采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法
阅读：941发布：2024-02-12
专利汇可以提供采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 柴油 的制备，特别是指一种采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法。包括培养小球藻、湿小球藻破壁、转酯化获得生物柴油等工艺步骤；本发明解决了 现有技术 存在的生物柴油的生产成本较高的技术难题。具有所制备的生物柴油的 密度 、运动黏度和 十六烷值 等主要技术指标符合国标要求，生物柴油的转化率可达90％以上，可大幅度降低生物柴油的生产成本等优点。，下面是采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法专利的具体信息内容。
1.采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、培养小球藻
在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：摇瓶培养，培养基按照体积比为40％的比例装量，接种量为每升含有碳源的BG11培养基接入小球藻0.05g-0.2g，培养温度为23℃-28℃，摇床转速为120转/分钟-220转/分钟，培养周期6-
10天；
B、湿小球藻破壁
将步骤A中获得的发酵液高速离心后获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入5mL-
20mL蒸馏水以及0.01％-1％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，将酶解后的物料高速离心后获得破壁的湿小球藻；
C、转酯化获得生物柴油
在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中按照每0.5克小球藻干重加入2mL-5mL的乙醇和10μL-60μL的液体脂肪酶的比例加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为25℃-40℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，时间为24小时-96小时。
2.根据权利要求1所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤A中的小球藻选自普通小球藻Chlorella vulgaris Carolina 15-2075、小球藻Chlorella zofingiensis ATCC 30412、普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395和蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9、原始小球藻Chlorella protothecoides CS-1、小球藻Chlorella sacchrarophila FACHB-4、小球藻Chlorella luteorividis FACHB-1中的一种。
3.根据权利要求1所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于步骤A中每升含有碳源的BG11培养基包含如下质量的原料：
NaNO3 0.1g-2g；K2HPO4 0.02g-0.1g；碳源；MgSO4·7H2O 0.025g-0.1g；CaCl2·H2O
0.01g-0.05g；Na2CO3 0.01g-0.1g；C6H8O7 0.001g-0.01g；EDTA 0.001g-0.01g；微量元素溶液0.5mL-2mL。
4.根据权利要求3所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于每升微量元素溶液包含如下质量的原料：
H3BO3 2g-4g；MnCl2·4H2O 1g-2.5g；ZnSO4·7H2O 0.1g-0.3g；NaMoSO4·2H2O 0.2g-
0.5g；CuSO4·5H2O 0.01g-0.1g；Co(NO3)2·6H2O 0.01g-0.1g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤A中的碳源选自葡萄糖、糖蜜、蔗糖、果糖和甘露糖中的一种。
6.根据权利要求5所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤A中的碳源用量分别为每升含有碳源的BG11培养基中含有葡萄糖1g-40g、或者糖蜜0.5g-20g、或者蔗糖1g-30g、或者果糖1g-30g，或者甘露糖1g-35g。
7.根据权利要求1所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中高速离心的条件是：转速为3000转/分钟-8000转/分钟，时间为3分钟-10分钟。
