효소처리한 분리대두단백질을 이용한 대두요구르트 및 그 제조방법{soy yogurt and process for preparation thereof}

본 발명은 효소처리한 분리대두단백을 이용하여 제조한 대두요구르트 및 그 제조방법에 대한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소, 브로멜라인 또는 α-키모트립신으로 처리된 분리대두단백에 바실러스 비피덤을 단독배양하거나 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스를 혼합배양하여 대두요구르트를 제조하는 방법에 관한 것이다.

대두단백은 필수아미노산을 풍부하게 제공하는 양질의 식물성 단백으로써 동물성 단백과 비교하여 가격이 저렴하므로 동물성 단백의 대체식품으로 사용되고 있다. 대두단백은 특유의 콩비린내로 인해 그 이용이 제한받고 있으나 동물성 단백이 가지고 있는 여러 기능적 특성을 나타내고 있으므로 식품산업에 이용되고 있다. 또한 대두단백은 식품영양 측면에서 뿐만 아니라 생리활성도 우수하여 혈청 콜레스테롤의 함량을 낮추는 역할을 하며 항암효과, 골다공증의 예방을 비롯하여 신장기능 이상증상을 개선하는 등의 작용을 한다.

분리대두단백은 단백질을 90%이상 함유하고 있어 식품에 첨가하였을 경우 단백질의 기능적 성질인 수분결합력, 유화성, 기포성 등을 부여한다. 즉 식품산업에서 분리대두단백은 제품의 물리적 성질을 향상시켜 주고 조직감 개선 및 냉동식품의 결착력 등을 증가시키기 위해 사용되고 있을 뿐만 아니라 분리대두단백을 첨가한 요구르트, 영양음료, 치즈, 아이스크림 등의 가공품에도 이용될 수 있으므로 유제품 대체식품으로서 대두의 이용에 관한 연구가 보고되고 있다.

최근 발효유의 소비가 증가되면서 탄산요구르트, 냉동요구르트 등 새로운 개념의 요구르트가 개발되었고 특히 발효유 특유의 영양적 특성과 풍미를 유지하면서 아이스크림의 부드럽고 시원한 특성을 가미한 냉동요구르트는 그 기호성이 높아 이미 상품화되어 있다. 냉동요구르트의 주재료인 원유나 탈지유의 우수한 특성을 가지고 있으며 비교적 저렴한 대두단백으로 대체한 냉동대두요구르트에 관한 연구도 진행되어 왔으나 콩비린내로 인하여 그 이용성이 제한되고 있다. 냉동대두요구르트 제조시 분리대두단백 그대로 우유고형분을 대체하여 적용하면 질감이 매우 거칠고 콩비린내가 감지되며 특히 냉동대두요구르트의 중요한 품질특성인 오버런이 잘 형성되지 않는 등의 문제점이 있어 대두단백을 화학적 또는 효소적으로 변형시키므로써 그 기능적 성질을 개선할 수 있다. 산이나 알칼리 처리에 의한 대두단백의 화학적 변형은 필수아미노산의 함량을 감소시키고 체내 소화효소에 의해 분해되지 않는 결합을 형성시키며 바람직하지 못한 물질을 생성시키는 등 여러 가지 단점을 가지고 있다.

본 발명자들은 분리대두단백을 효소적으로 처리하고 생균을 이용하여 발효시킨 겨로가, 질감이 더욱 부드럽고 콩비린내가 감소된 대두요구르트 및 냉동대두요구르트를 제조할 수 있었으며 그 품질을 향상시킬 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소, 브로멜라인 및 α-키모트립신으로 전처리한 분리대두단백에 바실러스 비피덤을 단독배양하거나 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스로 혼합배양하여 제조한 대두요구르트를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 대두요구르트의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 대두요구르트를 이용한 냉동대두요구르트를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 냉동대두요구르트의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 효소처리한 분리대두단백을 바실러스 비피덤 ( B.bifidum )으로 단독배양하거나 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 ( L.acidophilus ) 또는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스( L.bulgaricus )로 혼합배양하여 대두요구르트를 제조하고, 이로부터 냉동대두요구르트를 제조한 후, 상기 제품의 물리학적 특성과 품질특성을 조사한 결과, 비전처리 대두단백을 이용했을 때보다도 pH는 낮고, 산도는 높으며, 점도는 적당하고 유기산이 많을 뿐만 아니라, 냉동대두요구르트는 생균수 감소가 거의 없으며 내산성 및 담즙산 내성에 강하고 녹아내리는 정도가 낮은 매우 뛰어난 효과가 있음을 확인함으로써 달성되었다.

