백질-당-오일 에멀전 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 소듐 카세이네이트, 올리고당 및 건조 글루코스 시럽(Cas-oligo-DGS) 용액을 함유하는 혼합물을 준비하고, 오일을 첨가한 후, 250 bar에서 균질화시킴. 이 에멀전을 98℃에서 30분 동안 가열. 10℃로 냉각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 에멀전에 분산시킴. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 7 (캡슐화: 단백질-당-RS(MF)-오일 에멀전)

단백질-당-미세유동화된 고아밀로스 함유 전분-오일 매트릭스 중에 캡슐화된 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 15% w/w 단백질 용액을 준비하고, 당을 첨가. 60℃에서 20% w/w Hylon VII 분산액을 준비하고, 121℃에서 60분 동안 가열한 후, 냉각하고, 10% w/w 총고형 함량이 되도록 잔여 물을 첨가한 후, 800 bar x 3 통과로 미세유동화. 단백 질-당 용액을 미세유동화된 Hylon VII 분산액과 함께 혼합. 오일을 첨가하고, 250 bar에서 균질화시킴. 10℃로 냉각. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아를 이 에멀전에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

전략 3

실시예 8 (캡슐화:(오일 중) 단백질-당).

단백질-당 매트릭스 중에 캡슐화되며 오일 중에 존재하는 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 소듐 카세이네이트, 올리고당 및 건조 글루코스 시럽(Cas-oligo-DGS) 용액을 함유하는 혼합물을 준비. 10℃로 냉각. 오일 중에 동결건조된 박테리아를 분산시킴. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아 분산액을 이 용액에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 9 (캡슐화:(오일 중) 단백질-당 MRP)

가열 반응된 단백질-당 매트릭스 중에 캡슐화되며 오일 중에 존재하는 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 소듐 카세이네이트, 올리고당 및 건조 글루코스 시럽(Cas-oligo-DGS) 용액을 함유하는 혼합물을 준비. 98℃에서 30분 동안 가열. 10℃로 냉각. 오일 중에 동결건조된 박테리아를 분산시킴. 혼합기를 사용하여 비피도 박테리아 Bb12 분산액을 이 용액에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 10 (캡슐화:(오일 중)단백질-RS(Raw))

단백질-당-고아밀로스 함유 전분 매트릭스 중에 캡슐화되며 오일 중에 존재하는 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 15% w/w 소듐 카세이네이트를 준비. 60℃에서 10% w/w Hylon VII 분산액을 준비. 소듐 카세이네이트 용액과 Hylon VII 분산액을 서로 혼합. 10℃로 냉각. 동결건조된 박테리아를 오일 중에 분산시킴. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아 분산액을 이 단백질-전분 혼합물에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 11 (캡슐화:(오일 중)단백질-RS(MF))

단백질-미세유동화된 고아밀로스 함유 전분 매트릭스 중에 캡슐화되며 오일 중에 존재하는 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 15% w/w 소듐 카세이네이트를 준비. 60℃에서 20% w/w Hylon VII 분산액을 준비하고, 121℃에서 60분 동안 가열한 후, 냉각하고, 10% w/w 총고형 함량이 되도록 잔여 물을 첨가한 후, 800 bar에서 미세유동화. 소듐 카세이네이트 용액을 미세유동화된 Hylon VII 분산액과 함께 혼합. 10℃로 냉각. 동결건조된 박테리아를 오일 중에 분산시킴. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아 분산액을 이 단백질-전분 혼합물에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

실시예 12 (캡슐화:(오일 중) 단백질-당-RS(MF))

단백질-당-미세유동화된 고아밀로스 함유 전분 매트릭스 중에 캡슐화되며 오일 중에 존재하는 동결 건조 프로바이오틱 박테리아

가공 단계

60℃에서 15% w/w 소듐 카세이네이트를 준비하고, 당을 첨가. 60℃에서 20% w/w Hylon VII 분산액을 준비하고, 121℃에서 60분 동안 가열한 후, 냉각하고, 10% w/w 총고형 함량이 되도록 잔여 물을 첨가한 후, 800 bar x 3 통과로 미세유동화. 단백질-당 용액을 미세유동화된 Hylon VII 분산액과 함께 혼합. 10℃로 냉각. 동결건조된 박테리아를 오일 중에 분산시킴. 혼합기를 사용하여 동결건조된 박테리아 분산액을 이 단백질-당-전분 혼합물에 첨가. 160/65℃ T _i /T _o 에서 분무 건조.

