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一种高效阳离子型聚合物的制备方法及其应用

阅读：231发布：2024-01-18

专利汇可以提供一种高效阳离子型聚合物的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种高效阳离子型聚合物的制备方法，具体包括以下步骤：步骤1、带有长支链结构的阳离子聚合物的合成：步骤1.1、将引发剂、溶剂、前驱体和单体依次加入烧瓶中，通氮气20-40min后，置于水浴锅中反应；步骤1.2、待反应完全后用乙醇沉淀，在50-70℃条件下干燥后得到带有长支链结构的阳离子聚合物；步骤2、高效阳离子型聚合物的合成：步骤2.1、将得到的带有长支链结构的阳离子聚合物分散至四氢呋喃溶液中，在25-35℃下反应4-6h；步骤2.2、将所得产物用乙醇沉淀多次后离心洗涤，得到的固体产物在50-70℃条件下干燥，即为高效阳离子型聚合物；本发明还公开了该聚合物的应用，该聚合物能提高固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性。，下面是一种高效阳离子型聚合物的制备方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种高效阳离子型聚合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、带有长支链结构的阳离子聚合物的合成：
步骤1.1、将引发剂、溶剂、前驱体和单体依次加入烧瓶中，通氮气20-40min后，置于水浴锅中反应；
步骤1.2、待反应完全后用乙醇沉淀，在50-70℃条件下干燥后得到带有长支链结构的阳离子聚合物；
步骤2、高效阳离子型聚合物的合成：
步骤2.1、将所述步骤1得到的带有长支链结构的阳离子聚合物分散至四氢呋喃溶液中，在25-35℃下反应4-6h；
步骤2.2、将所述步骤2.1所得产物用乙醇沉淀多次后离心洗涤，得到的固体产物在50-
70℃条件下干燥，最终得到醛基或羧基改性的阳离子聚合物，即为高效阳离子型聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种高效阳离子型聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤
1.1中引发剂、溶剂、前驱体和单体的质量比为0.1～1.0：10～30：0.1～1.0：10～30。
3.根据权利要求1所述的一种高效阳离子型聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤
1.1中的前驱体为羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素或淀粉及其衍生物中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种高效阳离子型聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤
1.1中的单体为带双键或氨基的物质，如丙烯酰胺、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙脂或甲基丙烯酸二乙氨基乙脂中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种高效阳离子型聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤
1.1中是在65-75℃条件下进行水浴，反应时间为3-5h。
6.根据权利要求1所述的一种高效阳离子型聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤
2中的四氢呋喃溶液为含有2-4ml的二醛基或二羧基的四氢呋喃溶液，且所述四氢呋喃溶液的pH维持在7.5-8.5之间。
7.一种高效阳离子型聚合物的应用，其特征在于，所述高效阳离子型聚合物，能用于辣根过氧化物酶，葡萄糖酶，蛋白酶，胰蛋白酶或淀粉酶的固定化，能将固定时间从12小时缩短到1个小时，提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性。

说明书全文

一种高效阳离子型聚合物的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效阳离子型聚合物的制备方法，本发明还公开了该聚合物的应用。

背景技术

[0002] 进入21世纪以来，伴随生物技术工程的高速发展，生命科学迎来了一个伟大的时代。与此同时对于生命科学的研究也为医药产业，工农业，以及环境能源领域带来了新的挑战和机遇，从而推动了一系列新兴技术产业的发展，为社会发展和改革开放带来了巨大的收益，但是与此同时科技发展带来的影响也是一把双刃剑，环境的污染日益加重，可开采的资源日益枯竭，不可再生资源几近短缺等诸多问题。在绿色化学和可持续发展政策的推动下，具有高效、专一催化特点的生物酶，在工农业，医药产业等领域有广阔的应用前景。

