技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物发酵工程领域，具体涉及一种γ-聚谷
氨酸产生菌和一种使用同步
糖化、过滤与发酵工艺。
背景技术
[0002] γ-聚谷氨酸(英文名称γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA)是由L-谷氨酸或D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成，具有吸
水性、
水溶性、带负电荷、无毒、可
生物降解、可食用等性质，是一种优良的环保型高分子材料，因此γ-聚谷氨酸及其衍生物已被广泛应用于药物载体、
水处理絮凝剂、农业保水保肥剂、食品
化妆品添加剂等多个领域。传统工艺中，γ-聚谷氨酸主要是通过微生物发酵方法制备，
葡萄糖、甘油和
柠檬酸是发酵生产γ-聚谷氨酸的主要
碳源，但是这些碳源营养物质均来源于人类食物，如粮食、土豆、
甘蔗等，这样不仅导致γ-聚谷氨酸的成本较高，而且大规模的生产还会加剧人类食物的短缺。因此，伴随着γ-聚谷氨酸需求量快速增长，寻求可替代的经济型碳源材料进行γ-聚谷氨酸的生产具有重要意义。
[0003] 木质
纤维素是自然界最为丰富的碳水化合物资源，目前其已成功应用于生产多种生物
能源和高附加值化学产品，如生物
乙醇、乳酸、丁二醇、谷氨酸等。近年来，以木质
纤维素为原材料发酵生产γ-聚谷氨酸的研究已被陆续报道。如英文杂志《Journal of Chemical Technology and Biotechnology》(2013，89(4):616–622)公开了一篇名称为“A novel approach for poly-γ-glutamic acid production using xylose and corncob fibres hydrolysate in Bacillus subtillis HB-1”的期刊论文，该论文指出以玉米芯
水解液为主要碳源，使用枯草芽孢杆菌HB-1进行γ-聚谷氨酸发酵；英文杂志《Bioresource Technology》(2015，193(2015):370–376)公开了一篇名称为“Highly efficient rice straw utilization for poly-(c-glutamic acid)production by Bacillus subtilis NX-2”的期刊论文，该论文公开的技术是通过两步水解法将稻草水解，水解液经浓缩脱毒后使用枯草芽孢杆菌NX-2进行γ-聚谷氨酸发酵。但是，这些
现有技术均是通过分段水解与发酵相结合的方式进行γ-聚谷氨酸的生产制备，不仅工艺复杂，而且能耗大，另外，这些现有技术均是批次发酵，即每一次发酵都需要重新培养一级甚至多级
种子，亦即上一次发酵的细菌不会再循环利用，这样发酵方式不仅生产周期长，而且发酵过程中原料和设备的投入也会相应地增加。由此可见，目前以木质纤维素为主要原料发酵生产γ-聚谷氨酸的方法还不适合γ-聚谷氨酸的大规模工业化生产。
[0004] Ishola等人于2013年提出将同步糖化、过滤与发酵法(简称SSFF) 应用于发酵生产乙醇的工艺中，整个工艺在两个反应器中进行，即将预处理的木质纤维素材料在水解反应器中进行酶水解，经过
膜过滤，含糖的滤出液持续
泵入
发酵罐中进行微生物发酵。与传统的分步糖化发酵法 (简称SHF)相比，SSFF法不仅工艺简单，产物的生产效率高，而且采用SSFF法时细胞与固态的纤维素材料处于分离状态，发酵菌体容易回收，从而可以实现连续批次发酵生产。
[0005] 现有技术中γ-PGA发酵多采用游离细胞发酵，而与游离细胞相比，固定化细胞具有方便回收、可重复多次使用、批次生产间隔时间短等优点，因此，
申请人认为将SSFF法和固定化细胞发酵相结合可以有效的解决现阶段使用木质纤维素生产γ-聚谷氨酸所存在的工艺复杂、能耗大、发酵的菌体不能循环利用等问题，对以木质纤维素为原料发酵γ- 聚谷氨酸的规模化具有重大意义。
