技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物技术领域，特别是涉及一种纳豆激酶菌剂的制备及使用方法。
背景技术
[0002] 纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆
发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝
氨酸蛋白酶，于1980年在纳豆中被发现，由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27724，有分解血栓的独特功能。纳豆激酶具有溶解血栓，降低血
粘度，改善血液循环，
软化和增加血管弹性等作用。
[0003] 纳豆激酶菌剂的制备可实现纳豆小规模速酿生产，使纳豆成为价廉易制的保健食品。因此，纳豆激酶菌剂的制备对于家庭化制备食用纳豆以及纳豆的工业化生产具有重要意义。但是，现有纳豆激酶菌剂的制备方法的原料投入产出比较低、发酵得到的纳豆激酶活性不高。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服
现有技术的不足，提供一种纳豆激酶菌剂的制备及使用方法，提高发酵产物纳豆激酶的活性。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种纳豆激酶菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0006] S1.准备原料：原料包括下述
质量百分比含量的组分：2-18%的纳豆激酶产生菌、20-30%的
葡萄糖、4-15%的
大豆分离蛋白、5-12%的L-丝氨酸、2-6%的L-半胱氨酸和25-50%的麦芽糊精；
[0007] S2.菌种活化：制备浓度为0.7×106-1.3×106CFU/mL的纳豆激酶产生菌菌悬液，按照1-5%的体积比取纳豆激酶产生菌菌悬液接种于20 50 mL活化培养基中活化，在30-38℃、~100-200r/min的条件下培养18-24h；
[0008] S3.扩大培养：将活化后的液体培养物按照1-3%的体积比例接种到扩大培养基中，在30-38℃、100-200r/min的条件下培养18-24h；
[0009] S4.离心取菌体：将扩大培养后的液体培养物在3-5℃、8000-10000r/min的条件下离心10-15min，然后去掉上清液，剩下部分即为菌体；
[0010] S5.复配：将原料中的全部葡萄糖、全部L-丝氨酸、全部L-半胱氨酸、30-70%的大豆分离蛋白和15-35%的麦芽糊精混合均匀得到第一粉剂，将所述菌体与原料中剩余的大豆分离蛋白和2/3的麦芽糊精混合均匀得到第二粉剂。
[0011] 优选的，所述制备方法在复配后还包括一个干燥步骤：采用减压干燥法将第二粉剂进行干燥。
[0012] 优选的，所述减压干燥法的具体步骤为：将所述第二粉剂平铺于干燥器皿中，然后在
真空度为40-50kPa、
温度为50-65℃的条件下真空减压干燥3-5h。
[0013] 优选的，所述第二粉剂的平铺厚度小于等于1cm。
[0014] 优选的，所述活化培养基为营养肉汤培养基。
[0015] 优选的，所述扩大培养基的pH值为7.2-7.6，所述扩大培养基包括蛋白胨、
牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏
水，所述蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水的质量比例为9-11：2-4：4-6：0.004-0.006：900-1100。
[0016] 优选的，所述纳豆激酶产生菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种。
[0017] 优选的，所述纳豆激酶产生菌菌悬液由纳豆激酶产生菌和生理盐水混合制得。
[0018] 如上述制备方法制得的纳豆激酶菌剂的使用方法，包括：
[0019] 将黄豆煮熟，沥去水分，晾凉；
[0020] 取质量为黄豆0.4-0.6%的纳豆激酶菌剂，所述纳豆激酶菌剂包括质量比为1.5-2.5：1的第一粉剂和第二粉剂，先将第一粉剂拌入黄豆，搅拌均匀后再将第二粉剂拌入黄豆；
[0021] 拌匀后将黄豆置于纳豆机中，发酵16-22h得到纳豆；
[0022] 将所述纳豆置于3-5℃的环境下冷藏9-11h进行后熟。
[0023] 优选的，所述使用方法还包括：在将黄豆煮熟前，将黄豆浸泡10h或以上。
