一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用
阅读：181发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 雪 旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA 导管 及其应用，所述雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管的连接方法如下：首先将神经断端近心端套入LC-PLGA导管内，套入长度为1mm，神经断端外膜与神经导管以10-0缝合线缝合，然后将22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞和3.75μl神经干细胞混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。本发明还包括雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA的应用，应用于神经修复。本发明制备的上述修复神经导管具有很好的 生物 相容性 、可降解性；且应用时可很好地促进受损神经的修复，具有很好的应用前景。，下面是一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用专利的具体信息内容。
1.一种雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管，其特征在于，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法具体如下：
(1)制备Laminin-chitosan-PLGA导管：首先将PLGA导管浸渍于浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，30min后将其取出并刷去导管表面的壳聚糖，然后做晾干及干燥处理，15min后将PLGA导管内的芯轴抽出得到chitosan-PLGA导管；最后将制备好的chitosan-PLGA导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的层粘连蛋白水溶液中，20min后将其取出水洗，并在chitosan-PLGA导管表面进行重复层粘连蛋白膜的处理得到Laminin-chitosan-PLGA导管，将得到的Laminin-chitosan-PLGA导管剪切成长度为7mm的导管，备用；
(2)神经干细胞的获取及培养：首先将SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部切口，将子宫拉出并结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，同时用PBS对其进行冲洗，然后将子宫剪开并取出胚胎，同时使用显微镊离断胎头；在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，分离出海马组织，将分离出的海马组织转移至预先铺有DMEM/F12的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，将细胞悬液离心处理，最后将得到的细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次；
(3)雪旺细胞的获取及培养：首先将3-5天新生SD大鼠颈椎脱臼处死，之后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，并将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1的溶液混合，然后进行振荡、离心，弃上清并重悬，最后将细胞种于细胞培养皿，每隔一天换液并传代；
(4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管：首先将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管，神经断端近心端的套入长度为1mm，再将神经断端外膜与Laminin-chitosan-PLGA导管以10-0缝合线缝合；然后将matrigel、雪旺细胞和神经干细胞的混合物注入Laminin-chitosan-PLGA导管内；最后将神经断端的远心端以同近心端的处理方式进行处理。
2.根据权利要求1所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管，其特征在于，所述Laminin-chitosan-PLGA导管内神经断端间距为5mm。
3.根据权利要求1所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管，其特征在于，所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度为0.1％，所述壳聚糖溶液的成分及各组分的质量百分比为：壳聚糖为3.5％，醋酸为4％，水为92.5％；所述步骤(1)中在chitosan-PLGA导管表面进行层粘连蛋白膜处理时是在冰浴的条件下进行。
4.一种权利要求1所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备Laminin-chitosan-PLGA导管：首先将PLGA导管浸渍于壳聚糖溶液中，30min后将其取出并刷去导管表面的壳聚糖，然后做晾干及干燥处理，15min后将PLGA导管内的芯轴抽出得到chitosan-PLGA导管；最后将制备好的chitosan-PLGA导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的层粘连蛋白水溶液中，20min后将其取出水洗，并在chitosan-PLGA导管表面进行重复层粘连蛋白膜的处理得到Laminin-chitosan-PLGA导管，将得到的Laminin-chitosan-PLGA导管剪切成长度为7mm的导管，备用；
(2)神经干细胞的获取及培养：首先将SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部切口，将子宫拉出并结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，同时用PBS对其进行冲洗，然后将子宫剪开并取出胚胎，同时使用显微镊离断胎头；在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，分离出海马组织，将分离出的海马组织转移至预先铺有DMEM/F12的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，将细胞悬液离心处理，最后将得到的细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基重悬并计数，将细胞
