本发明涉及制备含α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)的溶液的方法，并涉及A1AT。

A1AT是分子量约55,000道尔顿的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。A1AT 可抑制多种蛋白酶如胰蛋白酶的活性，该抑制剂的名字基于胰蛋白酶是由于历史原 因。生理上，弹性蛋白酶是靶蛋白酶，参与尤其是组织与基质重构和降解过程，并由 细胞如颗粒细胞释放并因此参与炎症过程。弹性蛋白酶活性的持续时间在时间和空间 上受到抑制剂A1AT限制并基本受其调节。这种活性的失调导致组织迅速降解并可以 有病理生理后果。此外，启动和/或促进炎症过程。弹性蛋白酶控制减少或缺乏的已 知实例是伴随炎症现象的肺中的进行性局部组织降解，这进行性地导致肺气肿并因而 伴随部分显著的肺功能限制。最后阶段，这可以导致患者死亡，这只能最终通过肺移 植来阻止。

这些患者受缺乏A1AT或A1AT功能受限的痛苦。正常情况下该抑制剂由肝较 大量的生成并分泌，并在血浆中以较高浓度(典型浓度是1.3mg/ml)循环。此外， 生理有效的并且足够浓度的A1AT发现于健康人的一些器官，尤其是肺液(上皮层液) 中。如果该A1AT浓度显著降低或如果存在的A1AT的功能受限制或无活性(灭活)， 则肺组织不受控制的变性并具有上述后果。

缺乏A1AT或A1AT抑制功能降低的原因主要是遗传缺陷。所谓的“Z”突变， 尤其是纯合(PiZZ)个体中的“Z”突变导致已经存在于合成A1AT分子的细胞中的 这些分子聚合。因此，A1AT不再能进入循环，或只有极少量进入循环。一方面，这 导致缺乏抑制活性，经一段持续时间后在肺中尤其明显；另一方面，导致肝细胞中富 集其聚合物，从而导致相应的功能性疾病。杂合PiZ个体的抑制能力相应降低。已知 还有具有相似缺陷的其它突变。

根据目前估计，PiZZ突变在美国的发生率为人群中1/1600的水平；因此，突变 携带者的数目明显更高，可能只验明了其中的10％。

基于A1AT缺陷或A1AT功能减退的肺功能性疾病(进行性肺气肿)患者中， 目前并非所有都能被治疗，因为用于治疗和/或预防的A1AT作为批准药物不能充分 供给。既定的治疗方法是基于静脉施用由供体血浆制备的含A1AT的溶液。既定的且 目前推荐的剂量是每周每kg体重60mg A1AT，这对应每月每个患者平均消耗16-20 克A1AT。这又对应平均15升血浆中所含的量。考虑到起始材料血浆中只有部分该 抑制剂以纯形式的制剂获得，一个患者每月需要若干倍的15L正常血浆作为原材料。 用于回收A1AT从而用于永久治疗患者需要的作为原材料的血浆总体积相当大。

生产A1AT制剂的既定制备方法使用所谓的Cohn IV1浆作为起始材料。所述 Cohn IV1浆利用本领域技术人员所熟悉的Cohn-Oncley方法或其改进方法制备，所 述方法基于通过实质性地改变所加入乙醇的浓度、所调节的pH值和溶液温度而对血 浆蛋白质分级分离。除了A1AT以外，所谓的级分IV1通常还含有很多种其它血浆 蛋白，经之前的沉淀步骤其它血浆蛋白的数量已经部分降低。这种方法的变换方式是 Kistler-Nitschmann法。因此，与Cohn IV1级分相似的级分以及其它含A1AT的级 分，如所谓的上清液I+II+III，也可用作起始材料。