[0024] 本发明的有益效果是：本发明采用多种营养物质复配形成高酶活性菌剂，提升原料投入产出比，得到的纳豆激酶菌剂的发酵产物纳豆激酶的活性高。
具体实施方式
[0025] 下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
[0026] 【
实施例一】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0027] S1.准备原料：原料包括下述质量百分比含量的组分：10.5%的纳豆激酶产生菌、28%的葡萄糖、10%的大豆分离蛋白、9.8%的L-丝氨酸、4.2%的L-半胱氨酸和37.5%的麦芽糊精。
[0028] S2.菌种活化：将纳豆激酶产生菌和生理盐水混合，制备浓度为1×106CFU/mL的纳豆激酶产生菌菌悬液，按照2%的体积比取纳豆激酶产生菌菌悬液接种于20mL活化培养基中活化，在36℃、120r/min的条件下培养24h；取纳豆激酶产生菌接种于20ml活化培养基中活化，在36℃、120r/min的条件下培养24h；所述活化培养基为营养肉汤培养基。
[0029] S3.扩大培养：将活化后的液体培养物按照1.7%的体积比例接种到扩大培养基中，在36℃、120r/min的条件下培养24h；所述扩大培养基的pH值为7.4，所述扩大培养基包括蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水，所述蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水的质量比例为10：3：5：0.005：1000。
[0030] S4.离心取菌体：将扩大培养后的液体培养物在4℃、10000r/min的条件下离心10min，然后去掉上清液，剩下部分即为菌体。
[0031] S5.复配：将原料中的全部葡萄糖、全部L-丝氨酸、全部L-半胱氨酸、50%的大豆分离蛋白和20%的麦芽糊精混合均匀得到第一粉剂，将所述菌体与原料中剩余的大豆分离蛋白和剩余的麦芽糊精混合均匀得到第二粉剂。
[0032] 所述制备方法在复配后还包括一个干燥步骤：采用减压干燥法将第二粉剂进行干燥。所述减压干燥法的具体步骤为：将所述第二粉剂平铺于干燥器皿中，所述第二粉剂的平铺厚度为0.8cm，然后在真空度为45kPa、温度为60℃的条件下真空减压干燥4h。
[0033] 所述纳豆激酶产生菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种，购买自CICC（中国工业微生物菌种保藏中心），菌株编号：21076。
[0034] 【实施例二】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0035] S1.准备原料：原料包括下述质量百分比含量的组分：2%的纳豆激酶产生菌、20%的葡萄糖、10%的大豆分离蛋白、12%的L-丝氨酸、6%的L-半胱氨酸和50%的麦芽糊精；
[0036] S2.菌种活化：将纳豆激酶产生菌和生理盐水混合，制备浓度为1×106CFU/mL的纳豆激酶产生菌菌悬液，按照1%的体积比取纳豆激酶产生菌菌悬液接种于25mL活化培养基中活化，在30℃、100r/min的条件下培养18h；所述活化培养基为营养肉汤培养基。
[0037] S3.扩大培养：将活化后的液体培养物按照1%的体积比例接种到扩大培养基中，在30℃、100r/min的条件下培养18h；所述扩大培养基的pH值为7.3，所述扩大培养基包括蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水，所述蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水的质量比例为9：2：4：0.004：900。
[0038] S4.离心取菌体：将扩大培养后的液体培养物在3℃、8000r/min的条件下离心10min，然后去掉上清液，剩下部分即为菌体。
[0039] S5.复配：将原料中的全部葡萄糖、全部L-丝氨酸、全部L-半胱氨酸、60%的大豆分离蛋白和30%的麦芽糊精混合均匀得到第一粉剂，将所述菌体与原料中剩余的大豆分离蛋白和剩余的麦芽糊精混合均匀得到第二粉剂。
[0040] 所述制备方法还包括：干燥：采用减压干燥法将第二粉剂进行干燥。所述减压干燥法的具体步骤为：将所述第二粉剂平铺于干燥器皿中，所述第二粉剂的平铺厚度为1cm，然后在真空度为40kPa、温度为50℃的条件下真空减压干燥3h。