8.根据权利要求1所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为15000U/g-100000U/g。
9.根据权利要求8所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中的酶解条件是：温度为35℃-55℃、转速为150转/分钟-250转/分钟、酶解时间为4小时-24小时。
10.根据权利要求1所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤C中液体脂肪酶的酶活为5KLU/g-20KLU/g。
11.根据权利要求1或10所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤C中液体脂肪酶选自由丹麦诺维信公司生产的如下液体脂肪酶中的一种：南极假丝酵母脂肪酶A，英文缩写CALA，商品名 AD L，酶活6KLU/g；南极假丝酵母脂肪酶B，英文缩写CALB，商品名 CALB L，酶活5KLU/g；嗜热霉菌脂肪酶，英文缩写TL，商品名 TL，酶活20KLU/g；黑曲霉脂肪酶PLA1，英文缩写PLA1，商品名Ultra phospholipase A1，酶活10KLU/g。
12.根据权利要求1所述的采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤C中转酯化反应后将反应体系在转速为3000转/分钟-8000转/分钟的条件下离心3分钟-10分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物柴油的制备，特别是指一种采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法。
背景技术
[0002] 小球藻是最有潜力被开发成微藻生物柴油的藻种之一。这是因其具有生长速度快，固定二氧化碳效率高和油脂含量高(Cheng et al.,2017；Park et al.,2015)。此外，利用废水和烟气中的二氧化碳培养小球藻，不仅可以产生所需的富油藻体，而且还可以解决环境污染问题(Bach et al.,2017；
[0003] Rodriguez et al.,2016)。因此，开发小球藻生物柴油是目前研发微藻生物质能源的一个热点方向。已有大量研究表明利用小球藻制备生物柴油的品质指标(如密度、运动黏度和十六烷值)可达到中国生物柴油企业标准(标准代号：Q/WHRD 01-2003)、柴油机燃料调合用生物柴油(BD100)(GB/T
[0004] 20828-2015)和美国生物柴油标准(ASTM D6751-2003)的品质指标(Shuba et al.,2018；Sheehan et al.,2018；Rodriguez et al.,2016；Song et al.,2013；Sun et al.,2015；梅帅，2013)。国家质量监督检验检疫总局及国家质量标准化监督委员会于2017年9月1日颁布并实施了由石油化工研究院起草的《B5柴油》的国家标准(标准代号GB 25199-2017)。
[0005] 当前，利用湿藻体开发生物柴油的方法有酸催化法、碱催化法和酶法(Kim et al.,2015；Rodriguez et al.,2016)。虽然酸或碱催化法催化湿藻体可获得高的生物柴油转化率，但这两种方法的主要缺点如下(Chen et al.，2015；Kim et al.，2015；Rodriguez et al.，2016)：一是需要强酸或强碱作为催化剂；二是对设备有腐蚀性；三是反应需要较高的温度；四是反应完后，需消耗大量的水，稀释藻渣至中性。因此，利用酸或碱催化法催化微藻藻体制备生物柴油，并非是一种绿色且节能的方法(Chen et al.,2015；Kim et al.，2015；Rodriguez et al.，2016)。为了克服上述技术缺陷，研究者已利用酶法开发微藻生物柴油(Kim et al.，2015；Lopez et al.，2016；Law et al.，2018)。值得注意的是，现有所报道关于酶法制备微藻生物柴油的研究主要采用固定化酶。如Lopez等人(Lopez et al.，
2016)利用固定化酶Novozym 435催化微拟球藻藻体制备生物柴油。事实上固定化酶的价格高，不利于生产廉价的生物柴油(Mata et al.，2017)。此外，固定化酶催化微藻藻油或藻粉，往往表现出很差的可利用性(Lopez et al.，2016)。与固定化酶相比，液体酶的价格低廉(Mata et al.，2017)。Price et al等人(Price et al.，2016)研究表明，利用液体酶生产生物柴油是一种经济且可行的策略，酶使用成本仅占总成本的5％。至今常用于制备生物柴油的商用酶主要有南极假丝酵母脂肪酶(CALA和CALB)、嗜热霉菌(TL)、黑曲霉(PLA1)等(Cesarini et al.，2014；Christopher et al.，2014；Guldhe et al.，2015；Baut ista et al.，2015；Amoah et al.，2016；Law et al.，2018)。近年来随着生物技术的发展，促进了这些酶的生产成本大大降低(Cherry and Fidantsef,2003；Demain and Vaishnav,2009)。因此液体酶成为一种最有潜力开发微藻生物柴油的生物催化剂。
