专利汇可以提供上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 冷冻干燥 法制备的上皮细胞活性肽(hEGF),与番茄红素 树脂 、 牛 至精油等形成复合物,利用逆相 蒸发 -冷冻干燥法制备上皮细胞活性肽复合纳米微脂囊,粒径为30~80纳米。公开了上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,以其在 化妆品 、 皮肤 修复剂中的应用。本发明的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊基于纳米定向皮肤、组织渗透技术,实现上皮细胞活性肽活性成份快速、稳定、较长时间渗透至皮肤组织基底层,达到显著的皮肤、组织修复效果,增强皮肤、组织细胞抗 氧 化作用,维持组织细胞增值,细胞分化、生长作用,可起到祛斑、防止皮肤光老化的效果。可提供一种因多种原因引起的皮肤、组织损害修复、防皱减斑的 生物 化妆品。,下面是上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制专利的具体信息内容。
1.本发明公开了一种上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的应用及其备制,其特征在于,利用逆相蒸发-冷冻干燥法制备上皮细胞活性肽,与番茄红素树脂、薰衣草精油、牛至精油复合形成微脂囊至少一种形成复合物柔性纳米微脂囊,考察其包封率或载药量、变形性及稳定性;上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊为多室脂质体。所述的微脂囊其平均粒径为(78.86±4.32)nm,Zeta电位为(61.22±7.62)mV,包覆率可以为80.2~90.0%,载药量可以为22.0~26.0%。上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊柔性纳米脂质体具有较高的稳定性。
含量测定方法简单、可靠,稳定性和变形性高,可能成为透过皮肤屏障转运的有效载体。番茄红素通过清道夫受体B类1型蛋白(SR-B1)的转运被人体吸收,到达各种靶器官,抑制氧化应激、维持线粒体功能、抗细胞凋亡。所述的上皮细胞活性肽复合物由上皮细胞活性肽、番茄红素树脂、薰衣草精油、牛至精油复合而成:
上皮细胞活性肽10μg/L 20~30份、亚麻籽油番茄红素570mg/L 10~15份、薰衣草精油
3~10份、牛至精油3~10份。
2.根据权利要求1所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊,其特征在于,上皮细胞活性肽复合物由以下质量份的物质复合而成:
上皮细胞活性肽30份、番茄红素树脂15份、薰衣草精油6、牛至精油6份。
3.根据权利要求1~2中任一项所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊,其特征在于,所述的微脂囊的包覆率为80.2~90.0%,载药量为22.0~26.0%。
4.权利要求3所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征包括以下步骤:
(1)用公开的方法获取上皮细胞活性肽:小分子细胞活性物质成为细胞活性转移因子。
大分子细胞活性物质为大分子细胞活性因子。分离培养上皮细胞;收获上皮细胞培养液:用相应的培养基和因子培养细胞生长到一定阶段,取上清液;可多次传代收获。上皮细胞活性肽获取后:
①透析提取小分子上皮细胞活性肽,将上皮细胞裂解物适当处理后,装入透析袋或玻璃透析装置内,在一定温度下透析,12-30h收取透析液。
②中空纤维柱分离提取上皮细胞活性肽将上皮细胞裂解物经处理后,用分子截留孔径(如0.2KD、5KD、10KD、15KD等)的中空纤维柱分离截取上皮细胞活性肽,按分子量不同区分转移因子和活性因子。
③离子交换器和层析提取上皮细胞活性肽。
(2)鉴定①蛋白质浓度鉴定;②核糖和多核苷酸的浓度鉴定;③蛋白质和核酸类物质鉴定;④上皮细胞活性肽鉴定。
(3)上皮细胞活性肽含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]:分别配制质量浓度为15,30,
50,100,200,300,400,500ng/mL的上皮细胞活性肽系列溶液,以0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)破坏脂质膜的空白柔性纳米微脂囊做空白对照,按照EGF-ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品,以样品中上皮细胞活性肽的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标,采用四参数回归方法进行运算,得回归方程Y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,以检测样品中神经干细胞活性因子的含量。
(4)亚麻籽油提取番茄红素树脂:22%番茄固体物:亚麻籽油按1:1用微波萃取法制成
570mg/L番茄红素的亚麻籽番茄油;
(5)蒸馏方法提取薰衣草精油;
(6)蒸馏方法提取牛至精油;
(7)上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备:精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E,置瓶中,加入适量氯仿(含1%无水乙醇),于4℃水浴中溶解脂质。
取甘露醇、胆酸钠和上皮细胞活性肽溶解于4℃磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4)溶液中。脂质溶解后,将PBS溶液倒入脂质溶液中,在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超10s,停
5s),形成均匀乳液。室温下放置30min。将溶液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压0.07MPa,转速500r/min),形成水相脂质体混悬液后,继续蒸发15min,以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s,停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中,高压均质3次,再通过0.1μm微孔滤膜挤出10次后,-40℃预冻24h后,于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
(8)上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊分离采用由Fry等提出的交联葡聚糖-50(Sephadex G-50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离神经干细胞活性因子。将交联葡聚糖-50用适量PBS溶液浸泡24h后装柱,以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS,先用不含上皮细胞活性肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱,然后向柱中加入0.25mL上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液,离心,收集离心液,微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
