技术领域
[0001] 本
发明涉及总黄酮提取工艺研究技术领域，具体涉及一种响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法。
背景技术
[0002] 蓝刺头是菊科蓝刺头属的一种多年生宿根草本
植物又名驴欺口、追骨
风，广泛分布于我国东北、华北、西北、华中，蓝刺头的根(漏芦)和花序都可入药，有清
热解毒、排脓消肿、降糖、抗
氧化等功能。蓝刺头的主要活性成分多糖、黄酮类化合物等。其中黄酮类化合物是当前药学研究的热点，是一类具有
预防心
血管疾病、抗病毒、抗
肿瘤、抗衰老、抗菌、抗炎、抗过敏、
镇痛、降血糖等诸多功效的
生物活性物质，现已列为保健食品的一类功能因子。目前国内外对于蓝刺头地上花絮部分的药理研究偏少。关于黄酮类化合物的提取方法报道主要包括
有机溶剂提取法、
碱性稀醇或碱性
水提取、
超滤法、
超声波提取法、
微波提取法和酶法，其中
超声波提取法在黄酮类化合物中提取中运用较多，它既可大大缩短提取时间，又能提高有效成分的得率和原料的利用率。由于蓝刺头中的总黄酮的具有较好的药用价值，因此对其所含的总黄酮进行最佳提取工艺的研究必不可少。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于针对
现有技术的
缺陷和不足，提供一种设计合理的响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法，其采用超声波辅助提取的方法，在单因素试验的
基础上，采用了Box-behnken中心组合设计，使用响应面分析法对蓝刺头总黄酮超声波辅助提取条件进行优化；通过聚丙酰胺对提取后的黄酮进行纯化，并获得蓝刺头总黄酮的最佳提取工艺和更高纯度的黄酮，为更好地开发蓝刺头的药用价值提供合理的实验依据和参考。
[0004] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：它的操作步骤如下：
[0005] 1、材料的准备：
[0006] 1.1、材料：蓝刺头采集于鄂尔多斯市达拉特旗，由内蒙古农业大学中兽医教研室鉴定；
[0007] 1.2、仪器：
电子分析天平BT125D型，超声波仪KQ-5200B型，UV2000型紫外分光光度计、
旋转蒸发仪20L，
旋转蒸发仪5L，玻璃层析柱，超纯水一体机，
真空干燥箱，真空
泵，中空
纤维素
膜过滤设备；
[0008] 1.3、药品：无水
乙醇，乙酸乙酯，正丁醇，乙醇、氢氧化钠、
硝酸铝、亚硝酸钠，瓶装蒸馏水，
芦丁；
[0009] 2、方法
[0010] 2.1蓝刺头总黄酮的提取与含量测定：
[0011] 标准溶液的制备：取芦丁对照品22.8mg，加无水乙醇超声微热溶解，冷却后用水乙醇定无容至100mL，配置成0.21113mg/mL的溶液，备用；
[0012] 最大吸收峰的确定：精确吸取芦丁对照品溶液1mL，放于25mL容量瓶中，置于25mL容量瓶中，各加蒸馏水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min；在紫外-可见分光光度计上扫描
波长从200nm～800nm之间的吸光度，结果在波长500nm处有最大吸收值；
[0013] 标准曲线的绘制：分别吸取该对照品溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00mL置于25mL容量瓶中，各加蒸馏水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，在500nm处测吸光度值；测定结果计算得直线方程如下：
[0014] Y＝11.374x-0.0095，r＝0.9996，Y为浓度，X为吸光度值；
[0015] 2.2、总黄酮得率如下：提取液的总黄酮含量/原药提取重量
[0016] 2.3、单因素试验：
[0017] 以蓝刺头总黄酮得率为指标，考察提取溶剂浓度、提取
温度、料液比和提取时间各单因素对其得率的影响；研究不同因素对蓝刺头总黄酮得率的影响；
[0018] 2.4、响应面优化试验的设计：绘制Box-Behnken试验设计因素和水平数据表；
[0019] 2.5、蓝刺头总黄酮的纯化：
[0020] 蓝刺头醇提物悬浊液25L，经5kDa中空
纤维素膜过滤，得到滤液和滤渣两部分，滤渣加水重新混悬，摇匀后重复过滤，滤液合并；
[0021] 滤渣以10L水混悬，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相回收乙酸乙酯；
[0022] 水相继续用等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并有机相回收正丁醇，浓缩方法为65℃减压蒸馏，且不断向体系中加入少量去离子水，以降低溶液体系的沸点，浓缩至无正丁醇味；
[0023] 萃取残余水相65℃减压浓缩除去残留的正丁醇，冷却后与前面实验所得的滤液合并，混合均匀待用；