[0041] 所述纳豆激酶产生菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种，购买自CICC（中国工业微生物菌种保藏中心），菌株编号：21076。
[0042] 【实施例三】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0043] S1.准备原料：原料包括下述质量百分比含量的组分：18%的纳豆激酶产生菌、30%的葡萄糖、15%的大豆分离蛋白、10%的L-丝氨酸、2%的L-半胱氨酸和25%的麦芽糊精；
[0044] S2.菌种活化：将纳豆激酶产生菌和生理盐水混合，制备浓度为1×106CFU/mL的纳豆激酶产生菌菌悬液，按照2%的体积比取纳豆激酶产生菌菌悬液接种于30mL活化培养基中活化，在38℃、200r/min的条件下培养24h；所述活化培养基为营养肉汤培养基。
[0045] S3.扩大培养：将活化后的液体培养物按照3%的体积比例接种到扩大培养基中，在30℃、100r/min的条件下培养18h；所述扩大培养基的pH值为7.5，所述扩大培养基包括蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水，所述蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水的质量比例为11：4：6：0.006：1100。
[0046] S4.离心取菌体：将扩大培养后的液体培养物在5℃、10000r/min的条件下离心15min，然后去掉上清液，剩下部分即为菌体。
[0047] S5.复配：将原料中的全部葡萄糖、全部L-丝氨酸、全部L-半胱氨酸、65%的大豆分离蛋白和15%的麦芽糊精混合均匀得到第一粉剂，将所述菌体与原料中剩余的大豆分离蛋白和剩余的麦芽糊精混合均匀得到第二粉剂。
[0048] 所述制备方法还包括：干燥：采用减压干燥法将第二粉剂进行干燥。所述减压干燥法的具体步骤为：将所述第二粉剂平铺于干燥器皿中，所述第二粉剂的平铺厚度为0.9cm，然后在真空度为50kPa、温度为65℃的条件下真空减压干燥5h。
[0049] 所述纳豆激酶产生菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种，购买自CICC（中国工业微生物菌种保藏中心），菌株编号：21076。
[0050] 【实施例四】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0051] S1.准备原料：原料包括下述质量百分比含量的组分：12%的纳豆激酶产生菌、25%的葡萄糖、4%的大豆分离蛋白、5%的L-丝氨酸、4%的L-半胱氨酸和50%的麦芽糊精；
[0052] S2.菌种活化：将纳豆激酶产生菌和生理盐水混合，制备浓度为0.7×106CFU/mL的纳豆激酶产生菌菌悬液，按照5%的体积比取纳豆激酶产生菌菌悬液接种于50mL活化培养基中活化，在35℃、150r/min的条件下培养20h；所述活化培养基为营养肉汤培养基。
[0053] S3.扩大培养：将活化后的液体培养物按照2%的体积比例接种到扩大培养基中，在35℃、150r/min的条件下培养20h；所述扩大培养基的pH值为7.2，所述扩大培养基包括蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水，所述蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水的质量比例为10：3：5：0.005：1000。
[0054] S4.离心取菌体：将扩大培养后的液体培养物在4℃、9000r/min的条件下离心13min，然后去掉上清液，剩下部分即为菌体。
[0055] S5.复配：将原料中的全部葡萄糖、全部L-丝氨酸、全部L-半胱氨酸、30%的大豆分离蛋白和35%的麦芽糊精混合均匀得到第一粉剂，将所述菌体与原料中剩余的大豆分离蛋白和剩余的麦芽糊精混合均匀得到第二粉剂。
[0056] 所述制备方法还包括：干燥：采用减压干燥法将第二粉剂进行干燥。所述减压干燥法的具体步骤为：将所述第二粉剂平铺于干燥器皿中，所述第二粉剂的平铺厚度为0.8cm，然后在真空度为45kPa、温度为60℃的条件下真空减压干燥4h。
[0057] 所述纳豆激酶产生菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种，购买自CICC（中国工业微生物菌种保藏中心），菌株编号：21076。