2016)利用固定化酶Novozym 435催化微拟球藻藻体制备生物柴油。事实上固定化酶的价格高，不利于生产廉价的生物柴油(Mata et al.，2017)。此外，固定化酶催化微藻藻油或藻粉，往往表现出很差的可利用性(Lopez et al.，2016)。与固定化酶相比，液体酶的价格低廉(Mata et al.，2017)。Price et al等人(Price et al.，2016)研究表明，利用液体酶生产生物柴油是一种经济且可行的策略，酶使用成本仅占总成本的5％。至今常用于制备生物柴油的商用酶主要有南极假丝酵母脂肪酶(CALA和CALB)、嗜热霉菌(TL)、黑曲霉(PLA1)等(Cesarini et al.，2014；Christopher et al.，2014；Guldhe et al.，2015；Baut ista et al.，2015；Amoah et al.，2016；Law et al.，2018)。近年来随着生物技术的发展，促进了这些酶的生产成本大大降低(Cherry and Fidantsef,2003；Demain and Vaishnav,2009)。因此液体酶成为一种最有潜力开发微藻生物柴油的生物催化剂。
[0006] 利用酶法催化微藻藻体生产生物柴油有提油再转酯化和直接转酯化两种方法。提油再转酯化方法是先通过提油方法提取藻油，再利用脂肪酶催化藻油制备生物柴油(Lee et al.,2013；Tran et al.,2013；Huang et al.,2015)。众所周知现有的微藻提油技术常用有毒或低毒的有机试剂，且是高能耗和耗时的方法，无疑限制了提油再转酯化方法规模化开发小球藻生物柴油(杨凯，2015；Tran,et al.,2013；Huang et al.,2015)。因此，提油再转酯化并非一种理想生产低值的微藻生物柴油的方法。为此，研究者开发脂肪酶直接转酯化微藻制备生物柴油的方法。正如上述所述，2016年Lopez等人首次先利用高压均浆法破碎微拟球藻细胞，再利用固定化脂肪酶(Novozym 435，南极假丝酵母脂肪酶B固定在大孔丙烯酸树脂)催化已破碎的藻体，可获得生物柴油的转化率可达99％(Lopez et al.,2016)。但是，高压均浆法破碎微藻细胞是一个高能耗的处理过程(Gunerken et al.,2015)，即处理1Kg湿藻体(微藻干重4.1％)需要消耗6.08kWh/kg样品(Gunerken et al.,2015)。此外，在Lopez的研究中，固定化脂肪酶Novozym435的价格约7000元/kg，是液体脂肪酶形式价格的42倍。另外，固定化脂肪酶在催化微藻过程中，其表现出很差的可再利用性，即总可再利用次数小于3次。上述证据表明，从经济角度衡量利用高压均浆法处理微藻细胞，再利用固定化酶直接催化微藻制备低值的生物柴油的工艺路线，在工业化生产中并不可行。因此降低生物柴油的生产成本，使其便于产业化并具有实际应用的价值已成为目前本领域技术人员研究的主要方向及技术难题。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法。通过采用酶解破壁微藻以及利用液体脂肪酶进行转酯化反应，在保证所获得的生物柴油的品质以及反应转化率的前提下，有效降低了生物柴油的生产成本。
[0008] 本发明的整体技术构思是：
[0009] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0010] A、培养小球藻
[0011] 在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：摇瓶培养，培养基按照体积比为40％的比例装量，接种量为每升含有碳源的BG11培养基接入小球藻0.05g-0.2g，培养温度为23℃-28℃，摇床转速为120转/分钟-220转/分钟，培养周期6-10天；
[0012] B、湿小球藻破壁
[0013] 将步骤A中获得的发酵液高速离心后获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入5mL-20mL蒸馏水以及0.01％-1％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，将酶解后的物料高速离心后获得破壁的湿小球藻；
[0014] C、转酯化获得生物柴油
[0015] 按照每0.5克小球藻干重加入2mL-5mL的乙醇和10μL-60μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为25℃-40℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，时间为24小时-96小时。
[0016] 本发明的具体技术构思还有：