已经描述了制备纯度不等的A1AT制剂的各种方法。已经多次报道了使用离子 交换层析尤其是阴离子交换剂富集A1AT(Gray et al.，1960；Crawford et al.，1973； Chan et al.，1973；etc.)。然而，该制备步骤单独不产生具有与现有技术相当纯度的 A1AT制剂。因此，部分地与离子交换剂组合而使用其它制备步骤。例如，使用吸附 或沉淀方法，如与聚乙二醇(US-A-4,379,087)、锌鳌合剂或肝素吸附剂 (US-A-4,629,567)等一起孵育。这些方法用于(进一步)纯化A1AT，但其中的每 种方法都必须付出或多或少地损失产物收率的代价。原则上，产物损失随制备步骤数 增加而增加。此外，这经常伴随制备时间的延长，这些都会降低A1AT的完整性和活 性并增加生产成本。

除了蛋白质制备步骤以外，所谓的病毒灭活步骤或去除(depletion)步骤是由 血浆制备的蛋白质产品制备方法中的必需部分。所谓的SD(溶剂/去污剂)方法通过 破坏它们的保护性脂质囊膜而灭活相应病毒，除此以外，热灭活方法，例如巴斯德消 毒(60℃热处理10小时)，用于增加病毒安全性。经“纳滤器”过滤通常根据病毒大 小保留病毒，而无论它们是具有脂质囊膜的或是没有脂质的。现有技术是在一种制备 方法中整合两个工序，其中每一工序本身都有效并且基于不同原理，以使病毒安全性 最大化。

根据蛋白质不同，在这些工序中加入稳定剂如氨基酸或糖以使蛋白质稳定。因 此，稍后必须将它们从含A1AT的溶液中除去。在SD方法中，加入去污剂作为病毒 灭活的活性试剂，它必须在制备工艺的后续过程中用适当方法除去。为此，建立了与 疏水基质的吸附，如使用固定化C18链的层析。这种层析也伴随产物收率的损失并 包括方法中每个(进一步)层析步骤的上述缺点。此外，这些基质通常重复使用，即 需要高成本和耗时的基质再生步骤。

因此，已经描述了无需层析步骤的用于定性去除去污剂的可替代、有效而快速 的方法(WO 94/26287，US-A-5,817,765)。因此，例如，使含去污剂的蛋白质溶液达 到盐例如柠檬酸钠的超生理浓度(≥0.5M)，以形成含去污剂的颗粒，例如仅通过过 滤就可以将所述颗粒分离出来。以下，该方法将称作“去污剂/盐析”法。

在WO 94/26287的实施例中，“去污剂/盐析”法应用于三种溶解态分离蛋白， 即转铁蛋白、抗凝血酶III和白蛋白。在实施例中，该方法分别导致恢复95％的蛋白 质活性，并导致去污剂浓度降低。如果在使得靶蛋白产率不太受影响的条件下应用该 方法，产物中的Triton浓度通常仍然是高的。在WO 94/26287的实施例4中，发明 人能恢复95％的白蛋白活性，但得到含250ppm Triton X-100和35ppm TNBP的产 物。尤其是当生产药用制剂时，应该避免超过50ppm、优选超过10ppm的Triton X-100浓度，并且一般来说，理想的是尽可能降低去污剂含量。

本发明的目的是提供制备A1AT制剂的方法，所述方法尽可能有效、快速地得 到高纯度和安全性的产品。优选的，在制备过程中，不应对A1AT的活性和/或质量 产生不利影响，并且去污剂应该被除去到药用制剂可接受的水平。

本发明的另一个目的提供纯化含A1AT的溶液的方法，在此过程中其它蛋白组 分被去除。优选的，所述A1AT溶液还应该除去其它组分如脂质或病毒。

通过从含A1AT的溶液制备A1AT的方法实现该目的，所述方法包括以下步骤：

(a)将含A1AT的溶液进行离子交换层析；

(b)加去污剂和任选的溶剂来灭活脂质囊膜病毒；

(c)随后增加盐浓度使去污剂盐析。

此外，通过如权利要求1-19限定的实施方案，解决本发明的问题。从含A1AT 的溶液例如从复原的血浆级分IV1(Cohn)中制备A1AT的方法，大体上仅由两个 就富集A1AT而言非常高效的工序组成：即利用阴离子交换剂的层析和用Triton X-100和TnBP的SD病毒灭活处理，随后盐析除去病毒灭活剂。

