核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法专利检索-经预处理的水水处理专利检索查询-专利查询网

核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法

阅读：46发布：2024-02-01

专利汇可以提供核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，涉及一种核桃楸的植株再生方法。本发明是要解决现有核桃楸组织培养器官发生困难、褐化现象严重、诱导率和生根率低的问题。方法：一、对核桃楸合子胚进行预处理；二、取经过预处理的核桃楸合子胚接种于培养基中培养至出现愈伤组织；三、将愈伤组织接种于培养基中，进行光暗交替培养，至长出不定芽；四、将带有不定芽的愈伤组织切成块进行光照培养，进行不定芽伸长，转入培养基中进行不定芽的抽茎；五、将抽茎的不定芽转入培养基中进行不定芽生根；六、炼苗后移栽到温室培养。本方法的愈伤组织诱导率和不定芽诱导率高达100％，不定芽抽茎率和生根率较高，能够显著降低褐化率。用于核桃楸组织培养领域。，下面是核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、对核桃楸合子胚进行预处理；
二、取经过步骤一预处理的核桃楸合子胚接种于仅含有1.0 1.5mg/L噻苯隆、0.5 1.0 ~ ~
mg/L 6-BA 、350mg/L谷氨酰胺、500 mg/L 水解酪蛋白、0.5~1.0g/L Na2S2O3、0.5~1.0g/L PVP、6.0g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS改良培养基中，进行暗培养至出现愈伤组织；
三、将愈伤组织接种于仅含有0.5~1.0 mg/L 6-BA、0.5~1.0g/L Na2S2O3、0.5~1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中，在光照强度为32 36 μmol·m-2·s-1，温度为23 25℃~ ~
的环境中进行光暗交替培养，至长出不定芽；
四、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入仅含有0.1 0.5 mg/L 噻苯隆、0.02 0.04mg/~ ~
L NAA、0.5~1.0g/L Na2S2O3、0.5~1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，每日光照12 14h，在光照强度为32 38 μmol·m-2·s-1，温度为22 24℃的环境中进行光照培养，每~ ~ ~
2 3天继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2 3cm，将其转入仅含有0.05 0.5 ~ ~ ~
mg/L 6-BA、0.05~0.2 mg/L NAA、0.5~1.0g/L Na2S2O3、0.5~1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；
五、将抽茎的不定芽转入仅含有2.0mg/L 吲哚乙酸、1.0mg/L NAA 、6.0g/L琼脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培养基，在光照强度为32 38 μmol·m-2·s-1，温度为22 24℃的环境中，~ ~
进行光照培养以实现不定芽的生根；
六、将根长超过2cm的植株经炼苗2 3 d后移栽到温室培养；
~
步骤三中光暗交替培育的光暗周期为14h/10h；
步骤二、三和四中所述MS改良培养基仅包含以下成分：NH4NO3 1650mg·L-1、KNO3
1900mg·L-1、CaCl2·2H2O440 mg·L-1、MgSO4·7H2O 560 mg·L-1、KH2PO4170mg·L-1、KI
1.66 mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.05 mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.05 mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8 mg·L-1、Na2-EDTA 25.6 mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、盐酸硫胺素 1.0 mg·L-1、烟酸1.0 mg·L-1、盐酸吡哆素0.5 mg·L-1、甘氨酸4.0 mg·L-1和蒸馏水；
步骤五中所述1/2MS改良培养基仅包含以下成分：NH4NO3 825mg·L-1、KNO3 950mg·L-1、CaCl2·2H2O 220 mg·L-1、MgSO4·7H2O 280 mg·L-1、KH2PO4 85mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 11.2 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O
0.25 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、FeSO4·7H2O 13.9 mg·L-1、Na2-EDTA 12.8mg·L-1、肌醇500mg·L-1、盐酸硫胺素 0.5 mg·L-1、烟酸0.5 mg·L-1、盐酸吡哆素0.25 mg·L-1、甘氨酸2.0 mg·L-1和蒸馏水；
步骤一中所述对核桃楸合子胚进行预处理的方法具体为：5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果实表面，然后用流水冲洗1 2h，接着用无菌水冲洗3次，置于2 4℃条件下处理12~ ~ ~
24h，然后移至超净台，利用紫外灯灭菌15 30min，用质量浓度为75%的乙醇溶液浸泡2次，每~
次30s，再用质量浓度为0.1%的HgCl2溶液浸泡5-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，备用。
2.根据权利要求1所述的核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤二所述暗培养的温度为22-25℃。
3.根据权利要求1所述的核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤二所述暗培养的温度为23-24℃。
4. 根据权利要求1所述的核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤三中在光照强度为33 35 μmol·m-2·s-1，温度为24℃的环境中进行光暗交替培养。
~
5. 根据权利要求1所述的核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤六中炼苗移栽的具体方法为：取根长超过2cm的植株，移到自然光下，炼苗2 3 d，然后洗~
去根系上的培养基，栽种到草炭:蛭石=2:1混合基质中，在自然光下培育20 25天，然后移栽~
到土壤中。
6.根据权利要求5所述的核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于所述蛭石经过0.5%高锰酸钾溶液消毒。

