一种雨生红球藻的藻种筛选分离纯化方法
专利汇可以提供一种雨生红球藻的藻种筛选分离纯化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种雨生红球藻得藻种单个藻细胞的筛选分离纯化方法，包括雨生红球藻细胞专用毛细微吸管的制作、单个优质细胞筛选、分离纯化措施、扩大培养、复壮、培养液配制，挑选在室外管道反应器中雨生红球藻长势较好，细胞适应期短，分裂能 力 强，细胞直径大，抗性强的藻液；主要是单个藻细胞的筛选、分离纯化步骤。增强了优质雨生红球藻自身的耐受性与抗性，优质细胞通过反复清洗，保证了细胞的纯洁度，得到的优质细胞每次分离所用设备容量小、培养时间短、操作简单、避免了雨生红球藻受菌污染及转移过程中存在的成功概率低以影响工作效率的问题。，下面是一种雨生红球藻的藻种筛选分离纯化方法专利的具体信息内容。
1.一种雨生红球藻得藻种单个藻细胞的筛选分离纯化方法，包括雨生红球藻细胞专用毛细微吸管的制作、单个优质细胞筛选、分离纯化措施、扩大培养、复壮、培养液配制，挑选在室外管道反应器中雨生红球藻长势较好，细胞适应期短，分裂能力强，细胞直径大，抗性强的藻液；其特征在于单个藻细胞的筛选、分离纯化的操作步骤：
（1）预先准备50ml的离心管，于121℃下灭菌30min，烘干待用；
（2）挑选在室外培养环境下雨生红球藻分裂旺盛，处于分裂期，适应性强的藻液，使用灭好菌的50ml离心管进行取样，取样时间一般在早上8:00-10:00之间，取样时前三次涮洗倒掉，取第四次混合均匀的藻液；
（3）毛细微吸管的制作方法及灭菌处理：取样同时另外一个人负责制作毛细微吸管，利用玻璃巴斯德吸管通过超声波清洗，泡酸处理，酒精浸泡，晾干，烘干处理，于115℃下灭菌
2H,使用酒精喷灯灼烧拉丝，将巴斯德吸管拉丝成孔径为60um左右的毛细微吸管，使用前利用紫外灯照射30min再次进行消毒灭菌处理；
（4）藻液的选择：挑藻前通过显微镜观察细胞对比同一批次在管道反应器中培养的生长较好的一排管道反应器的藻液，如细胞分裂较快、细胞直径；
（5）挑选后使用灭菌过的50ml离心管取样20ml，取两份样品，添加20ml超纯水混合摇匀，静置30min倒掉上清液；
（6）上述沉淀转移至灭过菌的两个10ml的离心管中，添加超纯水至9ml，于2000r/min的条件离心3min，倒掉上清液，重复离心处理三次；
（7）分别将最后离心好的沉淀液转移至另外的两个灭过菌的10ml离心管中，添加5ml超纯水，混合备用；
（8）依次使用上述准备好的藻液进行挑藻，每个离心管的藻液转移到一块载玻片上，转移时使用20ul的移液枪转移，每块载玻片分为三排，每排滴8滴，每块载玻片滴24滴；
（9）准备清洗用的超纯水放在一块载玻片上，每块载玻片分为三排，每排滴8滴，每块载玻片滴24滴，每滴20ul；
（10）挑藻时首先对上述藻液放在显微镜上进行镜检（目镜10倍，物镜10倍），挑选视野中细胞形态正常，细胞壁表面光滑，且没有细胞壁预扩大现象；
（11）将之前制作好的毛细微吸管一端套上硅胶头，用手捏着硅胶头，并控制好，拉成丝的一端放在物镜下方，藻滴的上方，双眼看目镜，偏物镜，慢慢移动毛细微吸管至靠近需要挑选藻细胞的正上方位置处，最小幅度的活动食指与拇指，寻找发丝状阴影，当看到阴影后，手停止晃动，慢慢下移且眼睛不要离开目镜，当阴影逐渐清晰，开始前后最小幅度蠕动手腕，当视野中找到毛细微吸管拉丝一端的管口时，停止移动，使毛细微吸管的管口与要挑选细胞角度小于90度，当看到预挑选细胞进入毛细微吸管后，迅速拿起，滴入预先准备好的超纯水水滴中，松开手捏硅胶头的1/3到1/2让水滴牵引毛细微吸管中挑到细胞到水滴中，注意不要全松，仔细观察毛细微吸管拉丝部分是否还有液体残留，如还有少量液体，继续用毛细微吸管拉丝部分处对准第一滴直至液体全部进入到水滴中；一一对应，直至24个水滴全部处理完；
