制备α1－抗胰蛋白酶的方法
专利汇可以提供制备α1－抗胰蛋白酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种原料来源丰富、价格低廉，纯度较高、操作简便的α1－AT制备方法。本发明采用了如下步骤：(1)抽提蛋白，(2)杂蛋白的变性处理，(3)分离杂蛋白，(4)病毒灭活，(5)纯化，(6) 超滤 、配制、去病毒来制备α1－AT。本发明采用 血浆 分离的废弃物即低温 乙醇 分离法所获得的组分IV为原料，获得具有 治疗 价值的α1－AT，从而提供了人血浆的综合利用能 力 ，降低生产成本，提高经济效益；在纯化 α1－AT过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换 树脂 及苯基琼脂糖凝胶，可获得高纯度的α1－AT；在生产过程中采用了巴斯消毒法进行病毒灭活，同时运用15～20nm 膜过滤 去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。，下面是制备α1－抗胰蛋白酶的方法专利的具体信息内容。
1.一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：
(1)抽提蛋白：低温乙醇分离法所获得的组分IV沉淀溶于pH8.60～8.90的90～ 110mM Tris+10～20mM NaCl缓冲液中，其w/v比例为1∶3～5，在2～8℃条 件下搅拌1～2h后，用滤器压滤，得滤液a；
(2)杂蛋白的变性处理：滤液a中加入还原剂即1，4-二硫苏糖醇，使其浓度 为10～30mM，反应温度控制在2～8℃，pH为8.60～8.90，搅拌2～4h后用滤 器压滤，得滤液b；
(3)分离杂蛋白：
A、滤液b过DEAE-Sephrose或DEAE-SephroseFF阴离子交换柱进行纯化， 其层析柱用pH8.40～8.80、20～80mM的Tris缓冲液平衡，样品的pH控制在 8.40～8.80；
B、用pH7.20～7.80、20～80mMTris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；
C、选用pH7.20～7.80、NaCl浓度为0.03～0.07M的20～80mMTris缓冲液洗脱， 温度控制在室温，分别收集洗脱峰，可获得含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液A；
(4)病毒灭活：洗脱液A中加入保护剂，保护剂为盐类、糖类、氨基酸或其 混合物，采用巴斯德消毒法即在60℃作用10小时进行病毒灭活；
(5)纯化：
A、病毒灭活后液体中加入固体硫酸铵，使其浓度达到0.8～1.2M，室温下搅拌 10～20分钟后过滤，得滤液c；
B、滤液c上疏水层析柱，使用苯基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，柱子先用 pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液平衡；
C、用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液清洗柱子，一 般洗3～5个柱体积；
D、选用含0.3～0.6M硫酸铵的30～70mMTris，其pH7.30～7.70的缓冲液洗脱， 收集洗脱峰，得到含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液B；
(6)超滤、配制、去病毒及制备：
洗脱液B用10000分子量超滤膜进行超滤透析，透析液为pH6.6～7.4、含 25～45mM氯化钠、2～5％甘露醇的10～30mM磷酸缓冲液，后浓缩α1-抗胰蛋白 酶溶液，所有操作在2～8℃条件下；用透析液将蛋白含量调整到20～50mg/ml， 采用15～20nm膜过滤去除病毒，并除菌过滤后分装。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的还原剂1，4-二硫苏糖醇， 优选使用浓度为15mM。