[0003] 但是直接将游离酶用于催化反应中存在许多不足，如在高温、强酸强碱和有机溶剂中不稳定，容易丧失催化活性；游离酶回收困难，经济上不合理，还造成产物难以分离提纯，严重影响产品质量；生产过程难以实现连续操作，只能一次性间歇操作等。固定化酶克服了游离酶的上述不足，不仅保持了游离酶特有的催化特性，还提高了操作稳定性，生产过程易于实现连续操作，反应完成后易于与产物分离且可以重复使用，所得的产品纯度高，生产成本低。因此，酶的固定化一直是催化化学、生物化学和材料化学等领域的研究热点，其中高性能的固定化载体的合成技术是关键。

[0004] 常见的生物酶的固定化方法，根据作用力基本分为化学法和物理法。物理方法为包埋法(Encapsule)和吸附法(Adsorption)。化学方法为交联法(Cross-linking)和共价结合法(Covalent binding)。

[0005] 包埋法是将酶包埋在高分子凝胶网络中，或是将酶包埋在高分子的半透膜中(微胶囊型)。利用包埋法固定生物酶后，生物酶分子被载体包裹住，底物大分子通过载体与生物酶接触难度增大，生物酶分子较难发挥催化作用，酶的表观活力降低。因此，包埋法只能适合作用于底物和产物都是小分子的生物催化过程。

[0006] 吸附法主要包括物理吸附法与离子吸附法。物理吸附法是指通过范德华力等物理吸附作用，将酶固定在不溶性载体上的一种方法。但离子吸附法是通过阴阳离子吸附将酶固定在载体上。这两种方法存在吸附力较弱，酶易脱落的问题。

[0007] 交联法是利用双功能或多功能试剂，使生物酶蛋白分子间发生交联，达到固定生物酶的目的。但生物酶分子之间用化学键连接反应条件较激烈、生物酶失活率较高、稳定性降低并且交联生物酶需要高纯度结晶生物酶，生产方法复杂。

[0008] 共价结合法是生物酶分子的表面基团与固定载体表面的官能团发生化学反应，形成共价键，通过共价键的作用实现生物酶固定的方法。共价结合法中，固定酶与载体连接牢固，不易脱落，具有较高的稳定性和重复利用率。其缺点为固定反应条件比较苛刻，固定化后生物酶活力有所降低，固定化过程较复杂。

[0009] 综上所述，不同固定化方法及其应用十分普遍。物理方法固定酶，操作简单，生物酶活损失小，但重复利用率较低，导致相应的生产成本提高；化学法固定酶，生物酶活损失比物理法大，但固定化后，在多次使用后固定酶仍保持酶活，符合大规模生产需要。

[0010] 申请号：200810034516.2，公开日：2008-08-27，公开号 CN101250247A名称为一种用于生物酶固定化的磁性聚合物微球及其制备方法的。将超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子、含环氧基团的单体和交联剂等分散在甲酰胺溶液中制成单体相，在搅拌下加入到用 Span60和Tween20复合表面活性剂稳定的分散相中进行反相悬浮聚合，制备表面带有环氧基团的磁性聚合物微球。该发明用Tween20 代替CN101085874A中的硬脂酸钙，提高了固定化酶的活性，简化了后处理的操作。但是在该发明中，纳米级的磁性粒子具有较高的表面能，在聚合反应过程中分散性不好，极易团聚成大颗粒，使制备得到的磁性聚合物微球中磁含量不等、粒径分布不均匀和形貌不均一，降低了磁性聚合物微球的比表面积，从而降低了固定化酶的活性。同时磁性微球的循环催化效果较差，重复使用效率低。

发明内容

[0011] 本发明的目的在于提供一种高效阳离子型聚合物的制备方法，该聚合物提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性。