도 1은 대두요구르트 및 냉동대두요구르트의 제조 과정이다.

도 2은 배양방법과 효소처리를 달리하여 제조한 대두요구르트의 pH를 나타낸 결과이다.

도 3는 배양방법과 효소처리를 달리하여 제조한 대두요구르트의 산도를 나타낸 결과이다.

도 4는 배양방법과 효소처리를 달리하여 제조한 대두요구르트의 점도를 나타낸 결과이다.

도 5는 대두요구르트가 아이스크림 제조기에서 동결되는 동안의 오버런 (overrun) 변화를 30분동안 5분 간격으로 측정한 결과이다.

도 6은 냉동대두요구르트가 60분 동안 시간이 경과함에 따라 20∼22℃의 실온에서 10분 가격으로 녹아내리는 정도를 측정한 결과이다.

본 발명은 효소처리된 대두단백에 락토바실러스 균주를 단독 또는 혼합배양하여 대두요구르트를 제조하는 단계; 상기 제조된 대두요구르트의 물리화학적 성질을 측정하는 단계; 대두요구르트로부터 제조된 냉동대두요구르트의 품질특성을 측정하는 단계로 구성된다.

본 발명의 실험재료인 분리대두단백(SPI)은 ADM(Decatun, IL, USA)사의 Proten 972를 사용하였고, 안정제는 소듐알지네이트(sodium alginate)와 카라지난( carrageenan)의 혼합물인 모노아이스(monoice)를 (주)광일에서 제공받아 사용하였다.

효소처리에 사용된 아스파질러스 오리제( A.oryzae )로부터 추출된 단백분해효소 (P=4032, activity; 3.8 units/mg protein), 브로멜라인 (B-4882, activity; 6.1 units/mg protein), α -키토트립신 (C-4129, activity; 54 units/mg protein)은 Sigma사의 제품을 사용하였다. 사용균주는 비피도박테리움 비피둠 (KCTC 3176), 락토바실러스 아시도피러스 (ATCC 2182), 락토바실러스 불가리쿠스 (KCTC 3188)로서 한국생명공학연구소에서 분양받았으며 사용된 올리고당은 이소말토올리고당 (isomaltooligosacchride)으로 (주)삼양제넥스연구소에서 제공받았다.

유기산 분석에 사용된 표준시약 중의 초산(acetic acid), 구연산(citric acid)는 (주)보락향료에서 제공받아 사용하였고, 유산(lactic acid) (L-6402), 피루브산(pyruvic acid) (P-2256), 호박산(succinic acid) (S-3674)는 Sigma (St.Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다. 휘발성 향기성분 분석에 사용된 표준 휘발성 향기성분 중의 아세톤, 에탄올, 메탄올은 Merck (KGaA, Darmstadt, Germany)사의 제품을 사용하였고 디아세틸 (D-3634), 핵사날(hexanal) (H-9008)은 Sigma사의 제품을 사용하였으며 아세트알데하이드, 부틸 알콜(butyl alcohol)은 (주)보락향료에서 제공받아 사용하였다. 또한 유리아미노산 분석에 사용된 표준시약은 Sigma사의 제품을 사용하였다.

이하, 본 발명의 구체적 구성 및 작용을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 시료의 제조 방법

실험예 1 : 균주의 배양

락토바실러스 아시도피러스와 락토바실러스 불가리쿠스는 Lactobailli MRS 배지로 배양하고 비피도박테리움 비피덤은 0.05%의 L-시스테인(cystein)이 첨가된 Lactobacilli MRS 배지로 배양하여 37℃로 고정된 배양기에서 24시간 배양하여 대두요구르트를 제조하고, 요구르트 접종시에는 4℃에서 1770 ×g로 20분간 원심분리시킨 다음 상등액을 제거하고 균체만 회수하여 접종하였다.

실험예 2 : 분리대두단백(SPI)의 효소처리

10%의 분리대두단백 용액(w/v)을 만들고 6N NaOH를 이용하여 각각 pH7.5( A.oryzae 로부터 추출된 단백분해효소), 7.0(브로멜라인) 및 7.8( α -키토트립신)로 조정한 다음 항온수조에서 시료의 온도가 37℃가 되게 하여 조단백질함량의 0.5%(w/w)의 효소를 각각 첨가한 후 20분간 교반하면서 반응시킨 후 분리대두단백 용액을 즉시 87℃에서 5분간 가열하여 효소를 불활성화시켜 반응을 정지시킨 다음 6N HCl을 이용하여 pH 7.0으로 조정하였다.