박테리아 생존 능력의 평가

생존가능한 박테리아를 세기 위해, 인공 장액(Simulated Intestinal Fluid, SIF, 이후 기술됨) 또는 탈이온수(DI) 중에 캡슐 물질을 용해시켜 마이크로캡슐로부터 프로바이오틱을 방출시켰다. 1.0 g 샘플의 분무 건조된 캡슐화 물질을 10 ml의 SIF 또는 DI와 혼합하고 샘플을 100 rpm 에서 계속 혼합하면서 37℃에서 1-2시간 배양하였다(2회 실시). 방출된 생존 가능 박테리아의 세수는 통상의 미생물학 플레이팅 방법을 사용하여 수행하였다. 방출된 박테리아의 10배 연속 희석을 0.1% 펩톤 (pH 6.9-7.0) 중에서 수행하였다. 샘플 중 오일로부터 박테리아의 분산을 촉진시키기 위해 Tween 80 (100 ㎕)를 볼텍싱 전에 모든 샘플의 제1 희석액에 첨가하였다. 비피도박테리아를 강화 클로스트리디알 아가(Reinforced Clostridial Agar, RCA) 상에서 배양하고 락토바실러스를 MRS (de Man, Rogosa 및 Sharpe) 아가 상에서 성장시켰다. 아가 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양하고 및 CFU/g(캡슐화된 물질)을 측정하였다. 생존율을 하기와 같이 계산하였다:

생존율 = (처리후 CFU/g ÷ 초기 CFU/g) x 100%

프로바이오틱 박테리아의 생존에 대한 마이크로캡슐화 처리의 장점은 하기 네 부문에 대해 검사되었다:

분무 건조 동안의 생존

위장계 이동 동안의 생존(및 방출)

비냉장 저장 동안의 생존

낮은 pH 에서의 생존

분무 건조 동안의 마이크로캡슐화의 장점

이전에 언급된 3개의 프로바이오틱 박테리아 균주를 실시예에서 사용된 기술을 사용하여 마이크로캡슐화하고 분무 건조하였다. 분무 건조에서 생존한 프로바이오틱 박테리아의 퍼센트는 각 마이크로캡슐화 기술에 대해 측정하였다. 비피도박테리움 인판티스에 대하여, 박테리아의 재현탁된 동결 건조 샘플을 분무 건조하여 분무 건조 동안 캡슐화되고 재현탁된 동결 건조 박테리아의 비교를 제공할 수 있었다.

도 1 은 비캡슐화된 박테리아와 비교하여 분무 건조 동안 모든 3개의 마이크로캡슐화 전략이 프로바이오틱을 보호하고 있음을 보여준다(도 1의 "비캡슐화" 는 동결 건조 프로바이오틱 샘플이 물에 분산되어 분무 건조됨을 의미함)

마이크로캡슐화는 실질적으로 분무 건조 동안 프로바이오틱 비피도박테리움의 생존성을 보호한다.

전략 1 은 분무 건조 동안 비피도박테리움 인판티스에게 최적인 것으로 보인다.

프로바이오틱의 생존에 있어서 3 이상의 크기 정도(orders of magnitude, 3 log ₁₀ 유닛)의 향상이 상기 민감성 균주로 달성되었다.

도 2 는 비피도박테리움 락티스 Bb-12 의 생존이 일반적으로 민감성 비피도박테리움 인판티스 균주보다 일반적으로 아주 높음을 보여준다.

다수의 마이크로캡슐화 처리는 비피도박테리움 락티스 Bb-12 의 생존을 동일한 크기 정도(1 log ₁₀ 미만의 생존성 강하)로 유지시키게 해준다.

비피도박테리움 락티스 Bb-12 의 생존성을 보호하기 위한 전략 3 내에서의 처리들 사이의 이들의 능력의 차이가 관찰되었다.

물 중에 재현탁된 동결 건조된 비피도박테리움 락티스 Bb-12 는 동결 건조될수 없기 때문에, 상기 균주에 대해 동결 건조 동안 캡슐화의 효과를 비교하는 것이 가능하지 않았다.