3.根据权利要求1和/或2的制备方法，其特征在于所说的离子交换层析介质 为弱阴离子交换树脂，优选采用DEAE-SephroseFast Flow。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的病毒灭活步骤中，优选在 存在柠檬酸钠、糖、氨基酸或其混合物条件下的巴斯德消毒。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的疏水层析优选在苯基琼脂 糖凝胶上进行。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于所说的步骤(6)的病毒灭活步骤中， 用孔径15～20nm的钠米膜进行病毒颗粒的分离。
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是一种药用α1-抗胰蛋白酶制剂的制备方法。
背景技术
正常情况下α1-AT由肝大量的生成并分泌，在血浆中以较高浓度(典型浓 度为1.3mg/ml)循环；另外生理有效的并且足够浓度的α1-AT发现于健康人的 一些器官，尤其是肺液(上皮层液)中。α1-AT的活性下降，可源于数量上的缺 乏，如先天性的α1-AT缺乏症；也可由于功能性的不足，如吸烟和细菌感染时抗 蛋白酶的活性中心失活。研究结果表明，对于α1-AT缺乏患者，服用外源型人 α1-AT可以抑制弹性蛋白酶，从而改善存活率，降低肺部功能损失率，因此用外 源性α1-AT替代或补充这些炎症性肺病是可取的(Crystal et al.，AM.J.Respir.Crit. Care Med.158：49～59(1998)；Mathadeva R and Lomas D.，Thorax53：501～ 505(1998))。
因为α1-AT在临床应用中的治疗作用，α1-AT产品被广泛进行研究。Glaser 等(Biochemistry，5：333～348(1975))揭示了一种从Cohn组分沉淀分离α1-AT 的方法，该沉淀用pH8.5的磷酸缓冲液溶解并搅拌来激活α1-AT(在pH5.2的 Cohn组分中α1-AT大部分失活)，透析和离心，上清液过两次离子交换柱，首先 在pH6.0～7.6和8.6条件层析，接着在pH7.6和8.0条件下进一步层析，产生的 α1-AT收率在30％左右。
Coan等(Vax Sang48：333～342(1985)；Amer J Med84(sup6A)：32～ 36(1988)；Eur Respie J3(sup9)：16s-20s(1990))发明一种工艺，从Cohn组分 IV-1中获得45％的α1-AT，其纯度大约在60％。该工艺是用pH6.5～8.5的缓冲 液溶解Cohn组分IV-1沉淀，加入PEG，并将pH降低到4.6～5.7，从而沉淀杂 蛋白；然后离心，上清经离子交换层析分离。
Arrighi等(欧洲专利EP0717049)提出了一种提取α1-AT工艺。Cohn组 分IV-1用pH8.2的缓冲液溶解并搅拌1小时，温度控制在42℃；后用硫酸铵沉 淀杂蛋白，离心，上清在pH7.2条件下经疏水层析分离。
Glaser等(Anal.Biochem124：364～371(1982)；欧洲专利EP0067293)发明 了从Cohn组分IV-1沉淀中分离α1-AT方法。该方法是用pH8.5的缓冲液溶解 Cohn’s低温乙醇工艺的沉淀物组分IV-1，采用二硫苏糖醇处理，并综合硫酸铵沉 淀、DEAE-纤维素层析，所提取获得的α1-AT纯度只有70％左右。
Lebing等(美国专利WO02/48176A1)利用沉淀方法去除部分杂蛋白， 离心所得到的上清液经离子交换介质层析收集α1-AT，再将收集到的α1-AT溶液 用阳离子介质分离，所得的溶液经冻干加热法、去污剂及纳米膜过滤等方法去 除脂包膜和非脂包膜病毒。
1987年Bayer公司制备的α1-蛋白酶抑制剂(人源性)首先上市，该产品 是一种无菌、稳定、冻干的纯化人血浆α1-蛋白酶抑制剂(α1-AT，Prolastin)制 品，也称之为α1-抗胰蛋白酶。制备的方法是利用Cohn低温乙醇分离法的组分 IV-1，采用聚乙二醇(PEG)沉淀、离子交换层析等提取，并运用巴氏消毒法进 行病毒灭活，生产的制剂中α1-AT特异活性为每mg总蛋白功能性α1-AT≥0.35mg， 纯度为45～80％。