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以1×10 个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次；
(3)雪旺细胞的获取及培养：首先将3-5天新生SD大鼠颈椎脱臼处死，之后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，并将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1的溶液混合，然后进行振荡、离心，弃上清并重悬，最后将细胞种于细胞培养皿，每隔一天换液并传代；
(4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管：首先将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管，神经断端近心端的套入长度为1mm，再将神经断端外膜与Laminin-chitosan-PLGA导管以10-0缝合线缝合；然后将matrigel、雪旺细胞和神经干细胞的混合物注入Laminin-chitosan-PLGA导管内；最后将神经断端的远心端以同近心端的处理方式进行处理。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述Laminin-chitosan-PLGA导管内神经断端间距为5mm。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度为
0.1％，所述壳聚糖溶液的成分及各组分的质量百分比为：壳聚糖为3.5％，醋酸为4％，水为
92.5％；所述步骤(1)中在chitosan-PLGA导管表面进行层粘连蛋白膜处理时是在冰浴的条件下进行。
7.权利要求1所述的雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管应用于受损神经修复。
一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 由于现代社会生产和生活节奏的不断加快，人们受到伤害的几率大大增加。由于事故导致的损伤，常常伴有外周神经系统的损伤。神经损伤由于组织不能成功的再生，经常引起功能的长期丧失。周围神经损伤是一种常见的全球临床问题，这大大影响了患者的生活质量，并造成了巨大的社会经济负担。周围神经损伤或缺损时，人们首先选用的方法是将两侧神经断端直接吻合。如果不能直接吻合，由于周围结缔组织等的障碍作用，则会导致新生的神经纤维无法通过缺损部位到达其靶组织所在部位，在再生神经的残端形成增生的神经瘤样组织，其结果是造成创伤所在肢体的功能障碍。另外，也有采用自体神经移植的方法修复周围神经损伤或者神经外膜、神经束膜缝合进行修复，但是供体神经来源受限，且均需要进行缝合容易出现感觉神经纤维与运动神经纤维的错接以及断端瘢痕组织侵入，使用自体神经移植的方法，也存在会造成取材部位的功能缺损，被移植神经的部位功能恢复也不理想，而异体神经移植存在着无法克服的免疫排斥反应等问题。根据近年来已经被众多学者证实的神经选择再生理论，采用人工神经鞘管进行周围神经修复成为一个理想替代方法，其主要是利用断端留出空间提供选择性再生空间诱导损伤神经再生。然而现有技术的神经修复材料多采用生物不可降解的材料制成，一般需要采用二次手术进行去除。而且现有的神经修复导管制备方法单一，导致神经修复导管性能受限，或者只能满足强度要求但较难实现物质传递，或者容易实现物质传递但强度差。
[0003] 神经损伤修复的研究已经有近百年的历史，究其原因主要是损伤局部的微环境不利于神经纤维的再生和向靶部位延伸。近年来，人们采用坐骨神经移植、人工材料导管等方法已经证明大鼠脊髓损伤后，只要改善局部的微环境，离断的神经纤维是可以再生的。但是，由于导管的生物相容性、力学性能等问题，现在还没有较为理想的用于脊髓再生的人工神经导管。
[0004] 中国专利申请：CN101579246B公开了一种神经修复导管及其制备方法，所述神经修复导管由内层导管和外层纤维壁构成，所述内层导管由沿导管延展方向排列的丝素蛋白纤维构成，所述外层纤维壁由垂直导管环绕轴向排列的丝素蛋白纤维构成，所述丝素蛋白纤维的直径为50～3000nm；制备上述神经修复导管的方法，包括以下步骤：(1)制备再生丝素蛋白膜；(2)溶解纯再生丝素蛋白膜，使用静电纺丝纺制备丝素蛋白纤维；(3)通过滚筒装置收集丝素蛋白纤维得到神经修复导管；所述神经修复导管为高纯度蚕丝丝素蛋白，内层为沿导管延展方向排列的平行纤维；外层纤维环绕导管轴向排列。
[0005] 中国专利申请：CN105983136A公开了一种神经修复导管其制备方法，神经修复导管包括：内层和设于所述内层外壁的外层；所述内层由胶原、壳聚糖及其衍生物中的一种或者多种复合材料制得，所述外层由胶原、壳聚糖、丝素蛋白及其衍生物中的一种或者多种复合材料制得。但是关于本发明一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用目前还未见报道。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管。
[0007] 本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述导管的制备方法。
[0008] 本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述导管的应用。
[0009] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0010] 一种雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA(LC-PLGA)导管，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法具体如下：
[0011] (1)制备LC-PLGA导管：将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.1％浓度的壳聚糖溶液中(壳聚糖溶液的成分为：壳聚糖质量百分比3.5％，醋酸4％，水92.5％)，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出，将制备好的导管浸泡在层粘连蛋白(LN，0.2mg/ml)水溶液中，20min后取出水洗2次，这样就完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜，为了保持层粘连蛋白的活性，整个实验过程均在冰浴中进行，最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长，备用；