실험예 3 : 대두요구르트와 냉동대두요구르트의 제조

도 1에 나타낸 바와 같이, 분리대두단백 50g에 증류수 410mL를 가하여 분산시킨 후 효소처리 또는 비효소처리시키고 이 분산액에 대두유 20g, 안정제 2.5g을 첨가하여 대두요구르트믹스를 제조한 다음 121℃에서 15분간 멸균하였다. 또한 말레이드(Mailard) 반응을 방지하기 위해서 이소말토올리고당 40g에 증류수 40mL를 첨가하여 수용액으로 만든 다음 121℃에서 15분간 멸균하여 대두요구르트믹스와 잘 섞어 준 후, 37℃로 냉각되면 바실러스 비피덤, 락토바실러스 아시도피러스, 락토바실러스 불가리쿠스 배양액을 바실러스 비피덤 단독배양에서는 2%(v/v) 접종하고 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양에서는 각각 1%(v/v)씩 접종하여 37℃에서 14시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 대두요구르트를 2∼8℃에서 18∼30시간 동안 저장시킨 후 아스파르탐(aspartame) 0.2g을 첨가하고 아이스크림 제조기(Model HR2305, 1200mL, Philips Co., USA)로 30분간 작동하여 냉동대두요구르트를 제조하였다.

실시예 2 : 대두요구르트의 물리화학적 성질 측정

실험예 1 : 대두요구르트의 pH 측정

배양방법과 효소처리를 달리하여 제조한 대두요구르트의 pH를 측정하기 위하여 pH meter (Model 520A, Orion Co., USA)를 사용하여 측정하였다.

실험결과 그림 2와 같이, 배양방법과 효소처리에 따라 pH는 두 종류의 혼합배양시에 바실러스 비피덤 단독배양보다 낮았다(p＜0.001). 비효소처리군에서는 바실러스 비피덤 단독배양시에 바실러스 비피덤의 생장이 잘 이루어지지 않아 pH가 6.44를 나타내어 요구르트의 pH로 적합하지 않았으나, 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양시에는 각각 4.75, 4.95를 나타내었다. 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인처리군에서도 바실러스 비피덤을 단독배양시에는 pH가 가장 높았으나(p＜0.001), 락토바실러스 불가리쿠스와 혼합배양하였을때는 가장 낮아졌다. α-키모트립신 처리군에서는 바실러스 비피덤 단독배양시에 pH가 5.87로 두 종류의 혼합배양보다 높았다. 또한 아시파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인처리군의 pH는 비효소처리군보다 낮았다(p＜0.001).

효소처리에 따라 pH는 바실러스 비피덤 단독배양시에 비효소처리군, α-키모트립신처리군, 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군, 브로멜라인처리군 순으로 높았던 반면 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양의 경우는 α-키모트립신처리군에서 pH가 가장 높았으며(p＜0.001) 비효소처리군, 브로멜라인처리군, 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군 순으로 높았다.

실험예 2 : 대두요구르트의 산도 측정

시료 10g을 취하여 동량의 증류수로 희석한 다음 지시약으로 페놀프탈레인 (phenolphtalein) 용액을 0.5mL씩 넣어 0.1N NaOH 용액으로 분홍색이 될 때까지 중화적정하였다. 이때 소비된 0.1N NaOH의 mL수를 측정한 수 다음 식을 이용하여 lactic acid(LA) %로 환산하였다.

실험결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 배양방법과 효소처리에 따른 적정산도는 두 종류의 혼합배양시에 바실러스 비피덤 단독배양보다 산도가 높았다(p＜0.001).

배양방법에 따라 적정산도는 비효소처리군에서 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양시에 산도가 0.76%으로 가장 높았으며(p＜0.001), 특히 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양시의 pH는 4.95로 α-키모트립신처리군의 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양시에 pH 5.66보다 낮았으나 산도에 있어서는 반대로 더 낮았다. 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인처리군에서는 두 종류의 혼합배양시에 산도가 0.97∼1.38%로 산성요구르트의 적정산도 1.0∼1.3%에 속하였다. 전반적으로 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군의 적정산도가 브로멜라인처리군이나 α-키모트립신처리군보다 더 높은 경향을 나타내었다.

효소처리에 따라 적정산도는 바실러스 비피덤 단독배양 및 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양에서 효소처리군이 비효소처리군보다 높은 경향을 나타내었다.

