合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用
阅读：0发布：2020-05-08
专利汇可以提供合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 以5,6,4’‑三乙酰 氧 基黄 酮 ‑7‑O‑D‑三乙酰氧基 葡萄糖 醛 酸甲酯(结构式如式Ⅱ所示)为原料，经选择性消除和 水 解 两步反应，成功制备得到5,6,4’‑三羟基黄酮‑7‑0‑D‑葡萄糖醛酸有关物质b，并进一步纯化，最终获得5,6,4’‑三羟基黄酮‑7‑0‑D‑葡萄糖醛酸有关物质b 单体 ，进行确证后得出该有关物质化学结构。该方法合成路线短、成本低、操作简单，结果准确，产品纯度高，反应收率高，产品易于纯化，可用于合成5,6,4’‑三羟基黄酮‑7‑0‑D‑葡萄糖醛酸样品的杂质分析控制，有利于合成5,6,4’‑三羟基黄酮‑7‑0‑D‑葡萄糖醛酸的 质量 控制，更好的保障了产品质量。，下面是合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中杂质的制备方法，其特征在于，所述杂质的结构如式(Ⅰ)所示：
所述5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸为化学合成法所得产物；
所述杂质在所述5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中的含量低于0.5％；
所述制备方法包括以下步骤：
1)式(Ⅱ)所示化合物在催化剂的作用下，进行选择性消除反应，生成式(Ⅲ)所示化合物；所述催化剂为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、吡啶和4-二甲氨基吡啶中的任意一种或几种；
2)式(Ⅲ)所示化合物进行水解反应，得到式(Ⅰ)所示化合物；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述选择性消除反应的溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃和1,4-二氧六环中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)所示化合物与催化剂的摩尔比为1：(0.1～5)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述选择性消除反应的温度为10～30℃，反应时间为3～20小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水解反应的溶剂选自丙酮、水、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和二氧六环中的任意一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：式(Ⅲ)所示化合物在无机碱催化下进行水解反应，然后加入无机酸调节体系pH值至2～3，得到式(Ⅰ)所示化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、碳酸钾和碳酸钠中的任意一种或几种。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸和磷酸中的任意一种或几种。
9.一种权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸的杂质，在合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸或其制剂有关物质检测时，作为对照品的应用。
合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质及其制
备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种合成5,6,4＇-三羟基黄酮 -7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸，又名灯盏花乙素、野黄芩苷，是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬(Eriger0n breviscapus)的全草(又名灯盏细辛) 中提取的黄酮类混合物的主要有效成分，分子式为C21H18012，分子量为462.37，其结构式如式Ⅳ所示：
[0003]
[0004] 临床研究表明5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸对高血压、脑出血、脑血栓形成，脑栓塞多发性神经炎，慢性蛛网膜炎及其后遗症具有较好疗效，并对风湿病、冠心病也有一定疗效。此外大量的研究证实5,6,4＇-三羟基黄酮 -7-0-D-葡萄糖醛酸具有抗炎、抗氧化、蛋白激酶抑制剂作用，还具有对糖尿病、肾病、风湿类风湿等疾病的治疗作用。因此，目前5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D- 葡萄糖醛酸临床上广泛用于治疗脑血栓、脑梗塞、多发性神经炎、慢性蛛网膜等脑血管意外所致瘫痪以及冠心病、心绞痛、治疗痛风性关节炎等症。
[0005] 目前除了植物提取的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸，合成 5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸作为改良型创新原料药，具有良好的市场前景。但是合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸杂质谱不同于目前上市的植物提取5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸，对于合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸的有关物质目前尚无研究。杂质的存在将影响产品使用的安全性，按照新药开发过程中杂质控制的相关指导原则的要求，应对样品中杂质进行彻底研究，严格控制。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质及其制备方法和应用。
[0007] 本发明提供的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质或其盐，结构如式(Ⅰ)所示：
[0008]