[0024] 用乙醇处理30～80目聚酰胺粉，装填于Φ15cm×100cm玻璃柱中，用去离子
水处理至无醇味，柱体积约10L，将上一步所得水溶液上样于聚酰胺柱，用去离子水洗脱60L，弃去水洗部分，换用乙醇洗脱60L，55℃减压浓缩回收乙醇；
[0025] 将两步处理得到的浓缩液充分混合，转移至不锈
钢托盘中，60摄氏度真空干燥72h，取出
粉碎成粉末状，得到总黄酮；
[0026] 2.6、数据统计与分析：
[0027] 采用Design Expert 8.0
软件对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，通过F值考察，P<0.05，模型及因素的显著性，并根据响应曲面图分析出各因素之间交互作用的显著性，以得出科学的实验结果分析；
[0028] 3、结果与分析
[0029] 3.1、单因素试验结果中乙醇浓度对总黄酮得率的影响：
[0030] 称取原药材粉后加加相应浓度的乙醇溶液50mL后，密封，同时在80W超声波仪中温度50℃，超声1h后，冷却，用相应浓度乙醇补足减失的重量；各取滤液5mL至25mL容量瓶中，以标准曲线建立方法，自“各加蒸馏水至6mL”起，按步骤2.1中方法测定，计算总黄酮的得率，并绘制线性图；
[0031] 根据线性图可知，一定范围内随着乙醇浓度的升高，蓝刺头总黄酮的得率也随之升高，当乙醇浓度为70％时黄酮得率最高，随后随着乙醇浓度升高，黄酮得率反而出现下降趋势；因此，选择60％、70％、80％的乙醇浓度进行响应面分析；
[0032] 3.2、单因素试验结果中提取时间对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0033] 绘制提取时间对蓝刺头总黄酮得率的影的线性图，根据线性图可知，当超声提取时间小于90min时，蓝刺头总黄酮得率随着超声提取时间延长而缓慢逐渐增大，当超声提取时间大于90min时，得率又出现略微下降的趋势，超声提取时间为90min是最适提取时间；因此，选择60min、90min、120min的提取时间进行响应面分析；
[0034] 3.3、单因素试验结果中料液比对蓝刺头总黄酮得率的影响
[0035] 绘制不同料液比对蓝刺头总黄酮得率的影响的线性图，由线性图可知，在一定料液比范围内，随着的料液比的增大，蓝刺头总黄酮得率也随之升高，当料液比达到1:40时，蓝刺头总黄酮得率达到拐点，随着料液比的继续增加，总黄酮得率反而减小，因此综合考虑，选择1:30、1:40、1:50的料液比进行响应面分析；
[0036] 3.4、单因素试验结果中提取温度对蓝刺头总黄酮得率的影响
[0037] 绘制提取温度对蓝刺头总黄酮得率的影响的线性图，由线性图可知，随着超声温度的增加，蓝刺头总黄酮得率也随之逐渐升高，温度升高到60℃时，总黄酮得率达到最大值，为5.76％，然后随着提取温度的继续上升，总黄酮得率反而出现下降趋势；因此，选择50℃、60℃、70℃的提取温度进行响应面分析；
[0038] 3.5、响应面优化试验中二次响应面回归模型的建立与分析：建立响应面法实验设计与结果数据表；
[0039] 3.6、响应面优化试验中乙醇浓度和提取时间的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0040] 绘制乙醇浓度与提取时间对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，由曲面图和等高线图可知，乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率可以达到5.4％-5.6％，此时的乙醇浓度为80％，提取时间为120min；根据曲面图，增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，因此在优化实验方案时，可以将乙醇浓度提高的100％；相反，增加提取时间，总黄酮得率并没有提高；
[0041] 3.7、响应面优化试验中乙醇浓度和料液比的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0042] 绘制乙醇浓度与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图表示乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率为5.4％左右，此时的乙醇浓度为80％，料液比为1:50，根据等高线图可以发现乙醇浓度对得率的影响要高于料液比，同时显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性；增加料液比，黄酮得率没有增加的趋势；
