技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物制备技术领域，具体地涉及一种侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法。
背景技术
[0002] 侧孢短芽孢杆菌(BrevibacillusLaterosporu)属于芽孢杆菌属，是经过国家农业部微生物检测中心批准使用的一种天然菌种，其芽孢为椭圆形，侧生，孢囊膨大，游离芽孢一边比另一边厚。侧孢对无脊椎生物具有毒性作用，包括多种蚊蝇、甲虫类昆虫的幼虫以及
线虫虫卵等，其毒性物质主要为类芽孢内含物。侧孢可分泌多种抑菌物质，主要包括非肽类的芽孢菌胺，肽类抗生素等，还可以产生蛋白酶、几丁质酶、溶菌酶等多种酶类，因此，可用于防治青枯病、枯萎病、根腐病、立枯病、赤霉病等多种细菌性与
真菌性病害，是农业生产中用途广泛、应用量大的一种农业微生物。目前国内发酵
水平普遍较低，发酵液菌量一般只能达到10-30×108CFU/mL，导致生产成本偏高，严重制约了产品的销售和应用。因此，本发明公开了一种高菌量侧孢短芽孢杆菌发酵液的培养方法，能够显著提高发酵液活菌含量和芽孢菌量。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法，以解决对现有侧孢短芽孢杆菌发酵技术的不足造成产品菌含量不高的问题，以提高产品活菌的含量。
[0004] 本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
[0005] 一种侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法，包括以下工艺步骤：
[0006] (1)将侧孢短芽孢杆菌原始岀发菌株经复壮和扩大培养后，得到的菌液为发酵菌种；
[0007] (2)向步骤(1)所得发酵菌种中添加相当于发酵菌种体积量的15-20％的甘油，放置-80℃
温度下保存备用；
[0008] (3)发酵培养基原料经中性蛋白酶酶解后灭菌，将上述发酵菌种接种入该发酵培养基，分阶段控制转速和
风量，待镜检芽孢率达到95％以上时停止培养。
[0009] 进一步的，步骤(1)所述原始出发菌株的复壮和扩大培养包括以下步骤：
[0010] (A)从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到
种子固体平板培养基上，划线分离培养得单细胞菌落；
[0011] (B)挑出步骤(A)所述单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，培养出菌体；
[0012] (C)将步骤(B)所述菌体挑取一环接种到菌种液体培养基中，摇床培养20-24小时停止培养；
[0013] (D)将步骤(C)所得菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，培养得菌体；
[0014] (E)从步骤(D)所述菌体中挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，摇床培养20-24小时停止培养，所得菌液为发酵菌种。
[0015] 进一步的，步骤(C)所述菌种液体培养基组成为：按照重量百分比计,0.3-0.5％的
葡萄糖、0.8-1％的
氯化钠、0.8-1％的蛋白胨、0.3-0.5％的
酵母浸粉。
[0016] 进一步的，步骤(E)所述种子复壮液体培养基组成为：按照重量百分比计,0.3-0.5％的葡萄糖、0.3-0.5％的氯化钠、0.3-0.5％的蛋白胨、0.3-0.5％
牛肉膏。
[0017] 进一步的，所述种子固体斜面培养基、种子固体平板培养基分别是在菌种液体培养基中加入1.5-2％琼脂于无菌试管或无菌平板中制备得到。
[0018] 进一步的，所述种子复壮固体斜面培养基是在种子复壮液体培养基中加入1.5-2％琼脂于无菌试管中制备得到。
[0019] 进一步的，步骤(C)所述摇床培养是在36-37℃温度、200rpm条件下培养20-24小时。
[0020] 进一步的，步骤(E)所述摇床培养是在36-37℃温度、200rpm条件下培养20-24小时。
[0021] 进一步的，步骤(3)所述发酵菌种接入发酵培养基的接种量为0.5-0.8％。
[0022] 进一步的，步骤(3)所述发酵培养基的组成是：按照重量百分比计,5-5.5％低温豆饼粉、3.0-3.5％葡萄糖、0.2-0.25％KH2PO4、0.2-0.25％MgSO4·7H2O、0.2-0.25％NaCl、0.02-0.025％MnSO4、0.5-0.6％CaCO3，发酵开始前用24％
氨水调PH值为6.8-7.2。
[0023] 进一步的，步骤(3)所述培养基处理方法为：将原料加入
发酵罐中，升温至45-50℃，加入蛋白酶，蛋白酶用量根据其酶活计算，具体为每克低温豆饼粉使用蛋白酶酶活1000U，控制搅拌转速100-150rpm搅拌酶解1h；本处理方法的目的旨在充分释放原料中的营养成分，提高原料的利用率和菌种生长速度。
[0024] 步骤(3)可以在20L发酵罐中发酵，装液量12L；也可在50L发酵罐中发酵，装液量30L，也可在1000L发酵罐中发酵，装液量600L。步骤(3)所述发酵培养，初始搅拌转速为180-
220rpm，
通风量为1:0.5-1:0.6vvm，控制DO≥15％；在发酵进入6-8h时，搅拌转速为380-
420rpm，通风量1:0.9-1:1vvm，控制DO≥15％；在发酵进入10-12h时，搅拌转速为580-
600rpm，通风量1:1.2-1:1.3vvm，此时不再调控，直至培养结束。培养结束收集发酵培养所得的芽孢菌体。
[0025] 本发明所述侧孢短芽孢杆菌原始出发菌种可采用市购的侧孢短芽孢杆菌原始出发菌种，也可以是从
植物根系和根系
土壤等处，按照现有常规稀释平板分离法选育获得的侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0026] 本发明的技术效果：与