[0012] 本发明的另一个目的是提供这种高效阳离子型聚合物的应用。

[0013] 本发明所采用的技术方案是，一种高效阳离子型聚合物的制备方法，具体包括以下步骤：

[0014] 步骤1、带有长支链结构的阳离子聚合物的合成：

[0015] 步骤1.1、将引发剂、溶剂、前驱体和单体依次加入烧瓶中，通氮气20-40min后，置于水浴锅中反应；

[0016] 步骤1.2、待反应完全后用乙醇沉淀，在50-70℃条件下干燥后得到带有长支链结构的阳离子聚合物；

[0017] 步骤2、高效阳离子型聚合物的合成：

[0018] 步骤2.1、将所述步骤1得到的带有长支链结构的阳离子聚合物分散至四氢呋喃溶液中，在25-35℃下反应4-6h；

[0019] 步骤2.2、将所述步骤2.1所得产物用乙醇沉淀多次后离心洗涤，得到的固体产物在50-70℃条件下干燥，最终得到醛基或羧基改性的阳离子聚合物，即为高效阳离子型聚合物。

[0020] 本发明的特点在于，

[0021] 步骤1.1中引发剂、溶剂、前驱体和单体的质量比为0.1～1.0： 10～30：0.1～1.0：10～30。

[0022] 步骤1.1中的前驱体为羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素或淀粉及其衍生物中的任意一种。

[0023] 步骤1.1中的单体为带双键或氨基的物质，如丙烯酰胺、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙脂或甲基丙烯酸二乙氨基乙脂中的任意一种。

[0024] 步骤1.1中是在65-75℃条件下进行水浴，反应时间为3-5h。

[0025] 步骤2中的四氢呋喃溶液为含有2-4ml的二醛基或二羧基的四氢呋喃溶液，且四氢呋喃溶液的pH维持在7.5-8.5之间。

[0026] 本发明所采用的另一技术方案是，一种高效阳离子型聚合物的应用,能用于辣根过氧化物酶，葡萄糖酶，蛋白酶，胰蛋白酶或淀粉酶的固定化，能将固定时间从12小时缩短到1个小时，提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性。

[0027] 本发明的有益效果是：

[0028] 本发明一种高效阳离子型聚合物的制备方法，使用带有长支链结构的多官能团阳离子聚合物作为酶载体，支链上部分氨基被二醛基，二羧基结构的单体取代，所得产物与生物酶接枝得到生物酶接枝阳离子聚合物。将固定时间从12小时缩短到1个小时，提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性，连续催化48小时，活性保持95％以上。附图说明

[0029] 图1是本发明得到的带有长支链结构的阳离子聚合物结构；

[0030] 图2是本发明最终得到醛基或羧基改性的阳离子聚合物结构；

[0031] 图3是本发明辣根过氧化物酶的固定过程示意图；

[0032] 图4是本发明实施例1在玻璃片上的固定及活性稳定性检测结果；

[0033] 图5是本发明实施例2在氢氧化钠处理玻璃片上的固定及活性稳定性检测结果；

[0034] 图6是本发明实施例1在玻璃管内部的固定及活性稳定性检测结果；

[0035] 图7是本发明实施例2在填充棉花的玻璃管内部的固定及活性稳定性检测结果；

[0036] 图8(a)是本发明实施例1在纸张上的固定及活性稳定性检测结果；

[0037] 图8(b)是本发明实施例2在棉布上的固定及活性稳定性检测结果。

具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0039] 本发明一种高效阳离子型聚合物的制备方法，具体包括以下步骤：

[0040] 步骤1、带有长支链结构的阳离子聚合物的合成：

[0041] 步骤1.1、将引发剂、溶剂、前驱体和单体依次加入烧瓶中，通氮气20-40min后，置于水浴锅中反应；其中引发剂、溶剂、前驱体和单体的质量比为0.1～1.0：10～30：0.1～1.0：10～30；前驱体为羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素或淀粉及其衍生物中的任意一种；单体为带双键或氨基的物质，如丙烯酰胺、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙脂或甲基丙烯酸二乙氨基乙脂中的任意一种；

[0042] 且是在65-75℃条件下进行水浴，反应时间为3-5h；

[0043] 步骤1.2、待反应完全后用乙醇沉淀，在50-70℃条件下干燥后得到带有长支链结构的阳离子聚合物；如图1所示，是得到的带有长支链结构的阳离子聚合物结构示意图；