실험예 3 : 대두요구르트의 점도 측정

시료의 점도를 측정하기 위하여 점도계(Brookfield viscometer; Model LVF, Broolfield Eng., USA)를 사용하였으며, 100 mL의 시료를 비이커에 취하여 4℃에서 spindle No.4로 60 rpm에서 1분간 측정하였다. 실험결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 배양방법과 효소처리에 따라 점도는 유의차가 뚜렷하게 나타났다. 배양방법에 따라 점도는 비효소처리군에서 두 종류의 혼합배양시에 바실러스 비피덤 단독배양보다 높았으며(p＜0.001), 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스와의 혼합배양에서 점도가 가장 낮았으나 바실러스 비피덤 단독배양에서는 가장 높았다(p＜0.001). 또한 브로멜라인처리군과 α-키모트립신처리군의 점도는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스의 혼합배양에서 가장 높았으며, 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양, 바실러스 비피덤 단독배양 순으로 높았다.

또한 점도는 요구르트의 품질 중에서 특히 조직감에 영향을 주어 점도가 너무 높거나 너무 낮으면 전반적인 조직감에 좋지 않은 영향을 미치게 된다. 시판 농후요구르트의 점도를 측정한 결과 4412∼7160 cp를 나타났는데, 본 발명에서는 시판 요구르트의 점도보다 크게 높았던 비효소처리군의 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와 혼합배양의 경우 입안에서의 질감이 거칠다고 평가되었으며 4000∼6000 cp 범위의 점도를 나타내었던 α-키모트립신처리군의 입안에서의 질감이 부드럽다고 평가되어 점도가 요구르트의 질감에 영향을 주는 것으로 생각된다.

효소처리에 따라 점도는 효소처리군이 비효소처리군보다 낮은 경향을 나타내었다. 또한 비효소처리군의 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와 혼합배양의 경우 점도가 현저히 높았던 것은 pH가 저하됨에 따라 대두요구르트의 커드가 효소처리군에 비해 더 거칠고 단단하여 점도가 높았다.

실험예 4 . 대두요구르트의 유기산 함량 측정

5g의 시료에 5 mL의 탈이온수(deionized water), 20 mL의 아세토니트릴 (acetonitrile)을 가하여 50 mL의 원심분리튜브(centrifuge tube)에서 2분간 흔들어 준 후 5420 ×g 에서 5분간 원심분리 한 다음 상등액 0.2㎛ 막 필터(membrane filter)로 여과하여 HPLC분석용 시료를 사용하였다. HPLC에 의해 분석된 크로마토그램(chromatogram)은 표준 유기산의 용출시간(retention time)과 면적을 비교하여 계산하였다.

유기산은 유제품에 있어서 유지방의 가수분해나 미생물 생장에 의한 대사결과로서 생성되며 요구르트의 주된 유기산은 유산, 초산, 구연산, 포름산(formic acid), 호박산, 푸마르산(fumaric acid) 등이다.

실험결과 표 1에서와 같이, 배양방법과 효소처리에 따른 유기산 조성 및 함량은 배양방법에 따라 뚜렷한 차이를 나타내어, 바실러스 비피덤 단독배양의 경우는 초산과 호박산의 함량이 가장 많았으며 유산, 구연산 순으로 많았다. 반면 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스의 혼합배양에서는 유산의 함량이 가장 많았고 초산, 피루브산 순으로 많았으며 바실러스 비피덤 단독배양시에 생성된 구연산과 호박산은 검출되지 않았다.

초산의 함량은 배양방법에 따라서 바실러스 비피덤 단독배양시에 전체 유기산 중 33.5∼51.6%를 차지하였으나 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양에서는 전체 유기산 중 7.6∼19.2%를 차지하였다. 이상 젖산발효균인 바실러스 비피덤은 포도당 대사의 최종산물로 생산하는 산을 초산과 유산을 1.5:1의 비율로 생산하며 소량의 포름산, 호박산, 에탄올 등을 생성한다고 보고하였는데, 본 연구에서도 바실러스 비피덤 단독배양시에 유산만을 생성하는 정상 젖산발효균인 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양보다 초산의 함량이 더 많았으며 초산과 유산의 비율이 바실러스 비피덤 단독배양에서는 1.8:1∼2.8:1의 비율을 나타내었다.

효소처리에 따른 초산의 함량은 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인 처리군에서 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양시에 각각 18.7, 23.4 ppm으로 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스의 혼합배양시에 각각 13.9, 13.6 ppm 보다 더 많았으나, 비효소처리군과 α-키모트립신 처리군에서는 두 종류 혼합배양의 경우 초산 함량이 비슷하였다.

