一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核
分枝杆菌的核酸扩增方法
技术领域
背景技术
[0002] 结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTBC)引起的，几十年来一直是一个全球性的公共卫生挑战。据估计，2016年全球新增结核病病例1040万例，死亡人数170万人。传统的结核病诊断从根本上依赖于抗酸杆菌(AFB)涂片
显微镜和选择固体培养基上的分枝杆菌培养，但这些方法都存在局限性。首先，AFB涂片的敏感性低(30-40％)，其准确性往往受到限制。其次，虽然以培养为
基础的方法具有很高的准确性，长期以来一直被认为是实验室结核病诊断的金标准，但分枝杆菌培养的周转时间长(3-8周)往往导致诊断延迟。
[0003] 商业上可获得的实时
聚合酶链反应(PCR)检测方法，如Abbott实时MTB检测法和GeneXpert MTB/RIF Ultra可提供及时和准确的结核病诊断。然而，这些商业检测仍然过于昂贵，特别对于大多数结核病负担较高发展中国家而言无法常规使用。
发明内容
[0004] 基于此，本发明提供一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法。所述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂可以更快捷地从痰液样本中提取结核分枝杆菌及其DNA，有效去除人源DNA的干扰，且可以完全灭活结核分枝杆菌，更加安全高效。
[0005] 具体技术方案为：
[0006] 一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，所述处理试剂包括消化液、Tris-HCl溶液和裂解液；所述消化液为含有以下浓度组分的
水溶液：二硫苏糖醇13-14g/L；
氯化钠100-105g/L；氯化
钾2-3g/L；
磷酸氢二钠14-15.5g/L；磷酸二氢钾2-3g/L；所述Tris-HCl溶液的浓度为0.08-0.12mol/L；所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH 0.08-0.15w/v％；SDS 0.02-0.03w/v％。
[0007] 在其中一些
实施例中，所述消化液的pH值为7.2-7.6。
[0008] 在其中一些实施例中，优选所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13.33g/L；氯化钠104g/L；
氯化钾2.67g/L；磷酸氢二钠14.93g/L；磷酸二氢钾2.67g/L。
[0009] 在其中一些实施例中，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.1±0.01mol/L。
[0010] 在其中一些实施例中，优选所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH 0.1w/v％；SDS 0.025w/v％。
[0011] 本发明还提供了一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法。
[0012] 具体技术方案为：
[0013] 一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，包括以下步骤：
[0014] (1)向痰液样本中加入上述消化液，震荡混匀，然后于60-70℃孵育10-15分钟；
[0015] (2)将步骤(1)获得的
混合液于13200g±50g离心8-15分钟，弃上清；
[0016] (3)向步骤(2)获得的沉淀中加入上述Tris-HCl溶液，震荡混匀，然后于13200g±50g离心8-15分钟，弃上清；
[0017] (4)向步骤(3)获得的沉淀中加入上述裂解液，然后于60-70℃孵育45-60分钟；
[0018] (5)向步骤(4)获得的混合液中加入上述Tris-HCl溶液，混匀，得到DNA溶液。
[0019] 在其中一些实施例中，所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：(0.1-0.3)：(0.1-0.2)；优选地，所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：0.1：0.1，
发明人在研究中发现，当所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：0.1：0.1时可取得更好的处理效果。
[0020] 在其中一些实施例中，所述步骤(1)中于65℃孵育10分钟。
[0021] 在其中一些实施例中，所述步骤(2)中于13200g离心10分钟；所述步骤(3)中于13200g离心10分钟。
[0022] 在其中一些实施例中，所述步骤(4)中于65℃孵育45分钟。
[0023] 所述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法先通过温和的强还原剂消化液把粘稠的痰在短时间内