[0044] 步骤2、高效阳离子型聚合物的合成：

[0045] 步骤2.1、将所述步骤1得到的带有长支链结构的阳离子聚合物分散至四氢呋喃溶液中，在25-35℃下反应4-6h；其中四氢呋喃溶液为含有2-4ml的二醛基或二羧基的四氢呋喃溶液，且所述四氢呋喃溶液的pH维持在7.5-8.5之间；

[0046] 步骤2.2、将所述步骤2.1所得产物用乙醇沉淀多次后离心洗涤，得到的固体产物在50-70℃条件下干燥，最终得到醛基或羧基改性的阳离子聚合物，如图2所示，即为高效阳离子型聚合物。

[0047] 本发明一种高效阳离子型聚合物的应用，这种具有长支链的阳离子聚合物，能用于辣根过氧化物酶，葡萄糖酶，蛋白酶，胰蛋白酶或淀粉酶的固定化，能将固定时间从12小时缩短到1个小时，提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性。能连续催化48小时，活性保持95％以上。辣根过氧化物酶的固定过程如下图3所示[0048] 实施例1

[0049] 将1克过硫酸钾，20毫升水，0.1克羧甲基纤维素，10克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵依次加入烧瓶，通氮气30分钟后，于水浴锅70摄氏度反应4小时，待反应完全，用乙醇沉淀，60摄氏度干燥备用；将0.1克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素分散至3毫升(pH＝8.0)戊二醛溶液中，然后30摄氏度下反应5小时。用乙醇沉淀并多次离心洗涤，得到的固体60摄氏度干燥，得到戊二醛改性的聚阳离子型羧甲基纤维素CMC-g-(PDMC-r-GA)。称取5毫克CMC-g-(PDMC-r-GA)加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液(2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)和清洗后的盖玻片(直径：8毫米；厚度： 0.15-0.17毫米；总表面积：1.0平方厘米)，常温水浴5小时，完成后用PB1(磷酸二氢钠缓冲溶液pH＝7.0)洗涤盖玻片，放于4摄氏度保存。取出玻璃片放于2毫升离心管中，依次加入PB1(pH＝7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液,0.01M)1780微升、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,10.0mM)200微升、H2O2(过氧化氢溶液,
20.0mM)20微升，测量414纳米处吸光度,结果如图4所示。生物酶辣根过氧化物酶与载体玻璃片作用后，生物酶的保留活性较低，这是因为生物酶与玻璃片之间几乎没有作用力；生物酶经过聚合物 CMC-g-PDMC作与载体玻璃片作用，生物酶保留活性有所提高，是因为聚合物的阳离子氨基集团与玻璃片表面的阴离子有吸附作用，但酶和聚合物之间作用力弱；而生物酶经戊二醛改性的阳离子 CMC-g-(PDMC-r-GA)与载体玻璃片的作用，生物酶的保留活性最高，说明生物酶与戊二醛的醛基进行了反应，通过阳离子聚合物与玻璃片的阴阳离子吸附实现了生物酶的有效固定。

[0050] 实施例2

[0051] 将0.7克过硫酸钾，30毫升水，0.5克羧甲基纤维素，15克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵依次加入烧瓶，通氮气30分钟后，于水浴锅70摄氏度反应4小时，待反应完全，用乙醇沉淀，60摄氏度干燥备用；将0.1克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素分散至3毫升(pH＝8.0)戊二醛溶液中,然后30摄氏度下反应5小时。用乙醇沉淀并多次离心洗涤，得到的固体60摄氏度干燥，得到戊二醛改性的聚阳离子型羧甲基纤维素CMC-g-(PDMC-r-GA)。将上述阳离子型聚合物用于辣根过氧化物酶的固定化在玻璃片上(玻璃片经 10％氢氧化钠处理)上，取出玻璃片于2毫升离心管中，依次加入PB1 (pH＝7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液)1780微升、ABTS(2,2-联氮-二(3- 乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)200微升、H2O2(过氧化氢溶液) 20微升，测量414纳米处吸光度，结果如图5所示。实验结果表明经过氢氧化钠处理的玻璃片表面的阴离子数目显著增加，与生物酶接枝阳离子聚合物的作用力大大增加，生物酶的固定得到了良好改善。

