一种基于纳米铂探针检测牛乳β-乳球蛋白及其致敏性残基的
方法
技术领域
[0001] 本
发明属于食品分析技术领域，涉及食物过敏原及其致敏性残基含量的高灵敏检测方法。
背景技术
[0002] 牛乳具有丰富的营养物质，也经常添加到其他食品中，是人们日常生活中经常摄入的物质，同时牛乳作为八大类过敏食物之一，牛乳过敏在人群中的发病率为0.3%～7.5%，而在儿童中的发病率达0.1～7.5%，其中在一岁以下的婴幼儿中的发病率达到2%～3%。食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission）、欧洲
食品标签指导委员会（European Food Labeling Directive）和美国食品药品管理局（FDA）都规定食品标签中必须列出各类致敏成分，其中就包括牛乳及乳制品。对食物过敏原的检测是食物过敏管理的关键环节，以便对过敏食物进行
风险评估、生产和标示。牛乳中过敏原成分复杂，其中β-乳球蛋白约占牛
乳蛋白含量的10%，约占
乳清蛋白总量的50%，且IgE介导的牛奶过敏中82%的病人对β-乳球蛋白过敏。因此，开展β-乳球蛋白的检测，是保护牛乳过敏人群合法权益的关键举措，也有利于生产低致敏食品，从而提高牛乳过敏患者的
生活质量。
[0003] 目前，食物过敏原的检测技术有免疫学技术、聚合酶链式反应技术、高效液相色谱技术、液相/质谱联用技术等，其中免疫学技术最成熟、最常用。
抗体在免疫学方法检测食物过敏原中起着关键作用。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，其中单克隆抗体只能识别一个表位，在检测致敏性残基时存在明显不足，抗体制备技术要求较高、价格昂贵，而且一次性难以获得多株识别不同表位的细胞株。而多克隆抗体能识别多个表位，其制备方法简单、经济，能很好的弥补单克隆抗体在抗体制备及检测过敏原肽段的不足。
[0004]
蛋白质的结构决定其功能，作为食物过敏原的蛋白，过敏原表位是引起过敏反应的物质
基础，包括线性表位和构象性表位。食品在加工及工业应用中常常会经过加热、
发酵、酶解等处理，这使过敏原构象性表位易被破坏，但线性表位则相对稳定，不易被破坏。利用表位
疫苗原理，构建牛乳β-乳球蛋白IgE线性表位
串联体，通过原核表达制备表位串联体蛋白，再根据免疫学方法制备表位串联体多克隆抗体。
[0005] 由于金属纳米颗粒具有
比表面积大、易与抗体偶联等特点，被广泛应用于高灵敏检测方法中。目前，应用较多的纳米金属有胶体金、纳米
银、免疫
磁珠、
量子点、纳米铂等，而纳米铂除了具有金属纳米颗粒的特点外，还具有催化H2O2
氧化TMB显色的特点。因此，利用
生物素化β-乳球蛋白多克隆抗体与纳米铂制备纳米铂探针，并建立基于纳米铂探针的酶联
免疫吸附法（ELISA）进行高灵敏地检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量，同时可评价食物样品致敏性的强弱，评估
食品安全风险的高低，也为食品过敏原标示提供更可靠的检测方法。目前，在我国，结合纳米铂的高灵敏和IgE表位多克隆抗体的特异性对食品中过敏原及其致敏性残基的定量检测还是空白。
发明内容
[0006] 本发明的主要目的在于提出
一种基于纳米铂探针检测牛乳β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法，建立一种基于纳米铂探针高灵敏的IgE线性表位识别检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法。该方法准确、灵敏度高、特异性好、回收率高、线性范围宽。
[0007] 本发明的技术方案如下。
[0008] 1、β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的制备。
[0009] 表位疫苗是以
抗原表位为基础制备的疫苗，由B细胞表位、T细胞表位及间隔序列组成。其中B细胞表位用来定向诱导宿主的体液免疫应答，而通过选择特异性的T细胞表位使
机体的细胞免疫应答向特定类型定向发展，间隔序列具有保存表位独立的免疫原性，同时避免产生新的表位。
[0010] 基于表位疫苗设计原理，以牛乳β-乳球蛋白IgE线性表位（B：AA1 8、AA31 48、AA47~ ~60、AA67 78、AA75 86、AA127 144和AA141 152）、T细胞表位（T：AA77 97）及间隔序列（KK与~ ~ ~ ~ ~ ~
G）为基础。通过DNAStar
软件对不同组合串联体的抗原性、表面可及性及亲
水性进行分析，使每个表位的抗原性和亲水性大于0，同时表面可及性大于1；再利用网络
服务器SOMPA对不同组合的串联体二级结构进行分析，使表位形成β转
角和无规则卷曲结构。通过以上生物信息学方法的表位串联体的分析，最终得到的串联体组合为：T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。再合成串联体基因，并通过原核表达制备出牛乳β-乳球蛋白表位串联体重组蛋白。最后，以串联体蛋白为抗原，通过常规方法获得串联体蛋白多克隆抗体。
[0011] 2、串联体多克隆抗体的纯化。
[0012] 首先，把β-乳球蛋白与CNBr-Sepharose 4
B柱材偶联，制备免疫亲和柱。再把抗血清与等体积的PBS混合，将血清缓慢加入Sepharose 4B亲和柱中，室温下孵育30 min，接着循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3 M MgCl2进行特异性洗脱得到牛乳β-乳球蛋白特异性抗体。纯化后，用截留分子量为3 kDa的
超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积。
[0013] 3、串联体多克隆抗体对表位肽的识别。
[0014] 因为实际样品中被检测的牛乳β-乳球蛋白致敏性肽段所包含的
氨基酸数通常要大于表位本身的氨基酸数。因此，为了分析所制备的串联体多克隆抗体的表位的识别能
力，我们设计了表位阻断肽，即在每个IgE表位两端添各加一个氨基酸，并合成这7个IgE表位肽及其阻断肽。采用间接竞争ELISA法分析串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力。将β-乳球蛋白标准品用
碳酸盐缓冲液稀释后，100 μL/孔（板A），4 °C包被过夜，PBST洗三次，每次3 min扣干。另取一
块酶标板（板B），板A与板B中每孔加入250 μL 的3%明胶溶液37 °C封阻。板B封阻1 h后清洗，每孔加入串联体多克隆抗体和浓度梯度的多肽（PBS为对照）各