现有技术相比，本发明将侧孢短芽孢杆菌菌株经斜面活化及种子复壮后，接入独特设计的发酵培养基中，经分段控制培养，得到活性高的发酵种子，再经独特设计的发酵配方和发酵工艺发酵，有效提高了发酵液活菌含量和芽孢菌量。经本发明培养的侧孢短芽孢杆菌发酵液菌量可达到200×108CFU/mL，显著提高了产品的菌量。
具体实施方式
[0027] 下面通过具体
实施例对本发明作进一步说明。
[0028] 实施例1：
[0029] 本实施例所用的菌种为侧孢短杆菌属细菌(BrevibacillusLaterosporu)1株，从
棉花根系土壤中按照常规稀释平板分离法选育获得。
[0030] 本实施例涉及的侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法，包括以下工艺步骤：
[0031] (1)菌种液体培养基的配制:5克葡萄糖、10克氯化钠、10克蛋白胨、5g酵母浸粉和1升水(pH值为7.0)，配制三份；
[0032] 种子复壮液体培养基的配制:5克葡萄糖、5克氯化钠、5克蛋白胨、5g酵母浸粉和1升水(pH值为7.0)，配制一份；
[0033] 在一份上述菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基。
[0034] 在另一份上述菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基。
[0035] 在第三份菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基。
[0036] 在上述种子复壮液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；
[0037] (2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37℃温度下培养24小时；
[0038] (3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时；
[0039] (4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，挑取一环接种到菌种液体培养基中，于37℃温度下,200rpm，摇床培养24小时；
[0040] (5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时；
[0041] (6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37℃温度下,200rpm，摇床培养24小时，作为发酵菌种；
[0042] (7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的20％的甘油，放置于-80℃温度下保存；
[0043] (8)发酵培养：
[0044] 发酵培养基配方：33千克低温豆饼粉、21千克葡萄糖、1.5千克KH2PO4、1.5千克MgSO4·7H2O、1.5千克NaCl、150克MnSO4、3.6千克CaCO3，660克中性蛋白酶(酶活50000U/g)；
[0045] 培养基处理及灭菌：在1000升发酵罐内，加入450L水，投入原料，升温至45-50℃，加入蛋白酶，控制搅拌转速100-150rpm搅拌酶解1h。酶解结束后121℃，0.11MPa灭菌20分钟，消后体积600L；
[0046] 将发酵菌种以0.8％接种量接入600升发酵培养基，37℃培养。在发酵培养过程中，初始搅拌转速为200rpm，通风量为1:0.6vvm，控制DO≥15％；在发酵进入6-8h时，搅拌转速为400rpm，通风量1:1vvm，控制DO≥15％；在发酵进入10-12h时，搅拌转速为600rpm，通风量1:1.4vvm，此时不再调控DO，直至培养结束，发酵结束收集发酵液产品。
[0047] 实施例2：
[0048] 本实施例所用的菌种为侧孢短杆菌属细菌(BrevibacillusLaterosporu)1株，从番茄根系土壤中按照常规稀释平板分离法选育获得。
[0049] 本实施例涉及的侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法，包括以下工艺步骤：
[0050] (1)菌种液体培养基的配制:5克葡萄糖、10克氯化钠、10克蛋白胨、5g酵母浸粉和1升水(pH值为7.0)，配制三份；
[0051] 种子复壮液体培养基的配制:5克葡萄糖、5克氯化钠、5克蛋白胨、5g酵母浸粉和1升水(pH值为7.0)，配制一份；
[0052] 在一份上述菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；
[0053] 在另一份上述菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；
[0054] 在第三份菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；
[0055] 在上述种子复壮液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；
[0056] (2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37℃温度下培养24小时；
[0057] (3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时；
[0058] (4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，挑取一环接种到菌种液体培养基中，于37℃温度下,200rpm，摇床培养24小时；
[0059] (5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时；
[0060] (6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37℃温度下,200rpm，摇床培养24小时，作为发酵菌种；