도 3 은 다수의 캡슐화 처리에 대해 분무 건조 동안 락토바실러스 아시도필러스 La-5 의 생존이 잘 유지됨을 보여준다.

많은 캡슐화 처리는 가장 효율적인 처리에서 균주간 변화정도를 가지며 분무 건조 동안 생존율 50% 이상으로 유지되는 것을 허용한다.

종합적으로, 도 1 은 사용된 캡슐화 전략이 분무 건조 동안 보호해줌을 보여주며, 도 2 및 3 은 비피도박테리움 락티스 Bb-12 및 락토바실러스 아시도필러스 La-5 의 생존성이 분무 건조 후에도 크게 완전한 상태로 유지됨을 보여준다.

위장계 이동 동안 마이크로캡슐화의 장점

위장계 이동 동안의 생존을 시뮬레이션하기 위해, 마이크로캡슐화 및 비마이크로캡슐화 프로바이오틱 박테리아를 위장 및 소장에서 2단계의 시험관 내 모델 ㅅ시뮬레이션 조건을 통과시켰다. 각각의 분무 건조된 캡슐화 처리의 1.0 g 샘플을 10 ml의 인공 위장액(Simulated Gastric Fluid, SGF)에 혼합하고 100 rpm에서 일정하게 교반하면서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 후, 샘플의 pH를 1 M 수산화나트륨 (생세포의 가능한 손상을 막기 위해 적가함)을 이용하여 6.8 로 조절한 후, 10 ml의 SIF를 100 rpm에서 일정하게 교반하면서 37℃에서 3시간 동안 추가로 배양된 상기 pH-조절된 샘플에 첨가하였다. 이후 박테리아의 생존 세수를 측정하였다.

SGF 및 SIF 를 하기와 같이 제조하였다 (참조: 미국 약전서 (2000) & 미 전국 의약품 장전 (USP 24NF19, Rockville MD):

인공 위장액 ( SGF )( pH 1.2)

염화나트륨 (1.0 g), 1.6 g의 펩신, 및 3.5 ml의 농축 HCI (36%)를 탈이온수에 용해시켜 최종 부피를 500 ml로 하였다. 용액의 최종 pH 는 1.2 였다.

인공 장액 ( SIF )( pH 6.8)

인산수소칼륨 3.4 g을 450 ml의 탈이온수 중에 용해시켜 제조하였다. 여기에, 38.5 ml의 0.2 M 수산화나트륨 및 6.25 g의 판크레아틴 (8xUSP 등급)을 첨가하였다. 용액을 4℃에서 밤새 혼합하고 pH 를 1 M 수산화나트륨 또는 0.2 M 염산으로 6.8 로 조절하였다. 탈이온수로 부피를 500 ml 까지 하였다.

도 4 는 3개의 모든 마이크로캡슐화 전략이 균주의 생존성을 향상시킴을 보여준다 ("비캡슐화 (동결 건조)" 는 도 4 및 모든 후속 도면에서의 동결 건조 프로바이오틱 샘플을 의미함).

마이크로캡슐화는 실질적으로 분무 건조 동안 비캡슐화 동결 건조 박테리아와 비교하여 프로바이오틱 비피도박테리움 인판티스의 생존성을 보호한다.

전략 2 및 3 이 가장 보호적이었다.

동일한 조건 하에 거의 4 크기 정도(4 log ₁₀ 유닛)로 강하된 생존성의 비캡 슐화된 박테리아와 비교하여, 캡슐화에 의해 상기 민감성 프로바이오틱 균주의 거의 100%의 생존이 달성되었다.

비냉장 저장 동안의 마이크로캡슐화의 장점

캡슐화 및 비캡슐화 프로바이오틱 박테리아에 있어서 25℃ 및 50% 상대습도에서 5주 저장 동안 그 생존성에 대해 평가하였다.

박테리아의 생존성은 2주 및 5주 후에 평가하였다. 생존 세수를 상기 기술한 바와 같이 수득하였다.

도 5 는 모든 3개의 마이크로캡슐화 전략이 25℃-50% RH 에서 저장 2주 후에 어느 정도 균주의 생존성을 보호한다는 것을 보여준다("비캡슐화 (동결 건조)" 는 도 4 및 모든 후속 도면에서의 동결 건조 프로바이오틱 샘플을 의미함).