유산의 함량은 배양방법에 따라서 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양시에 크게 증가하여 전체 유기산 중 80.8∼ 92.4%를 차지하였는데, 두 종류의 혼합배양에서 산도증가는 주로 유산에 기인하는 것으로 생각된다. 특히 비효소처리군, 아스파질러스 비피더스로부터 추출한 단백분해효소처리군 및 브로멜라인처리군의 유산의 함량은 배양방법 중 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스의 혼합배양에서 가장 많았으나, α-키모트립신처리군에서는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양시에 가장 많았다. 바실러스 비피덤 단독배양에서는 전체 유기산 중 유산의 함량이 14.4∼21.5%를 차지하였다. 효소처리에 따른 유산 함량은 적정산도가 가장 높았던 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서 가장 많았으며 브로멜라인처리군, 비효소처리군, α-키모트립신처리군 순으로 많았다.

향미성분의 생성에 필요한 중요한 전구체인 구연산은 바실러스 비피덤 단독배양에서만 검출되었으며, 비효소처리군에서 6.5 ppm으로 가장 많았고 브로멜라인처리군과 α-키모트립신처리군에서 각각 5.4, 4.2 ppm을 나타내었다. 반면 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서는 구연산이 검출되지 않았다. 요구르트 내에서 구연산의 함량은 요구르트를 제조하는 동안 25∼30%가 감소되며 특히 구연산의 함량 변화는 구연산을 이용할 수 있는 균주의 존재여부에 달려있다. 본 발명에서 구연산이 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양에서는 검출되지 않은 점으로 미루어 보아 락토바실러스 아시도피러스 및 락토바실러스 불가리쿠스에 의해 구연산이 이용되었다.

피루브산는 대부분 시료군에서 극미량 검출되었으나 효소처리군의 바실러스 비피덤 단독배양에서는 검출되지 않았다.

호박산은 바실러스 비피덤 단독배양에서만 검출되었으며 α-키모트립신처리군에서는 52.9 ppm으로 가장 많았고 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군 , 브로멜라인처리군 및 비효소처리군에서는 각각 38.6, 28.8, 20.9 ppm을 나타내었다.

실시예 3. 효소처리가 냉동대두요구르트의 품질특성에 미치는 영향

실험예 1 . 냉동대두요구르트의 생균수 측정

제조 직후의 대두요구르트와 냉동대두요구르트를 각각 1g씩 무균적으로 취하여 멸균 펩톤 수에 의한 10배 희석법으로 희석하고 Latobacilli MRS 배지에 평판한 후 바실러스 비피덤은 혐기성 발효조(anaerobic jar; Difco, Ketroit, MI, USA)를 사용하여 37℃로 고정된 배양기에서 48∼72시간 동안 혐기적으로 배양하였고 락토바실러스 아시도피러스 및 락토바실러스 불가리쿠스는 호기적으로 배양하여 콜로니(colony) 수가 25∼250개가 나타나는 평판을 선택하여 산출하였다. 또한 냉동저장기간동안 냉동대두요구르트의 생균수 측정도 상기 방법과 동일하게 측정하였다.

실험결과 표 2에서와 같이, 대두요구르트와 냉동대두요구르트에서 바실러스 비피덤의 생균수는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양의 경우 바실러스 비피덤 단독배양보다 더 많았는데, 이는 기질내에 들어 있는 산소를 호기성균인 락토바실러스 아시도피러스와 락토바실러스 불가리쿠스가 이용하여 혐기적 조건으로 만들어 주므로써 혐기성균인 바실러스 비피덤의 생장을 촉진시킨 것이였다.

배양방법에 따른 생균수에 있어서는 바실러스 비피덤 단독배양시에 비효소처리군의 경우 바실러스 비피덤의 생균수가 10 ⁷ CFU/g이었으나 효소처리군에서는 10 ⁸ CFU/g으로 증가하였는데, 이는 분리대두단백을 효소처리하므로써 바실러스 비피덤이 이용가능한 질소가 생성되어 바실러스 비피덤의 생장을 촉진하였기 때문이다. 그러나 혼합배양시에는 효소처리가 생균수에 크게 영향을 미치지 않았다. 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와 혼합배양의 경우는 비효소처리군, 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군 및브로멜라인처리군에서 10 ⁹ CFU/g을 유지하였으나 α-키모트립신처리군은 10 ⁸ CFU/g을 나타내었다.

요구르트의 성분 규격에 의하면 생균수는 10 ⁸ CFU/ml 이상이 되어야 하는데, 본 발명에서는 생균수가 비효소처리군의 바실러스 비피덤 단독배양의 경우를 제외한 모든 시료군에서 10 ⁸ CFU/g 이상이었으므로 요구르트의 성분 규격에 적합하였다.

