技术领域
[0001] 本
发明属于农业
生物技术领域,具体涉及布氏白僵菌BRNS50206及应用。
背景技术
[0002] 金龟甲类、象甲类
害虫对农业、林业造成严重危害。长期以来,我国主要依赖化学
农药防治害虫,由于连年大量施用化学
杀虫剂,且缺乏高效的治理方法,导致害虫抗药性增强,使得用药量、防治
费用不断增加,有益天敌生物被大量损伤,生态环境遭到严重破坏,而害虫依然猖獗。与此同时,农产品、
土壤和
水域均受到农药残留污染,人类健康也受到严重威胁和损害。
[0003] 随着人民生活水平的不断提高,人们对
食品安全和环境污染问题也越来越关注,对食品
质量的要求也越来越高。为保护生态环境,保证食品和
饲料的产量、品质和安全性,应用
生物防治技术大面积控制农业害虫,采取害虫可持续治理措施势在必行。
发明内容
[0004] 为了解决
现有技术中存在的
化学农药防治害虫导致的生态破坏、环境污染等问题,本发明提供一种高效杀虫的布氏白僵菌,其具有对特定的病虫害的特效控制作用、对非靶生物安全性高、无污染无残留、环境友好的特点。
[0005] 本发明的目的在于提供一种高效杀虫的布氏白僵菌BRNS50206。
[0006] 本发明的再一目的在于提供布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供含有上述菌株的
杀菌剂。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述菌株的应用。
[0009] 本发明的布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)BRNS50206菌株的保藏编号为CGMCC No.15993,该菌株于2018年07月17日保存于中国普通
微生物菌种保藏中心,保藏中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
[0010] 根据本发明的具体实施方式,布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法包括以下步骤:
[0011] (1)液体
种子培养:将布氏白僵菌孢子接种到含有液体种子培养基的摇瓶中培养,得到液体种子;
[0012] (2)液体放大培养:将步骤(1)所得的液体种子接种到
发酵罐中进行放大培养,得到液体培养物;
[0013] (3)固体发酵培养:将步骤(2)所得的液体培养物接种到固体培养基中,培养5~9天后,干燥分离,得到菌种孢子粉。
[0014] 根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法,其中,所述液体种子培养所用的培养基含
蔗糖3%、蛋白胨1%、
酵母浸出粉0.25%、
硫酸镁0.01%,余量为水。
[0015] 根据本发明具体实施方式的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法,其中,所述液体放大培养所用的培养基含蔗糖2%、可溶性
淀粉1%、
啤酒酵母1%、胡萝卜干粉0.4-0.6%、
磷酸氢二
钾0.1%、
硫酸镁0.05%,余量为水。
[0016] 本发明的PPDA培养基的组分为1000mL中含
马铃薯200g(煮汁)、
葡萄糖20g、蛋白胨10g,琼脂18g。
[0017] 根据本发明的具体实施方式的布氏白僵菌BRNS50206的孢子粉的制备方法,其中,固体发酵培养所用的培养基含谷物皮壳35~60%、麦麸35~60%、玉米粉5~10%。
[0018] 本发明还提供了一种生物杀菌剂,其含有上述布氏白僵菌的菌体或孢子粉。
[0019] 根据本发明的具体实施方式的生物杀菌剂,优选的,将上述菌株孢子粉用土、沙土或工业无机填充料如
硅藻土、
高岭土等进行稀释分散,制成含孢量每克5-20亿孢子的粉剂,然后投撒到害虫发生的区域。
[0020] 根据本发明的具体实施方式的生物杀菌剂,优选的,将孢子粉按照
可湿性粉剂配方和加工方法,制成含孢量每克20-100亿孢子的可湿性粉剂,使用时兑水,喷洒或喷雾到害虫发生的区域。
[0021] 根据本发明的具体实施方式的生物杀菌剂,优选的,将孢子粉按照颗粒剂配方和加工方法,制成含孢量每克2-10亿孢子的颗粒剂,然后投撒到害虫发生的区域。
[0022] 本发明还提供布氏白僵菌BRNS50206在防治金龟甲类、象甲类害虫中的应用。
[0023] 本发明的有益效果:
[0024] 本发明的布氏白僵菌BRNS50206源于自然、与环境友好兼容、无污染无残留,对金龟甲类、象甲类害虫有独特的高效控制作用,可作为无公害新型农药,用于
