技术领域
[0001] 本
发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种微生物发酵法制取雷帕霉素的技术领域。
背景技术
[0002] 雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)，又名西罗莫司(Sirolimus)，是一种新型大环内酯类免疫
抑制剂。RAPA的分子式为C51H79NO13，分子量991KD，为白色固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性，溶解于甲醇、
乙醇、丙
酮、氯仿等
有机溶剂，极微溶于
水，几乎不溶于乙醚。RAPA通过不同的细胞因子受体阻断
信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的
进程，从而发挥免疫抑制效应。
[0003] 雷帕霉素最早是加拿大Wyeth-Ayerst研究实验室在七十年代中期从太平洋Ester岛(Rapa Nui)的
土壤样品中分离的链霉菌AYB-944所产生的代谢产物。产生菌菌丝单轴分枝，孢子丝螺旋，孢子堆灰转灰褐。气生菌丝吸水，孢子聚集成堆，产生黑色斑点。基内菌丝浅黄褐。产生可溶性色素。分类鉴定为吸水链霉菌，并分别贮存于美国农业部菌种保存中心和美国典型菌种保藏中心.定名为Streptomyees hygroseopics NRRL 5491(或ATCC 29253)。
[0004] 随着器官移植数量的增加，用于器官移植后减少排异反应的免疫抑制剂类药物也呈现快速增长趋势，特别是雷帕霉素等新的产品正在逐渐成为器官移植用免疫抑制剂主流产品，而作为一种新型的抗排斥反应药物，以雷帕霉素为原料的制剂在国内刚刚上市。国内由于用药水平起步较晚，此类产品技术开发周期较长，特别是现有生产工艺的不尽完善等因素，严重影响了雷帕霉素的技术和生产水平提高，由于生产能
力较小，现有产量尚不能满足国内需求。目前我国雷帕霉素制剂依靠进口为主，进口量呈现逐年增加的趋势。据专家预测，该产品仅在美国的市场销售额就可达5～20亿美元，以该产品为原料制成的制剂在中国市场上市后，产品市场容量巨大，市场前景引人注目。
[0005] 雷帕霉素是由能够代谢产生雷帕霉素的生物在合适的营养介质中富集分离得到的化合物，目前的制备方法主要包括发酵法和生物合成法两种。雷帕霉索的生物合成是一个复杂的过程，首先经过微生物体内各种酶系的作用，将吸收的氮源、
碳源、无机盐和生长因子等营养物质转化为可以利用的小分子，然后以小分子为前体，在雷帕霉索合成酶的作用下合成雷帕霉素，整个过程是由一系列的酶促反应逐步实现的，并受关键酶的调控。虽然人们已经做了很多工作，但仍然是有限的，还有许多问题尚待澄清。发酵法主要是由代谢产生雷帕霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopieus)或其他菌株发酵富集和分离纯化得到。因此，通过研究菌株代谢过程中雷帕霉素合成某些相关的酶的能力与其效价之间的关系，对其产生菌进行诱变，或以相关酶或前体含量为指标进行突变株的选育，可能是筛选高产突变株的又一途径，以及进行雷帕霉素发酵培养条件研究是发酵法制备技术中的关键。
[0006] 1993年Kojima等报道游动放线菌N902-109[Actino-planessp.N902-109(FERM BP-3832)]也能合成雷帕霉索，且其合成能力比吸水链霉菌ATCC 29253强10倍以上，但尚未见该菌株用于生产的报道。
[0007] 菌种是抗生素生产的
基础，多年来人们对抗生素的菌种改良主要集中在菌株生产能力的提高上，本发明以S.hygroseopics NRRL 5491菌株为出发菌株，采用紫外诱变原生质体的方法进行雷帕霉素高产菌株的选育，不仅可以改善诱变育种菌株的遗传性状、提高雷帕霉素的产量，在遗传育种的方向性和自觉性上都要优于传统育种。
发明内容
[0008] 本发明提供一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺，其特征是，所述微生物为吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145。
[0009] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，包括以下步骤：
[0010] 步骤一、先在斜面培养基中培养吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145，至斜面菌苔表面出现吸水黑斑，然后用接种铲从斜面上取一环菌种转接于新鲜
种子培养基中进行培养；
[0011] 步骤二、将经所述种子培养基中培养的菌株按照2％的接种量接种至新鲜的发酵培养基中进行发酵培养，得到含有雷帕霉素的发酵液。