已经发现最后提及的步骤也可非常有效地用于含A1AT的溶液。

当含A1AT的溶液含有大量不同于A1AT的蛋白质时，本发明方法尤其有用。 令人惊奇的是，在所述工艺条件下，该工序不仅能用于去除用于病毒灭活的去污剂， 而且在分离所存在的任何蛋白质、脂蛋白和脂质杂质方面也具有显著纯化效果，而不 会对A1AT产率产生不利影响。结合上述阴离子交换层析，基本获得纯度＞90％、优 选＞95％的A1AT产物，并且含有活性形式的A1AT。溶剂去污剂处理和盐析步骤以 ≥80％的产率回收活性A1AT。例如如果复原的IV1浆用作起始材料，那么本发明方 法使得可以通过从含A1AT的溶液中去除α-2-巨球蛋白、触珠蛋白、α-1酸性糖蛋白、 IgG、IgA和IgM来纯化A1AT。在本发明的具体实施方案中，相对于溶剂/去污剂处 理之前的A1AT溶液，例如先前的阴离子交换层析的洗脱液，盐析步骤后的含A1AT 溶液回收＜10％的α-2-巨球蛋白、＜40％的触珠蛋白、＜10％的α-1酸性糖蛋白、＜10％ 的IgG、＜10％的IgA和/或＜10％的IgM。在本发明优选实施方案中，最初的含A1AT 的溶液包含至多50％、至多20％或至多10％(w/w)的其它蛋白质。初始溶液优选 包含至少1％、2％或5％(w/w)的其它蛋白质。

更进一步，还观察到，本发明方法也可令人惊奇地用作病毒灭活和/或去除步骤。 即使高产率回收A1AT，产物不仅去除或减少了其它蛋白组分，还去除或减少了病毒。 这对于非脂质包被的病毒尤其有用，因为脂质包被的病毒将已经通过去污剂处理被灭 活。因此本发明方法也是含A1AT溶液中的病毒灭活方法，所述病毒尤其是非脂质包 被的病毒。

如WO 94/26287所述的“去污剂/盐析”法可用于当前情况，使得可以去除去污 剂到药用制剂可接受的水平，并导致高度特异性地富集A1AT，这种发现是令人惊奇 的。人们将会认为WO 94/26287的方法将导致产物中去污剂浓度降低，但对于药品 可能仍然太高，并且其中除去污剂以外的所有蛋白质和其它成分以相似比率回收。因 此人们将不会认为WO 94/26287的方法可用于从其它蛋白质中纯化蛋白。

如果想获得更高纯度的A1AT产品，那么理想的是例如在Phenyl-Sepharose上 使用疏水(相互作用)层析(HIC)。具体而言，在去污剂/盐析处理之后显示该步骤 的效果，因为蛋白质结合至疏水基质或配体通常由超生理盐浓度的存在而介导。然后， 例如通过降低盐浓度，洗脱结合的蛋白质。相应的，直接去除“盐析”的去污剂之后 或合理降低盐浓度(通过稀释或超滤/渗滤；UF/DF)之后，含A1AT的溶液可与疏 水基质接触，并如技术人员所熟悉的那样进行层析。

除了SD处理含A1AT的溶液以外，本方法中可以包括至少一个用于病毒灭活、 病毒去除和/或朊病毒去除的其它步骤，例如，含A1AT溶液的病毒热灭活。具体而 言，可以在盐析步骤后直接在溶液中进行这些步骤，因为溶液中所含盐尤其是柠檬酸 钠的量在热处理过程中用作稳定剂。另一种可能性是进行冻干产品的热处理。作为替 代方案或附加方案，可以包括任何合适的去除病毒或朊病毒的过滤方法。纳滤是本领 域技术人员尤其熟悉的并且可以结合到本方法中，优选用孔径范围为15-20nm的市 售过滤器或去除病毒和/或朊病毒的任何合适的过滤结构。通过加入氨基酸，优选每 种氨基酸浓度0.1M，可以改进病毒的去除。在优选实施方案中，加入浓度超过0.2M 的甘氨酸。优选方法由Yokoyama等人(2004，Vox Sanguinis 86，225-229)描述。

