一种用于检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)的电化学发光试
剂盒的制备
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种用于检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)的电化学发光
试剂盒及制备方法，属于电化学发光(ECL)和
免疫测定相结合的免疫测定技术领域。
背景技术
[0002] 重症肌无
力(MG)是一种由自身抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与，主要导致横纹肌神经-肌肉接头处
信号传导障碍的自身免疫性
疾病。其特点是发病年龄广、致残率高、易复发、
预后差，严重威胁到人类健康；据统计，MG全球患病率为每100万人群中有15～300人[1]患病，年发病率为(8.0～20.0)/100万 。MG是典型的抗体介导的
自身免疫性疾病，主要靶
抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体(AChR)。乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)作为MG疾病的检测指标，AchR-Ab大多数为IgG1和IgG3亚型，可以激活补体级联反应，攻击突触后膜组分，导致AChR降解和结构改变，使突触后膜受体数目减少[6]。AchR-Ab血清含量与临床症状的严重[7]
程度不成正比 ，对此现象可能的解释是MG的肌无力症状主要由受体数目的减少导致，其不仅受自身抗体滴度的影响，还与抗体的类型或其他因素有关系。据文献报道，MG的发病与肌肉特异性酪
氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)、低
密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)等也密切相关[2-3]。MG患者
治疗前的血清AchR-Ab含量与治疗前的肌无力绝对评分、患病严重程度不具有明显相关性，但治疗后的血清AchR-Ab浓度和治疗后的肌无力绝对评分呈正相关[4]，表明AchR-Ab血清含量变化对治疗效果有重要的指导意义。有研究表明，AchR-Ab和MuSK-Ab双阳性MG患者病情可能更严重，更易出现肌无力现象，胸腺增生性病变发生率较高，胸腺
切除术可能有效。AchR-Ab阳性患者多数伴有胸腺异常[5]。
[0003] AchR-Ab是一种多克隆抗体，多数属于抗α-
银环蛇毒素(α-bunga-rotoxin，α-BGT)结合部的抗体，主要为IgG型，不同类型的MG患者血清中AchR-Ab具有不同性质。准确测定其浓度对于MG病人的分型及后续治疗和监控都具有重要意义。目前最主要的测定方法就是酶联免疫法(ELISA)。其检测重症肌无力患者血清，AchR-Ab阳性率约为70％，然而由于ELISA方法所固有的操作繁琐，重复性差等缺点，很难获得准确的定量结果。不能满足重症肌无力患者病况监控，治疗
跟踪等需要。
[0004]
磁珠法电化学发光(ECL)技术是一种灵敏度更高，重现性更好，测定范围更宽广，操作更简便的检测方法[8]。已经成功应用于
肿瘤标志物，
激素等百余种指标的检测。开发用于检测AchR-Ab浓度的电化学发光试剂盒可大幅度提升AchR-Ab检测的效果和效率，具有十分重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是：为解决
现有技术中尚未有快速、准确地定量检测乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒及制法。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒，所述试剂盒成分包括：链霉亲和素偶联的
磁性微粒工作液，
生物素标记的AchR抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液，以及AchR-Ab校准品和/或质控品。
[0008] (1)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中AchR抗原为外购的商用AchR抗原。
[0009] (2)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01～0.2mol/L的
磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的
牛血清
白蛋白和/或
酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(Triton X-100)和/或聚
氧乙烯失
水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)和/或月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。
[0010] (3)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中生物素标记的AchR抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.5～5wt％的
氯化钠、1～5wt％的
蔗糖、0.05～2wt％的
小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
[0011] (4)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中AchR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
[0012] (5)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中清洗液为pH为13以上，浓度为0.1～0.5mol/L的KOH液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类
表面活性剂。
[0013] (6)所述AchR-Ab的电化学发光试剂盒中化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L的三丙胺、0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
[0014] 本发明还提供一种上述检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的AchR抗原工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，清洗液和电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。