发明内容
[0006] 本发明的首要目的是提供一种高产γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)JX-12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏号为CGMCCNO.13716，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2017年3月16日。
[0007] 本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)JX-12，是从大酱样品中筛选得到的芽孢杆菌。所述菌株JX-12的形态特征为：在LB培养基中营养细胞为0.7～0.9×2.0～3.0μm大小的杆菌，革兰氏
染色为阳性， 37℃培养3～5天形成芽孢，芽孢大小0.4～0.6×0.8～1.5μm，为长圆形或圆柱形。
[0008] 菌株JX-12的菌落形态特征为：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板培养： 30～40℃培养1天可大量生长，菌落表面凸起，光滑无褶皱，菌落透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，挑起有丝状。E型发酵培养基琼脂平板培养：30～40℃培养1d可大量生长，菌落表面凸起、中心凹陷，表面不光滑有褶皱，菌落白色半透明，边缘不规则，菌落表面有液滴，菌落粘性大，挑起有
拉丝状。
[0009] 菌株JX-12的生理生化性质如下表1所示：
[0010] 表1.JX-12菌部分生理生化特性
[0011]
[0012] 表1的“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性。
[0013] 分子生物学鉴定：提取菌株全基因组DNA，PCR扩增16S rDNA
片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为芽孢杆菌 (Bacillus sp.)。
[0014] 本发明的另一个目的是提供高产γ-聚谷氨酸的菌株在生产γ-聚谷氨酸中的应用，是一种新型的以木质纤维素为主要原料的γ-聚谷氨酸生产方法，能够同时实现同步糖化水解发酵和连续批次发酵。
[0015] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：生产γ-聚谷氨酸的步骤如下：
[0016] 1)、种子培养：将菌株JX-12接种于无菌的活化培养基斜面，在 30-37℃条件下培养24-48小时活化，将已活化的菌种接种于无菌的种子培养基，在30-37℃、150-250rpm的条件下摇瓶培养24-48小时，即得种子液。
[0017] 所述的活化培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂18～20g，pH 6.8～7.4，补水至1000mL。所述的种子培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，pH 7.0～7.4，补水至1000mL。
[0018] 2)、固定化细胞制备：将种子液离心，弃上清液，用无菌的0.9％生理盐水冲洗3-4次，用无菌水将菌体悬浮，并稀释至浓度为105 -107cfu/mL，将菌悬液与载体材料混合均匀，交联
固化形成颗粒，用无菌水清洗固化颗粒3-4次，转移至0.9％的生理盐水中，于4℃
冰箱保存备用。
[0019] 3)、木质纤维素材料预处理：取木质纤维素材料，用
自来水清洗，然后