[0043] 3.8、响应面优化试验中乙醇浓度和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0044] 绘制乙醇浓度与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图表示乙醇浓度和提取温度的交互作用下，乙醇浓度和提取温度的交互作用下，得率在5.0％-5.2％范围，等高线图显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，但是温度过高或者过低均不利于得率的提高，最佳温度范围在55-65℃；
[0045] 3.9、响应面优化试验中提取时间和料液比的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响
[0046] 绘制提取时间与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，其中曲面图较为平缓，说明料液比和提取时间的交互作用对得率的影响不大，料液比的影响要高于提取时间，但是增加料液比，黄酮得率的增加量较为缓慢；
[0047] 3.10、响应面优化试验中提取时间和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0048] 绘制提取时间与温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图显示，提取时间与温度对总黄酮得率的影响，温度的影响要高于提取时间，温度在55-60℃范围，得率较高，在4.8％-5.2％范围；
[0049] 3.11、响应面优化试验中料液比和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0050] 绘制料液比与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图显示，料液比与提取温度对总黄酮得率的影响，提取温度要高于料液比的影响，提高料液比对得率的影响不大，而温度在55-60℃范围，得率较高，在4.8％-5.2％范围；
[0051] 上述分析得出，对总黄酮得率的影响：乙醇浓度>温度>料液比>时间，其中乙醇浓度和提取温度对总黄酮的得率影响较大，而增加料液比或者提取时间，对总黄酮的影响较小，因此在优化提取方案时，可将乙醇浓度设置在60％-100％、提取时间为60-120min、料液比为1:30-1:50、提取温度为55-70℃；实验得率取最高值，设置范围为4.5％-100％，此时优化的提取方案为乙醇浓度100％、提取时间为120min、料液比为1:50、提取温度为65.4℃；实验得率为7.18％；
[0052] 3.12、最佳工艺条件的预测和检验
[0053] 模型建立的回归方程为：得率
[0054] ＝10.376-0.18×X1-0.068×X2-0.11×X3+0.18×X4+8.58×10-4×X1×X2+9.25×10-4×X1×X3+2.00×10-4×X1×X4-7.50×10-5×X2×X3+1.42×10-4×X2×X4+4.50×10-4×X3×X4+5.10×10-4×X12+1.36×10-5×X22+4.60×10-4×X32-1.80×10-3×
X42，R2＝0.7468，其中X3为料液比中液体部分的数值；根据回归方程得到的预测值与真实值相比较，残差大多数在0～5％之内，说明模型的预测结果良好；
[0055] 3.13、蓝刺头总黄酮的纯化的标准曲线绘制：
[0056] 精密称定5mg芦丁，置于25ml容量瓶，加入75％乙醇溶解至刻度，配成0.2mg/mL芦丁标液；精密量取标品0mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL置于10mL量瓶中，加5％亚硝酸钠0.3mL，静置6min，再加10％硝酸铝0.3mL，静置6min，最后加4％氢氧化钠4mL，并加入75％乙醇至刻度摇匀，静置15min；紫外510nm处读取吸光度，浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线，该标准曲线中，在0.01～0.08范围内线性关系良好；
[0057] 3.14、蓝刺头总黄酮的纯化的样品测试：
[0058] 平行称取一定量的待测样品三份，溶解于75％乙醇水溶液，定容至10mL，稀释25倍，按照上述方法测试吸光度，取三组数据的平均值，总黄酮含量为84.8％；
[0059] 4、讨论