[0017] 本发明中的小球藻可以采用多种现有藻种实现，其选择并不脱离本发明的技术实质，其中较为优选的技术方案是，所述的步骤A中的小球藻选自普通小球藻Chlorella vulgaris Carol ina 15-2075、小球藻Chlorella zofingiensis ATCC 30412、普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395和蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9、原始小球藻Chlorella protothecoides CS-41、小球藻Chlorella sacchrarophila FACHB-4、小球藻Chlorella luteorividis FACHB-1中的一种。
[0018] 所述的普通小球藻Chlorella vulgaris Carol ina 15-2075购自美国卡罗莱纳州生物供应公司(Carol ina Biological Supply Co.,Burl ington,USA)，小球藻Chlorella zofingiensis ATCC 30412购自美国模式菌种收集中心(American type culture col lection)，普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校微藻保藏库(Culture Col lection of Algae at The Univers ity of Texas at Austin)，蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9、小球藻Chlorella sacchrarophila FACHB-4、小球藻Chlorella luteorividis FACHB-1购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，原始小球藻Chlorella protothecoides CS-41购自澳大利亚CSIRO海洋实验室(CSIRO Marine Laboratory，Hobart Austral ia)；其中优选普通小球藻Chlorella vulgaris Carol ina 15-2075、小球藻Chlorella zofingiensis ATCC 30412、普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395和蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9。
[0019] 为满足小球藻生长的需要，优选的技术方案是，步骤A中每升含有碳源的BG11培养基包含如下质量的原料：
[0020] NaNO3 0.1g-2g；K2HPO4 0.02g-0.1g；碳源；MgSO4·7H2O 0.025g-0.1g；CaCl2·H2O 0.01g-0.05g；Na2CO3 0.01g-0.1g；C6H8O7 0.001g-0.01g；EDTA0.001g-0.01g；微量元素溶液
0.5mL-2mL。
0.5mL-2mL。
[0021] 微量元素溶液优选采用如下技术方案，每升微量元素溶液包含如下质量的原料：
[0022] H3BO3 2g-4g；MnCl2·4H2O 1g-2.5g；ZnSO4·7H2O 0.1g-0.3g；NaMoSO4·2H2O0.2g-0.5g；CuSO4·5H2O 0.01g-0.1g；Co(NO3)2·6H2O 0.01g-0.1g。
[0024] 更为优选的碳源选择及用量为，所述的步骤A中的碳源用量分别为每升含有碳源的BG11培养基中含有葡萄糖1g-40g、或者糖蜜0.5g-20g、或者蔗糖1g-30g、或者果糖1g-30g，或者甘露糖1g-35g。
[0025] 为便于快速收集小球藻，优选的技术方案是，所述的步骤B中高速离心的条件是：转速为3000转/分钟-8000转/分钟，时间为3分钟-10分钟
[0026] 为提高纤维素酶对湿小球藻酶解破壁效果，缩短酶解破壁反应时间，优选的技术实现方式是步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为15000U/g-100000U/g。1U的纤维素酶酶活定义为：纤维素酶在温度为50℃和pH为4.8条件下水解作用纤维素1分钟所释放1微克葡萄糖。
[0027] 更为优选的技术方案是，所述的步骤B中的酶解条件是：温度为35℃-55℃、转速为150转/分钟-250转/分钟、酶解时间为4小时-24小时。
[0028] 为提高转酯化反应的技术效果，优选的技术实现手段是，所述的步骤C中液体脂肪酶的酶活为5KLU/g-20KLU/g。1KLU的脂肪酶酶活为，脂肪酶在温度为37℃和pH为7.2条件下水解作用三丁酸甘油酯1分钟释放1毫摩尔的丁酸。
[0029] 更为优选的技术方案是，所述的步骤C中液体脂肪酶选自由丹麦诺维信公司生产的如下液体脂肪酶中的一种：南极假丝酵母脂肪酶A，英文缩写CALA，商品名 AD L，酶活6KLU/g；南极假丝酵母脂肪酶B，英文缩写CALB，商品名 CALB L，酶活5KLU/g；嗜热霉菌脂肪酶，英文缩写TL，商品名 TL，酶活20KLU/g；黑曲霉脂肪酶PLA1，英文缩写PLA1，商品名 Ultra phosphol ipase A1，酶活10KLU/g。