[0052] 实施例3

[0053] 将0.2克过硫酸钾，10毫升水，0.1克羧甲基纤维素，10克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵依次加入烧瓶，通氮气30分钟后，于水浴锅70摄氏度反应4小时，待反应完全，用乙醇沉淀，60摄氏度干燥备用；将0.1克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素分散至3毫升(pH＝8.0)戊二醛溶液中,然后30摄氏度下反应5小时。用乙醇沉淀并多次离心洗涤，得到的固体60摄氏度干燥，得到戊二醛改性的聚阳离子型羧甲基纤维素CMC-g-(PDMC-r-GA)。称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液 (2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)，常温水浴5小时，完成后将溶液加至玻璃微管中，依次加入pH＝7.0 的磷酸二氢钠溶液1780微升、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二铵盐ABTS 200微升、过氧化氢溶液20微升，测量414nm处吸光度，玻璃微管固定化酶活性测量，结果如图6所示。生物酶辣根过氧化物酶与载体玻璃管作用后，以及生物酶经聚合物CMC-g-PDMC与与载体玻璃管作用后，生物酶的保留活性较低，这是因为生物酶与玻璃片之间几乎没有作用力；而生物酶经戊二醛改性的阳离子 CMC-g-(PDMC-r-GA)与载体玻璃片的作用，生物酶的保留活性最高，说明生物酶与戊二醛的醛基进行了反应，通过阳离子聚合物与玻璃片的阴阳离子吸附实现了生物酶的有效固定。将酶固定时间从12小时缩短到1个小时，提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性，连续催化后生物酶活性稳定，活性保持95％以上。实施例3：将0.2克过硫酸钾，10毫升水，0.1克羧甲基纤维素，10 克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵依次加入烧瓶，通氮气30分钟后，于水浴锅70摄氏度反应4小时，待反应完全，用乙醇沉淀，60摄氏度干燥备用；将0.1克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素分散至3毫升(pH＝8.0)戊二醛溶液中,然后30摄氏度下反应5 小时。用乙醇沉淀并多次离心洗涤，得到的固体60摄氏度干燥，得到戊二醛改性的聚阳离子型羧甲基纤维素CMC-g-(PDMC-r-GA)。称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP) 溶液(2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液 pH＝4.7)，常温水浴5小时，完成后将溶液加至玻璃微管中，依次加入pH＝7.0的磷酸二氢钠溶液1780微升、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS 200微升、过氧化氢溶液20微升，测量414nm 处吸光度，玻璃微管固定化酶活性测量，结果如图6所示。生物酶辣根过氧化物酶与载体玻璃管作用后，以及生物酶经聚合物 CMC-g-PDMC与与载体玻璃管作用后，生物酶的保留活性较低，这是因为生物酶与玻璃片之间几乎没有作用力；而生物酶经戊二醛改性的阳离子CMC-g-(PDMC-r-GA)与载体玻璃片的作用，生物酶的保留活性最高，说明生物酶与戊二醛的醛基进行了反应，通过阳离子聚合物与玻璃片的阴阳离子吸附实现了生物酶的有效固定。将酶固定时间从12小时缩短到1个小时，提高了固定化生物酶的耐冲击性能，连续催化性能以及操作稳定性，连续催化后生物酶活性稳定，活性保持 95％以上。

