技术领域
[0001] 本
发明涉及农业
生物技术领域，尤其是涉及一种耐高温
纤维素降解芽孢杆菌筛选方法及应用方法。
背景技术
[0002]
发酵床养猪技术是根据微生态原理和生物发酵理论，利用
微生物对畜禽粪尿“原位降解”，达到生态环境“零污染”的新型养殖模式。该技术最先在日本出现并获得推广口，近年来在我国得到快速的推广和应用。发酵床养殖技术的关键是养床，其中对
垫料的科学养护与管理显得尤其重要，管理良好的垫料有助于畜禽
粪便的消化与分解，还能延长垫料的使用期来提高养殖效益。
[0003] 但是现在用于养猪发酵床中的菌剂施用于猪粪垫料上时，会受到土著菌的拮抗，不利于垫料的腐熟，另外，现有菌剂对高温耐受能
力有限，若发酵大于60℃则会影响堆肥效果。
[0004] 现在很少有研究从猪粪发酵床生境的原生生物中筛选出高温纤维素降解菌株。以猪粪垫料为菌源筛选的该类菌因为来源于猪粪垫料的土著菌，在制成菌剂后施用于猪粪垫料上时，不会受到土著菌的拮抗，因而更有利于垫料的腐熟。综上，筛选猪粪土著的高效纤维素降解菌，尤其是芽抱杆菌对于纤维素资源化利用尤其重要。
发明内容
[0005] 本发明的发明目的是为了提供一种耐高温纤维素降解芽孢杆菌筛选方法，得到的耐高温纤维素降解芽孢杆菌，对纤维素具有较强降解能力，且产物不会对环境造成污染，最高可在60℃高温下生长繁殖，可制成嗜热发酵床添加菌剂，在猪粪的发酵床领域具备应用前景。
[0006] 本发明还提供了一种耐高温纤维素降解芽孢杆菌在猪粪发酵床中的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 本发明的一种耐高温纤维素降解芽孢杆菌筛选方法，具体步骤为：
[0009] (1)将20wt％猪粪、40wt％木屑、60wt％谷壳混合后，在60℃
温度、60％湿度、pH7.5的条件下发酵二个月，得发酵猪粪锯末；
[0010] (2)以所得的发酵猪粪锯末为菌源样品，取10g发酵锯末置于100mL以CMC-Na为唯一
碳源的富集培养基中，50℃、150rpm恒温培养，得富集液；
[0011] (3)取100μl富集液涂布于CMC-刚果红培养基平板上，之后于50℃
培养箱中倒置恒温培养，5天后观察，平板上出现透明
水解圈，选取降解直径大的菌株直接接种于放有
滤纸条的富集培养基内，待培养基内滤纸条崩解，即为降解能力较强的菌株；
[0012] (4)挑取少量菌株在LB固体培养基上划线直至获得单菌落，再将获得的单菌落在以CMC-Na为唯一碳源的富集培养基上连续培养6代，待菌落形态稳定后，即得纯培菌株，得到的菌株命名为枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus SubtilisSM-5-1)，已于2018年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018415。
[0013] 本发明以自然发酵的猪粪锯末堆为菌源样品，加入高温富集培养基，富集过后以刚果红选择性平板高温筛选，选择降解直径/菌落直径较大的菌株再次高温培养，以滤纸条为纤维素降解指示物，当培养基内指示物崩解，即可得到高效的高温纤维素降解菌，最后进行纯化。通过上述方法，能够有效地筛选到性能稳定的耐高温纤维素降解芽孢杆菌。
[0014] 本发明的耐高温纤维素降解芽孢杆菌不仅对纤维素具备较好的降解能力，且产物不会对环境造成污染，由于其来源于猪粪，作为猪粪土著菌株，能减少与土著菌的抑制作用，对于猪粪的堆肥和发酵床均具备较高的降解能力，同时具备高温耐受性，可制成嗜热发酵床添加菌剂，在猪粪的发酵床领域具备广阔的应用前景。
[0015] 作为优选，以富集培养基总
质量为基准，富集培养基由98％Mandel
营养液和2％的
羧甲基纤维素组成，Mandel营养液中营养盐的组成为：2g/L NaNO3，1.5g/L K2HPO4，1.5g/L CaCl2，0.3g/L MgSO4，0.005g/L FeSO4.7H2O，0.0016g/LMnSO4.H2O，0.0014g/L ZnSO4.H2O，0.0005g/L CoCl2，pH5.5；121℃，20min，灭菌。
[0016] 作为优选，所述滤纸条规格为1×6cm。
[0017] 作为优选，所述枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)在60℃的条件下CMCase和FPase活性分别为121.18U/mL和104.14U/mL。