说明书全文

核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种核桃楸的植株再生方法。

背景技术

[0002] 核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)为胡桃科核桃属植物，又名胡桃楸、东北核桃，俗称山核桃。产于我国东北、华北各地，由于遭受破坏严重，自然资源大量减少，因而被列为国家Ⅱ级珍稀树种。核桃楸木材质地细韧，色泽淡雅，纹理致密，为家具、建筑等优良用材。其果实山核桃，果仁含脂肪70％以上，风味独特，香味浓郁，既是高热能营养食品，又是补气养血、润肺健脑的绿色保健食品。在我国，早已把核桃楸的幼果、树皮、根皮作为清热解毒、消炎的中药材使用，核桃楸的青皮中含有胡桃醌、黄酮类、萜类等多种有效成分，对治疗肿瘤、冠心病、高血压等疾病具有一定作用。核桃楸的树叶提取物，可以制造杀虫剂，生产绿色环保农药。可以说，核桃楸从根到梢的各个部位都有用，浑身是宝。

[0003] 目前核桃楸主要依靠种子和扦插两种途径繁育，速度慢，人工成本较高。研究核桃楸组培快繁技术已经成为扩大其人工种植种源的重要基础。但由于核桃楸细胞中含有丰富的酚类，因此在组织培养过程中褐化现象十分严重。另外现有的组培快繁方法诱导率和生根率并不高，难以满足核桃楸繁育的需要。

发明内容

[0004] 本发明是要解决现有核桃楸组织培养器官发生困难、褐化现象严重、诱导率和生根率低的问题，提供一种核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法。

[0005] 本发明核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，包括以下步骤：

[0006] 一、对核桃楸合子胚进行预处理

[0007] 5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果实表面，然后用流水冲洗1～2h，接着用无菌水冲洗3次，置于2～4℃条件下处理12～24h，然后移至超净台，利用紫外灯灭菌15～30min，用质量浓度为75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡5-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，备用；

[0008] 二、取经过步骤一预处理的核桃楸合子胚接种于含有1.0～1.5mg/L噻苯隆(TDZ)、0.5～1.0mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L 水解酪蛋白、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～
1.0g/L PVP、6.0g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS改良培养基中，进行暗培养至出现愈伤组织；

[0009] 步骤二所述暗培养的温度为22-25℃；

[0010] 三、将愈伤组织接种于含有0.5～1.0mg/L 6-BA、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中，在光照强度为32～36μmol·m-2·s-1，温度为
23～25℃的环境中进行光暗交替培养，光暗周期为14h/10h，至长出不定芽；

[0011] 四、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.1～0.5mg/L噻苯隆、0.02～0.04mg/LNAA、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，每日光照12～14h，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中进行光照培养，每2～3天继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2～3cm，将其转入含有0.05～0.5mg/L 6-BA、0.05～0.2mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP和
6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；

[0012] 五、将抽茎的不定芽转入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L琼脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培养基，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根；

[0013] 六、将根长超过2cm的植株经炼苗2～3d后移栽到温室培养。

[0014] 步骤六中炼苗移栽的具体方法为：取根长超过2cm的植株，移到自然光下，炼苗2～3d，然后洗去根系上的培养基，栽种到草炭:蛭石＝2:1(v/v)混合基质中，在自然光下培育
20～25天，然后移栽到土壤中。所述蛭石经过0.5％高锰酸钾溶液消毒。