Alpha Terapeutic Corporation制备的α1-蛋白酶抑制剂(人源性)是一种无 菌、稳定、冻干的纯化人血浆α1-蛋白酶抑制剂(α1-PI)制品，也称之为α1-抗 胰蛋白酶。它是由大量混合人血浆制备的，采用了Cohn低温乙醇分离方法、得 到组分IV1+4；组分IV1+4用PH6.0、0.1M NaCl溶解，搅拌，离心，收集沉淀； 沉淀溶解在PH8.5、含10.0mM Tris和150.0mM NaCl溶液中，搅拌后再将PH 调到8.0，加入PEG至15％浓度，搅拌；过滤，收集滤过液；PEG滤过液中加 入ZnCl2，使其终浓度为6.0mM，将溶液PH值调整到7.5，然后降温到5℃，搅 拌，离心收集沉淀；沉淀用50mM EDTA-Na2溶解，浓缩透析；透析液体经SD 处理灭活病毒；SD处理后的α1-PI溶液上离子交换层析柱，用含有PH8.0、20mM NaCl和20mM磷酸盐(NaH2PO4)缓冲液冲洗；后用PH8.0、100mM NaCl和 20mM磷酸盐(NaH2PO4)洗脱液进行洗脱，收集含有α1-PI的洗脱液；洗脱液 用1％(wt/wt)斑脱土在20℃条件下作用，过滤，滤液经超滤浓缩，使α1-PI活 性达到10单位/ml以上，浓缩液经除菌过滤，分装，冻干。
朱威和祝慈芳等(中国生物制品杂志14(2)：97～101(2001))提出了从 人血浆分离的组分IV-1中纯化α1-AT的方法。该方法是Cohn组分IV用缓冲液以 1∶10比例35～37℃抽提，上清液通过PEG、HCl等作有机溶剂、等电点沉淀处 理后，所获得上清继续以有机溶剂沉淀。将离心分离所得沉淀复溶后，调整蛋 白浓度及pH，加入由多糖、盐类、氨基酸等组成的保护剂，在液态状态下作 60℃10h加热处理进行病毒灭活，然后用离子交换凝胶作搅拌吸附，所获洗脱液 经超滤浓缩后作分子筛层析，收集活性部分，再经超滤浓缩，除菌过滤，分装 冻干即获得α1-抗胰蛋白酶制剂。
已经描述的制备α1-AT的各种方法中，有些方法只注重利用有机溶剂进行 沉淀或者单纯应用离子交换层析来富集α1-AT，致使纯化所得到的α1-AT纯度达 不到现有技术的要求。而部分地与离子交换凝胶联合使用其它制备方法，象使 用吸附或沉淀方法，例如与聚乙二醇、锌鳌合剂或肝素吸附剂等一起孵育，这 些方法用于或进一步纯化α1-AT，只是其中的每一种方法都必须付出或多或少地 损失产物收率的代价(原则上产物损失随制备步骤数的增加而增加)；另外，这 些方法往往制备时间被延长，从而将降低α1-AT的完整性和活性，并增加生产成 本。
发明内容
所叙述的本发明制备方法包括以下步骤：
(1)抽提蛋白：低温乙醇分离法所获得的组分IV沉淀溶于pH8.60～8.90的 90～110mM Tris+10～20mM NaCl缓冲液中，其比例为1∶3～5的(w/v)，在2～8℃ 条件下搅拌1～2h后，用滤器压滤，得滤液a；
(2)杂蛋白的变性处理：滤液a中加入还原剂1，4-二硫苏糖醇(DTT)，使其 浓度为10～30mM，反应温度控制在2～8℃，pH为8.60～8.90，搅拌2～4h后用滤 器压滤，得滤液b；
(3)分离杂蛋白：滤液b过阴离子交换柱(DEAE-Sephrose、DEAE-Sephrose FF，层析柱用pH8.40～8.80、20～80m mM的Tris缓冲液平衡)进行纯化，样品 的pH控制在8.40～8.80；用pH7.20～7.80、20～80mMTris缓冲液清洗柱子，一般 洗3～5个柱体积；选用pH7.20～7.80、NaCl浓度为0.03～0.07M的20～80mMTris 缓冲液洗脱，温度控制在室温，分别收集洗脱峰，获得含α1-抗胰蛋白酶的洗脱 液A；
(4)病毒灭活：洗脱液A中加入保护剂，保护剂为盐、糖、氨基酸或其混合物， 采用巴斯德消毒法(60℃作用10小时)进行病毒灭活；
(5)纯化：病毒灭活后液体中加入固体硫酸铵，使其浓度达到0.8～1.2M，室温 下搅拌10～20分钟后过滤，得滤液c；滤液c上疏水层析柱(应用苯基琼脂糖凝 胶、辛基琼脂糖凝胶等，柱子先用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液平衡)；用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液 清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；选用含0.3～0.6M硫酸铵的30～70mMTris (pH7.30～7.70)缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液B；