粉碎、过40目筛、预处理、脱毒，之后在60-90℃下干燥至恒重，常温保存备用。所述木质纤维素材料为玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、水稻秸秆、
高粱秸秆、油菜秸秆、甘蔗渣、木屑中的一种或多种混合。所述预处理为稀酸预处理、稀
碱预处理、离子液预处理、
蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、生物预处理中的一种，所述脱毒为水洗脱毒、过碱化处理、
活性炭吸附、生物脱毒中的一种。
[0020] 4)、同步糖化、过滤与发酵：
[0021] 第一、预水解：将预处理的木质纤维素材料加入水解反应器中，用蒸馏水稀释至固体含量5％-12％，加入纤维素酶10-35FPU/(g底物)，加入消泡剂，在50-55℃下搅拌100-200rpm，通过2M的NaOH和2M的HCl 维持水解反应体系pH为4.5-5.5，在与发酵罐整合同步发酵前预水解 24-48h。
[0022] 第二、发酵罐灭菌：发酵罐中加入不含主要碳源的发酵培养基，所述培养基的配方为：柠檬酸5g，谷氨酸20g，
硫酸铵10g，K2HPO4 1g， MgSO4·7H2O 0.5g，FeCl3·6H2O 0.02g，MnSO4·H2O 0.1g，CaCl2 0.2g，补水至1000mL；加入消泡剂，使用蒸汽将发酵罐及培养基121℃灭菌 20-40min，冷却待用。
[0023] 第三、同步糖化、过滤与发酵：预水解后，将固定化的γ-聚谷氨酸菌株接种到培养基中，进行同步糖化、过滤与发酵。
[0024] 使用
蠕动泵将水解反应器中木质纤维素-酶混合物泵入错流膜过滤装置中，流速为5-30L/min，滞留物泵回水解反应器，含糖的滤出液以 0.5-35mL/min的流速泵入发酵罐，供菌体发酵使用。同时发酵罐中液体以与滤出液相同的流速泵入水解反应器中，维持体系的平衡。发酵罐中搅拌速度为400-600rpm，通气量为1-1.5vvm，
温度为30-37℃，pH通过自动流加2M NaOH维持在5.5-7.0；发酵72-96h。
[0025] 第四、连续批次发酵：
[0026] 发酵72-96h后，取出发酵罐中的发酵液，将固定化的γ-聚谷氨酸留在发酵罐中，加入已灭菌的不含主要碳源的培养基，水解反应器中补充木质纤维素材料和酶，继续进行同步糖化、过滤与发酵48-72h，重复该操作，进行连续发酵。
[0027] 优选的：所述的固定化细胞制备过程中采用的载体材料为海藻酸钠、海藻酸
钙、聚乙烯醇、卡拉胶、聚氨酯
泡沫、活性炭、陶瓷颗粒等的一种或多种。
[0028] 优选的：所述同步糖化、过滤与发酵采用的设备包括水解反应器、错流膜过滤装置和通气搅拌式发酵罐，所述水解反应器和通气搅拌式发酵罐中设置搅拌组件；所述水解反应器通过第一连接管道与错流膜过滤装置的进液口连通，所述错流膜过滤装置的出液口通过第二连接管道与通气搅拌式发酵罐连通，所述通气搅拌式发酵罐通过第三连接管道与水解反应器连通；所述错流膜过滤装置上设置回收管，所述回收管通入水解反应器中；所述连接管道和回收管上均设置蠕动泵。
[0029] 优选的：所述的错流膜过滤装置中
超滤膜材料为聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚
酮或无机陶瓷膜的一种，膜的孔径为0.22-0.45μm，有效面积 0.025-0.25m2。
[0030] 本发明具有以下有益效果：
[0031] 1、生产成本低。本发明采用木质纤维材料为碳源生产γ-聚谷氨酸，显著降低了γ-聚谷氨酸的生产成本，使农业生产中的秸秆等固态废弃物得到高效利用，达到了农业的可持续发展。
[0032] 2、工艺简单，生产效率高。本发明采用同步糖化、过滤和发酵工艺，实现了木质纤维素材料水解和γ-聚谷氨酸发酵同步进行，与现有技术中分步水解与发酵的方法相比，大大简化了生产工艺。且水解过程中生产的糖及时被菌体消耗，避免了纤维素水解酶的产物抑制，提高了生产效率。同时，本发明将木质素水解反应和γ-聚谷氨酸发酵分别置于不同反应器中，与现有技术相比，水解反应与菌体发酵均是在其最适环境中进行的，进一步提高了生产效率，增加了木质纤维素的利用率。