农作物、果树、林木、草坪等的无害化处理。通过田间防治试验证明,本发明的菌株对金龟甲类、象甲类幼虫防效达到60-80%,防治效果良好。
[0025] 本发明的菌株可利用工业发酵技术进行规模化生产,极具市场开发潜
力。本发明菌株的孢子粉可加工制成粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂的形式,便于喷撒、喷洒或投撒到虫害发生区。
附图说明
[0026] 图1为本发明菌株在PPDA培养基上的菌落形态,左图为培养7天后的菌落形态,右图为培养9天后的菌落形态;
[0027] 图2为本发明的菌株在
电子显微镜下的形态;
[0028] 图3显示被本发明菌株侵染的金龟子幼虫;
[0029] 图4显示被本发明菌株侵染的苜蓿叶象甲成虫和幼虫。
[0030] 布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)BRNS50206的保藏编号CGMCC No.15993,该菌株于2018年07月17日保存于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
[0032] 1.获取高效菌株
[0033] 本发明分别从山东、江苏、河北、
云南、四川、北京、内蒙等地采集感染白僵病症的虫尸,在实验室内进行微生物分离、纯化。
[0034] 小心挑取虫尸上的菌体,接种到选择性培养基上,在25℃
温度下培养7天,分辨菌落并转移到新的选择性培养基平皿上,在25℃温度下培养14天以上,待菌落完全产孢后,转移到菌种培养基试管中,在25℃温度下培养14天后,于4℃
冰箱冷藏保存。
[0035] 将纯化的63个菌株对大黑鳃金龟幼虫进行生物测定,具体的方法步骤为:分别将各菌株的孢子与土壤混拌均匀,使最终每克土壤含2×107孢子,
含水量13.5%。将含菌土壤装入饲养盒,每盒接入1头试虫,25℃室内饲养至14天,每菌株处理30头(盒)。检查试虫死亡率,选取高死亡率的菌株进入复筛。经过单孢分离和3轮生物测定复筛,复筛时每菌株设置3组重复,每组重复30头(盒),最终筛选出高效菌株BRNS50206。
[0036] 2.高效菌株的形态学鉴定特征
[0037] 配制PPDA培养基并制成平板,接种菌株BRNS50206,25℃培养2天,肉眼观察可见白色小菌落,继续培养7天,如图1所示,可见菌落扩大生长,菌落呈白色绒毛状,表面有白色孢子产生,呈现粉状或小团状。
[0038] 在凹型
载玻片的小室内滴一滴灭菌的PPDA培养基,接种分生孢子,25℃培养5d,于环境扫描电子显微镜下观察,如图2所示,可见分生孢子梗着生于营养菌丝上,单生;产孢细胞簇生,呈瓶状,颈部产孢轴呈膝状弯曲;孢子粘着在孢梗上;分生孢子椭圆形2-4.5×1.5-2.5μm。
[0039] 3.鉴定菌株品系特征
[0040] 配制LM培养基,其组分和配制方法为称取蔗糖20g、蛋白胨5g,加水至1000mL,分装至三
角瓶,置于高压蒸气灭菌器中121℃保持30min,放凉至室温备用。
[0041] 接种分生孢子至上述培养基中,接种量为2-3×105孢子/mL,于25±1℃、200rpm摇床上培养48h,用
滤纸过滤后留菌丝,挤干水分备用。基于菌株ITS的核苷酸序列、延长因子EF-α的核苷酸序列,并结合生理性状,确定高效菌株BRNS50206为布氏白僵菌。
[0042] 实施例2 菌株的培养方法
[0043] 本发明菌株的培养方法,包括以下步骤:
[0044] (1)液体种子培养:培养基含蔗糖3%,蛋白胨1%,酵母浸出粉0.25%,硫酸镁0.01%,余量为水。将试验管菌种孢子接种到装有培养基的摇瓶中,接种量为5×104孢子/mL,于摇床上振荡培养25±1℃、200rpm 48h;
[0045] (2)液体二级培养:培养基含蔗糖2%,可溶性淀粉1%,
啤酒酵母1%,胡萝卜干粉0.4-0.6%,
磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,余量为水。将液体种子接种
发酵罐中,按体积比接种量为3-5%,控制温度25±1℃、转速50-200rpm,通气量0.5~0.8,发酵培养36-54h。
[0046] (3)固体发酵培养:培养基含谷壳或碎花生壳或碎玉米芯或碎麦秸40-60%,麦麸40-60%,玉米粉5-10%,各组分之和为100%,将液体培养物接种到的固体培养基中,接种比为体积∶重量0.4-0.8:1,基料适宜厚度5-8cm,于25±1℃培养6-8天后,转至16-20℃培养
5-9天,干燥后用振筛法或旋
风法分离收集孢子粉,即得到分生孢子粉产品。
[0047] 实施例3 验证菌株杀虫能力
