一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法
阅读：220发布：2024-01-10
专利汇可以提供一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，属于干细胞领域。该方法包括：从骨髓中分离单个核细胞，扩增培养得到细胞表型CD73、CD90和CD105为阳性的骨髓间充质干细胞。在培养过程中使用了无血清培养基，通过优化培养基的成分及各组分之间的配比，有效避免了异种蛋白和外源 微 生物 的污染，培养得到的干细胞形态和干细胞特性良好，显著提高了 细胞增殖 速率和骨髓间充质干细胞阳性表达率。该方法为规模化骨髓间充质干细胞制备和细胞移植 治疗 提供了新的途径。，下面是一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)从骨髓中分离单个核细胞，制成细胞悬液，统细胞计数，调整细胞密度，得到骨髓单个核细胞；
(2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；
(3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，进行细胞传代并使用无血清培养基进行扩增培养，得到骨髓间充质干细胞；
所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；
所述的基础培养基包括：L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐和L-缬氨酸；
所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胆红素和FeCl3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:2-4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的无血清培养基的pH值为6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的血小板衍生生长因子为血小板衍生生长因子AB和血小板衍生生长因子BB中的一种或几种；所述的转化生长因子为转化生长因子-β。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的基础培养基包括L-丙氨酸15-25mg/L、L-精氨酸盐酸盐80-100mg/L、L-天门冬氨酸30-50mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐20-30mg/L、L-谷氨酸70-80mg/L、L-谷氨酰胺250-350mg/L、L-组氨酸25-30mg/L、L-异亮氨酸50-60mg/L、L-亮氨酸50-60mg/L、L-赖氨酸70-80mg/L、L-蛋氨酸12-18mg/L、L-苯丙氨酸25-30mg/L、L-脯氨酸35-45mg/L、L-丝氨酸20-25mg/L、L-苏氨酸45-50mg/L、L-色氨酸8-12mg/L、酪氨酸二钠盐50-55mg/L和L-缬氨酸42-45mg/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB38-42ng/mL、血小板衍生生长因子BB20-25ng/mL、成纤维细胞生长因子7-10ng/mL、表皮生长因子3-5ng/mL、β-转化生长因子95-100ng/mL、葡萄糖280-300mg/dL、甘油三酯80-
90mg/dL、胆固醇140-150mg/dL、胆红素0.2-0.4mg/dL和FeCl370-80μg/dL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的营养培养基还包括0.5-5mg/dL肌酐。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述的培养为在温度36-
38℃，4-6％CO2的条件下进行细胞培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的骨髓间充质干细胞的细胞表型为：CD73阳性、CD90阳性、CD105阳性、CD34阴性、HLA-DR阴性和CD45阴性。
10.一种如权利要求1-9任意一项所述的方法在制备骨髓间充质干细胞中的应用。
一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明属于干细胞领域，具体涉及一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法。
背景技术
[0002] 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)来源于中胚层未分化的间充质细胞，具有向多种中胚层组织细胞分化的能力，如分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等。近年来发现BMSCs具有跨胚层分化的潜力，如分化为内胚层来源的心肌细胞，外胚层来源的神经细胞等。跨胚层分化能力的发现为BMSCs的应用创造了更广阔的前景。BMSCs可以在不同的理化环境和细胞因子的诱导下具有可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞甚至神经元样细胞等多系分化潜能。