液化，使细菌和人
体细胞碎片分开，不需要把人体细胞全部溶解，因此不含人源DNA；进一步在痰液液化离心弃上清液后加入适合人体生理条件的pH值的Tris-Hcl溶液，可以再次去除样本中的剩余人体细胞及其他杂质；最后加入裂解液，将细菌的细胞壁溶解破坏打开细胞膜，释放DNA。
[0024] 本发明还提供了一种检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒。
[0025] 具体技术方案为：
[0026] 一种检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒，包含以下组分：上述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂；针对IS6110的引物对1；针对IS6110的引物对2；针对IS6110的探针引物；质控模板；针对质控模板的探针引物；
[0027] 所述针对IS6110的引物对1包括序列如SEQ ID NO.1所示的IS6110-FW1和SEQ ID NO.2所示的IS6110-RV1；针对IS6110的引物对2包括序列如SEQ ID NO.3所示的IS6110-FW2和SEQ ID NO.4所示的IS6110-RV2；针对IS6110的探针引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针引物的5’端修饰有
荧光基团，3’端修饰有猝灭基团；
[0028] 所述质控模板含有小鼠RAB3A癌基因
片段和IS6110引物对2结合区域；所述质控模板序列如SEQ ID NO.6所示；针对质控模板的探针引物序列如SEQ ID NO.7所示，探针引物的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团，且所述荧光基团和猝灭基团与针对IS6110的探针引物的荧光基团和猝灭基团不相同。
[0029] 在其中一些实施例中，所述针对IS6110的探针引物的5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1；针对质控模板的探针引物的5’端修饰有荧光基团LC610，3’端修饰有猝灭基团BBQ。
[0030] SEQ ID NO.1：5’-CCGGCCAGCACGCTAATTAACGGTTC-3’
[0031] SEQ ID NO.2：5’-TGTGGCCGGATCAGCGATCGTGGT-3’
[0032] SEQ ID NO.3：5'-CTGCACACAGCTGACCGA-3'
[0033] SEQ ID NO.4：5’-CGTTCGACGGTGCATCTG-3’
[0034] SEQ ID NO.5：5'-FAM-ATGGCGAACTCAAGGAGCACATCAGC-BHQ1-3'
[0035] SEQ ID NO.6：5’-GGTACCTCGCGAATGCATCTAGATGACCCAATTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGATCAAGGTACTGGGCCTGTGAAGTTTTCGAACTAGAAAGAGAAATGGGTGGAAGAGGCTAAGCCTGGCTTCCCGGAGCAGGCACAACATGCCTGTATGGGAAGGTTGGTATAGGCAGAGTCGTGACAGTGGTGCGTGATCGCCCCTTAGAGGAACTGTGGCTGTCACTGCAGGCTGAGCTCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAAATTGGGATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC-3’[0036] SEQ ID NO.7：5’-LC610-TATAGGCAGAGTCGTGACAGTGGTGC-BBQ-3’
[0037] 在其中一些实施例中，所述检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒还包含以下组分：Probe PCR Master Mix和DEPC水。
[0038] 本发明还提供了一种结核分枝杆菌的核酸扩增方法，所述方法是单步套式PCR扩增法，可以同时在单管中进行具有不同的
退火温度的两组引物的检测，具有很好的灵敏度、特异性和准确性，可以实现结核分枝杆菌核酸的快速检测。
[0039] 具体技术方案为：
[0040] 一种结核分枝杆菌的核酸扩增方法，包括以下步骤：
[0041] (1)采集痰液样本，利用上述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法进行处理，得到DNA溶液；
[0042] (2)利用上述检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒对步骤(1)获得的DNA溶液进行PCR扩增检测。