[0048] 1.验证菌株孢子粉的杀虫能力
[0049] (1)对金龟子幼虫的杀灭能力
[0050] 将发酵培养得到的孢子粉定量加入到土壤中,混拌均匀,形成每克土壤含1×107、5×107、10×107孢子的不同浓度混合菌土,分装到小塑料饲养盒中,每盒放入野外捕获的蛴螬1只,加土豆
块作饲料,每浓度处理20只蛴螬,3次重复,以不加菌粉的空白土壤为对照,
23-26℃培养20天,每3天检查一次,根据蛴螬最终死亡率比较确定菌株的作用。实验中观察到死亡虫体变得僵硬,将死亡虫体转移到干净培养皿中保湿3天,如图3所示,可见到虫体表面生长出菌丝,之后产生白色孢子。
[0051] 具体实验结果如表1所示:
[0052] 表1 不同浓度菌剂处理蛴螬的死亡率
[0053]
[0054] 实验结果表明,试虫在1×107、5×107、10×107三种浓度孢子处理下的校正死亡率分别是55.2%,70.7%和86.2%,证明菌株能高效侵染金龟子幼虫,且金龟子幼虫死亡率随着孢子浓度增加而增加。
[0055] (2)对丽金龟幼虫的杀灭能力
[0056] 将野外采集的丽金龟成虫在实验室内饲养,待其产卵孵化,饲养到1龄、2龄和3龄幼虫期时进行试验测定。
[0057] 将发酵培养得到的孢子粉定量加入到土壤中,混拌均匀,形成每克土壤含0.08×107、0.4×107、2×107、10×107、50×107孢子的梯度浓度混合菌土,分装到花盆中。1龄幼虫处理每盆放入蛴螬30只,3次重复;2龄和3龄幼虫处理每盆分别放入蛴螬20只,4次重复。加草根作饲料。以不加菌粉的空白土壤为对照。25-28℃培养25天,每5天检查一次,根据蛴螬最终死亡率比较菌株不同浓度处理的作用。实验中观察到死亡虫体变得僵硬,转移到干净培养皿中保湿3天,可见到虫体表面生长出菌丝,之后产生白色孢子。
[0058] 结果表明,试虫在5种浓度孢子处理下的校正死亡率分别是35.0%,40.6%,58.3%,76.7%和84.6%,证明菌株能有效侵染丽金龟幼虫。
[0059] (3)对暗黑鳃金龟子幼虫的作用效果
[0060] 野外采集暗黑鳃金龟成虫,在实验室内饲养,待其产卵、孵化,饲养到1龄、2龄、3龄幼虫期时进行生物测定。
[0061] 将发酵培养得到的孢子粉定量加入到土壤中,混拌均匀,形成每克土壤含5×107孢子的混合菌土,分装到小塑料盒中,每盒放入蛴螬1只,加土豆块作饲料。每龄期幼虫处理30只蛴螬,3次重复,以不加菌粉的空白土壤为对照,23-26℃室温培养21天,根据蛴螬最终死亡率确定菌株的作用。实验中观察到死亡虫体变得僵硬,转移到干净培养皿中保湿3天,可见到虫体表面生长出菌丝,之后产生白色孢子。
[0062] 结果表明,1龄、2龄、3龄幼虫的死亡率分别为97.3%,84.5%,76.7%,证明本发明菌株能有效侵染暗黑鳃金龟子各龄期幼虫,对低龄幼虫的侵染率较高。
[0063] (4)对苜蓿叶甲虫的作用效果
[0064] 从苜蓿田中采集苜蓿叶象甲成虫和幼虫,在实验室内进行生物测定。
[0065] 将孢子粉配制成每克25亿孢子的可湿性粉剂,使用时取1克加水100mL配制成悬浮液,用
喷雾器接种到试虫体表,置于塑料饲养盒中,每盒试虫50头以上,以新鲜苜蓿苗为饲料,3盒重复,以喷雾清水为空白对照,24-26℃室温饲养3周,每天更换饲料,第4天起每日捡出死亡虫体,最终根据死亡率和死亡速率评价菌株的作用。如图4所示,实验中观察到死亡虫体变得僵硬,转移到干净培养皿中保湿5天,可见到虫体表面生长出菌丝并有白色孢子产生。
[0066] 结果表明,苜蓿叶象甲死亡率达到为86.6%,证明菌株对苜蓿叶象甲有高
毒力作用,可防控其对苜蓿的危害。
[0067] (5)对金龟子幼虫作用的田间效果
[0068] 将大约5亩的花生地划分为3×6的18个小区,分别为三种施菌量(低、中、高菌量分11 11 11
别为1×10 、5×10 、10×10 孢子/亩)、一种菌剂加20%常量化学农药、常量化学农药(辛硫磷
乳油剂,辛硫磷常量为40%乳油1000倍稀释液,20%常量为5000倍稀释液)和空白对照处理,每处理设3小区重复,随机排列。处理方法为在花生开花初期,将菌株孢子的可湿性粉剂兑水后喷淋到花生植株基部,然后培土
覆盖。在花生
收获时每小区内
抽取1m2样方3次重复,调查花生虫果率和产量,评价菌株防治害虫蛴螬的作用效果,结果如表2所示。
[0069] 表2 布氏白僵菌BRNS50206防治花生田间蛴螬效果
[0070]
[0071]
[0072] 表2的结果表明,田间使用本发明的布氏白僵菌BRNS50206后,虫口减退率均较对照组有较大幅度的提高。因此,田间应用布氏白僵菌BRNS50206后能够减少蛴螬危害,从而降低虫果率,增加花生产量。