[0009] 本发明所述的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸是指通过化学合成的方法制备的5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸。具体制备方法参照昆药集团申请号分别为CN201210114758.9，CN201210114894.8， PCT/CN2012/086543的专利申请。
[0010] 所述合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸含量大于99％，其中含有微量的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质，含量低于0.5％。
[0011] 本发明还提供了上述合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质的制备方法，包括以下步骤：
[0012] 1)式(Ⅱ)所示化合物在催化剂的作用下，进行选择性消除反应，生成式(Ⅲ)所示化合物；所述催化剂为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的任意一种或几种；
[0014]
[0015] 其反应方程式如下：
[0016]
[0017] 本发明首先以1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、吡啶和4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的任意一种或几种作为催化剂，式(Ⅱ)所示化合物在催化剂的作用下，进行选择性消除反应，选择性的脱去一分子水，生成式(Ⅲ)所示化合物。上述催化剂有助于提高选择性消除反应的速率和选择性。
[0019] 在本发明的某些具体实施例中，所述式(Ⅱ)所示化合物与催化剂的摩尔比为1：(0.1～5)，在某些实施例中为1：(0.2～3)，在一些实施例中为1:1。
[0020] 所述选择性消除反应的温度为10～30℃，反应时间为3～20h，在某些实施例中为4～6h，在一些实施例中为8h，在一些实施例中为10h。
[0022] 在本发明的某些具体实施例中，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾、碳酸钾和碳酸钠中的任意一种或几种。
[0024] 所述水解反应的溶剂选自丙酮、水、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜、四氢呋喃和二氧六环中的任意一种或几种。
[0025] 所述水解反应的温度优选为-10～40℃，在某些实施例中为-8～0℃，在一些实施例中为-5℃；反应时间优选为1～10h，在某些实施例中为2～4h，在一些实施例中为3h，在一些实施例中为2h，在一些实施例中为4h。
[0026] 所述式(Ⅲ)所示化合物与无机碱的摩尔比优选为1：(0.1～50)，在某些实施例中为1：(10～30)，一些实施例中为1:25，一些实施例中1:15，一些实施例中1:20。
[0027] 所述中和反应的温度优选为-10℃～40℃，在一些实施例中为-5℃。
[0028] 在本发明的某些具体实施例中，可以进一步采用常规方法如重结晶进行提纯，得到符合要求纯度的杂质对照品。
[0029] 本发明通过HPLC法、UV吸收法、核磁共振、MS谱分析对上述合成5,6,4＇ -三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质进行了结构验证。
[0030] 本发明所述5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质的结构确证包括以下步骤：
[0031] 步骤1、HPLC法证实制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b与昆药集团股份有限公司合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中有关物质(杂质)b的保留时间完全一致。
[0032] 步骤2、UV谱图证实制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b与昆药集团股份有限公司合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中有关物质b特征峰完全一致。
[0033] 步骤3、核磁共振氢谱、碳谱对制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的化学结构进行了确证。
[0034] 步骤4、经MS谱分析，证实昆药集团股份有限公司合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中有关物质b，与制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b，具有相同的分子离子信号。
[0035] 本发明所述结构确证方法步骤1中，色谱条件流动相和体积比为：流动相A:Water/TFA＝1000/1(v/v)，流动相B:Acet0nitrile/TFA＝1000/1(v/v)，样品溶剂:Acetonitrile/DMSO＝50/50(v/v)。
[0036] 本发明所述结构确证方法步骤3和步骤4证实了5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D- 葡萄糖醛酸杂质b的化学结构如式Ⅰ所示。
[0037] 本发明还提供了上述合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质或其盐或上述制备方法制备的合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质，在合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸或其制剂有关物质检测时，作为对照品的应用。
[0038] 具体的，可应用于合成5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸或其制剂的杂质分析控制、药理毒理研究等。