또한 대두요구르트를 아이스크림 제조기에서 30분 동안 동결시킨 후 제조한 냉동대두요구르트의 생균수를 측정한 결과 바실러스 비피덤, 락토바실러스 아시도피러스 및 락토바실러스 불가리쿠스의 생균수는 대두요구르트의 생균수와 거의 유사하므로 동결에 의한 생균수의 감소는 거의 나타나지 않았다.

즉 본 발명에서는 냉동대두요구르트 제조시 바실러스 비피덤, 락토바시럴스 아시도피러스 및 락토바실러스 불가리쿠스의 생균수는 동결에 의해 감소되지 않았으며, 대두요구르트를 아이스크림 제조기에서 30분간 동결하는 동안 유입되는 산소에 의해서도 혐기성균인 바실러스 비피덤의 생균수는 거의 감소되지 않았다.

실험예 2 : 냉동대두요구르트의 내산성 측정

제조 직후와 냉동저장된 냉동대두요구르트에 1.25N HCl을 첨가하여 pH 2.5로 조정한 후 37℃로 고정된 배양기에서 90분간 배양시킨 다음 상기의 생균수 측정실험과 동일한 조건으로 배양하여 냉동대두요구르트의 내산성을 측정하였다.

실험결과, 배양방법과 효소처리에 따른 냉동대두요구르트의 바실러스 비피덤 , 락토바실러스 아시도피러스 및락토바실러스 불가리쿠스의 내산성은 표 3에서와 같이, 바실러스 비피덤 단독배양시에 비효소처리군, 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인처리군에서 각각 3.2×10 ⁵ , 1.2×10 ⁵ , 1.6×10 ⁵ CFU/g을 나타내었으며 α-키모트립신처리군에서는 1.9×10 ⁶ CFU/g을 나타내어 냉동대두요구르트의 생균수에 비하여 전반적으로 10 ² ∼10 ³ CFU/g이 감소하였다. 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양의 경우는 모든 시료군에서 바실러스 비피덤의 내산성이 저하되어 10 ² CFU/g의 감소를 나타내었으며, 락토바실러스 아시도피러스도 10 ² CFU/g이 감소하였으나 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서는 10 ³ CFU/g이 감소하여 내산성이 더 저하되었다. 바실러스 비피덤과락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양에서는 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서 바실러스 비피덤과락토바실러스 불가리쿠스의 내산성이 가장 저하되어 각각 3.8×10 ⁶ , 6.4×10 ⁶ CFU/g을 나타내었으므로 10 ³ CFU/g이 감소하였다.

본 발명에서 바실러스 비피덤 , 락토바실러스 아시도피러스 및락토바실러스 불가리쿠스의 산성조건하에서 생존율은 0.1∼2.5%이었으며 배양방법과 효소처리에 따라 그 차이를 나타내지는 않았으나 두 종류의 혼합배양에서는 효소처리군 중에서 특히 α-키모트립신처리군에서 생존율이 더 높았다.

즉, 본 발명에 사용된 바실러스 비피덤 , 락토바실러스 아시도피러스 및 L. bulgaricus 의 내산성은 냉동대두요구르트의 생균수에 비하여 10 ² ∼10 ³ CFU/g 정도의 감소를 나타내었으므로 내산성이 비교적 우수하였다.

, 락토바실러스 아시도피러스 및 락토바실러스 불가리쿠스의 내산성

실험예 3 : 냉동대두요구르트의 담즙산 내성 측정

제조 직후와 냉동저장된 냉동대두요구르트 1g을 무균적으로 취하여 멸균 펩톤수에 의한 10배 희석법으로 희석하고 Latobacilli MRS 배지에 담즙산 성분인 옥스갈(oxgall) (Difco, Detroit, MI, USA)를 0.3% 첨가하여 평판한 다음 생균수 측정과 동일한 조건으로 배양하여 냉동대두요구르트의 담즙산 내성을 측정하였다.

젖산균은 인체의 소화장기내에서 생존하여 증식하기 위해서 내산성과 담즙산에 대한 내성이 있어야 한다. 담즙은 담낭에서 십이지장으로 분비되는 일종의 계면활성제로 콜산(cholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 케노데옥시콜산 (chenodeoxycholic acid)가 주성분이며, 젖산균이 생균제 (probiotics)로서의 기능을 수행하려면 담즙산(oxgall)이 0.3% 함유된 배지에서 성장할 수 있을 정도의 내성을 갖고 있어야 한다.