[0015] 优选地，所述生物素标记的AchR抗原的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与AchR抗原按照1～20:1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，
透析除去多余的生物素，得生物素标记的AchR抗原。
[0016] 优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗人IgG抗体与Ru-NHS酯的
质量比为5～20:1，37℃避光反应1～3小时，然后加入甘氨
酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 本发明提供了一种检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒、制法，制备的试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现AchR-Ab的准确定量；尤其是该试剂盒适用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试
软件，只需测试样本即可定量检测样本中的AchR-Ab，使检测更快速、更可靠、更稳定。
[0019] 本发明采用经典的免疫学间接法。用生物素标记抗原，这些抗原可以捕获被测样本中特异性的抗体，被捕获的抗体与标记有三联吡啶钌的第二抗体相结合，形成复合物；后通过全自动电化学发光系统实现自动化反应检测，获得被测样本中特异性的抗体浓度。
[0020] 本试剂盒适用于全自动电化学发光系统技术平台，优势在于：①被检抗体与本产品抗原结合的特异性高、亲和力强，本产品对生物样品的要求低，可简化样品的前处理过程；②操作简便，耗时短，可迅速获得检测结果；③试剂
稳定性好，检测结果重复性好；④检测灵敏度高、测定范围宽。
具体实施方式
[0021] 现在对本发明作进一步详细的说明。
[0022]
实施例1检测AchR-Ab的电化学发光试剂盒的制备方法
[0023] 1)链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备
[0024] 将链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液，磁分离去除上清，用pH为6.8，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液重悬至浓度为0.5mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的牛血清白蛋白、0.05wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮钠。
[0025] 2)生物素标记的AchR抗原的制备
[0026] I.取1mg AchR抗原，加入适量PBS缓冲液(0.05M，pH7.0～7.6)调整抗原总浓度至1mg/ml，并加入透析袋中进行透析，每隔3～4小时换一次
透析液，更换3～4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
[0027] II.准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-Biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/ml，得NHS-Biotin水溶液；
[0028] III.将NHS-Biotin水溶液加入AchR抗原溶液中，使NHS-Biotin与AchR抗原按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的AchR抗原溶液；
[0029] IV.将生物素标记的AchR抗原溶液转移至透析袋进行透析(透析液为0.1M PBS，pH7.4)，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的AchR抗原至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。
[0030] 3)三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体的制备
[0031] I.用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS酯溶液；用0.1M、pH7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/mL的抗人IgG抗体溶液；
[0032] II.于1mL抗人IgG抗体溶液中加入10μL配制好的Ru-NHS酯溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于0.1M、pH7.4的PBS缓冲液透析过夜，期间换液3次，回收三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。
[0033] 4)生物素标记的AchR抗原工作液以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备
[0034] 配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％的牛血清白蛋白、0.1wt％的酪蛋白、1wt％的氯化钠、1wt％的蔗糖、2wt％的小牛血清、0.5wt％的Triton X-100、0.2wt％的proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的AchR抗原工作液，以及抗体浓度为1mg/L三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液。
[0035] 5)校准品和质控品工作液的配制
[0036] 配制pH为7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％的牛血清白蛋白、1wt％的氯化钠、5wt％的乙二醇、0.1wt％的Tween-20、0.2wt％的proclin 300；然后用该缓冲液配制AchR-Ab校准品和质控品工作液，校准品共6个点，AchR-Ab的浓度分别为0pmol/mL、0.1pmol/mL、0.5pmol/mL、1.0pmol/mL、6.5pmol/mL、20pmol/mL。质控品分高，低两个浓度，AchR-Ab的浓度分别为9.5pmol/mL、