[0015] 所述MS改良培养基包含以下成分：NH4NO3 1650mg·L-1、KNO3 1900mg·L-1、CaCl2·-1 -1 -1 -12H2O440mg·L 、MgSO4·7H2O 560mg·L 、KH2PO4170mg·L 、KI 1.66mg·L 、H3BO3
6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.05mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.05mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1、Na2-EDTA 25.6mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、盐酸硫胺素1.0mg·L-1、烟酸1.0mg·L-1、盐酸吡哆素-1 -1
0.5mg·L 、甘氨酸4.0mg·L 和蒸馏水。

[0016] 所述1/2MS改良培养基包含以下成分：NH4NO3 825mg·L-1、KNO3 950mg·L-1、CaCl2·2H2O 220mg·L-1、MgSO4·7H2O 280mg·L-1、KH2PO4 85mg·L-1、KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 11.2mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1、FeSO4·7H2O
13.9mg·L-1、Na2-EDTA 12.8mg·L-1、肌醇500mg·L-1、盐酸硫胺素0.5mg·L-1、烟酸
0.5mg·L-1、盐酸吡哆素0.25mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1和蒸馏水。

[0017] 本发明的有益效果：

[0018] 本发明建立了高效、稳定的核桃楸不定芽诱导方法，利用本发明方法可解决核桃楸育种周期长、见效慢的问题，为核桃楸的基因工程育种和遗传改良工作奠定基础。

[0019] 本发明以核桃楸的合子胚为外植体进行不定芽的诱导，获得愈伤组织，愈伤组织诱导率和不定芽诱导率高达100％，不定芽抽茎率高达85.36％，而不定芽生根率可达85％以上。本发明方法操作步骤简便可行，能够显著降低褐化程度，褐化率仅为8.9％～10.4％。本发明方法与现有技术相比产生了预料不到的技术效果，这对核桃楸离体培养而言是一大突破，对于核桃楸的大量扩繁和基因工程育种研究具有广泛的应用价值。

具体实施方式

[0020] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

[0021] 具体实施方式一：本实施方式核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，包括以下步骤：

[0022] 一、对核桃楸合子胚进行预处理；

[0023] 二、取经过步骤一预处理的核桃楸合子胚接种于含有1.0～1.5mg/L噻苯隆、0.5～1.0mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP、6.0g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS改良培养基中，进行暗培养至出现愈伤组织；

[0024] 三、将愈伤组织接种于含有0.5～1.0mg/L 6-BA、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中，在光照强度为32～36μmol·m-2·s-1，温度为
23～25℃的环境中进行光暗交替培养，至长出不定芽；

[0025] 四、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.1～0.5mg/L噻苯隆、0.02～0.04mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，每日光照12～14h，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中进行光照培养，每2～3天继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2～3cm，将其转入含有0.05～0.5mg/L 6-BA、0.05～0.2mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na2S2O3、0.5～1.0g/L PVP和
6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；

[0026] 五、将抽茎的不定芽转入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L琼脂和60g/-2 -1L蔗糖的1/2MS改良培养基，在光照强度为32～38μmol·m ·s ，温度为22～24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根；

[0027] 六、将根长超过2cm的植株经炼苗2～3d后移栽到温室培养。

[0028] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述对核桃楸合子胚进行预处理的方法具体为：5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果实表面，然后用流水冲洗1～2h，接着用无菌水冲洗3次，置于2～4℃条件下处理12～24h，然后移至超净台，利用紫外灯灭菌15～30min，用质量浓度为75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡5-10min，然后用无菌水冲洗3-5次，备用。其它与具体实施方式一相同。

[0029] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述暗培养的温度为22-25℃。其它与具体实施方式一或二相同。

[0030] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述暗培养的温度为23-24℃。其它与具体实施方式一或二相同。

[0031] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中在光照强度为33～35μmol·m-2·s-1，温度为24℃的环境中进行光暗交替培养。其它与具体实施方式一至四之一相同。

[0032] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中光暗交替培育的光暗周期为14h/10h。其它与具体实施方式一至五之一相同。