（12）使用毛细微吸管对挑到细胞的藻滴通过控制硅胶头的松紧反复吹打，通过显微镜观察，当确定所挑选细胞表面无杂质，无其他异物后，重新更换新制作的毛细微吸管，继续清洗，但此时不需要吹打，直至清晰可见的细胞在视野中；此清洗过程重复次数不少于10次；
（13）按以上方法重复挑选剩余其他藻液样品，一般要保证清晰可见无任何杂质的细胞不少于24个（清洗时实时镜检并不断搅动，保证挑选到的优质细胞周围各个面都不能有其他附着物），以便于后期取舍；
（14）将挑选好的细胞逐一转移至预先已添加过培养液灭过菌的96孔板中（每孔添加
100ul培养液A），转移时毛细微吸管悬在上方，全捏硅胶头，通过水滴牵引力使毛细微吸管口慢慢靠近液体并轻轻吹打，保证藻细胞转移到96孔板中，转移时还需注意加完一排再开另外一排，顺势下移，加到自己所能加的最大量，避免个别孔有污染，保证一定的安全距离；
（15）全部转移结束后，用封口膜将四周封口，放于恒温光照培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一种雨生红球藻得藻种单个藻细胞的筛选分离纯化方法，其特征在于雨生红球藻细胞挑选专用毛细微吸管的制作方式如下：
（1）用德国Brand玻璃巴斯德吸管，型号747715，总长度145mm，尖端长度45mm，容量约
2ml；
（2）将巴斯德吸管尖端制作成长度约5cm左右，拉丝孔径在不大于60nm的专用毛细微吸管；
（3）拉丝部分只允许单个雨生红球藻细胞通过；
毛细微吸管制作方式：
a、在酒精灯对巴斯德吸管的尖端进行灼烧，灼烧过程中不停的晃动，保证尖端部位受热均匀；
b、观察达到要求, 即时脱离酒精灯；
c、用镊子往外拉，保证拉升长度约5cm左右，拉丝孔径不超过60nm；
d、拉丝长度及孔径达到要求后即刻停止拉的动作；用力折断镊子外端部分，保证拉丝管口通畅。
一种雨生红球藻的藻种筛选分离纯化方法
技术领域
背景技术
发明内容
1、雨生红球藻得藻种单个藻细胞的筛选、分离纯化
挑选在室外管道反应器中雨生红球藻长势较好，细胞适应期短，分裂能力强，细胞直径大，抗性强（夏天高pH值，冬天抗低温等）的藻液；
单个藻细胞的筛选、分离纯化的操作步骤：
（1）预先准备50ml的离心管，于121℃下灭菌30min，烘干待用；
（2）挑选在室外培养环境下雨生红球藻分裂旺盛，处于分裂期，适应性强的藻液，使用灭好菌的50ml离心管进行取样，取样时间一般在早上8:00-10:00之间，取样时前三次涮洗倒掉，取第四次混合均匀的藻液；
（3）毛细微吸管的制作方法及灭菌处理：取样同时另外一个人负责制作毛细微吸管，利用玻璃巴斯德吸管通过超声波清洗，泡酸处理，酒精浸泡，晾干，烘干处理，于115℃下灭菌
2H,使用酒精喷灯灼烧拉丝，将巴斯德吸管拉丝成孔径为60um左右的毛细微吸管，使用前利用紫外灯照射30min再次进行消毒灭菌处理；
（4）藻液的选择：挑藻前通过显微镜观察细胞对比同一批次在管道反应器中培养的生长较好的一排管道反应器的藻液，如细胞分裂较快、细胞直径；
（5）挑选后使用灭菌过的50ml离心管取样20ml，取两份样品，添加20ml超纯水混合摇匀，静置30min倒掉上清液；
（6）上述沉淀转移至灭过菌的两个10ml的离心管中，添加超纯水至9ml，于2000r/min的条件离心3min，倒掉上清液，重复离心处理三次；、