[0012] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，在步骤二之后还包括步骤三：利用高帕霉素在水和
有机溶剂中的
溶解度差异，分离和纯化发酵液中的雷帕霉素。
[0013] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，所述斜面培养基中培养条件：
温度26～30℃，培养时间14～16天。
[0014] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，所述种子培养条件：温度26～30℃，菌株于锥形瓶中在转数180～220rmp的摇床中振摇培养，培养时间55～65hr。
[0015] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，所述种子培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为：可溶性
淀粉9.5～10.5，蛋白胨5.5～6.5，
酵母提取物5.5～6.5，酸
水解酪1.0～2.0，其余为水。
[0016] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，所述发酵培养条件是：100L的
发酵罐内装50～70L经灭菌的发酵培养基，发酵温度26～30℃，通气量0.5v/min，搅拌速度230～270rmp，发酵3～6d。
[0017] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，所述发酵培养基组成，重量(g)/体积(L)比，为：
葡萄糖35～45，甘油9～11，黄豆饼9～11，酵母提取物5.0～7.0，蛋白胨，L-Lysine0.1～0.2，K2HPO4 4.0～6.0，KH2PO4 4.0～6.0，NaCl 4.0～6.0，MgSO4 1.5～2.5，FeSO4 1.0～2.0，其余为水。
[0018] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，雷帕霉素的分离步骤如下：
[0019] 往所述含雷帕霉素的发酵液中加入0.1％
硅藻土，进入
压滤机过滤，收集滤液，得到湿菌丝体
滤饼，再往湿菌丝体滤饼中搅拌加入1倍体积的甲醇在50℃水浴中提取两次，每次150min，分离出提取溶液，合并提取液和提取溶液，用2倍体积的氯仿对提取液和提取溶液的合并液进行萃取，得到氯仿萃取液，萃取液经
真空浓缩后，得到浓缩液；
[0020] 在1kg所述浓缩液中加入4L甲基叔丁基醚萃取浓缩液，有少量结晶吸出，收集结晶并用500ml甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到雷帕霉素晶体；
[0021] 先用2000ml冷却到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液，再用2份500ml冷却到0-5℃、0.1mol/L的HCl溶液依次洗涤上述所得雷帕霉素晶体，最后用水洗涤上述所得雷帕霉素晶体至呈中性，浓缩所得液体，浓缩液中加入300ml二异丙基醚后浓缩液中有结晶析出，收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤后干燥，得到雷帕霉素粗品。
[0022] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，雷帕霉素的提纯是指将上述所得雷帕霉素粗品溶解后上硅胶柱进行层析纯化，用丙酮的己烷溶液(丙酮30％)进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行浓缩后加入雷帕霉素晶体作为种子，将浓缩液冷却至0-5℃，搅拌1小时后静置结晶，重结晶获得的雷帕霉素产品过滤后干燥获得雷帕霉素终产品。
[0023] 优选的是，所述的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺中，所述吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145，为链霉菌属的吸水链霉菌S.hygroseopics NRRL 5491经过菌体培养、预处理、酶解、紫外诱变得到的。
[0024] 本发明提供的一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺包括以下步骤：
[0025] 1)将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145接种于燕麦-
马铃薯斜面28℃培养15天，直到斜面菌苔表面出现吸水黑斑，再用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，28℃、转速为200rmp的摇床中，培养60hr。