[0018] 作为优选，所述枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)采用-80℃低温冷冻保藏法保藏。
[0019] 一种耐高温纤维素降解芽孢杆菌应用方法，具体步骤为：
[0020] (1)制备发酵床菌剂
[0021] 将枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)接种于LB液体培养基中，24h后将菌液接种至由87wt％的麸皮，10wt％的砻糠，3wt％生石灰，70wt％的水组成的基质中，50℃发酵2d，出料烘干后磨成细粉，即得高温发酵床菌剂。
[0022] (2)发酵
[0023] 先将木屑与砻糠按质量比4:6混合，得垫料；再在垫料中加入猪粪，一立方垫料加8kg，加水调整水分含量为50～60％后得堆料；最后在堆料中添加为堆料质量0.5～1％的高温发酵床菌剂，当堆体温度达到顶峰且逐渐下降至45℃时完成第一次发酵，然后每5-6天翻堆1次，共翻堆3次，即制得生物
有机肥。
[0024] 因此，本发明具有如下有益效果：
[0025] (1)提供了一种耐高温纤维素降解芽孢杆菌筛选方法，得到的耐高温纤维素降解芽孢杆菌，对纤维素具有较强降解能力，且产物不会对环境造成污染，最高可在60℃高温下生长繁殖，可制成嗜热发酵床添加菌剂，在猪粪的发酵床领域具备广阔的应用前景；
[0026] (2)提供了一种耐高温纤维素降解芽孢杆菌应用方法，步骤简单，便于产业化实施。
附图说明
[0027] 图1是
实施例1枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)培养形态图。
[0028] 图2是实施例1中崩解实验的形态图。
具体实施方式
[0029] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
[0030] 实施例1
[0031] (一)菌种筛选
[0032] (1)将20wt％猪粪、40wt％木屑、60wt％谷壳混合后，在60℃温度、60％湿度、pH7.5的条件下发酵二个月，得发酵猪粪锯末；
[0033] (2)以所得的发酵猪粪锯末为菌源样品，取10g发酵锯末置于100mL以CMC-Na为唯一碳源的富集培养基中，50℃、150rpm恒温培养，得富集液，以富集培养基总质量为基准，富集培养基由98％Mandel营养液和2％的羧甲基纤维素组成，Mandel营养液中营养盐的组成为：2g/L NaNO3，1.5g/L K2HPO4，1.5g/LCaCl2，0.3g/L MgSO4，0.005g/L FeSO4.7H2O，0.0016g/L MnSO4.H2O，0.0014g/LZnSO4.H2O，0.0005g/L CoCl2，pH5.5；121℃，20min，灭菌。
[0034] (3)取100μl富集液涂布于CMC-刚果红培养基平板上，之后于50℃培养箱中倒置恒温培养，5天后观察，平板上出现透明水解圈，选取降解直径大的菌株直接接种于放有规格为1×6cm滤纸条的富集培养基内，待培养基内滤纸条崩解，即为降解能力较强的菌株，以富集培养基总质量为基准，富集培养基由98％Mandel营养液和2％的羧甲基纤维素组成，Mandel营养液中营养盐的组成为：2g/L NaNO3，1.5g/L K2HPO4，1.5g/L CaCl2，0.3g/L MgSO4，0.005g/LFeSO4.7H2O，0.0016g/L MnSO4.H2O，0.0014g/L ZnSO4.H2O，0.0005g/L CoCl2，pH5.5；121℃，20min，灭菌。
[0035] (4)挑取少量菌株在LB固体培养基上划线直至获得单菌落，再将获得的单菌落在以CMC-Na为唯一碳源的富集培养基上连续培养6代，待菌落形态稳定后，即得纯培菌株，得到的菌株命名为枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus SubtilisSM-5-1)，已于2018年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018415，以富集培养基总质量为基准，富集培养基由98％Mandel营养液和2％的羧甲基纤维素组成，Mandel营养液中营养盐的组成为：2g/LNaNO3，1.5g/L K2HPO4，1.5g/L CaCl2，0.3g/L MgSO4，0.005g/L FeSO4.7H2O，0.0016g/L MnSO4.H2O，0.0014g/L ZnSO4.H2O，0.0005g/L CoCl2，pH5.5；121℃，20min，灭菌。