[0043] 在其中一些实施例中，所述结核分枝杆菌的核酸扩增方法的扩增体系包含以下组分：IS6110-FW1 0.8-1μM；IS6110-RV1 0.8-1μM；IS6110-FW2 40-41μM；IS6110-RV2 40-41μM；IS6110探针引物3.5-4μM；质控模板探针引物3.5-4μM。
[0044] 在其中一些实施例中，优选所述检测结核分枝杆菌核酸的方法的扩增体系包含以下组分：IS6110-FW1 0.9μM；IS6110-RV1 0.9μM；IS6110-FW2 40.5μM；IS6110-RV2 40.5μM；IS6110探针引物4μM；质控模板探针引物4μM。
[0045] 在其中一些实施例中，所述检测结核分枝杆菌核酸的方法的扩增程序如下：95℃2min；15个循环：95℃5s,72℃30s；42个循环：95℃5s,6℃30s，并于6℃30s时采集荧光；40℃
30s。
[0046] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0047] 1、本发明提供的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂可以更快捷地从痰液样本中提取结核分枝杆菌DNA，且提取得到的DNA浓度更高，更适合下一步的检测。所述样本处理试剂比较温和且效果好，可以在短时间把结核分枝杆菌和人体细胞碎片分开，不需要把细胞全部溶解，因此更容易区分结核分枝杆菌和人的DNA，能有效去除人源DNA的干扰。所述样本处理试剂可以有效的减少
生物分子的变性，其pH值与人体相近，可以更有效的溶解
蛋白质及将其去除，使提取得到的DNA纯度更高。此外，所述样本处理试剂在处理过程中完全灭活了结核分枝杆菌，有效的降低了人员感染的
风险，更加安全高效。
[0048] 2、本发明提供的检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒能准确地对样本中的结核分枝杆菌核酸进行检测，且价格更低廉，试剂易于获取。所述试剂盒中提供的扩增引物和探针为发明人经过大量研究优化得到的，可以同时在单管中进行熔融温度较高的外部引物和熔融温度较低的内部引物的检测，既提高了检测的灵敏度，又提高了检测的特异性。其外部引物和内部引物的扩增都是在一个单管中进行的，不需要人工操作PCR扩增产物，从而减少交叉污染的机会。所述试剂盒还含有同源内部质控模板，可以更有效的监控PCR环节样本的情况，PCR抑制可以很容易地区别于真阴性结果，具有灵敏度、特异性好和准确率高等优点，可以快速地实现结核分枝杆菌核酸的扩增检测。
具体实施方式
[0049] 为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
[0050] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的
说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0051] 实施例1一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂
[0052] 本实施例一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，包含以下组分：消化液、Tris-HCl溶液和裂解液。
[0053] 所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13.33g/L；氯化钠104g/L；氯化钾2.67g/L；磷酸氢二钠14.93g/L；磷酸二氢钾2.67g/L；所述消化液的pH值为7.4。
[0054] 所述Tris-HCl溶液的浓度为0.1±0.01mol/L，pH值为7.4。
[0055] 所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH 0.1w/v％；SDS0.025w/v％。
[0056] 实施例2一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法
[0057] 本实施例一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，利用实施例1所述样本处理试剂来对痰液样本进行处理，包括以下步骤：
[0058] (1)向1mL痰液样本中加入100μL消化液，涡旋震荡混匀，然后于65℃孵育10分钟；
[0059] (2)将步骤(1)获得的混合液于13200g离心10分钟，弃上清；
[0060] (3)向步骤(2)获得的沉淀中加入100μL Tris-HCl溶液，涡旋震荡混匀，然后于13200g离心10分钟，弃上清；
[0061] (4)向步骤(3)获得的沉淀中加入100μL裂解液，然后于65℃孵育45分钟；
[0062] (5)向步骤(4)获得的混合液中加入100μL Tris-HCl溶液，混匀，得到DNA溶液，可立即使用或保存于-20℃备用。
[0063] 实施例3一种检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒
[0064] 本实施例一种检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒，包含以下组分：实施例1所述样本处理试剂、针对IS6110的引物对1；针对IS6110的引物对2；针对IS6110的探针引物；质控模板；针对质控模板的探针引物；QuantiNova Probe PCR Master Mix和DEPC水。
[0065] 所述针对IS6110的引物对1包括序列如SEQ ID NO.1所示的IS6110-FW1和SEQ ID NO.2所示的IS6110-RV1；针对IS6110的引物对2包括序列如SEQ ID NO.3所示的IS6110-FW2和SEQ ID NO.4所示的IS6110-RV2；针对IS6110的探针引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针引物的5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1；
[0066] 所述质控模板序列如SEQ ID NO.6所示；针对质控模板的探针引物序列如SEQ ID NO.7所示，针对质控模板的探针引物的5’端修饰有荧光基团LC610，3’端修饰有猝灭基团BBQ。
[0067] 上述质控模板(IC模板)为含有小鼠Rab3a致癌基因和结核分枝杆菌IS6110序列的pUC57质粒，可在DH5α大肠杆菌菌株中表达。其制备方法包括以下步骤：质粒DNA通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen Pte Ltd.；目录号27104)提取；对质粒DNA进行PCR扩增以获得346bp的质控模板，然后通过QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Pte Ltd.，目录号28106)进行纯化；通过用EB缓冲液稀释至5×10-9ng/μl来制备IC模板的工作浓度。具体如下：
[0068] A.质粒的提取
[0069] 1.将DH5αIS6110 IC的冷冻原种在6ml LB肉汤(DH5α)中与12μl 50mg/ml
氨苄青霉素继代培养，并在37℃下以250rpm摇动孵育过夜。
[0070] 2.将6ml DH5α的过夜肉汤培养液转移到15ml试管中，并以3,000xg离心5分钟。
[0071] 3.将细菌重悬于200μl的P1缓冲液中(添加了RNase A，使用前在4℃下保存)。
[0072] 4.添加200μl缓冲液P2(SDS裂解和NaOH变性)并轻轻颠倒6次，然后添加280μl缓冲液N3(中和)并立即轻轻颠倒10次。
[0073] 5.以13,000rpm离心10分钟。
[0074] 6.标记QIAprep
吸附柱，然后将上清液添加到柱中。
[0075] 7.以13,000rpm离心1分钟(更换一个收集管，添加剩余的上清液，并在必要时再次离心)。
[0076] 8.更换收集管并添加650μl缓冲液PE(添加了
乙醇)。
[0077] 9.以13,000rpm离心1分钟。
[0078] 10.更换收集管并以13,000rpm离心1分钟。
[0079] 11.丢弃收集管并更换新的1.5ml Ep管
[0080] 12.将30ul的EB缓冲液添加到吸附柱中。在室温下孵育1分钟，然后以13,000rpm离心1分钟。
[0081] 13.使用前，请储存在-20℃下。
[0082] B.PCR扩增质粒至IC模板库存
[0083] 1.如表1所示准备PCR反应混合物：
[0084] 表1 PCR反应混合物
[0085]
[0086]
[0087] *由HotStarTaq Plus DNA Polymerase 1000units提供(Qiagen Pte Ltd.,Cat no:203605)
[0088] a TBICplasmidF:5’-GGTACCTCGCGAATGCATCTAG-3’
[0089] b TBICplasmidR:5’-GAAACAGCTATGACCATGATTACGC-3’
[0090] 2.将1μl提取的质粒DNA加入混合物中。
[0091] 3.在表2条件下在热循环仪中进行PCR扩增：
[0092] 表2 PCR扩增条件
[0093]
[0094] 4.在
石蜡膜
蜡纸上加入1μl的6×上样染料。
[0095] 5.脉冲旋转PCR产物。将5μl PCR产物转移至滴加6×样品的染料中并混合。
[0096] 6.将混合物转移至2％琼脂糖凝胶的孔中。
[0097] 7.在凝胶的第一个孔中加入4μl 100bp分子大小的标记物。
[0098] 8.在120V下运行凝胶38分钟。
[0099] 9.轻轻摇动，用溴化乙锭将凝胶
染色20分钟。
[0100] 10.在紫外线照射下检查凝胶，IC模板的目标带大小：346bp。
[0101] C.纯化IC模板库存并准备工作浓度
[0102] 1.在1体积(45μl)的PCR产物中加入5体积(225μl)的PB溶液，并充分混合。
[0103] 2.将混合物加到QIAquick吸附柱上，以13,000rpm离心1分钟。
[0104] 3.丢弃离心下来的液体，然后将吸附柱放到新的收集管中。
[0105] 4.将750μl缓冲液PE加入柱中，并以13,000rpm离心1分钟。