[0012] (2)神经干细胞的获取及培养：SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部施行“T”形切口，充分暴露并拉出子宫，可见成串珠样排列的胚胎，结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，并用PBS冲洗除去血细胞，眼科剪小心剪开子宫，取出胚胎，并使用显微镊离断胎头，在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，然后分离出海马组织，将海马组织转移至规格为3.5mm预先铺有DMEM/F12(1:1)的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，然后将细胞悬液以750rpm/min的转速离心3min，将上清液转移至15ml离心管中，1500rpm/min转速离心5min，弃上清，细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基(NSCM)重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次。
[0013] (3)雪旺细胞的获取及培养：取3-5天新生SD大鼠，颈椎脱臼处死后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，使用眼科剪将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1溶液混合，置于37℃摇床45min-1h，然后置于离心机中以1500rpm/min的转速离心5min，弃上清，使用SCCM重悬，将细胞种于10cm细胞培养皿，每隔一天换液，视细胞生长情况传代，传代时弃去细胞上清液，加入3ml浓度为0.2％的Dispase(消化前，酶37℃水浴箱温热半小时)，细胞培养箱消化10-15min，轻轻拍打，显微镜下观察，雪旺细胞大部分消化下来即可，以1500rpm/min的转速离心5min，SCCM重悬后以1×106的密度种植于10cm培养皿中；
[0014] (4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管：将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管内，神经断端套入长度约为1mm，神经断端外膜与神经导管以10-0缝合线缝合，然后将约22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞(约0.083×106个)与3.75μl神经干细胞(约0.083×106个)混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。
[0015] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0016] 一种如上所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法，包括以下步骤：
[0017] (1)制备LC-PLGA导管：将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.1％浓度的壳聚糖溶液中(壳聚糖溶液的成分为：壳聚糖质量百分比3.5％，醋酸4％，水92.5％)，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出，将制备好的导管浸泡在层粘连蛋白(LN，0.2mg/ml)水溶液中，20min后取出水洗2次，这样就完成了一个的LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜，为了保持层粘连蛋白的活性，整个实验过程均在冰浴中进行，最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长；
[0018] (2)神经干细胞的获取及培养：SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部施行“T”形切口，充分暴露并拉出子宫，可见成串珠样排列的胚胎，结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，并用PBS冲洗除去血细胞，眼科剪小心剪开子宫，取出胚胎，并使用显微镊离断胎头，在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，然后分离出海马组织，将海马组织转移至规格为3.5mm预先铺有DMEM/F12(1:1)的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，然后将细胞悬液以750rpm/min的转速离心3min，将上清液转移至15ml离心管中,1500rpm/min转速离心5min，弃上清，细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基(NSCM)重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次。
[0019] (3)雪旺细胞的获取及培养：取3-5天新生SD大鼠，颈椎脱臼处死后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，使用眼科剪将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1溶液混合，置于37℃摇床45min-1h，然后置于离心机中以1500rpm/min的转速离心5min，弃上清，使用SCCM重悬，将细胞种于10cm细胞培养皿，每隔一天换液，视细胞生长情况传代，传代时弃去细胞上清液，加入3ml浓度为0.2％的Dispase(消化前，酶37℃水浴箱温热半小时)，细胞培养箱消化10-15min，轻轻拍打，显微镜下观察，雪旺细胞大部分消化下来即可，
1500rpm/min的转速离心5min，SCCM重悬后以1×106的密度种植于10cm培养皿中；
1500rpm/min的转速离心5min，SCCM重悬后以1×106的密度种植于10cm培养皿中；