[0039] 本发明以5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-O-D-三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯(结构式如式Ⅱ所示)为原料，经选择性消除和水解两步反应，成功制备得到5,6,4’- 三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b，并进一步纯化，最终获得5,6,4’- 三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b单体，进行确证后得出该有关物质化学结构。该方法合成路线短、成本低、操作简单，结果准确，产品纯度高，反应收率高，产品易于纯化，可用于合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸样品的杂质分析控制，有利于合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸的质量控制，更好的保障了产品质量。
附图说明
附图说明
[0040] 图1是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b (批号：20140913)的HPLC分析谱图；
[0041] 图2是昆药集团股份有限公司合成的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)的HPLC分析谱图；
[0042] 图3是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b (批号20140913)以5％质量分数加入到5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号20140424-
1)的HPLC分析谱图；
1)的HPLC分析谱图；
[0043] 图4是昆药集团股份有限公司合成的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)中5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的 UV谱图；
[0044] 图5是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b (批号20140913)的UV谱图；
[0045] 图6是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b (批号20140913)的HPLC分析谱图；
[0046] 图7是合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)+实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b(20140913) 的MS谱图；
[0047] 图8是实施例1制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸杂质b (20140913)的MS谱图；
[0048] 图9是合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号20140424-1)的 MS谱图。
具体实施方式
[0049] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的合成5,6,4＇- 三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质(以下简称5,6,4＇-三羟基黄酮-7-0-D- 葡萄糖醛酸有关物质b)及其制备方法和应用进行详细描述。
[0050] 实施例1
[0051] (1)化合物Ⅲ的制备
[0052] 20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-O-D–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200mL甲苯中，然后搅拌下缓慢滴加入1,8-二氮杂二环十一碳-7- 烯(DBU)4.1g(27mmol)，30℃下搅拌反应约8小时反应完全。反应混合物搅拌下加入约500ml乙酸乙酯，用500ml水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5：1(v/v)的洗脱剂洗脱，得15g白色固体化合物Ⅲ,色谱纯度
98.00％以上，收率为82％。
98.00％以上，收率为82％。
[0053] 1H-NMR(400MHz,DMS0),δ(ppm):7.95(2H,d,J＝8.6Hz),7.51(1H,s), 7.32(2H,d,J＝8.6Hz),6.78(1H,s),6.15(1H,d,J＝7.8Hz),5.57(1H,d,J＝10Hz), 5.38(1H,m),4.94(1H,m),3.67(3H,s),2.34(3H,s),2.31(3H,s),2.25(3H,s), 2.02(3H,s),2.01(3H,s).[0054] (2)5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的制备
[0055] 13.4g(20mmol)化合物Ⅲ中加入200mL丙酮和200mL水的混合溶剂，在 -5℃搅拌下缓慢滴加10％的NaOH水溶液200mL，搅拌反应约三小时后，经 TLC监测反应已完全。-5℃下缓缓向反应液中滴加2mol/L盐酸水溶液中和反应液至PH为2～3，持续搅拌一小时并逐渐升至室温，反应液中渐渐有黄色固体5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸析出。室温下静置过夜，过滤，滤饼用适量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重结晶得到8g 5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b，批号记为20140913，收率为89％。HPLC检测，纯度为
98.88％，HPLC检测的色谱图和统计结果见图1和表1，表1是图1的数据汇总。
98.88％，HPLC检测的色谱图和统计结果见图1和表1，表1是图1的数据汇总。
[0056] 1H-NMR(400MHz,DMS0),δ(ppm):12.78(1H,s),10.51(1H,s),8.71(1H, s),7.93(2H,d,J＝8.8Hz),7.11(1H,s),6.94(2H,d,J＝8.8Hz),6.83(1H,s),5.99 (1H,d,J＝3.6Hz),5.81(1H,d,J＝5.6Hz),5.74(1H,s),5.28(1H,s),4.14(1H, dd,J＝4.0,4.5Hz),
3.84(1H,dd,J＝4.5,6.0Hz).
3.84(1H,dd,J＝4.5,6.0Hz).