（7）分别将最后离心好的沉淀液转移至另外的两个灭过菌的10ml离心管中，添加5ml超纯水，混合备用；
（8）依次使用上述准备好的藻液进行挑藻，每个离心管的藻液转移到一块载玻片上，转移时使用20ul的移液枪转移，每块载玻片分为三排，每排滴8滴，每块载玻片滴24滴；
（9）准备清洗用的超纯水放在一块载玻片上，每块载玻片分为三排，每排滴8滴，每块载玻片滴24滴，每滴20ul；
（10）挑藻时首先对上述藻液放在显微镜上进行镜检（目镜10倍，物镜10倍），挑选视野中细胞形态正常，细胞壁表面光滑，且没有细胞壁预扩大现象；
（11）将之前制作好的毛细微吸管一端套上硅胶头，用手捏着硅胶头，并控制好，拉成丝的一端放在物镜下方，藻滴的上方，双眼看目镜，偏物镜，慢慢移动毛细微吸管至靠近需要挑选藻细胞的正上方位置处，最小幅度的活动食指与拇指，寻找发丝状阴影，当看到阴影后，手停止晃动，慢慢下移且眼睛不要离开目镜，当阴影逐渐清晰，开始前后最小幅度蠕动手腕，当视野中找到毛细微吸管拉丝一端的管口时，停止移动，使毛细微吸管的管口与要挑选细胞角度小于90度，当看到预挑选细胞进入毛细微吸管后，迅速拿起，滴入预先准备好的超纯水水滴中，松开手捏硅胶头的1/3到1/2让水滴牵引毛细微吸管中挑到细胞到水滴中，注意不要全松，仔细观察毛细微吸管拉丝部分是否还有液体残留，如还有少量液体，继续用毛细微吸管拉丝部分处对准第一滴直至液体全部进入到水滴中；一一对应，直至24个水滴全部处理完；
（12）使用毛细微吸管对挑到细胞的藻滴通过控制硅胶头的松紧反复吹打，通过显微镜观察，当确定所挑选细胞表面无杂质，无其他异物后，重新更换新制作的毛细微吸管，继续清洗，但此时不需要吹打，直至清晰可见的细胞在视野中；此清洗过程重复次数不少于10次；
（13）按以上方法重复挑选剩余其他藻液样品，一般要保证清晰可见无任何杂质的细胞不少于24个（清洗时实时镜检并不断搅动，保证挑选到的优质细胞周围各个面都不能有其他附着物），以便于后期取舍；
（14）将挑选好的细胞逐一转移至预先已添加过培养液灭过菌的96孔板中（每孔添加
100ul培养液A），转移时毛细微吸管悬在上方，全捏硅胶头，通过水滴牵引力使毛细微吸管口慢慢靠近液体并轻轻吹打，保证藻细胞转移到96孔板中，转移时还需注意加完一排再开另外一排，顺势下移，加到自己所能加的最大量，避免个别孔有污染，保证一定的安全距离；
（15）全部转移结束后，用封口膜将四周封口，放于恒温光照培养箱中培养。
（3）拉丝部分只允许单个雨生红球藻细胞通过；
毛细微吸管制作方式：
a、在酒精灯对巴斯德吸管的尖端进行灼烧，灼烧过程中不停的晃动，保证尖端部位受热均匀；
b、观察达到要求, 即时脱离酒精灯；
c、用镊子往外拉，保证拉升长度约5cm左右，拉丝孔径不超过60nm；
d、拉丝长度及孔径达到要求后即刻停止拉的动作；用力折断镊子外端部分，保证拉丝管口通畅。
具体实施方式
2ml；
2、烧，利用酒精灯的中偏外焰控制温度对巴斯德吸管的尖端进行灼烧；
3、晃（摇），在灼烧过程中不停的晃动，保证尖端部位受热均匀；
4、拿出，当尖端部分全部均匀烧红以后，从酒精灯上拿出；
5、拉，使用镊子往外拉，保证拉升长度约5cm左右，拉丝孔径在60nm左右；
6、停，保证拉丝长度及孔径达到要求后即刻停止拉的动作；
7、断，停止后，用力折断镊子外端部分，保证拉丝管口通畅。
2、挑选在室外培养环境下雨生红球藻分裂旺盛，处于分裂期，适应性强的藻液，使用灭好菌的50ml离心管进行取样，取样时间一般在早上8:00-10:00之间，取样时前三次涮洗倒掉，取第四次混合均匀的藻液；
3、毛细微吸管的制作方法及灭菌处理：取样同时另外一个人负责制作毛细微吸管，利用玻璃巴斯德吸管通过超声波清洗，泡酸处理，酒精浸泡，晾干，烘干处理，于115℃下灭菌