마이크로캡슐화는 실질적으로 비냉장 저장 동안 비캡슐화 동결 건조 박테리아와 비교하여 프로바이오틱 비피도박테리움 인판티스의 생존성을 보호한다.

전략 2 및 3 이 가장 보호적이었다.

산소와 같은 환경 조건에 민감한 종으로부터, 상기 프로바이오틱 균주의 생존성은 일부 처리를 사용한 비냉장 조건에서 2주 동안 동일한 크기 정도(1 log ₁₀ 유닛 미만의 강하) 내에 유지되었다.

반대로, 비캡슐화된 동결 건조 박테리아의 생존성은 5 크기 정도 이상으로 감소되었다.

도 6 은 마이크로캡슐화가 실질적으로 비냉장 저장 동안 비캡슐화 동결 건조 박테리아와 비교하여 프로바이오틱 비피도박테리움 인판티스의 생존성을 보호한다는 것을 보여준다. 5주의 저장 후, 전략 2를 포함하는 처리 및 단백질-RS(MF)의 캡슐화 (전략 1)가 비피도박테리움 인판티스의 생존을 유지하는데 있어서 가장 성공적이었다.

25℃ 및 50% 상대습도에서 5주 동안 저장 후, 전략 2를 사용한 박테리아의 마이크로캡슐화는 비캡슐화된 박테리아에 대해 측정된 생존 세수의 8 log ₁₀ 유닛 이상의 강하와 비교하여, 2 log ₁₀ 유닛 미만에서 생존 세수 손실이 유지될 수 있게 하였다.

도 7 은 모든 3개의 마이크로캡슐화 전략이 비캡슐화 박테리아보다 보다 큰 정도로 25℃ 및 50% 상대습도에서 5주 저장 동안 균주의 생존성을 보호하는 것을 보여준다.

마이크로캡슐화는 실질적으로 비냉장 저장 동안 비캡슐화 동결 건조 박테리아와 비교하여 프로바이오틱 비피도박테리움 락티스 Bb-12 의 생존성을 보호한다. 2주 저장에서 비캡슐화된 박테리아의 생존성은 1000 CFU/g의 관측 한계 미만이었다. 이 시점에서 비캡슐화 동결 건조 박테리아에 대해 기술된 생존율은 따라서 최대로 가능한 생존율을 나타내며 이는 지나친 어림 짐작일 수 있다.

5주 후 생존율의 관점에서 유익성은 2 내지 4 log ₁₀ 유닛이었다.

낮은 pH 환경에서 마이크로캡슐화의 장점

적당히 낮은 pH 에 대해 박테리아를 보호하는 마이크로캡슐화의 능력을 예로 서 pH 4.0 에서 배양을 이용하여 평가하였다. 캡슐화 분무 건조 및 비캡슐화 동결 건조 프로바이오틱 박테리아 (0.12 g 동결 건조 분말 당량)를 pH 4.0 에서 10 mL의 0.2 M 아세테이트 버퍼 중에 혼합하고 100 rpm 으로 일정하게 교반하면서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간의 배양 후, 샘플의 pH 를 1 M 수산화나트륨을 이용하여 6.8 로 조절하고 37℃ (실온)에서 추가로 1시간 동안 배양하여 캡슐로부터 박테리아의 방출을 유효화하였다. 샘플 내의 박테리아 생존 세수를 상기 기술한 바와 같이 측정하였다.

도 8 은 모든 3개의 마이크로캡슐화 전략이 pH 4.0 에서 배양 후 평균 2-3 log 의 생존성 향상을 제공하면서, 어느 정도 균주의 생존성을 보호하는 것을 보여준다 ("비캡슐화:동결 건조" 는 동결 건조된 프로바이오틱 샘플)

마이크로캡슐화는 실질적으로 비캡슐화 동결 건조 박테리아와 비교하여 프로바이오틱 비피도박테리움 인판티스의 생존성을 보호한다.

당업자는 본 발명이 본 발명의 기본적인 교시를 벗어나지 않고 상기 기술된 것과 다른 구체예로서 실현될 수 있음을 알 것이다.