[0033] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤六中炼苗移栽的具体方法为：取根长超过2cm的植株，移到自然光下，炼苗2～3d，然后洗去根系上的培养基，栽种到草炭:蛭石＝2:1混合基质中，在自然光下培育20～25天，然后移栽到土壤中。其它与具体实施方式一至六之一相同。

[0034] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：所述蛭石经过0.5％高锰酸钾溶液消毒。其它与具体实施方式七相同。

[0035] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤二、三和-1 -1四中所述MS改良培养基包含以下成分：NH4NO3 1650mg·L 、KNO3 1900mg·L 、CaCl2·
2H2O440mg·L-1、MgSO4·7H2O 560mg·L-1、KH2PO4170mg·L-1、KI 1.66mg·L-1、H3BO3
6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.05mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.05mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1、Na2-EDTA 25.6mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、盐酸硫胺素1.0mg·L-1、烟酸1.0mg·L-1、盐酸吡哆素
0.5mg·L-1、甘氨酸4.0mg·L-1和蒸馏水。其它与具体实施方式一至八之一相同。

[0036] 具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤五中所述1/2MS改良培养基包含以下成分：NH4NO3 825mg·L-1、KNO3 950mg·L-1、CaCl2·2H2O 220mg·L-1、MgSO4·7H2O 280mg·L-1、KH2PO4 85mg·L-1、KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 11.2mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1、-1 -1 -1
CuSO4·5H2O 0.025mg·L 、CoCl2·6H2O 0.025mg·L 、FeSO4·7H2O 13.9mg·L 、Na2-EDTA 12.8mg·L-1、肌醇500mg·L-1、盐酸硫胺素0.5mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、盐酸吡哆素
0.25mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1和蒸馏水。其它与具体实施方式一至九之一相同。

[0037] 下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0038] 实施例1：

[0039] 本实施例核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，包括以下步骤：

[0040] 一、对核桃楸合子胚进行预处理

[0041] 5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果实表面，然后用流水冲洗2h，接着用无菌水冲洗3次，置于4℃条件下处理12h，然后移至超净台，利用紫外灯灭菌15min，用质量浓度为75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗3次，备用；

[0042] 二、取经过步骤一预处理的核桃楸合子胚接种于含有1.5mg/L噻苯隆、0.5mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5g/L Na2S2O3、1.0g/L PVP、6.0g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS改良培养基中，进行暗培养至出现愈伤组织；所述暗培养的温度为26℃；

[0043] 三、将愈伤组织接种于含有1.0mg/L 6-BA、0.5g/L Na2S2O3、1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中，在光照强度为33μmol·m-2·s-1，温度为24℃的环境中进行光暗交替培养，光暗周期为14h/10h，至长出不定芽；

[0044] 四、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.2mg/L噻苯隆、0.04mg/L NAA、0.5g/L Na2S2O3、1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，每日光照14h，在光照强度为38μmol·m-2·s-1，温度为24℃的环境中进行光照培养，每2天继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2cm，将其转入含有1.0mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、0.5g/L Na2S2O3、
1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；

[0045] 五、将抽茎的不定芽转入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L琼脂和60g/-2 -1L蔗糖的1/2MS改良培养基，在光照强度为38μmol·m ·s ，温度为24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根；

[0046] 六、将根长超过2cm的植株经炼苗3d后移栽到温室培养。

[0047] 步骤六中练苗移栽的具体方法为：取根长超过2cm的植株，移到自然光下，炼苗3d，然后洗去根系上的培养基，栽种到草炭:蛭石＝2:1(v/v)混合基质中，在自然光下培育20天，然后移栽到土壤中。所述蛭石经过0.5％高锰酸钾溶液消毒。移栽成活率达到99％。

[0048] 所述MS改良培养基和1/2MS改良培养基的配方如表1所示。

[0049] 本实施例是方法中愈伤组织诱导率为100％，愈伤组织呈黄色疏松，生长较快。

[0050] 愈伤组织表面有绿色的、颗粒状芽原基产生，且不定芽的诱导率为100％，不定芽生长旺盛，芽点大，呈嫩绿色。

[0051] 本实施例的不定芽抽茎率为85.36％，不定芽生根的诱导率为89.4％，诱导形成的不定根数为2～5条，最长的不定根达5.0-6.0cm。再培养2周左右，不定根上长出许多侧根，这些侧根长达10cm以上，短达2cm左右。