실험결과 표 4에서 보는 바와 같이, 배양방법과 효소처리에 따라 균주의 담즙산 내성의 차이가 나타났다. 비효소처리군의 바실러스 비피덤 단독배양, 바실러스 비피덤 및 락토바실러스 아시도피러스 또는락 토바실러스 불가리쿠스 와의 혼합배양시에 담즙산에 대한 내성이 저하되어 10 CFU/g의 감소를 나타내었으며, 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인처리군에서는 바실러스 비피덤 단독배양시에 각각 3.7×10 ⁷ , 3.2×10 ⁷ CFU/g으로 10 CFU/g의 생균수 감소를 나타내었으나 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는락 토바실러스 불가리쿠스 와의 혼합배양시에는 담즙산에 대한 내성을 나타내어 생균수의 변화가 없었다. α-키모트립신처리군에서는 바실러스 비피덤 단독배양시 담즙산에 대한 내성을 나타내어 생균수의 감소가 없었던 반면 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양의 경우는 바실러스 비피덤의 담즙산에 대한 내성이 저하되어 1.7×10 ⁸ CFU/g에서 8.4×10 ⁷ CFU/g으로 감소하였으나 락토바실러스 아시도피러스는 담즙산에 대한 내성을 나타내었다. 바실러스 비피덤과락토 바실러스 불가리쿠스 혼합배양에서는 바실러스 비피덤 , 락토 바실러스 불가리쿠스 모두 담즙산에 대한 내성이있는 것으로 나타났다. 즉 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군과 브로멜라인처리군의 두 종류 혼합배양시에 바실러스 비피덤 , 락토바실러스 아시도피러스 및 락토 바실러스 불가리쿠스 는 담즙산에 대한 내성이 강하였으며 α-키모트립신처리군의 바실러스 비피덤 단독배양 및 바실러스 비피덤과락토 바실러스 불가리쿠스 혼합배양시에 담즙산 내성이 강한 것으로 나타났다.

본 발명에서 바실러스 비피덤 , 락토바실러스 아시도피러스 또는락토 바실러스 불가리쿠스 의 담즙산에 대한 생존율은 배양방법과 효소처리에 따라 차이를 나타내어 13.6∼94.8%이었으며, 혼합배양하였을 경우 바실러스 비피덤 단독배양보다 생존율이 더 높았고 효소처리에 따라서는 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서 더 높았다.

실험예 4. 냉동대두요구르트의 오버런(overrun) 측정

아이스크림 제조기 작동시 오버런의 변화를 30분동안 5분 간격으로 제조기에서 꺼낸 시료를 100 mL 컵에 담아 무게를 신속하게 측정하였다.

실험결과 도 5에서와 같이, 배양방법에 따라 바실러스 비피덤 단독배양의 경우 초기 5분에 비효소처리군의 오버런이 21.06%로 가장 높았으나(p＜0.001), 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양에서는 브로멜라인처리군에서2.70%로 가장 낮았다. 바실러스 비피덤과락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양의 경우에는 α-키모트립신처리군이 21.24%로 가장 높았으나(p＜0.001), 비효소처리군에서 4.91%로 가장 낮았다. 아이스크림 제조기에서 작동시간이 길어짐에 따라 오버런이 비교적 서서히 증가하여 전반적으로 대부분 시료군에서 20분 내지 25분 조작으로 최고치에 이르렀다. 이때 각 시료군들의 오버런을 비교해 보면 바실러스 비피덤 단독배양, 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와의 혼합배양에서 각각 24.33∼40.82, 16.18∼34.87, 8.66∼89.48%를 형성하였다. 효소처리에 따른 오버런의 변화를 보면 비효소처리군에서는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 또는 락토바실러스 불가리쿠스와 혼합배양의 경우 다른 시료군에 비하여 오버런의 형성이 매우 낮았는데, 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양의 경우 30분 조작으로 4.91∼9.33%이였다. 이는 두 종류의 혼합배양으로 제조된 대두요구르트는 커드가 단단하고 물과 분리되는 현상이 생겨 아이스크림 제조기에서 동결되는 동안 0℃이하에서 빙결되는 자유수의 함량이 많아져 공기의 주입량이 감소되므로 오버런이 형성되지 못했다. 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군에서는 배양방법이 오버런의 형성에는 영향을 주지 않아 시료간에 유의차 없이 유사한 경향을 나타내었다. 브로멜라인처리군과 α-키모트립신처리군에서는 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양시에 오버런이 가장 높았으며 바실러스 비피덤 단독배양, 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양 순으로 높았다. 전반적으로 효소처리군 중에서 α-키모트립신처리군의 오버런이 높은 경향을 나타내었으며 특히 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양의 경우는 아이스크림 제조기에서 20분 조작으로 89.48%의 최고치를 나타내었다.