[0026] 2)将以上培养菌株按照2％的接种量转接入100L的发酵罐内，罐内装60L经灭菌的发酵培养基，发酵温度为28℃，通气量为0.5v/min，搅拌速度为250rmp，发酵5d，得到含雷帕霉素的发酵液。
[0027] 3)将所述含雷帕霉素的发酵液中加入0.1％
硅藻土，进入压滤机过滤，收集滤液，得到湿菌丝体滤饼，往湿菌丝体滤饼中搅拌加入1倍体积的甲醇50℃水浴条件下提取两次，每次150min，分离出提取液，合并提取液和滤饼溶液，用2倍体积的氯仿萃取提取液和滤饼溶液的合并液，得到约氯仿萃取液，萃取液经真空浓缩后，得到浓缩液；在1kg所述浓缩液中加入4L甲基叔丁基醚萃取浓缩液，有少量结晶吸出，收集结晶并用500ml甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到雷帕霉素晶体。
[0028] 4)先用2000ml冷却到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液，再用2份500ml冷却到0-5℃、0.1mol/L的HCl溶液依次洗涤上述所得雷帕霉素晶体，最后用水洗涤所得雷帕霉素晶体至呈中性，浓缩所得液体，浓缩液中加入300ml二异丙基醚，浓缩液中有结晶析出，收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤后干燥，得到雷帕霉素粗品。
[0029] 5)将上述所得雷帕霉素粗品溶解后上硅胶柱进行层析纯化，用丙酮的己烷溶液(丙酮30％)进行洗脱，收集含有雷帕霉素的洗脱液，浓缩洗脱液后加入雷帕霉素晶体作为种子，将浓缩液冷却至0-5℃，搅拌1小时后静置结晶，重结晶获得的雷帕霉素产品过滤后干燥获得雷帕霉素终产品。
[0030] 本发明提供的微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺具有以下突出特点：
[0031] 本发明创新性地采用
碱洗和
酸洗的方法除去共存杂质，提高雷帕霉素的分离效果和收率，减少传统活性碳
吸附、
解吸以及多次柱层析的操作，不仅节省时间，也降低分离纯化工序中的消耗成本，更加符合产业化生产的需要。
[0032] 本发明获得一种低成本、高纯度雷帕霉素的生产技术，通过提供低价的原料，可为器官移植患者提供经济上可以接受并且安全、有效的免疫抑制药物。本发明技术具有安全无污染、高纯度、低成本、适于工业生产等特点。
具体实施方式
[0033] 下面通过
实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0034] 吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏号CGMCC No.5145，保藏日期：2011年08月16日。
[0035] 实施例1
[0036] 将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145接种于燕麦-马铃薯斜面28℃培养15天，斜面菌苔表面出现吸水黑斑，此时转接于种子瓶中；用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，28℃、200rmp的条件下培养60hr。其中种子培养基组成，
质量(g)/体积(L)比：可溶性淀粉10.0，蛋白胨6.0，酵母提取物6.0，酸水解酪1.5，其余为水；将以上培养菌株按照2％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温28℃，通气量为0.5v/min，搅拌速度250rmp，发酵3d。其中发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比：葡萄糖40，甘油10，黄豆饼10，酵母提取物6.0，蛋白胨，L-Lysine0.15，K2HPO45.0，KH2PO45.0，NaCl5.0，MgSO42.0，FeSO41.5，其余为水。
[0037] 测定发酵液中的雷帕霉素浓度，为320mg/L。
[0038] 实施例2
[0039] 将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145接种于燕麦-马铃薯斜面28℃培养15天，斜面菌苔表面出现吸水黑斑，此时转接于种子瓶中；用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，28℃、200rmp的条件下培养60hr。其中种子培养基组成，质量(g)/体积(L)比：可溶性淀粉10.0，蛋白胨6.0，酵母提取物6.0，酸水解酪1.5其余为水；将以上培养菌株按照2％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温度28℃，通气量为0.5v/min，搅拌速度250rmp，发酵4d。其中发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比：葡萄糖40，甘油10，黄豆饼10，酵母提取物6.0，蛋白胨，L-Lysine0.15，K2HPO45.0，KH2PO45.0，NaCl5.0，MgSO42.0，FeSO41.5其余为水。