(9)观察形态;柔性纳米微脂囊径1.0%磷钨酸负染,将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍,在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位;包封率(EE)采用以下公式计算:
EE(%)=柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中EGF总含量×100%;载药量:
取上皮细胞活性肽复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中,加入0.2mL10%TritonX-100,加PBS至刻度,测定总上皮细胞活性肽复合物量;冻干微脂囊载药量=上皮细胞活性肽复合物的量/1mg×100%。本方法所制备的上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径为(78.86±4.32)nm,Zeta电位为(61.22±7.62)mV,包覆率可以为80.2~
90.0%,载药量可以为22.0~26.0%。
(10)变形性测定:取1mL一次性注射器,分别加入1mL蒸馏水、上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊及上皮细胞活性肽复合物普通脂质体,分别外加0.1,0.2,0.3,0.4和0.5MPa压力,计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间,计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比,以测定柔性纳米微脂囊的变形性,相比,上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
(11)稳定性鉴定:取3批上皮细胞活性肽微脂囊复合物混悬液、上皮细胞活性肽复合物冻干粉及上皮细胞活性肽复合物微脂囊冻干粉冻干粉,分别置室温25℃、4℃条件下,于0,
3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位,并观察外观,以确定其稳定性。
5.根据权利要求4所述的上皮细胞活性肽复合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)用公开的方法获取上皮细胞分离培养上皮细胞,收获上皮细胞培养液:上皮细胞活性肽分离、备制、鉴定(①蛋白质浓度鉴定;②核糖和多核苷酸的浓度鉴定;③蛋白质和核酸类物质鉴定;④上皮细胞活性肽活性物质生物活性鉴定。
6.根据权利要求5所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(7)中所述的一种公开方法,上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊(逆相蒸发-冷冻干燥法)制备:精密称取大豆磷脂、胆固醇和维生素E,置梨形瓶中,加入适量氯仿(含1%无水乙醇),于4℃水浴中溶解脂质。取甘露醇、胆酸钠和上皮细胞活性肽溶解于4℃PBS(pH=7.4)溶液中。脂质溶解后,将PBS溶液倒入脂质溶液中,在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s,停5s),形成均匀溶液。室温下放置30min。将溶液于旋转蒸发仪上减压蒸发(负压
0.07MPa,转速500r/min),形成水相脂质体混悬液后,继续蒸发15min,以彻底去除有机溶剂。再在水浴式超声仪中(低于10℃)超声10min(超声10s,停5s)。将脂质体混悬液转移高压均质挤出机中,高压均质3次,再通过0.1μm微孔滤膜挤1次后,-40℃预冻24h后,于冷冻干燥机中制备成冻干粉末。
7.权利要求6所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的上皮细胞活性肽复合物含量检测[酶联免疫吸附法(ELISA)]:使其分别配制质量浓度为15,30,50,100,200,300,400,500ng/mL的上皮细胞活性肽复合物系列溶液,以0.2%TritonX-100破坏脂质膜的空白柔性纳米脂质体做空白对照,按照EGF-ELISA检测试剂盒说明书的方法和步骤检测样品,以样品中上皮细胞活性肽复合物的质量浓度(X)为横坐标、检测的OD值(Y)为纵坐标,采用四参数回归方法进行运算,得回归方程Y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D,以检测样品中上皮细胞活性肽复合物的含量。
8.权利要求7所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(8)所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊分离采用交联葡聚糖-50(SephadexG–50)微柱离心法分离柔性纳米微脂囊和游离上皮细胞活性肽。将Sephadex G-50用适量PBS溶液浸
24h后装柱,以3000r/min离心3min以去除其中多余的PBS,先用不含上皮细胞活性肽复合物的空白柔性纳米微脂囊0.25mL过柱,然后向柱中加入0.25mL上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊混悬液,离心,收集离心液,微脂囊就和仍然滞留于柱中的游离药物分离。
9.权利要求8所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(9)所述的观察其形态;用柔性纳米微脂囊径1.0%磷钨酸负染,将柔性纳米微脂囊用PBS缓冲液稀释10倍,在室温下用粒径和电位分析仪测定其粒径和电位;包封率(EE)采用以下公式计算:EE(%)=柔性纳米脂质体EGF含量/柔性纳米脂质体混悬液中上皮细胞活性肽复合物总含量×100%;载药量:取上皮细胞活性肽复合物冻干微脂囊1mg置5mL容量瓶中,加入
0.2mL10%TritonX-100,加PBS至刻度,测定总上皮细胞活性肽复合物量;冻干微脂囊载药量=上皮细胞活性肽复合物的量/1mg×100%。本方法所制备的上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应为多室脂质体。其平均粒径应为(80.66±3.86)nm,Zeta电位为(61.22±
7.62)mV,平均包封率为(37.86±4.77)%;平均载药量为(6.58±1.27)%。
10.权利要求9所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(10)所述的变形性测定:取1mL一次性注射器,分别加入1mL蒸馏水、上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊及上皮细胞活性肽复合物普通脂质体,分别外加0.1,0.2,0.3,0.4和
0.5MPa压力,计算样品完全通过100nm一次性微孔滤膜的时间,计算样品通过时间与蒸馏水通过时间之比,以测定柔性纳米微脂囊的变形性,相比,上皮细胞活性肽复合物柔性纳米微脂囊应具有极显著的变形性。
11.权利要求10所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊的制备方法,其特征在于,步骤(11)的稳定性鉴定:取3批上皮细胞活性肽微脂囊复合物混悬液、上皮细胞活性肽复合物冻干粉及上皮细胞活性肽复合物微脂囊冻干粉冻干粉,分别置室温25℃、4℃条件下,于0,
3m测定其包封率、载药量、pH、粒径和Zeta电位,并观察外观,以确定其稳定性。
12.权利要求1所述的上皮细胞活性肽复合物纳米微脂囊制备的上皮细胞活性肽复合物在医疗及化妆品领域中的应用。
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