[0060] 从曲面图上可以得出得率的最高值，从得率最高值可以分别得出每个因素的取值范围，以方便进一步优化实验方案；乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率可以达到5.4％-5.6％，此时的乙醇浓度为80％，提取时间为120min；根据曲面图，增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，因此在优化实验方案时，可以将乙醇浓度提高的100％；乙醇浓度和料液比的交互作用下，得率为5.4％左右，此时的乙醇浓度为80％，料液比为1:50，根据等高线图可以发现乙醇浓度对得率的影响要高于料液比；同时显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性；乙醇浓度和提取温度的交互作用下，得率在5.0％-5.2％范围，登高线图显示乙增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，但是温度过高或者过低均不利于得率的提高，最佳温度范围在55～65℃；料液比和提取时间的交互作用对得率的影响不大；提高料液比和提取时间对得率的影响不大，而温度在55～60℃范围，得率较高，在4.8％-5.2％范围；因此在优化提取方案时，可将乙醇浓度设置在60％～100％、提取时间为60～120min、料液比为1:30～1:50、提取温度为55～70℃；实验得率取最高值，设置范围为4.5％～8％，此时优化的提取方案为乙醇浓度100％、提取时间为120min、料液比为1:50、提取温度为65℃，实验得率为7.18％；同时得到蓝刺头总黄酮得率与各提取条件的二次多项式模型，该模型拟合度较好，在实际应用过程中具有一定的参考价值。
[0061] 采用上述步骤后，本发明的有益效果是：本发明提供了一种响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法，其采用超声波辅助提取的方法，在单因素试验的基础上，采用了Box-behnken中心组合设计，使用响应面分析法对蓝刺头总黄酮超声波辅助提取条件进行优化；通过聚丙酰胺对提取后的黄酮进行纯化，并获得蓝刺头总黄酮的最佳提取工艺和更高纯度的黄酮，为更好地开发蓝刺头的药用价值提供合理的实验依据和参考。
附图说明：
[0062] 图1是本发明中乙醇浓度对总黄酮提取率的影响线性图。
[0063] 图2是本发明中提取时间对总黄酮得率的影响线性图。
[0064] 图3是本发明中料液比对总黄酮得率的影响线性图。
[0065] 图4是本发明中超声温度对总黄酮得率的影响线性图。
[0066] 图5是本发明中乙醇浓度与提取时间对总黄酮得率的影响的曲面图。
[0067] 图6是本发明中乙醇浓度与提取时间对总黄酮得率的影响的等高线图。
[0068] 图7是本发明中乙醇浓度与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图。
[0069] 图8是本发明中乙醇浓度与料液比对总黄酮得率的影响的等高线图。
[0070] 图9是本发明中乙醇浓度与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图。
[0071] 图10是本发明中乙醇浓度与提取温度对总黄酮得率的影响的等高线图。
[0072] 图11是本发明中提取时间与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图。
[0073] 图12是本发明中提取时间与料液比对总黄酮得率的影响的等高线图。
[0074] 图13是本发明中提取时间与温度对总黄酮得率的影响的曲面图。
[0075] 图14是本发明中提取时间与温度对总黄酮得率的影响的等高线图。
[0076] 图15是本发明中料液比与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图。
[0077] 图16是本发明中料液比与提取温度对总黄酮得率的影响的等高线图。
[0078] 图17是本发明中浓度与吸光度的线性关系图。
[0079] 图18是本发明中Box-Behnken试验设计因素和水平数据表。
[0080] 图19是本发明中响应面法试验设计与结果数据表。
[0081] 图20是本发明中各个样品总黄酮含量数据表。具体实施方式：
[0082] 下面将结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0083] 本具体实施方式采用如下技术方案：它的操作步骤如下：
[0084] 1、材料的准备：
[0085] 1.1、材料：蓝刺头采集于鄂尔多斯市达拉特旗，由内蒙古农业大学中兽医教研室鉴定；
[0086] 1.2、仪器：电子分析天平BT125D型(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，超声波仪KQ-5200B型(昆山美美超声仪器有限公司)，UV2000型紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)、旋转蒸发仪20L，旋转蒸发仪5L，玻璃层析柱，超纯水一体机，真空干燥箱，
真空泵，中空纤维素膜过滤设备；
[0087] 1.3、药品：无水乙醇、乙酸乙酯(分析纯)，正丁醇(分析纯)，乙醇(95％)、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等均为国产分析纯，蒸馏水为屈臣氏蒸馏法制备瓶装；芦丁对照品购于中国食品药品检验研究院(UV测试含量以92.6％计，使用前不需要干燥处理)，批号F5PE-ECAN；