[0057] 表1图1的数据汇总
[0058]
[0059] 实施例2
[0060] (1)化合物Ⅲ的制备
[0061] 20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-O-D–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200mL二氯甲烷中，然后搅拌下缓慢加入4-二甲氨基吡啶 (DMAP)1.7g(13.7mmol,0.5eq)，25℃下搅拌反应约10小时反应完全。反应混合物搅拌下加入约300ml乙酸乙酯，用
500ml水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脱剂洗脱，得14.3g白色固体化合物Ⅲ,色谱纯度
98.00％以上，收率为78％。核磁鉴定结果与实施例1结果一致。
500ml水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脱剂洗脱，得14.3g白色固体化合物Ⅲ,色谱纯度
98.00％以上，收率为78％。核磁鉴定结果与实施例1结果一致。
[0062] (2)5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的制备
[0063] 13.4g(20mmol)化合物Ⅲ中加入200mL丙酮和200mL水的混合溶剂，在 0℃搅拌下缓慢滴加10％的氢氧化钾水溶液220mL，搅拌反应约四小时后，经 TLC监测反应已完全。0℃下缓缓向反应液中滴加乙酸中和反应液至PH为 2～3，持续搅拌一小时并逐渐升至室温，反应液中渐渐有黄色固体5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b析出。室温下静置过夜，过滤，滤饼用适量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重结晶得到7.4g 5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b，收率为83％。HPLC检测，纯度达98.00％以上，核磁鉴定结果与实施例1结果一致。
[0064] 实施例3
[0065] (1)化合物Ⅲ的制备
[0066] 20g(27.4mmol)5,6,4’-三乙酰氧基黄酮-7-O-D–三乙酰氧基葡萄糖醛酸甲酯溶解于200mL四氢呋喃中，然后搅拌下滴加入吡啶6.5g(82.2mmol)，25℃下搅拌反应约6小时反应完全。反应混合物搅拌下加入约200ml乙酸乙酯，用500水洗两次。分出水层后的有机层中加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸干。硅胶柱层析并用石油醚：乙酸乙酯＝5:1(v/v)的洗脱剂洗脱，得14.7g 白色固体化合物Ⅲ,色谱纯度98.00％以上，收率为80％。核磁鉴定结果与实施例1结果一致。
[0067] (2)5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的制备
[0068] 13.4g(20mmol)化合物Ⅲ中加入200mL丙酮和200mL水的混合溶剂，在 5℃搅拌下缓慢滴加10％的氢氧化锂水溶液190mL，搅拌反应约两小时后，经 TLC监测反应已完全。5℃下缓缓向反应液中滴加2mol/L硫酸水溶液中和反应液至PH为2～3，持续搅拌一小时并逐渐升至室温，反应液中渐渐有黄色固体5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b析出。室温下静置过夜，过滤，滤饼用适量水和丙酮洗，干燥后用乙醇重结晶得到7.6g 5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b，收率为85％。HPLC检测，纯度达98.00％以上，核磁鉴定结果与实施例1结果一致。
[0069] 实施例4结构确证
[0070] 1、HPLC确证合成制备所得化合物为合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b：
[0071] HPLC色谱条件如下：
[0072] HPLC系统：Waters Alliance 2695四元泵
[0073] Waters Alliance 2998PDA检测器
[0074] Waters Alliance 2695自动进样器
[0075] Waters Alliance 2695柱温箱
[0076] Empower 2网络版工作站
[0077] 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C8,5um,250x 4.6mm PN:880975-906[0078] 流速:1.0mL/min.