[0040] 测定发酵液中的雷帕霉素浓度，为689mg/L。
[0041] 实施例3
[0042] 将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145接种于燕麦-马铃薯斜面28℃培养15天，斜面菌苔表面出现吸水黑斑，此时转接于种子瓶中；用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，28℃、200rmp的条件下培养60hr。其中种子培养基组成(g/L)包括可溶性淀粉10.0，蛋白胨6.0，酵母提取物6.0，酸水解酪1.5；将以上培养菌株按照2％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温28℃，通气量为0.5v/min，搅拌速度250rmp，发酵5d。其中发酵培养基组成(g/L)包括：葡萄糖40，甘油10，黄豆饼10，酵母提取物6.0，蛋白胨，L-Lysine0.15，K2HPO45.0，KH2PO45.0，NaCl5.0，MgSO42.0，FeSO41.5。
[0043] 测定发酵液中的雷帕霉素浓度，为815mg/L。
[0044] 实施例4
[0045] 将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145接种于燕麦-马铃薯斜面28℃培养15天，斜面菌苔表面出现吸水黑斑，此时转接于种子瓶中；用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，28℃、200rmp的条件下培养60hr。其中种子培养基组成，质量(g)/体积(L)比：可溶性淀粉10.0，蛋白胨6.0，酵母提取物6.0，酸水解酪1.5，其余为水；将以上培养菌株按照2％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温28℃，通气量为0.5v/min，搅拌速度250rmp，发酵6d。其中发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比：葡萄糖40，甘油10，黄豆饼10，酵母提取物6.0，蛋白胨，L-Lysine0.15，K2HPO45.0，KH2PO45.0，NaCl5.0，MgSO42.0，FeSO41.5，其余为水。
[0046] 测定发酵液中的雷帕霉素浓度，为802mg/L。
[0047] 实施例5
[0048] 将100L发酵罐内获得的发酵液中加入0.1％硅藻土，进入压滤机过滤，获得湿菌丝体滤饼，搅拌加入1倍体积的甲醇50℃水浴条件下提取两次，每次120min，合并提取液和滤饼溶液，用2倍体积的氯仿萃取，得到约250L氯仿萃取液，经真空浓缩后，得到1.5kg左右的浓缩液。
[0049] 雷帕霉素粗品的制备是在1kg浓缩液中加入4L甲基叔丁基醚萃取浓缩液，有少量结晶吸出，收集结晶并用500ml甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到38g雷帕霉素(纯度95.1％，产率14％)。用2000ml冷却到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液洗涤，再用2份500ml冷却到0-5℃、0.1mol/L的HCl溶液洗涤，用水洗涤至呈中性，浓缩，浓缩液中加入300ml二异丙基醚，浓缩液中有结晶析出，收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤后干燥，获得131.2g雷帕霉素(纯度85.4％，产率52.3％)。
[0050] 雷帕霉素的精制是收集获得的粗雷帕霉素晶体溶解后上硅胶柱进行层析纯化，洗脱溶液为丙酮的己烷溶液(丙酮30％)，收集含有雷帕霉素的洗脱液，浓缩后加入雷帕霉素晶体作为种子，将溶液冷却至0-5℃，搅拌1小时后静置结晶。重结晶获得的雷帕霉素产品过滤后干燥获得雷帕霉素终产品，经检测产品纯度达到95％以上，重结晶收率在84％以上。
[0051] 实施例6
[0052] 将100L发酵罐内获得的发酵液中加入0.1％硅藻土，进入压滤机过滤，获得湿菌丝体滤饼，搅拌加入1倍体积的甲醇50℃水浴条件下提取两次，每次150min，合并提取液和滤饼溶液，用2倍体积的氯仿萃取，得到约250L氯仿萃取液，经真空浓缩后，得到1.5kg左右的浓缩液。