[0088] 2、方法
[0089] 2.1蓝刺头总黄酮的提取与含量测定：
[0090] 标准溶液的制备：取芦丁对照品22.8mg，加无水乙醇超声微热溶解，冷却后用水乙醇定无容至100mL，配置成0.21113mg/mL的溶液，备用；
[0091] 最大吸收峰的确定：精确吸取芦丁对照品溶液1mL，放于25mL容量瓶中，置于25mL容量瓶中，各加蒸馏水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL(中国药典规定氢氧化钠试液为4.3％的氢氧化钠溶液)，再加水至刻度，摇匀，放置15min；在紫外-可见分光光度计上扫描波长从200nm～800nm之间的吸光度，结果在波长500nm处有最大吸收值；
[0092] 标准曲线的绘制：分别吸取该对照品溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00mL置于25mL容量瓶中，各加蒸馏水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL(中国药典规定氢氧化钠试液为4.3％的氢氧化钠溶液)，再加水至刻度，摇匀，放置15min，在500nm处测吸光度值；测定结果计算得直线方程：
[0093] Y＝11.374x-0.0095，r＝0.9996，Y为浓度，X为吸光度值
[0094] 2.2、总黄酮得率：
[0095] 提取液的总黄酮含量/原药提取重量
[0096] 2.3、单因素试验：
[0097] 以蓝刺头总黄酮得率为指标，考察提取溶剂浓度、提取温度、料液比和提取时间各单因素对其得率的影响；研究不同因素对蓝刺头总黄酮得率的影响；
[0098] 2.4、响应面优化试验的设计：绘制Box-Behnken试验设计因素和水平数据表，参看图18；
[0099] 2.5、蓝刺头总黄酮的纯化：
[0100] 蓝刺头醇提物悬浊液25L，经5kDa中空纤维素膜过滤，得到滤液和滤渣两部分，滤渣加水重新混悬，摇匀后重复过滤，滤液合并；
[0101] 滤渣以10L水混悬，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相回收乙酸乙酯；
[0102] 水相继续用等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并有机相回收正丁醇，浓缩方法为65℃减压蒸馏，且不断向体系中加入少量去离子水，以降低溶液体系的沸点，浓缩至无正丁醇味；
[0103] 萃取残余水相65℃减压浓缩除去残留的正丁醇，冷却后与前面实验所得的滤液合并，混合均匀待用；
[0104] 用乙醇处理30～80目聚酰胺粉，装填于Φ15cm×100cm玻璃柱中，用去离子水处理至无醇味，柱体积约10L，将上一步所得水溶液上样于聚酰胺柱，用去离子水洗脱60L，弃去水洗部分，换用乙醇洗脱60L，55℃减压浓缩回收乙醇；
[0105] 将两步处理得到的浓缩液充分混合，转移至
不锈钢托盘中，60摄氏度真空干燥72h，取出粉碎成粉末状，得到总黄酮；
[0106] 2.6、数据统计与分析：
[0107] 采用Design Expert 8.0软件对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，通过F值考察((P<0.05)模型及因素的显著性，并根据响应曲面图分析出各因素之间交互作用的显著性，以得出科学的实验结果分析；
[0108] 3、结果与分析
[0109] 3.1、单因素试验结果中乙醇浓度对总黄酮得率的影响：
[0110] 称取原药材粉后加加相应浓度的乙醇溶液50mL后，密封，同时在80W超声波仪中温度50℃，超声1h后，冷却，用相应浓度乙醇补足减失的重量；各取滤液5mL至25mL容量瓶中，以标准曲线建立方法，自“各加蒸馏水至6mL”起，按步骤2.1中方法测定，计算总黄酮的得率，并绘制线性图，结果见图1；
[0111] 由图1可知，根据线性图可知，一定范围内随着乙醇浓度的升高，蓝刺头总黄酮的得率也随之升高，当乙醇浓度为70％时黄酮得率最高，随后随着乙醇浓度升高，黄酮得率反而出现下降趋势；因此，选择60％、70％、80％的乙醇浓度进行响应面分析；
[0112] 3.2、单因素试验结果中提取时间对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0113] 绘制提取时间对蓝刺头总黄酮得率的影的线性图，根据线性图可知，从图2可得，当超声提取时间小于90min时，蓝刺头总黄酮得率随着超声提取时间延长而缓慢逐渐增大，当超声提取时间大于90min时，得率又出现略微下降的趋势，超声提取时间为90min是最适提取时间；因此，选择60min、90min、120min的提取时间进行响应面分析；
[0114] 3.3、单因素试验结果中料液比对蓝刺头总黄酮得率的影响