[0061] (7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的20％的甘油，放置于-80℃温度下保存；
[0062] (8)发酵培养：
[0063] 发酵培养基配方：33千克低温豆饼粉、21千克葡萄糖、1.5千克KH2PO4、1.5千克MgSO4·7H2O、1.5千克NaCl、150克MnSO4、3.6千克CaCO3，660克中性蛋白酶(酶活50000U/g)。
[0064] 培养基处理及灭菌：在1000升发酵罐内，加入450L水，投入原料，升温至45-50℃，加入蛋白酶，控制搅拌转速100-150rpm搅拌酶解1h。酶解结束后121℃，0.11MPa灭菌20分钟，消后体积600L；
[0065] 将发酵菌种以0.8％接种量接入600升发酵培养基，37℃培养。在发酵培养过程中，初始搅拌转速为200rpm，通风量为1:0.6vvm，控制DO≥15％；在发酵进入6-8h时，搅拌转速为400rpm，通风量1:1vvm，控制DO≥15％；在发酵进入10～12h时，搅拌转速为600rpm，通风量1:1.4vvm，此时不再调控DO，直至培养结束，发酵结束收集发酵液产品。
[0066] 实施例3：
[0067] 本实施例所用的菌种为侧孢短杆菌属细菌(BrevibacillusLaterosporu)1株，从广东省微生物菌种保藏中心购买，菌种编号为GDMCC 1.404。
[0068] 本实施例涉及的侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法，包括以下工艺步骤：
[0069] (1)菌种液体培养基的配制:5克葡萄糖、10克氯化钠、10克蛋白胨、5g酵母浸粉和1升水(pH值为7.0)，配制三份；
[0070] 种子复壮液体培养基的配制:5克葡萄糖、5克氯化钠、5克蛋白胨、5g酵母浸粉和1升水(pH值为7.0)，配制一份；
[0071] 在一份上述菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌试管中，制成种子固体斜面培养基；
[0072] 在另一份上述菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌平板中，制成种子固体平板培养基；
[0073] 在第三份菌种液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌斜面中，制成种子固体斜面培养基；
[0074] 在上述种子复壮液体培养基中加入1.5％琼脂，倒入无菌试管中，制成种子复壮固体斜面培养基；
[0075] (2)用无菌接种环从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于37℃温度下培养24小时；
[0076] (3)待种子固体平板培养基上长出单细胞菌落，用无菌接种环挑出单细胞菌落，接种在种子固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时；
[0077] (4)将种子斜面固体培养基上长出的菌体，挑取一环接种到菌种液体培养基中，于37℃温度下,200rpm，摇床培养24小时；
[0078] (5)将步骤(4)中的菌液转至种子复壮固体斜面培养基上，于37℃温度下培养24小时；
[0079] (6)从步骤(5)的种子复壮固体斜面培养基上长出的菌体中再挑取一环菌体转至种子复壮液体培养基上，于37℃温度下,200rpm，摇床培养24小时，作为发酵菌种；
[0080] (7)步骤(6)中培养的菌液中按体积百分比添加菌液的20％的甘油，放置于-80℃温度下保存；
[0081] (8)发酵培养：
[0082] 发酵培养基配方：33千克低温豆饼粉、21千克葡萄糖、1.5千克KH2PO4、1.5千克MgSO4·7H2O、1.5千克NaCl、150克MnSO4、3.6千克CaCO3，660克中性蛋白酶(酶活50000U/g)；
[0083] 培养基处理及灭菌：在1000升发酵罐内，加入450L水，投入原料，升温至45-50℃，加入蛋白酶，控制搅拌转速100-150rpm搅拌酶解1h。酶解结束后121℃，0.11MPa灭菌20分钟，消后体积600L；
[0084] 将发酵菌种以0.8％接种量接入600升发酵培养基，37℃培养。在发酵培养过程中，初始搅拌转速为200rpm，通风量为1:0.6vvm，控制DO≥15％；在发酵进入6-8h时，搅拌转速为400rpm，通风量1:1vvm，控制DO≥15％；在发酵进入10～12h时，搅拌转速为600rpm，通风量1:1.4vvm，此时不再调控DO，直至培养结束，发酵结束收集发酵液产品。
[0085] 实验例：产品品质测定
[0086] 从植物根系和根系土壤，按照常规稀释平板分离法选育获得的侧孢短杄菌属细菌(BrevibacillusLaterosporu)菌种和现有从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买的侧孢短芽孢杆菌1株，分别采用本发明实施例1-3所述方法和常规方法进行发酵处理(斜面活化、摇床培养、发酵罐培养等步骤处理)，发酵后的产品采用稀释平板计数方法测定产品活菌含量，测定结果见表1所示
[0087] 表1侧孢短芽孢杆菌发酵的效果对比
[0088] 测定样品 发酵液芽孢菌含量(CFU/mL)常规培养 20×108
实施例1 210×108
8
实施例2 260×10
实施例3 280×108
[0089] 从表1可知，经过本方法培养的菌种，发酵液芽孢菌量大幅度提高，最高可达到280×108CFU/mL，明显提升了发酵效果和产量，对于降低生产成本具有显著经济效益。
[0090] 上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的
专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明
权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。
