一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法
阅读：774发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法。利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶 水 解 为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量。本发明检测方法线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。，下面是一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法专利的具体信息内容。
1.一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶降解为还原糖，将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量。
2.如权利要求1所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
3.如权利要求2所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：所述κ-卡拉胶酶的最适反应温度为25℃，最适反应pH值为8.0，且在pH 6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月；酶动力学常数Km为0.07mg/mL，Kcat为27.54s-1，Km/Kcat为165.63μM-1s-1。
4.如权利要求2所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：编码上述κ-卡拉胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2或可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。
5.如权利要求1或2所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级或以上纯度的κ-卡拉胶溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的κ-卡拉胶标准溶液；
(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成10-
100mg/mL的pHBH溶液；
(3)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与适量的κ-卡拉胶酶液混合进行反应；反应后使酶灭活；再加入pHBH溶液，进行显色，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值；将相同浓度梯度的κ-卡拉胶溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度κ-卡拉胶溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液浓度为横坐标，以各浓度κ-卡拉胶的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
(4)样品测定：向样品溶液中加入一定量κ-卡拉胶酶重复步骤(3)的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而可得到样品中的κ-卡拉胶含量。
6.如权利要求5所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：步骤(1)中的缓冲液pH为7.0-10.0。
7.如权利要求5所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：步骤(2)中酶的添加量为1-1000U，反应时间为5-40min，反应温度为20-35℃。
8.如权利要求5所述的酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，其特征在于：步骤(4)测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。
一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法
技术领域
背景技术
[0002] 卡拉胶(carrageenan)又称为鹿角菜胶或角叉菜胶，是从角叉菜、麒麟菜、杉藻等红藻的细胞壁中提取的天然阴离子硫酸线性多糖，根据结构中半乳糖上硫酸基的数量与连接位置以及3，6-脱水半乳糖的含量的不同，卡拉胶具有多种类型。κ-卡拉胶是三种常见卡拉胶类型(κ-、ι-和λ-卡拉胶)之一，它由交替的硫酸化-α-D-3,6-脱水半乳糖和硫酸化-β-D-半乳糖残基组成，因来源广泛，功能多样而被应用于食品、药品、化妆品等多项工业生产中，发挥凝固剂、粘合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等作用。
[0003] κ-卡拉胶的定量检测是κ-卡拉胶质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前，常用的κ-卡拉胶定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法等。苯酚-硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但易受样品中其他多糖的干扰，且耗费时间，样品和试剂消耗较多。液相色谱-串联质谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定κ-卡拉胶组成单糖的含量合计得到κ-卡拉胶含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。
[0004] 对羟基苯甲酰肼(pHBH)是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。这就为酶法定量检测κ-卡拉胶提供了可行性。
[0005] 综上所述，找到一种灵敏度高、准确性好、操作简便的κ-卡拉胶定量检测方法具有重大的意义。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是常用的κ-卡拉胶定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法，这两种方法分别具有重现性差和操作繁琐、费时费力的问题。