[0020] (4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管：将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管内，神经断端套入长度约为1mm，神经断端外膜与神经导管以10-0缝合线缝合，然后将22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞(约0.083×106个)与3.75μl神经干细胞(约0.083×106个)混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。
[0021] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] 如上所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的应用。
[0023] 作为本发明的一个优选实施方案，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管应用于受损神经修复。
[0024] 本发明优点在于：
[0025] 1、本发明制备的雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管具有很好的生物相容性、可降解性；且所使用材料的降解时间和神经纤维的生长速度相适应，可很好地促进受损神经的修复。
[0026] 2、本发明通过改良大鼠坐骨神经的方法获取大量纯化的雪旺细胞及海马组织获取神经干细胞，同时结合Laminin-chitosan-PLGA导管的优良的生物相容性、可降解性等优点及雪旺细胞和神经干细胞共培养的优点来修复周围神经，此种方法通过各项实验(电子显微镜、甲苯胺蓝染色、肌电图检测、共聚焦显微镜、电子喉镜等)验证可有效促进神经再生。
[0027] 3、本发明所制备的导管表面有层粘连蛋白膜，层粘连蛋白(Laminin)是神经基底膜的主要成分，主要参与细胞的粘附、持续维持神经轴突再生、并能影响细胞的生长、迁移和分化，有利于周围神经再生。同时LN也是重要的神经生长促进因子，有利于神经球的形成，当周围神经受损，受损位点的LN表达量增加，可持续维持轴突再生，促进神经分化。附图说明
[0028] 附图1是再生神经透射电镜示意图，图A-F分别表示术后第8周CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经透射电镜示意图；图G-K分别表示术后第12周CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经透射电镜示意图。
[0029] 附图2是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的第8周及第12周髓鞘厚度柱形图。
[0030] 附图3是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的第8周及第12周髓鞘直径柱形图。
[0031] 附图4是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的第8周及第12周髓鞘面积柱形图。
[0032] 附图5是甲苯胺蓝染色示意图，图A-F分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组甲苯胺蓝染色示意图；图G-L分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组甲苯胺蓝染色示意图。
[0033] 附图6是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组甲苯胺蓝染色下再生髓鞘计数示意图。
[0034] 附图7是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组喉肌中BDNF表达量的柱形图。
[0035] 附图8是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组喉肌中GDNF表达量的柱形图。
[0036] 附图9是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经中BDNF表达量的柱形图。
[0037] 附图10是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经中GDNF表达量的柱形图。
[0038] 附图11是环杓后肌肌电示意图，图A-F分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电示意图；图G-L分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电示意图。
[0039] 附图12是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电图潜伏期柱形图。
[0040] 附图13是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电图波幅柱形图。
[0041] 附图14是电子喉镜示意图，图A-F分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带张开状态时的结构示意图；图G-L分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带闭合状态时的结构示意图。
[0042] 附图15是电子喉镜示意图，图A-F分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带张开状态时的结构示意图；图G-L分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带闭合状态时的结构示意图。
具体实施方式
[0043] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0044] 实施例1制备Laminin-chitosan-PLGA导管的预实验
[0045] 一、实验方法
[0046] 1、制备Laminin-chitosan-PLGA导管
[0047] 方法一：
[0048] 将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.05％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.3mg/ml的纤粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，这样就完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜且整个实验过程均在水浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长，备用。