[0036] (二)滤纸崩解试验
[0037] 在富集培养基内放置两片规格为1×6cm滤纸条，在其中一片滤纸条上直接接种本发明菌株，接种有菌株的滤纸条崩解成碎片(见图2)，其中，以富集培养基总质量为基准，富集培养基由98％Mandel营养液和2％的羧甲基纤维素组成，Mandel营养液中营养盐的组成为：2g/L NaNO3，1.5g/L K2HPO4，1.5g/L CaCl2，0.3g/L MgSO4，0.005g/L FeSO4.7H2O，0.0016g/L MnSO4.H2O，0.0014g/LZnSO4.H2O，0.0005g/L CoCl2，pH5.5；121℃，20min，灭菌。
[0038] 说明本发明的菌株对纤维素具备较好的降解能力。
[0039] (三)菌种鉴定
[0040] 所得的枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)的16srDNA如下所示：
[0041] AAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGCAAGTGGTAGCTAAAAGCCACCTTTTATGATTGAACCATGCGGTTCAATCAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTGACCTAAGGGAGCAAGCTCCCGTCGGTCCGCTCGACT
[0042] 枯草芽孢杆菌5-1的16SrDNA序列见SEQ ID No.1所示。
[0043] 经过16srDNA测序，鉴定该菌株为枯草芽抱杆菌(Bacillus Subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)，已于2018年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018415。
[0044] (四)产纤维素酶、滤纸酶活力的测定
[0045] 在1.8ml的1％CMC溶液中加入0.2ml粗酶上清液，50℃保温50min。在反应液中加入2ml DNS，沸水浴10min，
冰水冷却。以灭活酶为对照，测550nm处的吸光度。
[0046] 反应体系为
柠檬酸缓冲液(pH 4.8)1.4ml，滤纸屑0.1g,50℃预热10min后，加入0.6ml粗酶液，50℃保温50min。取1ml反应液，加入含2ml DNS液的反应管中，沸水浴10min，冰水终止反应。以灭活酶为对照，测550nm处的吸光度。
[0047] 在上述条件下,每小时催化纤维素水解生成1μmol
葡萄糖的酶量为一个酶活力点为IU。酶活力计算公式为：酶活力单位(U)＝G×n×103/m×t×M(葡萄糖μmol/ml·h·50℃)
[0048] 经测定，该芽抱杆菌在60℃的条件下CMCase和FPase活性分别为121.18U/mL和104.14U/mL。
[0049] (五)具体应用方法
[0050] (1)制备发酵床菌剂
[0051] 将枯草芽孢杆菌SM-5-1(Bacillus Subtilis SM-5-1)接种于LB液体培养基中，24h后将菌液接种至由87wt％的麸皮，10wt％的砻糠，3wt％生石灰，70wt％的水组成的基质中，50℃发酵2d，出料烘干后磨成细粉，即得高温发酵床菌剂。
[0052] (2)发酵
[0053] 先将木屑与砻糠按质量比4:6混合，得垫料；再在垫料中加入猪粪，一立方垫料加8kg，加水调整水分含量为50～60％后得堆料；最后在堆料中添加为堆料质量0.5～1％的高温发酵床菌剂，当堆体温度达到顶峰且逐渐下降至45℃时完成第一次发酵，然后每5-6天翻堆1次，共翻堆3次，即制得生物有机肥。
[0054] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出
权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