1.2pmol/mL。
[0037] 6)清洗液的配制
[0038] 配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15％的十二醇乙二醇醚。
[0039] 7)化学发光底物液的配制
[0040] 配制pH为6.5，浓度为0.15mol/L的三丙胺溶液、含有0.05wt％的十二醇乙二醇醚、0.01wt％的proclin 300。
[0041] 8)试剂分装及组装
[0042] 将链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液12ml/瓶、生物素标记的AchR抗原工作液12ml/瓶、三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液12ml/瓶、校准品/质控品工作液1.0ml/瓶分装后，组装在一起，保存于2-8℃，将清洗液380ml/瓶、化学发光底物液380ml/瓶单独
包装，保存于20～25℃。
[0043] 实施例2使用本发明的试剂盒检测AchR-Ab的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
[0044] 1)将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的AchR抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗体复合物溶液；
[0045] 2)于抗原-抗体-抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁性微粒工作液，37℃孵育10分钟，形成磁性复合物悬浮液；
[0046] 3)将磁性复合物悬浮液置于
磁场内，清洗液流过，洗涤所述磁性复合物；
[0047] 4)向洗涤后的磁性复合物中先后注入电化学发光底物溶液，检测其
光子强度。由光子强度和定标曲线推算出AchR-Ab的含量。
[0048] 本发明的试剂盒的性能评估
[0049] 实施例3试剂灵敏度的研究
[0050] 试剂灵敏度是根据最低
检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(相邻浓度0.1pmol/mL)之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。
[0051] 以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂最低检测限(LOB)为0.0024pmol/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.01pmol/mL以下。
[0052] 表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
[0053]
[0054] 实施例4本发明试剂盒的重复性的研究
[0055] 检测高低两个水平浓度血清，血清浓度分别为6.4pmol/mL和1.24pmol/mL，每个样本分别检测10次，并计算样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。这个水平的精密度是ELISA等传统方法所远远不及的。
[0056] 表2本发明试剂盒的精密度测定结果
[0057]
[0058]
[0059] 实施例5本发明试剂盒的准确度测定结果
[0060] 由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为0.6、3.5和8.2pmol/mL三个浓度的AchR-Ab标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于10％。
[0061] 表3本发明试剂盒的准确度测定结果
[0062]
[0063] 综上所述本发明检测灵敏度高、检测结果重复性好，特异性优异，准确性高，可以实现乙酰胆碱受体抗体的准确定量。
[0064] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的
权利要求。
[0065] 参考文献
[0066] [1]Carr AS,Cardwell CR,Mccarron PO,et al.A systematic review of population based epidemiological studies in myasthenia gravis[J].BMC Neurology,2010,10(1):46.
[0067] [2]Meriggioli M N.Myasthenia Gravis with Anti-Acetylcholine Receptor Antibodies[J].Frontiers of neurology and neuroscience,2009,26:94-108.[0068] [3]Leite M I,Waters P,Vincent A.Diagnostic use of autoantibodies in myasthenia gravis[J].Autoimmunity,2010,43(5-6):371-379.
[0069] [4]万娜,成亚纯,许华明,et al.血清乙酰胆碱受体抗体、肌肉特异性酪氨酸激酶抗体浓度与重症肌无力患者临床分型和疾病转归的关系[J].脑与神经疾病杂志,2018,v.26(05):42-46.
[0070] [5]刘举,连志
云,陈虹西,et al.乙酰胆碱受体抗体和肌肉特异性酪氨酸激酶抗体双阳性的重症肌无力13例临床分析[J].华西医学,2018(6).
[0071] [6]Huijbers MG,Lipka AF,Plomp JJ,et al.Pathogenic immune mechanisms at the neuromuscular synapse:the role of specififi c antibody-binding epitopes in myasthenia gravis[J].J Intern Med,2014,275(1):12-26.
[0072] [7]Gilhus NE,Verschuuren JJ.Myasthenia gravis:subgroup classification and therapeutic strategies[J].Lancet Neurol,2015,14(10):1023-1036.[0073] [8]Richter M M,Powell M J,Belisle C M.Assays employing electrochemiluminescent labels and electrochemiluminescence quenchers[J].2008.