[0007] 为解决上述问题，本发明提供一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，利用特异性的κ-卡拉胶酶，将κ-卡拉胶特异性的降解为还原糖，利用对羟基苯甲酰肼(pHBH)的显色反应，通过测定400-420nm处的吸光值，测定κ-卡拉胶的含量。
[0008] 为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，利用κ-卡拉胶酶特异性的将κ-卡拉胶降解为κ-卡拉胶四糖及少量二糖。将酶灭活后，加入对羟基苯甲酰肼溶液进行显色反应，离心后测定上清液在400-420nm处的吸光值，对比标准曲线得到κ-卡拉胶含量。
[0009] 进一步的，所述κ-卡拉胶酶为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0010] SEQ ID NO.1：
[0011] TSQNLRPLNAKPGENWTIKWNRSDDFNQSRPNNAVDYGKWQRNPGQVQTWTWDND NNAKEVNGVLNLTARFDDAGADRNIFQNCGGATNDLFYTSAMLKSYSKGVYGYYEAKIK GANLFPGVAPAFWMYSDIDDSLTQEGAIRYSEVDVVEMTQRGNRVSGNEMIMDHNLHAIV TTRNKVTSNGYTFQLDTNGNKIPLTNNEITTNKGRRWFRPGNPEVSHDQENVTGQASDPN RFDPRAAFHTYGCRIDQNWITWYVDNREIGRKANTKWHRPMNVALSLGIRAPYTTFCNNA FALPTRQFALNNQNKFPQTMQVDYIRVWELDGNNTNNNPPTEPIDPPSNNNLPSSGSTINLK ASNNNKFITVVSNNSNTLKTTANSGTGNNQKFTITNTSDGFVSLKSSANNKFVTATSITNSP LRVGASKAFNRQKFRIETSNGKIVLKAKINNKYIVANNNVLEANGNNKNAALKFDITNFSS TANLIKKEETLEISNLK
[0012] 进一步的，该酶的最适反应温度为25℃，常温下即可达到该酶的最大活力，其最适反应 pH值为8.0，且在pH 6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定该酶具有良好的贮存稳定性，在 4℃下可至少稳定贮存3个月。该酶具有良好的反应特异性，对于κ-卡拉胶具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、ι-卡拉胶等均无降解作用。综上，κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa 具有良好的应用潜力，特别是应用于检测κ-卡拉胶含量，具有操作简便、准确度高、稳定性好的特点，且常温下即可反应，从而避免底物在高温下发生改变((ι-和λ-卡拉胶、褐藻胶、琼胶等在高温下会发生降解，产生还原糖，这些降解产物也会与pHBH发生显色反应，导致实际检测结果偏高)，从而影响定量准确性。
[0013] 该酶与其他已知酶的序列相似度最高为40％(最相近序列为Pseudoalteromonas sp.LL1 所产的kappase_P.LL1)。利用MEGA6将Cgk1_Wa与已被注释为GH16家族的κ-卡拉胶酶序列构建系统发育树，结果如图2所示：可以看出κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa处于GH16家族κ-卡拉胶酶的系统发育树中。因此，Cgk1_Wa是κ-卡拉胶酶GH16家族的一个新成员。将κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa氨基酸序列进行Blast分析并利用ClustalX2将Cgk1_Wa与GH16家族已知的 7条κ-卡拉胶酶序列进行多序列比对，结果如图3所示：这7个κ-卡拉胶酶分别是来源于 Pseudoalteromonas carrageenovora的CgkA_P.c(Genbank CAA50624.1)、来源于 Pseudoalteromonas sp.QY203的CgkX_P.QY203(Genbank AFV39914.1)、来源 Pseudoalteromonas tetraodonis的Cgk-K142a_P.t(Genbank BAJ61957.1)、来源于 Pseudoalteromonas sp.LL1的kappase_P.LL1(Genbank ADD92366.1)、来源于Shewanella sp. Kz7的CgkS_S.Kz7(Genbank AHN05534.1)、来源于Zobellia galactanivorans的CgkA_Z.g (Genbank CAZ94309.1)与来源于Zobellia sp.M-2的CgkZ_Z.M-2(GenbankAGS43006.1)。由图3可知，Cgk1_Wa除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，且Blast证实Cgk1_Wa与Pseudoalteromonas sp.LL1所产的kappase_P.LL1序列相比，仅具有 40％的最高相似度，表明Cgk1_Wa是GH16家族中一种新颖的κ-卡拉胶酶。
[0014] 上述κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa对于κ-卡拉胶具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、ι-卡拉胶等均无降解作用。其最适反应温度为25℃，在4℃下可至少稳定贮存30天，其最适反应pH值为8.0，且在pH 6.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定，酶动力学常数Km 为0.07mg/mL，Kcat为27.54s-1，Km/Kcat为165.63μM-1s-1。以上可知，相较于其他κ-卡拉胶酶，本发明的κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，同时对于底物结合的特异性强、酶解速率快，是用于检测κ-卡拉胶定量检测的理想的酶，且常温下即可反应，从而避免底物在高温下发生改变，从而影响定量准确性。
[0015] 进一步的，一种编码上述κ-卡拉胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2或可翻译出 SEQ ID NO.1的所有基因。
[0016] SEQ ID NO.2：