[0049] 方法二：
[0050] 将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.2％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.3mg/ml的纤粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，这样就完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜且整个实验过程均在水浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长，备用。
[0051] 方法三：
[0052] 将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.2％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的纤粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，这样就完成了一的LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜且整个实验过程均在水浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长，备用。
[0053] 2、检测
[0054] 取方法一、方法二、方法三制备得到的Laminin-chitosan-PLGA导管置于扫描电镜下观察。
[0055] 二、实验结果
[0056] 实验结果表明：方法一制备的Laminin-chitosan-PLGA导管的表面光滑，表明该导管不利于细胞黏附迁移；方法二制备的Laminin-chitosan-PLGA导管表面较方法一制备得到的Laminin-chitosan-PLGA导管表面粗糙，方法三制备的Laminin-chitosan-PLGA导管表面较方法二制备得到的Laminin-chitosan-PLGA导管表面粗糙。
[0057] 三、实验结论
[0058] 由上述实验结果表明：以下实验参数及制备方法满足导管扫描电镜结果要求：
[0059] 将PLGA导管，浸渍于0.2％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的纤粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，即完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜且整个实验过程均在水浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长。
[0060] 实施例2制备Laminin-chitosan-PLGA导管的条件优化
[0061] 一、实验方法
[0062] 1、制备Laminin-chitosan-PLGA导管
[0063] 将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.2％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的纤粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，即完成一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜且整个实验过程均在水浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长，对其进行培养，第8周将其取出置于扫描电镜下观察，并对其进行甲苯胺蓝染色，观察结果。
[0064] 2、参数设置
[0065] 改变壳聚糖溶液的浓度，分别为0.05％、0.1％、0.2％、0.5％，其余成分固定不变；改变纤粘连蛋白水溶液的浓度，分别为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml，其余成分固定不变；
将纤粘连蛋白水溶液换成层粘连蛋白水溶液，其余成分固定不变；将整个实验过程在水浴中进行换成整个实验过程在冰浴中进行，其余成分固定不变；每个实验进行3次重复操作，摸索在不同条件下的效果，寻找一最佳实验参数及条件。
将纤粘连蛋白水溶液换成层粘连蛋白水溶液，其余成分固定不变；将整个实验过程在水浴中进行换成整个实验过程在冰浴中进行，其余成分固定不变；每个实验进行3次重复操作，摸索在不同条件下的效果，寻找一最佳实验参数及条件。
[0066] 二、实验结果
[0067] 第8周的实验结果表明：实验条件为：壳聚糖溶液的浓度为0.1％，选择层粘连蛋白水溶液，且层粘连蛋白水溶液浓度为0.2mg/ml，在冰浴条件下制备得到的Laminin-chitosan-PLGA导管于扫描电镜下观察，其表面最粗糙；甲苯胺蓝染色结果表明该实验条件下制备得到的导管的髓纤维数目最多。
[0068] 三、实验结论
[0069] 由上述实验结果表明：制备Laminin-chitosan-PLGA神经导管的最优条件为：
[0070] 将PLGA导管，浸渍于0.1％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的层粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，即完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜且整个实验过程均在冰浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长。
[0071] 实施例3雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管
[0072] 一、实验方法
[0073] 1、分组及制备
[0074] 分别设置：Laminin-chitosan-PLGA导管组(NULL)、Laminin-chitosan-PLGA导管+雪旺细胞组(SC)、Laminin-chitosan-PLGA导管+神经干细胞组(NSC)、Laminin-chitosan-PLGA导管+雪旺细胞+神经干细胞组(CO)、自体神经移植组(AUTOGRAFT)、SHAM组。