[0030] 粗生物柴油的提取优选采用如下技术手段实现：所述的步骤C中转酯化反应后将反应体系在转速为3000转/分钟-8000转/分钟的条件下离心3分钟-10分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0031] 为验证本发明的技术效果，申请人采用如下方法对本发明所获得的生物柴油品质及生物柴油的转化率进行测试：
[0032] 1、转化率测定
[0033] 反应进行完毕后，反应物在5000转/分钟条件下离心5分钟，收集上清液。向下层固形物中再加5mL无水乙醇，5000转/分钟的转速下离心5分钟，收集上清液。将两次的上清液混合后，旋转蒸发去除乙醇。取2mg的反应物，加1mL正己烷(含0.5mg十七烷酸甲酯)，利用气相色谱仪，测定脂肪酸乙酯含量。取2mg的反应物，加1mL0.5M氢氧化钠-甲醇溶液，于80℃反应10分钟；冷却后，加1mL14％三氟化硼-甲醇溶液，于80℃反应2分钟。反应完成后，冷却至室温，加0.2mL饱和盐溶液(270mg/mL的氯化钠和1.5mg/mL的氯化钾)，振荡10秒后，加入1mL正己烷(含0.5mg十七烷酸甲酯)。充分振荡后，取正己烷，利用气相色谱仪，测定可皂化的脂肪酸含量。生物柴油的转化率＝(100％×脂肪酸乙酯含量/可皂化的脂肪酸含量)。
[0034] 2、主要品质指标的测定
[0035] 依据国标记载，评估所制备的生物柴油中密度、运动黏度和十六烷值等三个主要品质指标。
[0036] 本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：
[0037] 1、采用本发明的方法所制备的生物柴油的密度(860-880kg/m3)、运动黏度(4.43-4.52mm2/s)和十六烷值(52-56)，符合国标中对于生物柴油的主要技术指标要求，生物柴油的转化率可达90％以上。
[0038] 2、采用酶解破壁微藻由于酶反应条件温和、水解酶底物选择性强、商用水解酶的价格低廉(https://www.1688.com，酶活为50000U/g的纤维素酶价格约100元/kg)、酶用量少(低于1％)，其破壁反应过程的能耗较低，利用液体脂肪酶酶取代固定化脂肪酶，可大大降低生产生物柴油所用的脂肪酶成本，进而大幅度降低生物柴油的生产成本。
具体实施方式
[0040] 实施例1
[0041] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0042] A、培养小球藻
[0043] 在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：摇瓶培养，培养基按照体积比为40％的比例装量，接种量为每升含有葡萄糖(1克-40克)的BG11培养基接入小球藻0.05g，培养温度为23℃，摇床转速为120转/分钟，培养周期6天；
[0044] B、湿小球藻破壁
[0045] 将步骤A中获得的发酵液在转速为3000转/分钟的条件下，高速离心3分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入5mL蒸馏水以及1％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，酶解条件是：温度为35℃、转速为150转/分钟、酶解时间为4小时；将酶解后的物料在转速为3000转/分钟的条件下，高速离心3分钟获得破壁的湿小球藻；
[0046] C、转酯化获得生物柴油
[0047] 按照每0.5克小球藻干重加入2mL的乙醇和10μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为25℃，转速为150转/分钟，时间为96小时。液体脂肪酶选自由丹麦诺维信公司生产的南极假丝酵母脂肪酶A，英文缩写CALA，商品名 AD L，酶活6KLU/g。
[0048] 所述的步骤A中的小球藻选用普通小球藻Chlorella vulgaris Carol ina 15-2075。所述的普通小球藻Chlorella vulgaris Carol ina 15-2075购自美国卡罗莱纳州生物供应公司(Carol ina Biological Supply Co.，Burl ington，USA)。
[0049] 步骤A中每升含有碳源的BG11培养基包含如下质量的原料：
[0050] NaNO3 0.1g-2g；K2HPO4 0.02g-0.1g；碳源；MgSO4·7H2O 0.025g-0.1g；CaCl2·H2O 0.01g-0.05g；Na2CO3 0.01g-0.1g；C6H8O7 0.001g-0.01g；EDTA0.001g-0.01g；微量元素溶液
0.5mL-2mL。
0.5mL-2mL。
[0051] 每升微量元素溶液包含如下质量的原料：
[0052] H3BO3 2g-4g；MnCl2·4H2O 1g-2.5g；ZnSO4·7H2O 0.1g-0.3g；NaMoSO4·2H2O0.2g-0.5g；CuSO4·5H2O 0.01g-0.1g；Co(NO3)2·6H2O 0.01g-0.1g。