[0017] ACTTCTCAAAATTTAAGACCGCTTAATGCCAAACCTGGAGAAAATTGGACTATCAA ATGGAATCGTTCCGATGATTTTAATCAATCCAGACCAAACAATGCTGTTGATTATGGTAA ATGGCAAAGAAACCCAGGTCAAGTACAAACATGGACTTGGGACAACGACAATAATGCC AAAGAAGTGAATGGTGTTTTAAATTTAACAGCTCGATTTGATGATGCTGGAGCAGATAG AAATATTTTTCAGAATTGTGGTGGTGCTACCAATGATTTATTCTACACATCTGCAATGCTT AAATCTTATTCCAAAGGAGTTTACGGCTATTATGAAGCCAAAATTAAAGGTGCCAATTTG TTTCCTGGTGTAGCTCCTGCATTTTGGATGTATAGTGATATTGATGATAGTTTAACCCAAG AGGGAGCTATTAGATATAGCGAAGTAGATGTGGTAGAAATGACTCAAAGAGGTAACAGA GTAAGTGGTAATGAAATGATTATGGATCATAATTTACACGCTATTGTTACTACCCGTAACA AAGTAACTTCTAACGGTTATACATTTCAATTAGATACTAATGGAAATAAAATTCCTTTGAC CAATAATGAGATAACCACCAACAAGGGACGTAGATGGTTTAGACCTGGAAATCCAGAA GTAAGTCACGACCAAGAAAATGTAACAGGTCAAGCTAGTGATCCTAACAGATTTGATCC TAGAGCTGCATTTCACACATATGGATGTAGAATAGATCAAAATTGGATTACATGGTATGTT GATAACAGAGAAATTGGAAGAAAGGCCAATACAAAATGGCATAGACCTATGAATGTGGC ATTATCTTTAGGGATTAGAGCTCCTTATACTACATTTTGTAACAATGCCTTTGCATTGCCTA CCAGACAGTTTGCCTTAAACAATCAAAATAAGTTTCCACAAACAATGCAAGTTGATTAC ATAAGAGTATGGGAACTAGATGGAAATAATACAAACAACAATCCGCCAACTGAACCTAT AGATCCTCCAAGCAACAACAATTTACCTAGTTCTGGTAGTACTATCAATTTAAAAGCTTC CAATAACAACAAATTTATTACTGTAGTAAGCAACAACAGCAATACATTAAAAACAACGG CTAATAGTGGAACTGGAAACAATCAAAAATTTACAATAACAAACACATCAGATGGCTTT GTTAGCTTAAAATCTTCTGCAAATAATAAATTTGTAACAGCAACTTCTATTACAAATTCCC CCTTAAGAGTAGGAGCTTCTAAAGCTTTTAATAGACAAAAATTTAGAATTGAAACTTCTA ATGGTAAAATTGTATTAAAAGCTAAAATTAACAACAAGTATATTGTAGCAAACAACAATG TATTAGAAGCTAATGGAAATAATAAAAATGCAGCCTTAAAGTTTGACATTACTAATTTTAG TAGCACAGCTAACCTAATTAAAAAAGAAGAAACGTTAGAAATATCTAATCTTAAGAACA ATGTTCTTGTTAAATTAGAGAATACTAATAGTATTAAAAACATTAGTTTGTTTACTCTTTTA GGAAGTTTAATCTATCACAATTCTACCAGTGAAAACAATTTCAACTTACATAAAAATCAA TTTCAAAAAGGTATTTACGTATTAGAAATAAGTTCTAACACAGGAATTAAAACCCAAAA AATAATTATAGATTAA
[0018] 进一步的，所述酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，具体包括以下步骤：
[0019] (1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级或以上纯度的κ-卡拉胶溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的κ-卡拉胶标准溶液；
[0020] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成10-100mg/mL的pHBH溶液；这是因为酸性环境下的浓pHBH试剂较容易贮藏，但是显色必须的碱性环境下显色。
[0021] (3)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与适量的κ- 卡拉胶酶液混合进行反应；反应后于100℃金属浴放置5-10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-420nm；将相同浓度梯度的κ-卡拉胶溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度κ-卡拉胶溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液浓度为横坐标，以各浓度κ-卡拉胶的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
[0022] (4)样品测定：向样品溶液中加入一定量κ-卡拉胶酶重复步骤(3)的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而可得到样品中的κ-卡拉胶含量。
[0023] 进一步的，步骤(1)中的缓冲液pH为7.0-10.0，在该pH范围下，酶活力较高，有利于充分酶解。
[0024] 进一步的，步骤(2)中酶的添加量为1-1000U，反应时间为5-40min，反应温度为20-35℃，Cgk1_Wa在20℃-35℃范围内均有较高酶解活力且能保持稳定；另外在以上参数范围内，κ- 卡拉胶酶特别是Cgk1_Wa均具有较高的酶解活力，保证酶解反应的快速进行；酶的添加量与反应时间需相互对应，加酶量少则增加反应时间，保证样品酶解彻底。
[0025] 进一步的，步骤(4)测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。
[0026] 本发明的有益效果在于：
[0027] (1)本发明提供了一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法，利用κ-卡拉胶酶能在较低温度下特异性的降解样品中的κ-卡拉胶形成还原糖，还原糖可与pHBH发生显色反应，且溶液颜色深浅与还原糖浓度成正比，通过检测反应液反应前后的吸光值增量，即可得知检测样品中的κ-卡拉胶含量。该检测方法线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。