[0075] 其中：Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法如下：将东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.1％浓度的壳聚糖溶液中，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出。将制备好的导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的层粘连蛋白水溶液中，20分钟后取出水洗2次，即完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤在PLGA导管表面进行LN多层膜处理且整个实验过程均在冰浴中进行。最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长。
[0076] 神经干细胞的获取及培养方法如下：SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部施行“T”形切口，充分暴露并拉出子宫，可见成串珠样排列的胚胎，结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，并用PBS冲洗除去血细胞，眼科剪小心剪开子宫，取出胚胎，并使用显微镊离断胎头，在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，然后分离出海马组织，将海马组织转移至规格为3.5mm预先铺有DMEM/F12(1:1)的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，然后将细胞悬液离以
750rpm/min的转速离心3min，将上清液转移至15ml离心管中，以1500rpm/min转速离心
5min，弃上清，细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基(NSCM)重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次。
750rpm/min的转速离心3min，将上清液转移至15ml离心管中，以1500rpm/min转速离心
5min，弃上清，细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基(NSCM)重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次。
[0077] 雪旺细胞的获取及培养方法如下：取3-5天新生SD大鼠，颈椎脱臼处死后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下出去外膜及结缔组织，使用眼科剪将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1溶液混合，置于37℃摇床45min-1h，然后置于离心机中以1500rpm/min，离心5min，弃上清，使用SCCM重悬，将细胞种于10cm细胞培养皿，每隔一天换液，视细胞生长情况传代，传代时弃去细胞上清液，加入浓度为0.2％的Dispase3ml(消化前，酶37℃水浴箱温热半小时)，细胞培养箱消化10-15min，轻轻拍打，显微镜下观察，雪旺细胞大部分消化下来即可，1500rpm/min，离心5min，SCCM重悬后以1×106的密度种植于10cm培养皿中；
[0078] 连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管的方法如下：将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管内，神经断端套入长度约为1mm，神经断端外6
膜与神经导管以10-0缝合线缝合，然后将22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞(约0.083×10个)与3.75μl神经干细胞(约0.083×106个)混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。
膜与神经导管以10-0缝合线缝合，然后将22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞(约0.083×10个)与3.75μl神经干细胞(约0.083×106个)混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。
[0079] 2、检测
[0080] 取第8周及第12周NULL、SC、NSC、CO、AUTOGRAFT、SHAM组的导管对其进行检测，检测项目包括透射电镜检测、甲苯胺蓝染色检测、Real-timeq-PCR检测、肌电图检测、电子喉镜检测。
[0081] 二、实验结果
[0082] 1、透射电镜实验结果
[0083] 透射电镜结果如图1-图4，附图1是再生神经透射电镜示意图，图1中A-F分别表示术后第8周CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经透射电镜示意图；G-K分别表示术后第12周CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经透射电镜示意图。附图2是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的第8周及第12周髓鞘厚度柱形图。附图3是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的第8周及第12周髓鞘直径柱形图。附图4是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的第8周及第12周髓鞘面积柱形图。
[0084] 术后第8周电镜下观察，CO组可见大量再生神经纤维，髓鞘厚且发育成熟，轴浆内富含微管和微丝，纤维束之间结缔组织较少；SC组和NULL组的再生神经纤维较CO组细小，数目少，排列松散扭曲且不规则，且髓鞘较薄。NSC组电镜下可见大量结缔组织、炎性细胞，还可见胞核分裂相及未吸收的Matrigel胶，但未见明显的新生髓鞘。术后第12周NSC组仍未见到明显的再生髓鞘，CO组、SC组、NULL再生髓鞘的数目较第8周时更多，髓鞘厚度也增加。
[0085] 通过对各组再生髓鞘厚度的测量，可得到如下结果：术后CO组、SC组、NULL组、AUTOGRAFG组再生髓鞘厚度随着时间延长而增加，术后第8周和第12周CO组髓鞘厚度均薄于SHAM组，但明显大于其他各组(P<0.05)。
[0086] 通过对各组再生髓鞘直径的测量，可得到如下结果：术后第8周CO组髓鞘直径比SHAM组小，与AUTOGRATR组无明显统计学差异，但大于SC组和NULL组。第12周时，CO组髓鞘直径小于SHAM组，但大于包括AUTOGRAFT组在内的其他各组(P<0.05)。