[0053] 所述的步骤A中的碳源用量为每升含有碳源的BG11培养基中含有葡萄糖1g-40g。
[0054] 步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为15000U/g。1U的纤维素酶酶活定义为：纤维素酶在温度为50℃和pH为4.8条件下水解作用纤维素1分钟所释放1微克葡萄糖。
[0055] 1KLU的脂肪酶酶活为，脂肪酶在温度为37℃和pH为7.2条件下水解作用三丁酸甘油酯1分钟释放1毫摩尔的丁酸。
[0056] 所述的步骤C中转酯化反应后将反应体系在转速为5000转/分钟的条件下离心5分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0057] 生物柴油的转化率及其脂肪酶组成。通过气相色谱仪分析后，采用实施例1的方法获得生物柴油的转化率为92-95.31％。生物柴油的密度862-871kg/m3、运动黏度4.45-4.52mm2/s、十六烷值53.21-55.49。
[0058] 实施例2
[0059] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0060] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0061] A、培养小球藻
[0062] 在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：接种量为每升含有葡萄糖(1克-40克)的BG11培养基接入小球藻0.2g，培养温度为28℃，摇床转速为220转/分钟，培养周期10天；
[0063] B、湿小球藻破壁
[0064] 将步骤A中获得的发酵液在转速为8000转/分钟的条件下，高速离心10分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入20mL蒸馏水以及0.55％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，酶解条件是：温度为55℃、转速为220转/分钟、酶解时间为24小时；将酶解后的物料在转速为
8000转/分钟的条件下，高速离心10分钟获得破壁的湿小球藻；
8000转/分钟的条件下，高速离心10分钟获得破壁的湿小球藻；
[0065] C、转酯化获得生物柴油
[0066] 按照每0.5克小球藻干重加入5mL的乙醇和60μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为40℃，转速为250转/分钟，时间为60小时。液体脂肪酶选自由丹麦诺维信公司生产的南极假丝酵母脂肪酶B，英文缩写CALB，商品名 CALB L，酶活5KLU/g。
[0067] 步骤A中的碳源用量为每升含有碳源的BG11培养基中含有葡萄糖1g-40g。
[0068] 所述的步骤A中的小球藻选用小球藻Chlorella zofingiensis ATCC30412。所述的小球藻Chlorella zofingiensis ATCC 30412购自美国模式菌种收集中心(American type culture col lection)。
[0069] 步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为50000U/g。
[0070] 所述的步骤C中转酯化反应后将反应体系在转速为8000转/分钟的条件下离心10分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0071] 生物柴油的转化率及其脂肪酶组成。通过气相色谱仪分析后，采用实施例2的方法获得生物柴油的转化率为93.28-95.46％。生物柴油的密度860-874kg/m3、运动黏度4.43-4.5mm2/s、十六烷值53.2-55.6。
[0072] 其余内容同实施例1。
[0073] 实施例3
[0074] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0075] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0076] A、培养小球藻
[0077] 在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：接种量为每升含有果糖(1克-30克)的BG11培养基接入小球藻0.13g，培养温度为25℃，摇床转速为170转/分钟，培养周期8天；
[0078] B、湿小球藻破壁
[0079] 将步骤A中获得的发酵液在转速为5500转/分钟的条件下，高速离心5分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入12.5mL蒸馏水以及0.28％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，酶解条件是：温度为45℃、转速为200转/分钟、酶解时间为14小时；
[0080] C、转酯化获得生物柴油