[0028] (2)提供了一种κ-卡拉胶酶，该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为40％。其酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，同时对于底物结合的特异性强、酶解速率快，是用于检测κ- 卡拉胶定量检测的理想的酶。附图说明
[0029] 图1：本发明的κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa纯化后的电泳图；
[0030] 图2：Cgk1_Wa与所有已注释为GH16家族κ-卡拉胶酶构建的系统发育树；其中，黑框为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa；
[0031] 图3：Cgk1_Wa多序列比对结果；其中，黑框为κ-卡拉胶酶的保守残基。
具体实施方式
[0032] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0033] 实施例1：κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa在大肠杆菌中克隆表达及获取
[0034] 在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组 DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’- GACACGGATCCACTTCTCAAAATTTAAGACCGCTTAATGC；5’- GACACCTCGAGTTAATCTATAATTATTTTTTGGGTTTTAATTCC)，以全基因组为模板进行 PCR，PCR反应条件为：95℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃150s，22个循环，最后72℃持续5min，得到了κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa基因片段，连接至DH5α载体，构成重组质粒。将重组质粒导入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。在含卡那霉素的LB培养基中利用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，诱导温度为17℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa的粗酶液。
[0035] 将超声破碎后的胞内上清酶液，以HisTrapTM HP色谱柱对上清液中的目标蛋白进行亲和层析纯化，SDS-PAGE分析结果如图2所示，纯化后酶蛋白为单一条带，表明其纯度良好。纯化后酶的活力为40.28U/mg(1U活力定义为1min内生成1μmol还原糖的活力)。
[0036] 实施例2：κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa在枯草芽孢杆菌中克隆表达及获取
[0037] 在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组 DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’- GTACACGGATCCACTTCTCAAAATTTAAGACCGCTT；5’- TTAGCTCGAGTTAATCTATAATTATTTTTTGGGTTTACCG)，以全基因组为模板如实施例1 进行PCR，得到κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa基因片段，连接至pHT01载体，构成重组质粒。将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并利用异丙基硫代半乳糖苷在LB 培养液中进行诱导表达，诱导温度为38℃，诱导时间为14h。离心收集菌体，加入一定量的 20mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙
6s，循环99次)，离心收集上清，此即为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa的粗酶液。重复实施例 1中纯化操作，获取纯酶液，检测重组酶发酵液的活力为81.61U/mg。
6s，循环99次)，离心收集上清，此即为κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa的粗酶液。重复实施例 1中纯化操作，获取纯酶液，检测重组酶发酵液的活力为81.61U/mg。
[0038] 实施例3：κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa在毕赤酵母中克隆表达及获取
[0039] 在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组 DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’- GGAATGGATCCACTTCTCAAAATTTAAGACCGCTTAA；5’- CCGTATCGAGTTAATCTATAATTATTTTTTGGGTTTTAGGCC)，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到κ-卡拉胶酶Cgk1_Wa基因片段，连接至pPIC9k载体，构成重组质粒，加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中构成重组细胞；筛选阳性克隆并接种于YPD培养基中， 30℃培养20h，然后接种于BMGY培养基，30℃、200rpm下摇床培养至OD600＝2.0，离心收集菌体，弃上清，用BMMY培养基重悬沉淀，29℃下200rpm用甲醇诱导培养72h。诱导结束后，离心收集上清液，即为粗酶液。检测重组酶发酵液的活力为72.24U/mg。
[0040] 实施例4：对本发明方法进行准确性验证
[0041] 利用本发明方法与苯酚-硫酸法测定样品中κ-卡拉胶含量：
[0042] (1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级的κ-卡拉胶溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为0.50mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL、2.00mg/mL、2.50mg/mL的κ-卡拉胶标准溶液；