[0033] 3、能够连续批次发酵。本发明采用的固定化细胞进行γ-聚谷氨酸发酵，与现有的游离细胞发酵相比，发酵液和菌体更容易分离，实现了菌体的重复利用。在一次发酵完成后，分离出发酵液并重新加入培养基就可进行下一次发酵，节约了不同批次间种子培养的成本，缩短了发酵时间，进一步提高了γ-聚谷氨酸的生产效率。对以木质纤维素为碳源生产γ-聚谷氨酸的工业放大具有重要意义。
[0034] 此外，本发明采用的错流膜过滤装置中滤膜孔径为0.22-0.45μm，具有除菌的效果。这样不需要在水解反应器中采取无菌操作，就可以使泵入发酵罐的含糖滤出液为无菌液体，进一步简化了工艺，也减少了能耗。
附图说明
[0035] 图1为本发明同步糖化、过滤与发酵采用设备的结构示意图。
具体实施方式
[0036] 如图1所示的同步糖化、过滤与发酵采用的设备，包括水解反应器 1、错流膜过滤装置2和通气搅拌式发酵罐3，所述水解反应器1和通气搅拌式发酵罐3中设置搅拌组件。这里的搅拌组件可以通过多种结构实现其搅拌功能，例如所述搅拌组件是一根由
电机驱动的搅拌轴，所述搅拌轴的末端固定有搅拌叶，或者所述搅拌组件包括一个磁
力搅拌器和多个搅拌子，所述磁力搅拌器位于水解反应器1和通气搅拌式发酵罐3的底部，搅拌子位于水解反应器1和通气搅拌式发酵罐3内部，在磁力作用下完成搅拌。
[0037] 如图1所示，所述水解反应器1通过第一连接管道与错流膜过滤装置2的进液口连通，所述第一连接管道的作用是将水解后的混合物由水解反应器1向错流膜过滤装置2输送。所述错流膜过滤装置2的出液口通过第二连接管道与通气搅拌式发酵罐3连通，所述第二连接管的作用是由错流膜过滤装置2向通气搅拌式发酵罐3输送含糖滤出液。所述通气搅拌式发酵罐3通过第三连接管道与水解反应器1连通，所述第三连接管道的作用是由通气搅拌式发酵罐3向水解反应器1输送发酵液。所述错流膜过滤装置2上设置回收管，所述回收管通入水解反应器1中，回收管的作用是由错流膜过滤装置2向水解反应器1输送未通过过滤装置的滞留物。所述连接管道和回收管上均设置蠕动泵5，所述蠕动泵5 为各个管道的输送提供动力。
[0038] 进一步的，所述的错流膜过滤装置2中超滤膜材料为聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或无机陶瓷膜的一种，膜的孔径为2
0.22-0.45μm，有效面积 0.025-0.25m 。这样的膜孔径具有除菌的效果，可省去在水解反应器中采取无菌操作，使泵入发酵罐的含糖滤出液为无菌液体，进一步简化了工艺，也减少了能耗。
[0039] 本发明同步糖化、过滤与发酵采用的设备在使用时，先将木质纤维素加入水解反应器1中进行预处理，并向通气搅拌式发酵罐3中加入不含主要碳源的发酵培养基。将固定化的菌株JX-12接种到培养基中，然后打开各个管道上的蠕动泵5，使水解反应器1中的混合物通过第一连接管道进入错流膜过滤装置2中，通过错流膜过滤装置2的滤出液经第二连接管道进入通气搅拌式发酵罐3中，滞留物经回收管回到水解反应器1中。同时，通气搅拌式发酵罐3中的发酵液通过第三连接管道进入水解反应器1中，形成完整的循环，维持体系平衡。
[0040] 下面具体提供优选的
实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果，但本发明的实施方式不限于此。
[0041] 实施例一
[0042] 以玉米秸秆为主要原料生产γ-聚谷氨酸：
[0043] 1)、种子培养：将低温冻存的解