[0058] 【实施例五】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0059] S1.准备原料：原料包括下述质量百分比含量的组分：13%的纳豆激酶产生菌、26%的葡萄糖、6%的大豆分离蛋白、7%的L-丝氨酸、5%的L-半胱氨酸和43%的麦芽糊精；
[0060] S2.菌种活化：将纳豆激酶产生菌和生理盐水混合，制备浓度为1.3×106CFU/mL的纳豆激酶产生菌菌悬液，按照3%的体积比取纳豆激酶产生菌菌悬液接种于20mL活化培养基中活化，在36℃、130r/min的条件下培养21h；所述活化培养基为营养肉汤培养基。
[0061] S3.扩大培养：将活化后的液体培养物按照2%的体积比例接种到扩大培养基中，在38℃、200r/min的条件下培养24h；所述扩大培养基的pH值为7.6，所述扩大培养基包括蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水，所述蛋白胨、牛肉膏、NaCl、MnSO4·H2O和蒸馏水的质量比例为10：3：5：0.005：1100。
[0062] S4.离心取菌体：将扩大培养后的液体培养物在4℃、9000r/min的条件下离心13min，然后去掉上清液，剩下部分即为菌体。
[0063] S5.复配：将原料中的全部葡萄糖、全部L-丝氨酸、全部L-半胱氨酸、70%的大豆分离蛋白和33%的麦芽糊精混合均匀得到第一粉剂，将所述菌体与原料中剩余的大豆分离蛋白和剩余的麦芽糊精混合均匀得到第二粉剂。
[0064] 所述制备方法还包括：干燥：采用减压干燥法将第二粉剂进行干燥。所述减压干燥法的具体步骤为：将所述第二粉剂平铺于干燥器皿中，所述第二粉剂的平铺厚度为0.7cm，然后在真空度为45kPa、温度为60℃的条件下真空减压干燥4h。
[0065] 所述纳豆激酶产生菌为枯草芽胞杆菌枯草亚种，购买自CICC（中国工业微生物菌种保藏中心），菌株编号：21076。
[0066] 【实施例六】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的使用方法，包括：
[0067] 将黄豆浸泡11h；
[0068] 将豆黄豆煮熟，沥去水分，晾凉；
[0069] 取质量为黄豆0.5%的纳豆激酶菌剂，所述纳豆激酶菌剂包括质量比为2：1的第一粉剂和第二粉剂，先将第一粉剂拌入黄豆，搅拌均匀后再将第二粉剂拌入黄豆；
[0070] 拌匀后将黄豆置于纳豆机中，发酵18h得到纳豆；
[0071] 将所述纳豆置于4℃的环境下冷藏10h进行后熟。
[0072] 本实施例与实施例一制备的纳豆激酶菌剂结合，发酵得到的纳豆用紫外分光光度法测得产品纳豆激酶酶活为72280u/g。
[0073] 【实施例七】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的使用方法，包括：
[0074] 将黄豆浸泡10h；
[0075] 将黄豆煮熟，沥去水分，晾凉；
[0076] 取质量为黄豆0.4%的纳豆激酶菌剂，所述纳豆激酶菌剂包括质量比为1.5：1的第一粉剂和第二粉剂，先将第一粉剂拌入黄豆，搅拌均匀后再将第二粉剂拌入黄豆；
[0077] 拌匀后将黄豆置于纳豆机中，发酵16h得到纳豆；
[0078] 将所述纳豆置于3℃的环境下冷藏10h进行后熟。
[0079] 本实施例与实施例二制备的纳豆激酶菌剂结合，发酵得到的纳豆用紫外分光光度法测得产品纳豆激酶酶活为65260u/g。
[0080] 【实施例八】该实施例描述了一种纳豆激酶菌剂的使用方法，包括：
[0081] 将黄豆浸泡12h；
[0082] 将黄豆煮熟，沥去水分，晾凉；
[0083] 取质量为黄豆0.6%的纳豆激酶菌剂，所述纳豆激酶菌剂包括质量比为2.5：1的第一粉剂和第二粉剂，先将第一粉剂拌入黄豆，搅拌均匀后再将第二粉剂拌入黄豆；
[0084] 拌匀后将黄豆置于纳豆机中，发酵22h得到纳豆；
[0085] 将所述纳豆置于5℃的环境下冷藏11h进行后熟。
[0086] 本实施例与实施例三制备的纳豆激酶菌剂结合，发酵得到的纳豆用紫外分光光度法测得产品纳豆激酶酶活为71390u/g。
[0087] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于
权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