[0003] 近年来，干细胞研究的迅猛发展为干细胞新药产品的研发提供了科学依据。特别是在心血管疾病领域，干细胞治疗新药研发尤为明显。在2011年到2016年间，韩国、加拿大、意大利、欧盟、日本等国家先后批准了治疗心梗干细胞药物。可以说，干细胞治疗的时代已经来临，同时以干细胞技术为核心的再生医学产业的战略布局和国际竞争也已拉开序幕。而规模化培养干细胞是干细胞治疗的基础。目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是胎牛血清或新生小牛血清。血清是由许多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯化带来很大的困难。比如，中国专利CN105238749B公开了一种复苏骨髓间充质干细胞的方法，该方法提供了含10％胎牛血清的DMEM培养基扩增培养骨髓间充质干细胞，但是胎牛血清等动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对规模化培养增加了难度。
[0004] 再如，中国专利CN101412985B公开了用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，通过在基础培养基中添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、生长因子、贴壁因子、激素、腐胺、无机盐、维生素、白蛋白和抗氧化剂，能使骨髓间充质干细胞在无血清条件下贴附于培养介质，实现体外培养和扩增，并维持多向分化的潜能，但是以0.5*104个/mL作为初始细胞量，扩增培养10天后细胞数量仅为2*105个/mL，细胞增殖能力远没有达到规模化培养的要求。
[0005] 可见，现有技术中采用的骨髓间充质干细胞培养方法存在细胞增殖速率不够理想、培养基成分复杂等问题。
[0006] 因此，建立制备间充质干细胞的培养方法、培养体系避免动物源成分、获得质量可靠的、数量可观的间充质干细胞，是干细胞产业亟待解决的关键问题。
发明内容
[0007] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，通过该方法制备得到的骨髓间充质干细胞细胞增殖速率高并且能够避免减少血清成分的引入。
[0008] 一方面，本发明涉及一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0009] (1)从骨髓中分离单个核细胞，制成细胞悬液，统细胞计数，调整细胞密度，得到骨髓单个核细胞；
[0010] (2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；
[0011] (3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，进行细胞传代并使用无血清培养基进行扩增培养，得到骨髓间充质干细胞。
[0012] 其中，所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；
[0013] 所述的基础培养基包括：L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐和L-缬氨酸；
[0014] 所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胆红素、铁和肌酐；所述的血小板衍生生长因子为血小板衍生生长因子AB和血小板衍生生长因子BB中的一种或几种；所述的转化生长因子为转化生长因子-β。
[0015] 优选地，所述的基础培养基包括：L-丙氨酸15-25mg/L、L-精氨酸盐酸盐80-100mg/L、L-天门冬氨酸30-50mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐20-30mg/L、L-谷氨酸70-80mg/L、L-谷氨酰胺250-350mg/L、L-组氨酸25-30mg/L、L-异亮氨酸50-60mg/L、L-亮氨酸50-60mg/L、L-赖氨酸70-80mg/L、L-蛋氨酸12-18mg/L、L-苯丙氨酸25-30mg/L、L-脯氨酸35-45mg/L、L-丝氨酸20-25mg/L、L-苏氨酸45-50mg/L、L-色氨酸8-12mg/L、酪氨酸二钠盐50-55mg/L和L-缬氨酸
42-45mg/L；
42-45mg/L；
[0016] 所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB 38-42ng/mL、血小板衍生生长因子BB 20-25ng/mL、成纤维细胞生长因子7-10ng/mL、表皮生长因子3-5ng/mL、β-转化生长因子95-100ng/mL、葡萄糖280-300mg/dL、甘油三酯80-90mg/dL、胆固醇140-150mg/dL、胆红素0.2-0.4mg/dL和FeCl3 70-80μg/dL。
[0017] 更优选地，所述的营养培养基还包括：0.5-5mg/dL肌酐。
[0018] 再进一步优选地，所述的基础培养基包括：L-丙氨酸20mg/L、L-精氨酸盐酸盐90mg/L、L-天门冬氨酸40mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐25mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺
300mg/L、L-组氨酸28mg/L、L-异亮氨酸55mg/L、L-亮氨酸55mg/L、L-赖氨酸75mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸28mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸23mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐53mg/L和L-缬氨酸43mg/L；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB 40ng/mL、血小板衍生生长因子BB 22ng/mL、成纤维细胞生长因子8ng/mL、表皮生长因子4ng/mL、β-转化生长因子98ng/mL、葡萄糖290mg/dL、甘油三酯85mg/dL、胆固醇