[0079] 检测波长:UV 254nm
[0080] 进样体积:10ul
[0081] 柱温:30℃
[0082] 自动进样器温度:5℃
[0083] 流动相A:Water/TFA＝1000/1(v/v)
[0084] 流动相B:Acetonitrile/TFA＝1000/1(v/v)
[0085] 样品溶剂:Acetonitrile/DMS0＝50/50
[0086] 样品浓度:1.0mg/ml
[0087] 实施例1合成制备获得的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b (批号：20140913)，与合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号 20140424-1)中含有的杂质b的等同性验证：
[0088] 分别对合成制备所得5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b、合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸进行HPLC分析(谱图如图1、图2所示)，表2是图2的数据汇总。再将约5％的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b标准品，加入昆药集团股份有限公司合成的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸样品(批号20140424-1)，进行HPLC分析(谱图如图3所示)，表3 是图3的数据汇总。
[0089] 分析结果显示，合成制备获得的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b标准品出峰位置与5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中本身含有的 5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b完全吻合。
[0090] 对二者的UV吸收进行检测，谱图如图4、图5所示，结果表明两者的UV 吸收图谱完全一致。因此它们的等同性可以得到确认。
[0091] 表2图2的数据汇总
[0092]
[0093]
[0094] 表3图3的数据汇总
[0095]
[0096]
[0097] 2、质谱和LC/MS解析
[0098] 测试条件：
[0099] 质谱：Waters SQD
[0101] Source:120℃ Desolvati0n:300℃ Capilary:3.5KV
[0102] LC-MS:
[0103] 流动相A:超纯水(Millipore ultra pure water system，resistivity： 18.2MΩ.CM)+0.1％甲酸
[0104] Pump B:色谱纯乙腈(MerckKGaA 64271,hypergrade for LC-MS)+0.1％甲酸[0105] 色谱柱： T3(3μm)，100×4.6mm
[0106] 柱温:30℃
[0107] 检测波长:λ＝254nm,230nmand 218nm/PDA
[0108] 流速:1.0mL/min
[0109] 谱图见图6、图7、图8和图9。
[0110] 由上述谱图可知，对5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸(批号 20140424-1)中含有的杂质b，以及合成制备的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸杂质b(批号201409132)进行LC/MS分析，均显示其分子量为444 ([M-H]-443)(见图8和图9)。由其分子量可以推测，杂质b应该是5,6,4’ -三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸脱一分子水后的产物。
并且，5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中本身含有的杂质b，与合成制备的杂质b，具有相同的分子离子信号。
并且，5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸中本身含有的杂质b，与合成制备的杂质b，具有相同的分子离子信号。
[0111] 3、5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸杂质b的核磁共振谱图解析[0112] 核磁共振氢谱：
[0113] 仪器型号：BrukerAvance III 400spectrometer(Z115310,SN10032129)[0114] 溶剂：[D6]DMSO(D,99.9％)+0.03％V/V TMS,10*0.6mL ampoule, Cambridge Isotope Laboratories,Inc.,Lot 12A-029
[0115] 温度：25℃
[0116] 测试数据见表4。
[0117]
[0118] 表4核磁共振氢谱数据汇总
[0119]
[0120]
[0121] 核磁共振13C谱：
[0122] 仪器型号：BrukerAvance III 400spectrometer(Z115310,SN10032129)[0123] 溶剂：[D6]DMSO(D,99.9％)+0.03％V/V TMS,10*0.6mL ampoule, Cambridge Isotope Laboratories,Inc.,Lot 12A-029
[0124] 温度：25℃
[0125] 结果见表5。
[0126] 表5 5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸杂质b的核磁共振碳谱分析[0127]
[0128]
[0129] 由以上结果可知，MS一级谱给出了杂质准确的分子量信息：m/z 442.7, 与5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸脱一分子水后所得的5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b分子量一致。HPLC谱确证了制备所得 5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b与合成5,6,4’-三羟基黄酮 -7-0-D-葡萄糖醛酸中5,6,4’-三羟基黄酮-7-
0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的保留时间完全一致，且UV谱证实了二者的特征吸收峰完全一致。核磁共振氢谱和碳谱，证实了5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质(杂质)b化学结构如式(Ⅰ)所示：
0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的保留时间完全一致，且UV谱证实了二者的特征吸收峰完全一致。核磁共振氢谱和碳谱，证实了5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质(杂质)b化学结构如式(Ⅰ)所示：
[0130]
[0131] 由上述实施例可知，本发明证实了上述5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸有关物质b的结构，并成功制备得到该化合物，且具有较高的纯度，可以直接用于合成5,6,4’-三羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸的杂质分析控制，以此基础制订了严格的杂质限度，为将来产品的安全使用提供了理论依据。
[0132] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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