[0081] 按照每0.5克小球藻干重加入3.5mL的乙醇和35μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油。转酯化反应的条件是：温度为32.5℃，转速为200转/分钟，时间为24小时。液体脂肪酶选自由丹麦诺维信公司生产的嗜热霉菌脂肪酶，英文缩写TL，商品名 TL，酶活20KLU/g。
[0082] 步骤A中的碳源用量为每升含有碳源的BG11培养基中含有果糖1克-30克。
[0083] 所述的步骤A中的小球藻选用普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395。所述的普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校微藻保藏库(Cul ture Col lection of Algae at The Univers ity of Texas at Austin)。
[0084] 步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为100000U/g。
[0085] 所述的步骤C中转酯化反应后将反应体系在转速为5500转/分钟的条件下离心6分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0086] 生物柴油的转化率及其脂肪酶组成。通过气相色谱仪分析后，采用实施例3的方法获得生物柴油的转化率为90.27-95.47％。生物柴油的密度864-880kg/m3、运动黏度4.47-4.51mm2/s、十六烷值52-55.4。
[0087] 其余内容同实施例1。
[0088] 实施例4
[0089] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0090] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0091] A、培养小球藻
[0092] 在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：接种量为每升含有甘露糖(1克-35克)的BG11培养基接入小球藻0.09g，培养温度为24℃，摇床转速为145转/分钟，培养周期7天；
[0093] B、湿小球藻破壁
[0094] 将步骤A中获得的发酵液在转速为4000转/分钟的条件下，高速离心4分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入8mL蒸馏水以及0.28％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，酶解条件是：温度为40℃、转速为175转/分钟、酶解时间为9小时；
[0095] C、转酯化获得生物柴油
[0096] 按照每0.5克小球藻干重加入2.75mL的乙醇和23μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油。转酯化反应的条件是：温度为30℃，转速为200转/分钟，时间为24小时。液体脂肪酶选自由丹麦诺维信公司生产的黑曲霉脂肪酶PLA1，英文缩写PLA1，商品名 Ul tra phosphol ipase A1，酶活10KLU/g。
[0097] 步骤A中的碳源用量为每升含有碳源的BG11培养基中含有甘露糖1克-35克。
[0098] 所述的步骤A中的小球藻选用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9。所述的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9购自中科院水生生物研究所淡水藻种库。
[0099] 步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为20000U/g。
[0100] 所述的步骤C中转酯化反应后将反应体系在转速为4200转/分钟的条件下离心5分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0101] 生物柴油的转化率及其脂肪酶组成。通过气相色谱仪分析后，采用实施例4的方法3
获得生物柴油的转化率为91.78-96.2％。生物柴油的密度861-876kg/m 、运动黏度4.44-
4.52mm2/s、十六烷值54.3-56。
获得生物柴油的转化率为91.78-96.2％。生物柴油的密度861-876kg/m 、运动黏度4.44-
4.52mm2/s、十六烷值54.3-56。
[0102] 其余内容同实施例1。
[0103] 实施例5
[0104] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0105] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0106] A、培养小球藻
[0107] 在灭菌后含有每升含有糖蜜(0.5克-20克)的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：接种量为每升含有碳源的BG11培养基接入小球藻0.16g，培养温度为27℃，摇床转速为195转/分钟，培养周期9天；