70 μL，37 °C孵育1 h。板A用PBST清洗3次，从板B中取100 μL抗体与多肽的反应液加入到板B中，37 °C孵育1 h后清洗，每孔加入100 μL OPD显色液，37 °C避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后立即用酶标仪测吸光值。根据吸光值计算不同浓度肽的抑制率，根据抑制率高低可以反映串联体多克隆抗体对不同表位肽和阻断肽识别能力的强弱。
[0015] 4、β-乳球蛋白多克隆抗体的制备。
[0016] 以牛乳β-乳球蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白多克隆抗体。
[0017] 5、β-乳球蛋白多克隆抗体的生物素化。
[0018] 首先，按步骤[0012]对β-乳球蛋白多克隆抗体进行纯化。再把纯化得到的β-乳球蛋白特异性多克隆抗体与长链生物素按1：20的摩尔比混合，
冰浴2 h，再用脱盐柱除去多余的生物素。
[0019] 6、纳米铂探针的制备。
[0020] 取1 mL纳米铂溶液（粒径约为20 nm）10,000×g室温离心15 min，去除上清，加990 μL的PBS（pH 6.5）重悬纳米铂沉淀，再加入10 μL 浓度为1mg/mL的生物素化的β-乳球蛋白多克隆抗体，使抗体与纳米铂质量比为1:100，于4 °C偶联过夜。接着10,000×g室温离心15 min，去除含未标记抗体的上清，加入1 mL保存液（含1% BSA，0.1 % Triton X-100，5%
蔗糖的PBS，pH 6.5）重悬沉淀标记抗体的纳米铂探针。
[0021] 7、基于纳米铂探针夹心ELISA法检测β-乳球蛋白标准曲线的绘制。
[0022] 以串联体多克隆抗体为捕获抗体，标记抗体的纳米铂探针为检测抗体，β-乳球蛋白为检测抗原，采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度。酶标板中每孔加入100 μL碳酸盐稀释的捕获抗体，4 °C包被过夜，PBST洗三次，每次3 min并扣干，每孔加入250 μL 2%的明胶溶液，37 °C封阻0.5 h。清洗后，每孔加入100 μL已知浓度梯度的β-乳球蛋白，37 °C孵育2 h。清洗后，每孔加入100 μL纳米铂探针，37 °C孵育1 h。清洗后，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37 °C孵育0.5 h。清洗后，每孔加入100 μL TMB溶液，
37 °C避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β-乳球蛋白标准曲线。
[0023] 8、样品预处理。
[0024] （1）液态乳制品：取一定量的液态乳制品于离心管中，用低温离心机10,000g，4 °C离心15 min，去除脂肪层和沉淀，取样用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
[0025] （2）粉状乳制品：称一定量的样品用PBS稀释，溶解后离心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
[0026] （3）固态乳制品：称一定量的样品，磨成均匀粉末，取1g 粉末加入到20 mL提取液（20 mmol/L Tris-HCl, 2% Tween-20, pH 8.0），4 °C搅拌过夜提取蛋白。再经10,000×g于4 °C离心10 min，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
[0027] 9、样品检测。
[0028] 将待检测的食品进行预处理，制备检测样。根据上述方法包被捕获抗体、封闭及清洗后，每孔加入100 μL预处理的样品，孵育清洗后，再按[0020]步骤依次加入检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、TMB溶液，经H2SO4终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量。
[0029] 本发明的优点是：1、本发明利用牛乳β-乳球蛋白表位串联体为抗原制备多克隆抗体，具有特异性识别β-乳球蛋白IgE表位的优点；2、本发明利用纳米铂和抗体制备探针，具有高灵敏的优点；3、基于表位抗体及纳米铂探针定量检测乳产品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的夹心ELISA方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、线性范围宽等优点，便于高通量检测；4、本发明所建立的方法将为高通量高灵敏分析检测多种食品中相关过敏原及其致敏性残基提供了一种有效的方法，具有良好的推广和应用前景。
附图说明
[0030] 图1为串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力。B1-B7：表位肽；b1-b7：阻断肽。
[0031] 图2为所建夹心ELISA法检测β-乳球蛋白的标准曲线。
具体实施方式
[0032] 本发明将通过以下具体实例作进一步说明。
[0033]
实施例1：定量检测阳光纯牛奶中过敏原β-乳球蛋白含量。
[0034] 1. 样品预处理。
[0035] 取1 mL阳光纯牛奶10,000×g，4 °C离心15min，去除脂肪，上清用封阻液稀释10,000倍后作为检测样。
[0036] 2. 样品检测。
[0037] （1）包被：串联体多克隆抗体用包被液稀释至3.5 μg/mL后，每孔加100 μL，4 °C包被过夜。
[0038] （2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0039] （3）封阻：用PBS配2%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0040] （4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在0.49–16,000 ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100 μL标准品/样品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0041] （5）加检测抗体：用封阻液将纳米铂探针稀释200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
[0042] （6）加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：用封阻液将加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育0.5 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