[0053] 雷帕霉素粗品的制备是在1kg浓缩液中加入4L甲基叔丁基醚萃取浓缩液，有少量结晶吸出，收集结晶并用500ml甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到40g雷帕霉素(纯度95.6％，产率15％)。用2000ml冷却到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液洗涤，再用2份500ml冷却到0-5℃、0.1mol/L的HCl溶液洗涤，用水洗涤至呈中性，浓缩，浓缩液中加入300ml二异丙基醚，浓缩液中有结晶析出，收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤后干燥，获得132.8g雷帕霉素(纯度85.4％，产率52.8％)。
[0054] 雷帕霉素的精制是收集获得的粗雷帕霉素晶体溶解后上硅胶柱进行层析纯化，洗脱溶液为丙酮的己烷溶液(丙酮30％)，收集含有雷帕霉素的洗脱液，浓缩后加入雷帕霉素晶体作为种子，将溶液冷却至0-5℃，搅拌1小时后静置结晶。重结晶获得的雷帕霉素产品过滤后干燥获得雷帕霉素终产品，经检测产品纯度达到95％以上，重结晶收率在84％以上。
[0055] 实施例7
[0056] 将100L发酵罐内获得的发酵液中加入0.1％硅藻土，进入压滤机过滤，获得湿菌丝体滤饼，搅拌加入1倍体积的甲醇50℃水浴条件下提取两次，每次180min，合并提取液和滤饼溶液，用2倍体积的氯仿萃取，得到约250L氯仿萃取液，经真空浓缩后，得到1.5kg左右的浓缩液。
[0057] 雷帕霉素粗品的制备是在1kg浓缩液中加入4L甲基叔丁基醚萃取浓缩液，有少量结晶吸出，收集结晶并用500ml甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到37g雷帕霉素(纯度95.0％，产率14％)。用2000ml冷却到0-5℃，0.1mol/L的NaOH溶液洗涤，再用2份500ml冷却到0-5℃、0.1mol/L的HCl溶液洗涤，用水洗涤至呈中性，浓缩，浓缩液中加入300ml二异丙基醚，浓缩液中有结晶析出，收集结晶固体，用二异丙基醚洗涤后干燥，获得131.1g雷帕霉素(纯度85.3％，产率52.2％)。
[0058] 雷帕霉素的精制是收集获得的粗雷帕霉素晶体溶解后上硅胶柱进行层析纯化，洗脱溶液为丙酮的己烷溶液(丙酮30％)，收集含有雷帕霉素的洗脱液，浓缩后加入雷帕霉素晶体作为种子，将溶液冷却至0-5℃，搅拌1小时后静置结晶。重结晶获得的雷帕霉素产品过滤后干燥获得雷帕霉素终产品，经检测产品纯度达到95％以上，重结晶收率在84％以上。
[0059] 实施例8
[0060] 以链霉菌属的吸水链霉菌S.hygroseopics NRRL 5491为出发菌株，通过经过菌体培养、预处理、酶解、紫外诱变得到发菌株的原生质体吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145。
[0061] 在吸水链霉菌S.hygroseopics NRRL 5491菌丝体生长培养基中添加10％
蔗糖及0.7％甘
氨酸，移种入孢子斜面培养物，于28℃振荡培养(220r/min)46-48h，离心收集菌丝体；再往菌丝体中加入高渗溶液洗涤菌丝体两遍，每遍离心(3000r/min)10min，弃上清液；
每毫升压积菌丝体加入高渗溶液悬浮；采用1.0mg/mL溶菌酶于36℃酶解10h，酶解结束用差速离心除去未酶解的菌丝体，过滤收集原生质体；取原生质体液于培养皿中，置于磁力搅拌器上，用30W紫外灯距离20cm照射20s。
[0062] 实施例9
[0063] 将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus，CGMCC No.5145接种于燕麦-马铃薯斜面26℃培养14天，斜面菌苔表面出现吸水黑斑，此时转接于种子瓶中；用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，26℃、180rmp的条件下培养55hr。其中种子培养基组成，质量(g)/体积(L)比：可溶性淀粉9.5，蛋白胨5.5，酵母提取物5.5，酸水解酪1.0，其余为水；将以上培养菌株按照2％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装50L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温26℃，通气量为0.5v/min，搅拌速度230rmp，发酵5d。其中发酵培养基组成，质量(g)/体积(L)比：葡萄糖35，甘油9，黄豆饼9，酵母提取物5.5，蛋白胨，L-Lysine0.1，K2HPO44.5，KH2PO44.5，NaCl4.5，MgSO4 1.5，FeSO41.0，其余为水。
[0064] 测定发酵液中的雷帕霉素浓度，为765mg/L。