(6)超滤、配制、去病毒及制备：洗脱液B用10000分子量超滤膜进行超滤透 析，透析液为10～30mM磷酸缓冲液(pH6.6～7.4，其中含25～45mM氯化钠、2～5％ 甘露醇)，后浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液，所有操作在2～8℃条件下；用透析液将蛋 白含量调整到20～50mg/ml，采用15～20nm膜过滤去除病毒，并除菌过滤后分装。
本发明的优点在于：1、采用血浆分离的废弃物即组分IV为原料，获得具 有治疗价值的α1-AT，从而提供了人血浆的综合利用能力，降低生产成本，提供 经济效益；2、纯化α1-AT过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换树脂及 苯基琼脂糖凝胶，可获得高纯度的α1-AT；3、生产过程中采用了巴氏消毒法进 行病毒灭活，同时运用20nm膜过滤去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。
附图说明
图1为本发明SDS-PAGE凝胶电泳图。
图中a蛋白标准品；b抽提液；c DTT处理的α1-AT样品；d离子 交换层析后的α1-AT样品；e疏水层析后的α1-AT样品。
具体实施方式
实施例1
2000g组分IV沉淀溶于8000ml、pH8.80、100mM Tris+10mM NaCl溶液， 2～8℃搅拌1.5小时后，压滤，得滤液7700ml，pH8.90。
实施例2
7700ml滤液中加入176g的1，4-二硫苏糖醇(DTT)，使DTT浓度达到15mM， 搅拌3小时，反应温度控制在2～8℃，压滤，得滤液7100ml，pH8.64。
实施例3
DEAE-Sephrose FF柱先用50mMTris缓冲液清洗，洗5个柱体积；7100ml 滤液上离子交换层析柱，样品的pH为8.60；上样后用pH7.50的50mMTris缓 冲液清洗柱子；然后选用pH7.50、NaCl分别为0.03～0.07M的50mMTris缓冲 液洗脱，分别收集洗脱峰；所有过程温度控制在20～25℃条件下进行。收集含 α1-AT的洗脱液2700ml。
实施例4
2700ml洗脱液加入甘氨酸、蔗糖和柠檬酸钠，使其浓度分别为3％(w/v)、 50％(w/v)和0.5M，室温让其全部溶解后，除菌过滤并采用60℃处理10小时 进行病毒灭活；
实施例5
大约3000ml病毒灭活液中加入152g硫酸铵，使其浓度为1M，室温搅拌 15分钟后过滤，滤液上疏水层析柱(柱中填料为苯基琼脂糖凝胶，柱子先用含 1M硫酸铵的50mMTris缓冲液平衡5个柱体积)。后用pH7.50、含1M浓度硫 酸铵的50mM Tris缓冲液清洗。再选用含0.4M硫酸铵浓度的50mMTris(pH7.50) 缓冲液洗脱，收集洗脱液3500ml。
实施例6
3500ml洗脱液用分子量10000道尔顿的超滤膜进行超滤透析，去除硫酸铵 及Tris，透析液为20mM磷酸缓冲液(pH7.0，其中含45mM NaCl，3％甘露醇)， 后将α1-抗胰蛋白酶溶液浓缩，所有操作均在2～8℃条件下进行。室温下用20mM 磷酸缓冲液将浓缩液的蛋白含量调整到20mg/ml，再采用20nm膜过滤去除病毒； 然后除菌过滤、分装冻干。
本发明采用了如下步骤：(1)抽提蛋白，(2)杂蛋白的变性处理，(3)分 离杂蛋白，(4)病毒灭活，(5)纯化，(6)超滤、配制、去病毒来制备α1-AT。 本发明采用血浆分离的废弃物即组分IV为原料，获得具有治疗价值的α1-AT，从 而提供了人血浆的综合利用能力，降低生产成本，提供经济效益；在纯化α1-AT 过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换树脂及苯基琼脂糖凝胶，可获得 高纯度的α1-AT；在生产过程中采用了巴氏消毒法进行病毒灭活，同时运用 15～20nm膜过滤去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。
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