原则上，可以通过特征为以下步骤组合的方法获得根据本发明的含A1AT的制 剂：

(a)将含A1AT的溶液进行阴离子交换层析；

(b)任选的肝素亲合层析和/或疏水相互作用层析(HIC)；

(c)加去污剂和任选的溶剂来灭活脂质囊膜病毒；

(d)随后盐析除去这些化学物质和蛋白质杂质；

(e)再进行至少一次病毒灭活和/或去除步骤。

从血浆及其级分获得的含A1AT的溶液或重组或转基因表达的A1AT通常是适 合的。

在本方法的优选实施方案中，浆IV1(Cohn)用水或缓冲液复原，更优选用20 mM Tris缓冲液，达到溶液与浆之比≥3∶1(优选＞10∶1)，随后与离子交换凝胶接触， 优选阴离子交换凝胶，在一个优选实施方案中为DEAE Sepharose(Amersham)， 更优选为DEAE-SepharoseFast Flow，洗涤凝胶，并通过增加离子强度来洗脱 A1AT。例如使用根据EP-A-0131740的方法实现病毒灭活。任选的加入稳定剂，随 后加入病毒灭活剂，优选Triton X-100、Polysorbate 80(Tween 80)、TnBP和/或辛 酸/辛酸盐，优选最终浓度达到≥0.1％(w/w)的Triton和Tween 80、≥0.03％(w/w)的 TnBP、≥0.1mM的辛酸/辛酸盐。经过优选≥0.1小时、更优选≥1小时的适当孵育时 间后，在≥4℃、更优选≥15℃下，优选用柠檬酸盐增加盐浓度，具体达到≥0.5M的 浓度。除去由此形成的颗粒，具体通过过滤除去。再洗涤过滤器或分离出来的颗粒可 导致A1AT产率增加。随后可以再次进行病毒灭活步骤，优选在存在≥0.5M柠檬酸 钠、氨基酸、糖或这些物质的混合物的情况下进行巴斯德消毒。随后优选通过超/渗 滤降低所加入物质的浓度。更优选的，随后通过纳滤器分离病毒颗粒，优选孔径为 15-20nm的过滤器。由此获得的A1AT可作为液体或冷冻制剂保存，或用本领域技 术人员熟悉的方法冻干。

如权利要求12-17所限定的本发明的A1AT与现有技术的制剂不同。EP436086 和DE4407837的制剂没有本发明制剂的高纯度和≤1mg/ml的IgA含量。

由此获得的A1AT产物可作为溶液经皮下、肌内、局部或作为气溶胶施用，优 选静脉施用。作为干燥材料，它也可以用于以粉末形式吸入。也可以例如以与其它溶 液的混合物形式静脉施用。可能的剂量是例如每周60mg/kg体重，或每月250mg/ 每kg体重。

另一个优选方法除了上述步骤以外还包括优选在如上所述的SD处理和盐析除 去杀病毒剂和其它杂质之后进行的HIC，优选利用苯基基质的HIC。优选的，进行 负纯化，即有价值的物质A1AT穿过层析基质而不结合，同时不希望的物质被结合并 因此从该溶液中去除。

在另一个优选方法中可以包括上述HIC，在固定化肝素上的层析优选利用肝素- 琼脂糖凝胶(sepharose)或肝素-fractogel进行。因而，含A1AT的溶液在柱子中或 分批与肝素凝胶接触。富集的A1AT穿过柱子而不结合，或者凝胶分离后在出现在上 清液中。该工序优选在上述离子交换层析之前或之后进行，或在盐析除去去污剂并例 如通过透析降低溶液离子强度之后进行。

根据本发明还要求保护的是包含根据本发明的A1AT的药物，其中所述A1AT 作为唯一活性成分或与优选类固醇、NSAID的抗炎药组合，以及根据本发明的A1AT 用于制备药物的用途，所述药物用于治疗A1AT缺乏、肺变性现象如肺纤维化和肺气 肿。