[0043] （7）加显色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
[0044] （8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收
波长为450 nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
[0045] 3. 结果。
[0046] 检测标准曲线方程为y=0.26185x+0.1936，r2=0.99898，灵敏度为0.12 ng/mL。阳光纯牛奶中β-乳球蛋白的含量为3.50 mg/mL，而牛乳中β-乳球蛋白的含量约为3-4 mg/mL，说明所建立的检测方法是可行的。
[0047] 实施例2：定量检测雀巢超级能恩部分
水解婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白致敏性残基含量。
[0048] 1. 样品预处理。
[0049] 称取0.2 g雀巢超级能恩部分水解婴幼儿奶粉，加入封阻液并充分溶解，使蛋白浓度为5 mg/mL。10,000×g于4 °C 离心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液将上清稀释至250 μg/mL, 50 μg/mL及10 μg/mL，作为检测样。
[0050] 2. 样品检测。
[0051] （1）包被：串联体多克隆抗体用包被液稀释至3.5 μg/mL后，每孔加100 μL，4 °C包被过夜。
[0052] （2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0053] （3）封阻：用PBS配2%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0054] （4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在0.49–16,000 ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100 μL标准品/样品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0055] （5）加检测抗体：用封阻液将纳米铂探针稀释200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
[0056] （6）加加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：用封阻液将加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育0.5 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
[0057] （7）加显色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
[0058] （8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为450 nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
[0059] 3. 结果。
[0060] 检测标准曲线方程为y=0.26185x+0.1936，r2=0.99898，灵敏度为0.12 ng/mL。雀巢超级能恩部分水解婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量为205.32 mg/kg。
[0061] 实施例3：定量检测Milka Choco Break饼干中β-乳球蛋白含量。
[0062] 1. 样品预处理。
[0063] 把Milka Choco Break饼干磨成粉末，称取1.0 g粉末，加20 mL提取液（20 mmol/L Tris-HCl, 2% Tween-20, pH 8.0），4 °C搅拌过夜提取蛋白。将提取液于10,000 g 4 °C 离心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液将上清稀释1,000倍，作为检测样。
[0064] 2. 样品检测。
[0065] （1）包被：串联体多克隆抗体用包被液稀释至3.5 μg/mL后，每孔加100 μL，4 °C包被过夜。
[0066] （2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0067] （3）封阻：用PBS配2%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0068] （4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在0.49–16,000 ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100 μL标准品/样品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
[0069] （5）加检测抗体：用封阻液将纳米铂探针稀释200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
[0070] （6）加加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：用封阻液将加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育0.5 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
[0071] （7）加显色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
[0072] （8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为450 nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
[0073] 3. 结果。
[0074] 检测标准曲线方程为y=0.26185x+0.1936，r2=0.99898，灵敏度为0.12 ng/mL。Milka Choco Break饼干中β-乳球蛋白的含量为6.25 g/kg。