[0115] 绘制不同料液比对蓝刺头总黄酮得率的影响的线性图，由线性图可知，见图3所示，在一定料液比范围内，随着的料液比的增大，蓝刺头总黄酮得率也随之升高，当料液比达到1:40(g/mL)时，蓝刺头总黄酮得率达到拐点(得率最高)，随着料液比的继续增加，总黄酮得率反而减小，因此综合考虑，选择1:30、1:40、1:50的料液比进行响应面分析；
[0116] 3.4、单因素试验结果中提取温度对蓝刺头总黄酮得率的影响
[0117] 绘制提取温度对蓝刺头总黄酮得率的影响的线性图，由线性图可知，从图4可得，随着超声温度的增加，蓝刺头总黄酮得率也随之逐渐升高，温度升高到60℃时，总黄酮得率达到最大值，为5.76％，然后随着提取温度的继续上升，总黄酮得率反而出现下降趋势；因此，选择50℃、60℃、70℃的提取温度进行响应面分析；
[0118] 3.5、响应面优化试验中二次响应面回归模型的建立与分析：建立响应面法实验设计与结果数据表，参看图19；
[0119] 3.6、响应面优化试验中乙醇浓度和提取时间的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0120] 绘制乙醇浓度与提取时间对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，见图5和图6，并根据该两幅图得出，乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率可以达到5.4％-5.6％，此时的乙醇浓度为80％，提取时间为120min；根据曲面图，增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，因此在优化实验方案时，可以将乙醇浓度提高的100％；相反，增加提取时间，总黄酮得率并没有提高(甚至得率降低了)；
[0121] 3.7、响应面优化试验中乙醇浓度和料液比的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0122] 绘制乙醇浓度与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，见图7-图8，该两幅图表示乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率为5.4％左右，此时的乙醇浓度为80％，料液比为1:50，根据等高线图可以发现乙醇浓度对得率的影响要高于料液比，同时显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性；增加料液比，黄酮得率没有增加的趋势；
[0123] 3.8、响应面优化试验中乙醇浓度和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0124] 绘制乙醇浓度与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，见图9、图10，该两幅图表示乙醇浓度和提取温度的交互作用下，乙醇浓度和提取温度的交互作用下，得率在5.0％-5.2％范围，等高线图显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，但是温度过高或者过低均不利于得率的提高，最佳温度范围在55-65℃；
[0125] 3.9、响应面优化试验中提取时间和料液比的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响
[0126] 绘制提取时间与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，见图11、图12，其中曲面图较为平缓，说明料液比和提取时间的交互作用对得率的影响不大，料液比的影响要高于提取时间，但是增加料液比，黄酮得率的增加量较为缓慢；
[0127] 3.10、响应面优化试验中提取时间和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0128] 绘制提取时间与温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，见图13、图14，该两幅图显示提取时间与温度对总黄酮得率的影响，温度的影响要高于提取时间，温度在55-60℃范围，得率较高，在4.8％-5.2％范围；
[0129] 3.11、响应面优化试验中料液比和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：
[0130] 绘制料液比与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，见图15、图16，该两幅图显示料液比与提取温度对总黄酮得率的影响，提取温度要高于料液比的影响，提高料液比对得率的影响不大，而温度在55-60℃范围，得率较高，在4.8％-5.2％范围；