2H,使用酒精喷灯灼烧拉丝，将巴斯德吸管拉丝成孔径为60um左右的毛细微吸管，使用前利用紫外灯照射30min再次进行消毒灭菌处理；
4、挑藻前藻液的选择：通过显微镜观察细胞对比同一批次在管道反应器中培养的生长较好的一排管道反应器的藻液，如细胞分裂较快、细胞直径；
5、挑选后使用灭菌过的50ml离心管取样20ml，取两份样品，添加20ml超纯水混合摇匀，静置30min倒掉上清液；
6上述沉淀转移至灭过菌的两个10ml的离心管中，添加超纯水至9ml，于2000r/min的条件离心3min，倒掉上清液，重复离心处理三次；、
7、分别将最后离心好的沉淀液转移至另外的两个灭过菌的10ml离心管中，添加5ml超纯水，混合备用；
8、依次使用上述准备好的藻液进行挑藻，每个离心管的藻液转移到一块载玻片上，转移时使用20ul的移液枪转移，每块载玻片分为三排，每排滴8滴，每块载玻片滴24滴；
9、准备清洗用的超纯水放在一块载玻片上，每块载玻片分为三排，每排滴8滴，每块载玻片滴24滴，每滴20ul；
10、挑藻时首先对上述藻液放在显微镜上进行镜检（目镜10倍，物镜10倍），挑选视野中细胞形态正常，细胞壁表面光滑，且没有细胞壁预扩大现象；
11、将之前制作好的毛细微吸管一端套上硅胶头，用手捏着硅胶头，并控制好，拉成丝的一端放在物镜下方，藻滴的上方，双眼看目镜，偏物镜，慢慢移动毛细微吸管至靠近需要挑选藻细胞的正上方位置处，最小幅度的活动食指与拇指，寻找发丝状阴影，当看到阴影后，手停止晃动，慢慢下移且眼睛不要离开目镜，当阴影逐渐清晰，开始前后最小幅度蠕动手腕，当视野中找到毛细微吸管拉丝一端的管口时，停止移动，使毛细微吸管的管口与要挑选细胞角度小于90度，当看到预挑选细胞进入毛细微吸管后，迅速拿起，滴入预先准备好的已滴加超纯水水滴中，松开手捏硅胶头的1/3到1/2让水滴牵引毛细微吸管中挑到细胞到水滴中，注意不要全松，仔细观察毛细微吸管拉丝部分是否还有液体残留，如还有少量液体，继续用毛细微吸管拉丝部分处对准第一滴直至液体全部进入到水滴中；一一对应，直至24个水滴全部处理完；
12、使用毛细微吸管对挑到细胞的藻滴通过控制硅胶头的松紧反复吹打，通过显微镜观察，当确定所挑选细胞表面无杂质，无其他异物后，重新更换新制作的毛细微吸管，继续清洗，但此时不需要吹打，直至清晰可见的细胞在视野中；此清洗过程重复次数不少于10次；
13、按以上方法重复挑选剩余其他藻液样品，一般要保证清晰可见无任何杂质的细胞不少于24个（清洗时实时镜检并不断搅动，保证挑选到的优质细胞周围各个面都不能有其他附着物），以便于后期取舍；
14、将挑选好的细胞逐一转移至预先已添加过培养液灭过菌的96孔板中（每孔添加
100ul培养液A），转移时毛细微吸管悬在上方，全捏硅胶头，通过水滴牵引力使毛细微吸管口慢慢靠近液体并轻轻吹打，保证藻细胞转移到96孔板中，转移时还需注意加完一排再开另外一排，顺势下移，加到自己所能加的最大量，避免个别孔有污染，保证一定的安全距离；
15、全部转移结束后，用封口膜将四周封口，放于恒温光照培养箱中培养；
例三、雨生红球藻的藻种进一步扩大培养、复壮措施：
1、杀菌处理：将96孔板和24孔板置于紫外灯下照射至少2H，封口膜于紫外灯下照射至少30min。
26、待培养基冷却到50℃时,无菌操作倒入到灭菌的培养皿中待用。
29、培养液、培养的工具、器皿要进行高温灭菌，灭菌条件为121℃，灭菌30min，接种、转接操作均在超净工作台上进行。
1 NaNO3 （硝酸钠） 0.35
2 K2NO（3 硝酸钾） 0.2