含A1AT的药物的合适的施用形式对本领域技术人员是本身所公知的。具体而 言，所有的蛋白质施用形式都是合适的，如胃肠道外施用、静脉或吸入施用。

根据本发明的方法通过以下实施例进一步加以说明：

实施例1：

为复原，以1∶9重量比在碱性pH下搅拌3小时将冷冻Cohn IV1浆溶于20mM Tris溶液。

阴离子交换层析

用于此工艺步骤的优选层析材料是DEAE-Sepharose FF(Fast Flow)，但是本领 域技术人员也可以根据每种阴离子交换材料来改变条件。装好的DEAE-Sepharose FF 层析柱用20mM Tris溶液(pH8.0)平衡。此后，在pH8.0处加入溶解的Cohn IV1 浆。用平衡缓冲液洗涤，随后用缓冲溶液洗涤。然后可用20mM Tris、0.075M NaCl、 pH8.0洗柱子从而洗脱与基质结合的A1AT。由此获得的A1AT溶液的比活性是约0.5 PEU/mg蛋白(PEU：血浆等价单位；对应于平均在1毫升人血浆中发现的A1AT的 量或活性)。用高盐缓冲液(如2M NaCl)洗脱柱子，随后用本身已知的方法再生层 析凝胶。

溶剂/去污剂处理

经超滤浓缩由此获得的洗脱液。随后，加入Triton X-100、TnBP和药用水的预 混溶液(WFI)，达到最终浓度为1％(w/w)Triton X-100和0.3％(w/w)TnBP。在 适度搅拌下在20℃进行SD处理4小时。

盐析

为除去SD试剂并沉淀不希望的伴随蛋白质，用含1.5M柠檬酸钠和20mM Tris pH7.0的溶液稀释含A1AT的溶液。搅拌下在至少15分钟期间加入柠檬酸盐，达到 1M的浓度。随后，在适度搅拌下孵育该溶液至少1小时。所形成的发白沉淀随后经 过滤分离。这样将SD试剂浓度降低到低于10ppm，并且不希望的伴随蛋白质和变 性的A1AT也被分离出去。

这个生产步骤以后，A1AT的比活性是至少0.8PEU/mg(PEU：血浆等价单位； 对应于平均在1毫升人血浆中发现的A1AT的量或活性)。

纳滤

经UF/DF除去低分子物质以后，由此获得的溶液用标称排阻尺寸为15-20nm的 过滤器如Pall公司的DV20过滤器过滤，以进一步增加A1AT产物的病毒安全性。

结果：

过滤后产物中Triton X-100和TNBP的浓度低于5ppm。测定产物中A1AT和 其它蛋白质组分的量并与溶剂/去污剂处理之前测定的量比较。计算得到以下回收率：

A1AT              ＞80％

α-2-巨球蛋白     ＜10％

触珠蛋白          ＜40％

α-1酸性糖蛋白    ＜10％

IgG               ＜10％

IgA               ＜10％

IgM               ＜10％

结果表明在产物中A1AT特异性地以高量回收。而产物中明显除去了其它蛋白 组分。这进一步由图1说明，图中示出溶剂/去污剂处理之前(泳道2)和盐析步骤之 后(泳道3)的溶液的SDS-PAGE结果。A1AT对应于稍大于50kD(与泳道1中的 分子量标记物相比)的宽带。起始溶液中可清楚检测到的各种其它蛋白组分显著减少。

实施例2

修改如实施例1所述的方法，将离子交换层析得到的含A1AT的洗脱液与肝素 -sephaorse接触。A1AT穿过肝素-sepharose柱子而不结合。如果采用分批操作，A1AT 保留在上清液中。如实施例1中所述进一步加工柱洗脱液或得自分批进行的变化方案 的上清液。由此获得的产品的特征是纯度增加。

图1表示还原条件下的SDS-PAGE结果，4-20％梯度，考马斯蓝染色，5μg蛋白/ 泳道。泳道1：分子量标记物；泳道2：溶剂/去污剂处理之前的根据实施例1的溶液 的探测；泳道3：盐析步骤之后的根据实施例1的溶液的探测。