[0106] 5.丢弃离心下来的液体，然后将吸附柱放到新的收集管中。
[0107] 6.再以13,000rpm吸附柱1分钟。丢弃收集管。将吸附柱放在干净的1.5ml Ep管中。
[0108] 7.将30μl EB缓冲液添加到吸附柱中心。
[0109] 8.保持吸附柱静置1分钟。以13000rpm离心1分钟。
[0110] 9.收集离心下来的液体作为纯化的IC模板库存，储存于-80℃以便长期储存。
[0111] 10.用Nanodrop仪器分光光度法定量。
[0112] 11.用缓冲液EB稀释IC模板至5×10-7ng/μl。将5×10-7ng/μl的IC模板以20μl的等-9分试样保存在-20℃下。每次运行中应重新准备5×10 ng/μl的工作IC模板。
[0113] 上述试剂盒在用于检测结核分枝杆菌核酸时的结果判断标准如下表3所示：
[0114] 表3试剂盒结果判断标准
[0115]
[0116] 注：IS6110阳性：样本有ct值及S型曲线；IS6110阴性：样本没有ct值或无S型曲线。质控模板阳性：样本有ct值与IC的S型曲线；质控模板阴性：样本IS6110没有ct值或S型曲线。
[0117] 实施例4一种结核分枝杆菌的核酸扩增方法本实施例一种结核分枝杆菌的核酸扩增方法，采用实施例3所述试剂盒进行扩增检测，包括以下步骤：
[0118] (1)采集痰液样本，利用实施例2所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法进行处理，得到DNA溶液；
[0119] (2)配置PCR扩增体系和进行PCR扩增检测：按表4配置PCR扩增体系，向体系中加入5μL步骤(1)获得的DNA溶液，震荡混合均匀，然后按照表5中的扩增程序进行PCR扩增检测。
[0120] 表4 PCR扩增体系
[0121]
[0122]
[0123] 表5 PCR扩增程序
[0124]
[0125] 检测结束后按照实施例3所述的判断标准进行结果判断。
[0126] 对比例1
[0127] 本对比例一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，使用常规方法对痰液标本的DNA进行提取，具体步骤如下：
[0128] (1)将痰液放入等体积的4％NaOH进行液化；
[0129] (2)将液化的样本13000转离心10min，弃去上清，加入1mL的生理盐水；
[0130] (3)再在底部沉淀中加入裂解液，在100℃金属浴十分钟；
[0131] (4)金属浴后离心，弃上清，加入DEPC水溶解，得到DNA溶液。
[0132] 对比例2
[0133] 本对比例一种结核分枝杆菌的核酸扩增方法，为使用GeneXpert MTB/RIF法进行扩增检测，检测试剂盒为MTB/RIF Assay，购于赛沛公司，检测步骤按照说明书进行，具体如下：
[0134] (1)将样本加入两倍的样品处理试剂进行液化。
[0135] (2)取出液化好的样本2mL加入试剂盒中上机进行检测。
[0136] 利用实施例2和对比例1所述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法对15例痰液样本进行DNA提取，并对提取得到的DNA溶液进行浓度和纯度测定，结果如表6所示：
[0137] 表6 DNA溶液的浓度和纯度测定结果
[0138] 样本号 实施例2 对比例11 浓度(ng/μl) 浓度(ng/μl)
2 3.2 2.8
3 6.4 5.4
4 13.2 10.1
5 2.5 2.1
6 6.8 5.9
7 28.5 25.3
8 32.1 26.8
9 16.2 14.2
10 15.2 13.2
11 14.2 10.2
12 13.5 10.1
13 3.5 2.8
14 4.6 3.3
15 5.4 4.1
[0139] 由表6中的结果可知，本发明提供的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法(实施例2)能成功对痰液样本中的DNA进行提取，且与现有的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法(对比例1)相比，其提取得到的核酸浓度更高，更适合下一步的检测。
[0140] 利用实施例4和对比例2所述检测结核分枝杆菌核酸的方法对39例痰液样本进行检测，结果如表7所示：
[0141] 表7结核分枝杆菌核酸检测结果
[0142]
[0143]
[0144] 由上表中的检测结果可知，本发明提供的结核分枝杆菌的核酸扩增方法(实施例4)检测效果与现有的GeneXpert MTB/RIF法(对比例2)检测效果相当，但是本发明提供的检测方法
费用比GeneXpert MTB/RIF法更低，本发明所述检测方法检测一个痰液样本的费用约为35元，而GeneXpert MTB/RIF法检测一个痰液样本的费用约为600元。因此，本发明提供的检测结核分枝杆菌核酸的方法更加易于推广和使用。
[0145] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0146] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