145mg/dL、胆红素0.3mg/dL、FeCl3 75μg/dL和1.1mg/dL肌酐。
300mg/L、L-组氨酸28mg/L、L-异亮氨酸55mg/L、L-亮氨酸55mg/L、L-赖氨酸75mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸28mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸23mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐53mg/L和L-缬氨酸43mg/L；所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB 40ng/mL、血小板衍生生长因子BB 22ng/mL、成纤维细胞生长因子8ng/mL、表皮生长因子4ng/mL、β-转化生长因子98ng/mL、葡萄糖290mg/dL、甘油三酯85mg/dL、胆固醇
145mg/dL、胆红素0.3mg/dL、FeCl3 75μg/dL和1.1mg/dL肌酐。
[0019] 其中，所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:2-4；优选地，体积比为1:3。
[0020] 其中，所述的无血清培养基的pH值为6.5-7.5；优选地，所述的无血清培养基的pH值为7.0。
[0021] 其中，步骤(2)和(3)中所述的培养为在温度36-38℃，4-6％CO2的条件下进行细胞培养；优选地，所述的培养为37℃、5％CO2。
[0022] 其中，步骤(3)中所述的骨髓间充质干细胞的细胞表型为：CD73阳性、CD90阳性、CD105阳性、CD34阴性、HLA-DR阴性和CD45阴性。
[0023] 另一方面，本发明涉及一种上述方法在制备骨髓间充质干细胞中的应用。
[0024] 与现有技术相比，本发明所实现的技术效果如下：
[0025] (1)本发明使用无血清的扩增培养基，避免了免疫反应和微生物污染。
[0026] (2)本发明提供的无血清培养基由基础培养基和营养培养基组成，二者合理配比，共同保持良好的干细胞形态和干细胞特性，提高了骨髓间充质干细胞阳性的表达率，达到95％以上。
[0027] (3)本发明优化了无血清培养基的组分及其浓度，并创造性地添加肌酐，丰富了营养培养基的成分，进一步提高干细胞细胞增殖速率，在培养72小时后，细胞密度最高可达13.7×104个/mL。
[0029] 图1是实验例2中实施例1得到的细胞的细胞免疫表型检测结果图；
[0030] 图2是实验例2中实施例2得到的细胞的细胞免疫表型检测结果图；
[0031] 图3是实验例2中实施例3得到的细胞的细胞免疫表型检测结果图；
[0032] 图4是实验例2中实施例4得到的细胞的细胞免疫表型检测结果图；
[0033] 图5是实验例2中实施例5得到的细胞的细胞免疫表型检测结果图；
[0034] 图6是实验例2中实施例6得到的细胞的细胞免疫表型检测结果图。
具体实施方式
[0035] 以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1
[0038] 一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0039] (1)用20mL浓度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液(购自：上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY131136)从健康成人骨髓(捐献)中分离骨髓单个核细胞，制成细胞悬液，利用全自动细胞计数仪(购自Biorad，型号TC-20)统计细胞数，用PBS调整细胞密度至1×104个/mL，得到骨髓单个核细胞；
[0040] (2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；
[0041] (3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶(购自：北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300)消化细胞进行细胞传代，以细胞密度为1.0×104个/mL接种于新的培养皿中，使用无血清培养基进行扩增培养，每24小时换一次培养液，得到骨髓间充质干细胞。
[0042] 所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；
[0043] 所述的基础培养基包括：L-丙氨酸15mg/L、L-精氨酸盐酸盐80mg/L、L-天门冬氨酸30mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐20mg/L、L-谷氨酸70mg/L、L-谷氨酰胺250mg/L、L-组氨酸25mg/L、L-异亮氨酸50mg/L、L-亮氨酸50mg/L、L-赖氨酸70mg/L、L-蛋氨酸12mg/L、L-苯丙氨酸
25mg/L、L-脯氨酸35mg/L、L-丝氨酸20mg/L、L-苏氨酸45mg/L、L-色氨酸8mg/L、酪氨酸二钠盐50mg/L、L-缬氨酸42mg/L；
25mg/L、L-脯氨酸35mg/L、L-丝氨酸20mg/L、L-苏氨酸45mg/L、L-色氨酸8mg/L、酪氨酸二钠盐50mg/L、L-缬氨酸42mg/L；