淀粉芽孢杆菌JX-12接种于无菌的活化培养基斜面，活化培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂19g，pH 7.0～7.4，补水至1000mL，在121℃灭菌30min。在37℃条件下培养24小时活化，将已活化的菌种接种于无菌的种子培养基，种子培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，pH 7.0～ 7.4，补水至
1000mL，在121℃灭菌30min。在30℃、200rpm的条件下摇瓶培养24小时，即得种子液。
[0044] 2)、固定化细胞制备：将种子液在5000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清液，用无菌的0.9％生理盐水冲洗3次，用无菌水将菌体悬浮，并稀释至浓度为106cfu/mL。
[0045] 取3％海藻酸钠溶液200mL，与50mL上述细胞悬液混合，使用滴管将混合溶液逐滴加入无菌的50g/L的CaCl2溶液中，即可形成3-5mm固定化凝胶颗粒，30min后弃CaCl2溶液，使用无菌水清洗凝胶颗粒4次，加入无菌的0.9％的生理盐水，4℃保存备用。
[0046] 3)、木质纤维素材料预处理：将玉米秸秆用自来水清洗，干燥后粉碎、过40目筛，加入2.0％的H2SO4溶液，至固体含量为10％，121℃蒸煮 3h,迅速冷却，使用自来水清洗4次，直至
洗出的液体为中性，60℃干燥至恒重。
[0047] 4)、同步糖化、过滤与发酵：
[0048] 第一、预水解：将500g预处理的玉米秸秆粉加入水解反应器1中，加入5L蒸馏水、纤维素酶20FPU/(g底物)、5mL消泡剂，在50℃、150rpm 下搅拌24h，体系pH维持在4.5-5.5。
[0049] 第二、发酵罐灭菌：向5L通气搅拌式发酵罐3中加入3L不含主要碳源的发酵培养基，发酵培养基的配方为：柠檬酸15g，谷氨酸60g，硫酸铵30g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，FeCl3·6H2O 0.06g，MnSO4·H2O 0.3g，CaCl2 0.6g，补水至3L；加入6mL消泡剂，使用蒸汽将发酵罐及培养基121℃灭菌30min，冷却待用。
[0050] 第三、同步糖化、过滤与发酵：预水解后，将150g固定化的菌株 JX-12接种到3L培养基中，打开各个管道上的蠕动泵，将水解反应器1 与通气搅拌式发酵罐3连接在一起。使水解反应器1中木质纤维素-酶混合物泵入错流膜过滤装置2中，错流膜过滤装置2中设置孔径0.22 μm的陶瓷膜，有效面积为0.25㎡，流速为30L/min，滞留物泵回水解反应器1，含糖的滤出液以35mL/min的流速泵入通气搅拌式发酵罐3。同时通气搅拌式发酵罐3中液体以35mL/min的流速泵入水解反应器1 中，维持体系的平衡。发酵罐中搅拌速度为400rpm，通气量为12vvm，温度为30℃，pH通过自动流加2M NaOH维持在7.0,发酵96h。
[0051] 取发酵液，过滤除菌，加入3倍体积的乙醇，离心提纯γ-聚谷氨酸，110℃
真空酸水解24h,衍生后，通过高效液相色谱测定γ-聚谷氨酸产量。
[0052] 第四、连续批次发酵：
[0053] 发酵96h后，取出通气搅拌式发酵罐3中的发酵液，将固定化的γ- 聚谷氨酸留在通气搅拌式发酵罐3中，加入3L已灭菌的不含主要碳源的培养基，水解反应器1中补充200g经过预处理的玉米秸秆和4000FPU 的纤维素酶，继续进行同步糖化、过滤与发酵72h，如此重复三个批次，测定每批次中γ-聚谷氨酸产量。检测结果如下表2所示：。
[0054] 表2.以玉米秸秆为主要原料同步糖化、过滤与发酵连续批次生产
[0055] γ-聚谷氨酸产量
[0056] 批次 γ-聚谷氨酸产量(g/L)1 15.4
2 18.8
3 19.2
4 18.5
[0057] 实施例二
[0058] 以玉米秸秆为主要原料生产γ-聚谷氨酸：