[0052] 本发明方法操作步骤简便可行，能够显著降低褐化程度，褐化率仅为8.9％。

[0053] 从外植体培养至成苗仅用60d左右时间，极大地缩短了植株再生时间，不定芽分化仅需12d，小植株生根仅需6d。

[0054] 实施例2：

[0055] 本实施例核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法，包括以下步骤：

[0056] 一、对核桃楸合子胚进行预处理

[0057] 5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果实表面，然后用流水冲洗2h，接着用无菌水冲洗3次，置于4℃条件下处理12h，然后移至超净台，利用紫外灯灭菌15min，用质量浓度为75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗3次，备用；

[0058] 二、取经过步骤一预处理的核桃楸合子胚接种于含有1.0mg/L噻苯隆、1.0mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5g/L Na2S2O3、1.0g/L PVP、6.0g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS改良培养基中，进行暗培养至出现愈伤组织；所述暗培养的温度为26℃；

[0059] 三、将愈伤组织接种于含有1.0mg/L 6-BA、0.5g/L Na2S2O3、1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中，在光照强度为35μmol·m-2·s-1，温度为24℃的环境中进行光暗交替培养，光暗周期为14h/10h，至长出不定芽；

[0060] 四、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.5mg/L噻苯隆、0.02mg/L NAA、0.5g/L Na2S2O3、1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，每日光照14h，在光照强度为38μmol·m-2·s-1，温度为22℃的环境中进行光照培养，每3天继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2cm，将其转入含有0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、0.5g/L Na2S2O3、
1.0g/L PVP和6.0g/L琼脂的MS改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；

[0061] 五、将抽茎的不定芽转入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L琼脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培养基，在光照强度为38μmol·m-2·s-1，温度为24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根；

[0062] 六、将根长超过2cm的植株经炼苗3d后移栽到温室培养。

[0063] 步骤六中练苗移栽的具体方法为：取根长超过2cm的植株，移到自然光下，炼苗3d，然后洗去根系上的培养基，栽种到草炭:蛭石＝2:1(v/v)混合基质中，在自然光下培育20天，然后移栽到土壤中。所述蛭石经过0.5％高锰酸钾溶液消毒。移栽成活率达到98％。

[0064] 所述MS改良培养基和1/2MS改良培养基的配方如表1所示。

[0065] 本实施例是方法中愈伤组织诱导率为100％，愈伤组织呈黄色疏松，生长较快。

[0066] 愈伤组织表面有绿色的、颗粒状芽原基产生，且不定芽的诱导率为100％，不定芽生长旺盛，芽点大，呈嫩绿色。

[0067] 本实施例的不定芽抽茎率为86.16％，不定芽生根的诱导率为91.22％，诱导形成的不定根数为2～5条，最长的不定根达5.0-6.0cm。再培养2周左右，不定根上长出许多侧根，这些侧根长达10cm以上，短达2cm左右。

[0068] 本发明方法操作步骤简便可行，能够显著降低褐化程度，褐化率仅为9.4％。

[0069] 从外植体培养至成苗仅用60d左右时间，极大地缩短了植株再生时间，不定芽分化仅需12d，小植株生根仅需6d。

[0070] 表1

[0071]

[0072]

标题	发布/更新时间	阅读量
一种基于激光冲击压印技术的仿生表面制备方法	2020-05-17	0
一种煤砖的抛光方法	2020-07-26	1
一种基于视频图像对运动目标检测和平滑跟随的方法	2020-11-23	0
一种MOCVD制程氢氮混合尾气的分离提纯再利用方法	2021-02-05	1
一种松杉灵芝速生栽培方法	2021-10-11	1
抗菌塑料瓶及其制备方法和用途	2021-10-24	1
一种大水分烟叶烘干制丝的干燥方法	2023-05-05	0
一种基于港口群联合调度的防台锚地规模优化方法	2022-01-26	0
一种用于修复龟裂沥青路面的装置	2020-05-11	0
秸秆粉/PLA/PBAT生物质全降解塑料及制备方法	2020-12-04	1

核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法

核桃楸离体培养不定芽诱导植株再生的方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：