즉 본 발명에서는 배양방법과 효소처리에 따라 오버런 형성의 차이를 나타내었으며 α-키모트립신처리군의 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양의 경우를 제외한 모든 시료군에서 아이스크림 제조기의 30분 조작으로 9.33∼36.43%의 오버런이 형성되었다.

이와 같이 본 발명에서 냉동대두요구르트의 오버런은 우유로 제조된 냉동요구르트에 비하여 낮은 경향을 나타내었는데, 이는 오버런의 형성에 영향을 미치는 요인들, 즉 요구르트 믹스의 총 고형분의 함량 및 조성, 단백질의 거품생성능력, 교반기의 회전속도 등의 차이에 의한 것으로 판단되었다.

실험예 5 : 냉동대두요구르트의 녹아내리는 정도 측정

메스실린더 위에 엉글게 짜인 철망을 얹은 다음 아이스크림용 스쿠퍼 (scooper)로 뜬 냉동대두요구르트를 얹었다. 60분 동안 10분 간격으로 메스실린더 바닥으로 녹아 떨어지는 양을 스쿠퍼의 용량당 백분율로 계산하였고 녹아내리는 양상을 관찰하였다. 또한 냉동저장하는 동안 녹아내리는 정도는 20∼22℃ 실온에서 시료를 30분 동안 방치한 후 상기 전술된 방법과 동일하게 측정하였다.

실험결과 도 6와 같이, 초기 10분 동안은 대부분 시료군의 녹아내리는 정도에 있어서 유의차가 없었으나 시간이 경과함에 따라 녹아내리는 정도가 증가하여 60분에는 초기 10분에 비하여 증가하였다(p＜0.001). 배양방법에 따라 녹아내리는정도는 바실러스 비피덤 단독배양시에 비효소처리군, 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군 및 브로멜라인처리군에서 30분 또는 40분 동안 급격히 증가하였으나, 그 이후에는 거의 변화가 없었으며 60분에 68.0∼77.3%로 두 종류의 혼합배양에 비하여 녹아내리는 정도가 증가하였다. α-키모트립신처리군의 녹아내리는 정도는 60분 동안 서서히 증가하여 60분에 11.2%로 다른 시료군에 비하여 매우 낮은 경향을 나타내었다.

바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양의 경우는 브로멜라인처리군의 녹아내리는 정도가 가장 높았으며, 비효소처리군은 60분 동안 0∼1.32%로 가장 낮았고 모든 시료군이 초기 10분에서 60분 동안 녹아내리는 정도가 서서히 증가하였다. 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양에서는 아스파질러스 오리제로부터 추출한 단백분해효소처리군의 녹아내리는 정도가 가장 높았으나 비효소처리군에서 가장 낮았으며, 바실러스 비피덤과 락토바실러스 아시도피러스 혼합배양의 경우와 마찬가지로 초기 10분에서 60분까지 녹아내리는 정도가 서서히 증가하였다.

상업적으로 판매되고 있는 소프트아이스크림의 오버런은 40∼80%를 형성하며 지나치게 오버런이 형성되면 공기의 주입량이 많아져서 입안에서 너무 빠르게 녹는다고 하였는데, 본 발명에서는 아이스크림 제조기로 30분 작동시 오버런이 73.45%를 형성한 α-키모트립신처리군의 바실러스 비피덤과 락토바실러스 불가리쿠스 혼합배양시에 녹아내리는 정도가 60분 경과까지 0∼15.57%를 나타내어 오버런의 형성이 시료군의 녹아내리는 정도에 크게 영향을 미치지 않았다.

일반적으로 바실러스 비피덤 단독배양시에 α-키모트립신처리군을 제외한 모든 시료군에서 녹아내리는 양상이 고형분과 수분이 함께 녹아내리는 경향을 나타내었으나, 두 종류의 혼합배양에서는 모든 시료군에서 수분만이 분리되어 녹아내리는 양상을 나타내었으므로 고형분과 수분이 함께 녹아내리는 바실러스 비피덤 단독배양에서보다 녹아내리는 정도가 매우 낮은 경향을 나타내었다.

본 발명 대두요구르트는 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 효소처리된 대두단백에 락토바실러스 균주를 단독 또는 혼합배양하여 제조한 것이므로 비전처리대두단백을 이용하여 제조한 것에 비하여 pH가 낮고, 산도는 높으며, 점도가 적당하고, 유기산 함량이 높을 뿐만 아니라, 동결로 인한 생균수 감소가 거의 없으며 내산성 및 담즙산 내성에 강하고, 오버런이 높으며 녹아내리는 정도가 낮은 매우 뛰어난 효과가 있으므로 본 발명은 발효식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.