[0044] 所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB 38ng/mL、血小板衍生生长因子BB 20ng/mL、成纤维细胞生长因子7ng/mL、表皮生长因子3ng/mL、β-转化生长因子95ng/mL、葡萄糖280mg/dL、甘油三酯80mg/dL、胆固醇140mg/dL、胆红素0.2mg/dL和FeCl3 70μg/dL。
[0045] 所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:2；所述的无血清培养基的pH值为6.5。
[0046] 步骤(2)和(3)中所述的培养为在温度36℃，4％CO2的条件下进行细胞培养。
[0047] 实施例2
[0048] 一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0049] (1)用20mL浓度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液(购自：上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY131136)从健康成人骨髓(捐献)中分离骨髓单个核细胞，制成细胞悬液，，利用全自动细胞计数仪(购自Biorad，型号TC-20)统计细胞数，用PBS调整细胞密度至1×104个/mL，得到骨髓单个核细胞；
[0050] (2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；
[0051] (3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶(购自：北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300)消化细胞进行细胞传代，以细胞密度为1.0×104个/mL接种与新的培养皿中，使用无血清培养基进行扩增培养，每24小时换一次培养液，得到骨髓间充质干细胞。
[0052] 所述的无血清培养基包括：基础培养基和营养培养基；L-丙氨酸25mg/L、L-精氨酸盐酸盐100mg/L、L-天门冬氨酸50mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐30mg/L、L-谷氨酸80mg/L、L-谷氨酰胺350mg/L、L-组氨酸30mg/L、L-异亮氨酸60mg/L、L-亮氨酸60mg/L、L-赖氨酸80mg/L、L-蛋氨酸18mg/L、L-苯丙氨酸30mg/L、L-脯氨酸45mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸50mg/L、L-色氨酸12mg/L、酪氨酸二钠盐55mg/L、L-缬氨酸45mg/L；
[0053] 所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB 42ng/mL、血小板衍生生长因子BB 25ng/mL、成纤维细胞生长因子10ng/mL、表皮生长因子5ng/mL、β-转化生长因子100ng/mL、葡萄糖300mg/dL、甘油三酯90mg/dL、胆固醇150mg/dL、胆红素0.4mg/dL和FeCL3 80μg/dL。
[0054] 所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:4；所述的无血清培养基的pH值为7.5。
[0055] 步骤(2)和(3)中所述的培养为在温度38℃，6％CO2的条件下进行细胞培养。
[0056] 实施例3
[0057] 一种无血清培养骨髓间充质干细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0058] (1)用20mL浓度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液(购自：上海泽叶生物科技有限公司，货号：ZY131136)从健康成人骨髓(捐献)中分离骨髓单个核细胞，制成细胞悬液，利用全自动细胞计数仪(购自Biorad，型号TC-20)统计细胞数，用PBS调整细胞密度至1×104个/mL，得到骨髓单个核细胞；
[0059] (2)将步骤(1)得到骨髓单个核细胞接种到细胞培养板中，使用无血清培养基进行培养，得到骨髓间充质干细胞原代细胞；
[0060] (3)当步骤(2)得到的原代细胞达到80％-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶(购自：4
北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300)消化细胞进行细胞传代，以细胞密度为1.0×10个/mL接种与新的培养皿中，使用无血清培养基进行扩增培养，每24小时换一次培养液，得到骨髓间充质干细胞。
北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300)消化细胞进行细胞传代，以细胞密度为1.0×10个/mL接种与新的培养皿中，使用无血清培养基进行扩增培养，每24小时换一次培养液，得到骨髓间充质干细胞。
[0061] 所述的基础培养基包括：L-丙氨酸20mg/L、L-精氨酸盐酸盐90mg/L、L-天门冬氨酸40mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐25mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、L-组氨酸28mg/L、L-异亮氨酸55mg/L、L-亮氨酸55mg/L、L-赖氨酸75mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸
28mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸23mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐53mg/L、L-缬氨酸43mg/L；
28mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸23mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、酪氨酸二钠盐53mg/L、L-缬氨酸43mg/L；
[0062] 所述的营养培养基包括：血小板衍生生长因子AB 40ng/mL、血小板衍生生长因子BB 22ng/mL、成纤维细胞生长因子8ng/mL、表皮生长因子4ng/mL、β-转化生长因子98ng/mL、葡萄糖290mg/dL、甘油三酯85mg/dL、胆固醇145mg/dL、胆红素0.3mg/dL和FeCL3 75μg/dL。
[0063] 所述的无血清培养基中基础培养基和营养培养基的体积比为1:3；所述的无血清培养基的pH值为7.0。
[0064] 步骤(2)和(3)中所述的培养为在温度37℃，5％CO2的条件下进行细胞培养。
[0065] 实施例4
[0066] 与实施例3相比，营养培养基仅增加0.5mg/dL肌酐。
[0067] 实施例5
[0068] 与实施例3相比，营养培养基仅增加1.1mg/dL肌酐。
[0069] 实施例6
[0070] 与实施例3相比，营养培养基仅增加5mg/dL肌酐。
[0071] 对比例1
[0072] 与实施例3相比，营养培养基仅增加0.2mg/dL肌酐。
[0073] 对比例2
[0074] 与实施例3相比，营养培养基仅增加6mg/dL肌酐。
[0075] 对比例3
[0076] 使用中国专利CN101412985B提供的用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，按照本发明实施例3所述的方法培养间充质干细胞。
[0077] 对比例4
[0078] 中国专利CN105238749B提供的一种复苏骨髓间充质干细胞的方法。
[0079] 实验例1
[0080] 按照实施例1-6和对比例1-4所述的方法，进行细胞培养，分别于0小时、24小时、48小时和72小时使用全自动细胞计数仪(购自Biorad，型号TC-20)进行细胞计数，结果如表1所示。
[0081] 表1：各组细胞密度(个/mL)
[0082] 0小时 24小时 48小时 72小时
实施例1 1×104 2.6×104 5.7×104 10.3×104
4 4 4 4
实施例2 1×10 2.9×10 6.8×10 11.4×10
实施例3 1×104 3.3×104 7.4×104 12.6×104
实施例4 1×104 3.8×104 7.9×104 12.9×104
实施例5 1×104 4.6×104 8.9×104 13.7×104
实施例6 1×104 4.1×104 8.6×104 13.4×104
对比例1 1×104 3.1×104 6.9×104 11.6×104
对比例2 1×104 2.8×104 5.9×104 9.8×104
对比例3 1×104 1.3×104 3.2×104 5.1×104
对比例4 1×104 1.7×104 3.6×104 5.3×104
实施例1 1×104 2.6×104 5.7×104 10.3×104
4 4 4 4
实施例2 1×10 2.9×10 6.8×10 11.4×10
实施例3 1×104 3.3×104 7.4×104 12.6×104
实施例4 1×104 3.8×104 7.9×104 12.9×104
实施例5 1×104 4.6×104 8.9×104 13.7×104
实施例6 1×104 4.1×104 8.6×104 13.4×104
对比例1 1×104 3.1×104 6.9×104 11.6×104
对比例2 1×104 2.8×104 5.9×104 9.8×104
对比例3 1×104 1.3×104 3.2×104 5.1×104
对比例4 1×104 1.7×104 3.6×104 5.3×104
[0083] 结果显示：经过本发明提供的方法培养72小时后的骨髓间充质干细胞总数明显高于现有的技术，在营养培养基中添加肌酐能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。
[0084] 实验例2：骨髓间充质干细胞的免疫表型测定
[0085] 使用Beckman coulter免疫荧光法(FITC或PE荧光标记抗体)检测实施例1-6中CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR的细胞表型，使用流式细胞仪分析细胞免疫表型结果，检测结果图1-6所示。图1-6分别为实施例1-6的细胞表型检测结果，其中检测CD90和CD45的细胞表型使用了FITC荧光标记抗体；检测CD73、CD105和CD34和HLA-DR的细胞表型使用了PE荧光标记抗体；阴性对照组1为FITC-IgG1(即，FITC标记的鼠抗IgG1抗体)；阴性对照组2为PE-IgG1，阴性对照组3为PE-IgG3。
[0086] 结果显示：利用实施例1-6的方法培养得到的骨髓间充质干细胞中的CD73、CD90和CD105均为高阳性表达，阳性率均达到了95％以上；而CD34、CD45和HLA-DR的表达均为阴性，低于2％。由此可见，分离得到的细胞符合干细胞的要求。
[0087] 综上，利用本发明提供的方法培养骨髓间充质干细胞，显著提高了细胞增殖速率和骨髓间充质干细胞阳性表达率，避免了异种蛋白和外源微生物的污染，可适用于骨髓间充质干细胞的规模化培养。
[0088] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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