[0054] 实施例4

[0055] 将0.5克过硫酸钾，15毫升水，0.3克羧甲基纤维素，20克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵依次加入烧瓶，通氮气30分钟后，于水浴锅70摄氏度反应4小时，待反应完全，用乙醇沉淀，60摄氏度干燥备用；将0.1克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素分散至3毫升(pH＝8.0)戊二醛溶液中,然后30摄氏度下反应5小时。用乙醇沉淀并多次离心洗涤，得到的固体60摄氏度干燥，得到戊二醛改性的聚阳离子型羧甲基纤维素CMC-g-(PDMC-r-GA)。称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液(2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)，常温水浴5小时，完成后将溶液加至玻璃微管(玻璃微管中加入棉花增大比表面积)中，依次加入pH＝7.0的磷酸二氢钠溶液1780微升、 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS 200微升、过氧化氢溶液20微升，测量414nm处吸光度，玻璃微管固定化酶活性测量，结果如图7所示。表明填充棉花增加了玻璃管内部的比表面积，有助于生物酶活性的提高。

[0056] 实施例5

[0057] 将1克过硫酸钾，20毫升水，0.1克羧甲基纤维素，10克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵依次加入烧瓶，通氮气30分钟后，于水浴锅70摄氏度反应4小时，待反应完全，用乙醇沉淀，60摄氏度干燥备用；将0.1克甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素分散至3毫升(pH＝8.0)戊二醛溶液中,然后30摄氏度下反应5小时。用乙醇沉淀并多次离心洗涤，得到的固体60摄氏度干燥，得到戊二醛改性的聚阳离子型羧甲基纤维素CMC-g-(PDMC-r-GA)。称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液(2.67 微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)和纸张和布料(表面积：1.0平方厘米)，浸泡5小时，完成后用PB1(磷酸二氢钠缓冲溶液pH＝7.0)洗涤纸张(定性滤纸)和布料(棉布)，放于4摄氏度保存。
取出纸张布料于2毫升离心管中，依次加入PB1 (pH＝7.0的磷酸二氢钠缓冲溶液)1780微升、ABTS(2,2-联氮-二(3- 乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)200微升、H2O2(过氧化氢溶液)
20 微升，测量414纳米处吸光度，结果如图8所示。表明生物酶通过阳离子接枝聚合物可以固定于棉布和纸张表面，且生物酶活性稳定。

[0058] 辣根过氧化物酶(HRP)的固定化试验：

[0059] (1)辣根过氧化物酶(HRP)在盖玻片的固定

[0060] 如图3所示，称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液(2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)和清洗后的盖玻片(直径：8毫米；厚度： 0.15-0.17毫米；总表面积：1.0平方厘米)，常温水浴5小时，完成后用PB1(磷酸二氢钠缓冲溶液pH＝7.0)洗涤盖玻片，放于4摄氏度保存。

[0061] (2)辣根过氧化物酶(HRP)在纸张，布料上的固定

[0062] 如图3所示，称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液(2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)和纸张和布料(表面积：1.0平方厘米)，浸泡5小时，完成后用PB1(磷酸二氢钠缓冲溶液pH＝7.0)洗涤纸张和布料，放于4摄氏度保存。

[0063] (3)辣根过氧化物酶(HRP)在玻璃微管中的固定

[0064] 如图3所示，称取5毫克戊二醛改性的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵接枝羧甲基纤维素加入2毫升离心管中，加入0.5毫升辣根过氧化物酶(HRP)溶液(2.67微米,MesB1)(2吗啉代乙磺酸和氯化钠的缓冲溶液pH＝4.7)，常温水浴5小时，完成后将溶液加至玻璃微管中(内径：0.9-1.1毫米；壁厚：0.10-0.15毫米；管长120 毫米；总表面积：76平方毫米)。

[0065] 辣根过氧化物酶的活性和操作稳定性测定方法：取出玻璃片于 2毫升离心管中，依次加入pH＝7.0的磷酸二氢钠溶液1780微升(0.01 M,pH＝7.0)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐ABTS 200 微升(10.0mM)、过氧化氢溶液20微升(20.0mM)，测量414nm处吸光度。

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