[0087] 通过对各组再生髓鞘面积的测量，可得到如下结果：术后第8周和第12周时表现为：两个监测时间点CO组髓鞘面积均比SHAM组小，与AUTOGRATR组无明显统计学差异，但明显大于其他各组(P<0.05)。
[0088] 2、甲苯胺蓝染色实验结果
[0089] 甲苯胺蓝染色实验结果如图5-图6。附图5是甲苯胺蓝染色示意图，其中A-F分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组甲苯胺蓝染色示意图，G-L分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组甲苯胺蓝染色示意图。附图6是术后CO、SC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组甲苯胺蓝染色下再生髓鞘计数示意图。
[0090] 术后对再生神经标本甲苯胺蓝染色后进行有髓纤维计数，CO组再生有髓神经纤维的数目随时间延长而增加，术后第8周CO组有髓纤维的数目均较AUTOGRAFT组及SHAM组少，但明显大于其他各组(P<0.05)，第12周结果同样是CO组有髓纤维的数目均较AUTOGRAFT组及SHAM组少，但明显大于其他各组(P<0.05)。
[0091] 3、Real-timeq-PCR检测结果
[0092] Real-timeq-PCR检测结果如图7-图10所示。附图7是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组喉肌中BDNF表达量的柱形图。附图8是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组喉肌中GDNF表达量的柱形图。附图9是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经中BDNF表达量的柱形图。附图10是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组再生神经中GDNF表达量的柱形图。
[0093] 术后第8周real-timeqPCR检测结果：CO组喉肌BDNF和GDNF的表达量显著高于其他各组(P<0.05)，再生神经中BDNF和GDNF的表达也是CO组最高。术后第12周qPCR检测结果：CO组喉肌BDNF和GDNF的表达量以及再生神经中BDNF和GDNF的表达含量均显著高于其他各组(P<0.05)。
[0094] 4、肌电图检测结果
[0095] 肌电图检测结果如图11-图13所示。附图11是环杓后肌肌电示意图，其中A-F分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电示意图，G-L分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电示意图。附图12是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电图潜伏期柱形图。附图13是术后第8周及第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组的环杓后肌肌电图波幅柱形图。
[0096] 术后第8周肌电图检查结果可见，CO组潜伏期长于SHAM组，但明显短于其他各组，波幅低于SHAM组，但明显高于其他各组。第12周时，CO组潜伏期长于SHAM组，但明显短于其他各组，波幅低于SHAM组，但明显高于其他各组(P<0.05)。
[0097] 5、电子喉镜检测结果
[0098] 电子喉镜检测结果如图14-图15所示，附图14是电子喉镜示意图，其中A-F分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带张开状态时的结构示意图，G-L分别表示术后第8周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带闭合状态时的结构示意图。附图15是电子喉镜示意图，其中A-F分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带张开状态时的结构示意图，G-L分别表示术后第12周CO、SC、NSC、NULL、AUTOGRAFT、SHAM组电子喉镜下声带闭合状态时的结构示意图。
[0099] 共培养组(CO组)第8周时喉镜下可见术侧杓状软骨外展稍差，外展起始较对侧略延迟，声门不能完全闭合；第12周时镜下见术侧杓状软骨基本恢复外展功能，声门闭合良好。SC组第8周可见术侧杓状软骨固定，对侧代偿，声门不能完全闭合；第12周镜下可以观察到术侧杓状软骨外展稍差，外展起始较对侧延迟，声门不能完全闭合。NULL组第8周时电子喉镜下见术侧杓状软骨固定于旁正中位，左侧代偿，声门不能完全闭合；第12周镜下表现为术侧杓状软骨外展较差，声门不能完全闭合；NSC组第8周及第12周术侧杓状软骨均固定于旁正中位，左侧代偿，声门不能完全闭合。AUTOGRATR组第8周和第12周电子喉镜下表现均与CO组相似。
[0100] 此外，将本发明制备得到的雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管应用于受损神经的修复时，未出现排斥反应，且应用的过程中发现本发明制备的导管可降解性很好。
[0101] 三、实验结论
[0102] 由上述实验结果表明：在术后神经电生理、神经营养因子的分泌、术后再生髓鞘数目和面积方面，CO组的结果都优于SC组、NSC组、NULL组。
[0103] 本发明制备的雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管具有很好的生物相容性、可降解性；且所使用材料的降解时间和神经纤维的生长速度相适应，可很好地促进受损神经的修复。本发明通过改良大鼠坐骨神经的方法获取大量纯化的雪旺细胞及海马组织获取神经干细胞，然后结合Laminin-chitosan-PLGA导管的优良的生物相容性、可降解性等优点及雪旺细胞和神经干细胞共培养的优点来修复周围神经，此种方法通过各项实验(电子显微镜、甲苯胺蓝染色、肌电图检测、共聚焦显微镜、电子喉镜等)验证可有效促进神经再生。本发明所制备的导管表面有层粘连蛋白膜，层粘连蛋白(Laminin)是神经基底膜的主要成分，主要参与细胞的粘附、持续维持神经轴突再生、并能影响细胞的生长、迁移和分化，有利于周围神经再生，同时LN也是重要的神经生长促进因子，有利于神经球的形成，当周围神经受损，受损位点的LN表达量增加，持续维持轴突再生，促进神经分化。
[0104] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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