3 MgSO4*7H2O（七水硫酸镁） 0.1
4 柠檬酸 0.15
5 CaCl2*2H2O（二水氯化钙） 0.06
6 KH2PO4(磷酸二氢钾) 0.02
7 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.001
8 NaHCO3（碳酸氢钠） 0.045
9 Na2SO3(亚硫酸钠) 0.04
10 FeSO4*7H2O 0.001
11 FeCl3*6H2O(氯化铁) 0.001
12 A5
H3BO（3 硼酸） 0.0006
MnCl2*4H2O（四水氯化锰） 0.00035
ZnCl（2 氯化锌） 0.00005
（NH4）6Mo7O24（钼酸铵） 0.00004
CuSO4*5H2O（五水硫酸铜） 0.00003
CoCl2*6H2O（氯化钴） 0.00005
2、培养液B的配制方法
组分 配方量g/L
1 NaNO（3 硝酸钠） 1.25
2 K2HPO（4 磷酸氢二钾） 0.04
3 MgSO4*7H2O（七水硫酸镁） 0.075
4 CaCl2*2H2O（二水氯化钙） 0.036
5 柠檬酸 0.06
6 柠檬酸铁铵 0.06
7 Na2EDTA（乙二铵四乙酸二钠） 0.001
8 Na2CO（3 碳酸钠） 0.02
9 A5
H3BO（3 硼酸） 0.00286
MnCl2*4H2O（四水氯化锰） 0.00186
ZnSO4*7H2O（七水硫酸锌） 0.00022
Na2MoO（4 钼酸钠） 0.00039
CuSO4*5H2O（五水硫酸铜） 0.00008
Co(NO3)2*6H2O（六水硝酸钴） 0.00005
3、将配制好的培养液用灭菌锅按常规方式进行灭菌处理
培养液、培养的工具、器皿作高温灭菌，灭菌条件为121℃，灭菌至少30min；接种、转接操作均在超净工作台上进行。
0.3g/L,MgSO4*7H2O（七水硫酸镁）0.05-0.2g/L,柠檬酸0.1-0.3g/L,CaCl2*2H2O（二水氯化钙）0.02-0.08g/L,KH2PO4(磷酸二氢钾) 0.01-0.03g/L,Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠）
0.001-0.003g/L,NaHCO3（碳酸氢钠）0.025-0.05g/L,Na2SO3(亚硫酸钠) 0.02-0.05g/L,FeSO4*7H2O 0.001-0.003g/L,FeCl3*6H2O(氯化铁)0.001-0.003g/L；
2、辅料成分即微量元素：MnCl2*4H2O（四水氯化锰）0.00025-0.00045g/L，ZnCl（2 氯化锌）0.00003-0.00006 g/L，（NH4）6Mo7O2（4 钼酸铵）0.00002-0.00006g/L，CuSO4*5H2O（五水硫酸铜）0.00002-0.00005g/L，CoCl2*6H2O（氯化钴）0.00003-0.00006g/L。
2、辅料成分即微量元素：H3BO（3 硼酸）0.002-0.003g/L MnCl2*4H2O（四水氯化锰）
0.001-0.002g/L，ZnSO4*7H2O（七水硫酸锌）0.0002-0.0003g/L，Na2MoO（4 钼酸钠）0.0003-
0.0005g/L，CuSO4*5H2O（五水硫酸铜）0.00008-0.0001g/L，Co(NO3)2*6H2O（六水硝酸钴）
0.00005-0.00008 g/L。
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