[0131] 上述分析得出，对总黄酮得率的影响：乙醇浓度>温度>料液比>时间，其中乙醇浓度和提取温度对总黄酮的得率影响较大，而增加料液比或者提取时间，对总黄酮的影响较小，因此在优化提取方案时，可将乙醇浓度设置在60％-100％、提取时间为60-120min、料液比为1:30-1:50(X3为30-50)、提取温度为55-70℃；实验得率取最高值，设置范围为4.5％-100％，此时优化的提取方案为乙醇浓度100％、提取时间为120min、料液比为1:50、提取温度为65.4℃；实验得率为7.18％；
[0132] 3.12、最佳工艺条件的预测和检验
[0133] 模型建立的回归方程为：得率
[0134] ＝10.376-0.18×X1-0.068×X2-0.11×X3+0.18×X4+8.58×10-4×X1×X2+9.25×10-4×X1×X3+2.00×10-4×X1×X4-7.50×10-5×X2×X3+1.42×10-4×X2×X4+4.50×10-4×X3×X4+5.10×10-4×X12+1.36×10-5×X22+4.60×10-4×X32-1.80×10-3×
X42，R2＝0.7468，其中X3为料液比(1:X3)中液体部分的数值；根据回归方程得到的预测值与真实值相比较，残差大多数在0～5％之内，说明模型的预测结果良好；
[0135] 3.13、蓝刺头总黄酮的纯化的标准曲线绘制：
[0136] 精密称定5mg芦丁，置于25ml容量瓶，加入75％乙醇溶解至刻度，配成0.2mg/mL芦丁标液；精密量取标品0mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL置于10mL量瓶中，加5％亚硝酸钠0.3mL，静置6min，再加10％硝酸铝0.3mL，静置6min，最后加4％氢氧化钠4mL，并加入75％乙醇至刻度摇匀，静置15min；紫外510nm处读取吸光度，浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线，如图17所示，在0.01～0.08范围内线性关系良好；
[0137] 3.14、蓝刺头总黄酮的纯化的样品测试：
[0138] 平行称取一定量的待测样品三份，溶解于75％乙醇水溶液，定容至10mL，稀释25倍，按照上述方法测试吸光度，各个样品的总黄酮如图20所示：取三组数据的平均值，总黄酮含量为84.8％；
[0139] 4、讨论
[0140] 图1-12表示两两因素之间的交互作用对得率的影响；其中从曲面图上可以得出得率的最高值，从得率最高值可以分别得出每个因素的取值范围，以方便进一步优化实验方案；图5可以得出，乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率可以达到5.4％-5.6％，此时的乙醇浓度为80％，提取时间为120min；根据曲面图，增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，因此在优化实验方案时，可以将乙醇浓度提高的100％；图7和图8表示乙醇浓度和料液比的交互作用下，得率为5.4％左右，此时的乙醇浓度为80％，料液比为1:50，根据等高线图可以发现乙醇浓度对得率的影响要高于料液比；同时显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性；图9和图10表示乙醇浓度和提取温度的交互作用下，得率在5.0％-5.2％范围，登高线图显示乙增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，但是温度过高或者过低均不利于得率的提高，最佳温度范围在55～65℃；图11和图12显示，料液比和提取时间的交互作用对得率的影响不大；图13-16显示，提高料液比和提取时间对得率的影响不大，而温度在55～60℃范围，得率较高，在4.8％-5.2％范围；因此在优化提取方案时，可将乙醇浓度设置在
60％～100％、提取时间为60～120min、料液比为1:30～1:50(X3为30-50)、提取温度为55～
70℃；实验得率取最高值，设置范围为4.5％～8％，此时优化的提取方案为乙醇浓度100％、提取时间为120min、料液比为1:50、提取温度为65℃，实验得率为7.18％；同时得到蓝刺头总黄酮得率与各提取条件的二次多项式模型，该模型拟合度较好，在实际应用过程中具有一定的参考价值。
[0141] 采用上述步骤后，本具体实施方式的有益效果如下：本具体实施方式提供了一种响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法，其采用超声波辅助提取的方法，在单因素试验的基础上，采用了Box-behnken中心组合设计，使用响应面分析法对蓝刺头总黄酮超声波辅助提取条件进行优化；通过聚丙酰胺对提取后的黄酮进行纯化，并获得蓝刺头总黄酮的最佳提取工艺和更高纯度的黄酮，为更好地开发蓝刺头的药用价值提供合理的实验依据和参考。
[0142] 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