[0059] 1)、种子培养：将低温冻存的解淀粉芽孢杆菌JX-12接种于无菌的活化培养基斜面，活化培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂19g，pH 7.0～7.4，补水至1000mL，在121℃灭菌30min。在37℃条件下培养24小时活化，将已活化的菌种接种于无菌的种子培养基，种子培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，pH 7.0～ 7.4，补水至
1000mL，在121℃灭菌30min。在30℃、200rpm的条件下摇瓶培养24小时，即得种子液。
[0060] 2)、固定化细胞制备：将种子液在5000rpm、4℃条件下离心20min，弃上清液，用无菌的0.9％生理盐水冲洗3次，用无菌水将菌体悬浮，并稀释至浓度为106cfu/mL。
[0061] 将聚氨酯泡沫裁剪成1cm3左右的小
块，取400mL 10％聚乙烯醇溶液，与80mL上述菌悬液混合，将100粒聚氨酯泡沫浸入聚乙烯醇菌株混合溶液，待混合溶液充分浸入泡沫的缝隙中后，将带有菌液的聚氨酯泡沫转移到饱和
硼酸溶液中，于4℃冰箱中交联固化20h，用无菌水洗涤4 次，将固定化细胞颗粒浸在0.9％的生理盐水，4℃冰箱中保存待用。
[0062] 3)、木质纤维素材料预处理：将玉米秸秆用自来水清洗，干燥后粉碎、过40目筛，加入2.0％的H2SO4溶液，至固体含量为10％，121℃蒸煮 3h,迅速冷却，使用自来水清洗4次，直至洗出的液体为中性，60℃干燥至恒重。
[0063] 4)、同步糖化、过滤与发酵：
[0064] 第一、预水解：将500g预处理的玉米秸秆粉加入水解反应器1中，加入5L蒸馏水、纤维素酶20FPU/(g底物)、5mL消泡剂，在50℃、150rpm 下搅拌24h，体系pH维持在4.5-5.5。
[0065] 第二、发酵罐灭菌：向5L通气搅拌式发酵罐3中加入3L不含主要碳源的发酵培养基，发酵培养基的配方为：柠檬酸15g，谷氨酸60g，硫酸铵30g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，FeCl3·6H2O 0.06g，MnSO4·H2O 0.3g，CaCl2 0.6g，补水至3L；加入6mL消泡剂，使用蒸汽将发酵罐及培养基121℃灭菌30min，冷却待用。
[0066] 第三、同步糖化、过滤与发酵：预水解后，将60粒聚乙烯醇-聚氨酯固定化的菌株JX-12接种到3L培养基中，打开各个管道上的蠕动泵，将水解反应器1与通气搅拌式发酵罐3连接在一起。使水解反应器1中木质纤维素-酶混合物泵入错流膜过滤装置2中，错流膜过滤装置2中设置孔径0.22μm的陶瓷膜，有效面积为0.25㎡，流速为30L/min，滞留物泵回水解反应器1，含糖的滤出液以35mL/min的流速泵入通气搅拌式发酵罐3。同时通气搅拌式发酵罐3中液体以35mL/min的流速泵入水解反应器1中，维持体系的平衡。发酵罐中搅拌速度为400rpm，通气量为12vvm，温度为30℃，pH通过自动流加2M NaOH维持在7.0,发酵96h。
[0067] 取发酵液，过滤除菌，加入3倍体积的乙醇，离心提纯γ-聚谷氨酸，110℃真空酸水解24h,衍生后，通过高效液相色谱测定γ-聚谷氨酸产量。
[0068] 第四、连续批次发酵：
[0069] 发酵96h后，取出通气搅拌式发酵罐3中的发酵液，将固定化的γ- 聚谷氨酸留在通气搅拌式发酵罐3中，加入3L已灭菌的不含主要碳源的培养基，水解反应器1中补充200g经过预处理的玉米秸秆和4000FPU 的纤维素酶，继续进行同步糖化、过滤与发酵72h，如此重复三个批次，测定每批次中γ-聚谷氨酸产量。检测结果如下表3所示：。
[0070] 表3.以玉米秸秆为主要原料使用聚乙烯醇和聚氨酯泡沫固定化细胞同步糖化、过滤与发酵连续批次生产γ-聚谷氨酸产量
[0071] 批次 γ-聚谷氨酸产量(g/L)1 21.3
2 23.5
3 20.4
4 21.7
[0072]
[0073]