[0108] B、湿小球藻破壁
[0109] 将步骤A中获得的发酵液在转速为6500转/分钟的条件下，高速离心8分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入16mL蒸馏水以及0.75％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，酶解条件是：温度为40℃、转速为225转/分钟、酶解时间为19小时；
[0110] C、转酯化获得生物柴油
[0111] 按照每0.5克小球藻干重加入4.3mL的乙醇和48μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油。转酯化反应的条件是：温度为36℃，转速为210转/分钟，时间为72小时。液体脂肪酶选用由丹麦诺维信公司生产的南极假丝酵母脂肪酶A，英文缩写CALA，商品名 AD L，酶活6KLU/g。
[0112] 步骤A中的碳源用量为每升含有碳源的BG11培养基中含有糖蜜0.5克-20克。
[0113] 所述的步骤A中的小球藻选用普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395。所述的普通小球藻Chlorella vulgaris UTEX 395购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校微藻保藏库(Cul ture Col lection of Algae at The Univers ity of Texas at Austin)。
[0114] 步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为20000U/g。
[0115] 所述的步骤C中转酯化反应后在转速为6800转/分钟的条件下离心5分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0116] 生物柴油的转化率及其脂肪酶组成。通过气相色谱仪分析后，采用实施例4的方法获得生物柴油的转化率为91.97-94.28％。生物柴油的密度861-880kg/m3、运动黏度4.43-4.49mm2/s、十六烷值52.17-54.7。
[0117] 其余内容同实施例1。
[0118] 实施例6
[0119] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0120] 采用两步酶法催化湿小球藻制备生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
[0121] A、培养小球藻
[0122] 在灭菌后含有碳源的BG11培养基中采用异养培养的方法培养小球藻，培养条件：接种量为每升含有蔗糖(1克-30克)的BG11培养基接入小球藻0.1g，培养温度为26℃，摇床转速为160转/分钟，培养周期7天；
[0123] B、湿小球藻破壁
[0124] 将步骤A中获得的发酵液在转速为7000转/分钟的条件下，高速离心6分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿小球藻，按照每克小球藻干重加入15mL蒸馏水以及0.05％纤维素酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及纤维素酶进行酶解，酶解条件是：温度为34℃、转速为170转/分钟、酶解时间为10小时；
[0125] C、转酯化获得生物柴油
[0126] 按照每0.5克小球藻干重加入4mL的乙醇和40μL的液体脂肪酶的比例，在步骤B中获得的破壁的湿小球藻中加入乙醇及液体脂肪酶进行转酯化反应后获得生物柴油。转酯化反应的条件是：温度为32℃，转速为185转/分钟，时间为54小时。液体脂肪酶选用由丹麦诺维信公司生产的嗜热霉菌脂肪酶，英文缩写TL，商品名 TL，酶活20KLU/g。
[0127] 步骤A中的碳源用量为每升含有碳源的BG11培养基中含有蔗糖1克-30克。
[0128] 所述的步骤A中的小球藻选用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9。所述的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa FACHB-9购自中科院水生生物研究所淡水藻种库。
[0129] 步骤B中的纤维素酶来源于木霉，纤维素酶的酶活为100000U/g。
[0130] 所述的步骤C中转酯化反应然后在转速为6000转/分钟的条件下离心7分钟，收集正己烷，旋转蒸发，获得粗生物柴油。
[0131] 生物柴油的转化率及其脂肪酶组成。通过气相色谱仪分析后，采用实施例4的方法获得生物柴油的转化率为90.97-94.07％。生物柴油的密度863-875kg/m3、运动黏度4.43-4.51mm2/s、十六烷值52-55.8。
[0132] 其余内容同实施例1。
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