[0043] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/L HCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/L NaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mL pHBH溶液。
[0044] (3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与100U Cgk1_Wa(缓冲液补足至375μL)于30℃反应20min。反应后于100℃金属浴放置5min使酶灭活，加入250μL pHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在410nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与κ-卡拉胶溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.1468x+0.0072，R2值为0.9994。
[0045] (4)样品测定：称取适量样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL 样品溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.1468x+0.0072，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而折算出样品中的κ-卡拉胶含量。
[0046] (5)根据国标SN/T 4260-2015中苯酚-硫酸法测定样品中的κ-卡拉胶含量。
[0047] 每种方法分别进行三次平行测定，结果如下表所示。
[0048] 本发明方法 苯酚-硫酸法
测定平行1(mg/mL) 10.18 9.91
测定平行2(mg/mL) 9.73 9.70
测定平行3(mg/mL) 9.80 10.08
测定平均值(mg/mL) 9.90 9.90
测定平行1(mg/mL) 10.18 9.91
测定平行2(mg/mL) 9.73 9.70
测定平行3(mg/mL) 9.80 10.08
测定平均值(mg/mL) 9.90 9.90
[0049] 从以上结果可以看出，本发明方法测定结果与苯酚-硫酸法测定结果基本没有偏差，说明本发明方法具有良好的准确性。
[0050] 实施例5：对本发明方法进行定量特异性验证
[0051] 用本发明方法分别对三种混合溶液中的κ-卡拉胶进行定量。
[0052] 步骤一，κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级的κ-卡拉胶溶于pH7.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度为10.00mg/mL的κ-卡拉胶溶液；同时制备浓度均为 10.00mg/mL的琼胶、ι-卡拉胶、褐藻胶溶液；将琼胶、ι-卡拉胶、褐藻胶溶液分别与κ-卡拉胶溶液等体积混匀制备成混合溶液，混合溶液的κ-卡拉胶浓度为5.00mg/mL。
[0053] 步骤二，pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/L HCl中，制备200mg/mL的pHBH 母液，将母液与2mol/L NaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mL pHBH溶液。
[0054] 步骤三，定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与10U Cgk1_Wa(缓冲液补足至375μL)于25℃反应10min。反应后于100℃金属浴放置8min使酶灭活，加入250μL pHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在415nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与κ-卡拉胶溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.1040x+0.0018，R2值为0.9992。
[0055] 步骤四，样品测定：分别取375μL混合溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.1040x+0.0018，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而折算出混合溶液中的κ-卡拉胶含量。
[0056] 平行测定三次，测定结果如下。
[0057] κ-卡拉胶、琼胶 κ-卡拉胶、ι-卡拉胶 κ-卡拉胶、褐藻胶
测定平行1(mg/mL) 5.05 5.08 4.98
测定平行2(mg/mL) 5.02 4.99 5.04
测定平行3(mg/mL) 5.04 4.95 5.04
测定平均值(mg/mL) 5.04 5.01 5.02
相对误差(％) 0.73％ 0.13％ 0.40％
测定平行1(mg/mL) 5.05 5.08 4.98
测定平行2(mg/mL) 5.02 4.99 5.04
测定平行3(mg/mL) 5.04 4.95 5.04
测定平均值(mg/mL) 5.04 5.01 5.02
相对误差(％) 0.73％ 0.13％ 0.40％
[0058] 从以上结果可以看出，本发明方法具有良好的定量特异性。
[0059] 实施例6：测定一款火腿肠中κ-卡拉胶含量
[0060] (1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级的κ-卡拉胶溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为0.5mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL、2.00mg/mL、2.50mg/mL的κ- 卡拉胶标准溶液；
[0061] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/L HCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/L NaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mL pHBH溶液。
[0062] (3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与20U Cgk1_Wa(缓冲液补足至375μL)于35℃反应15min。反应后于100℃金属浴放置10min使酶灭活，加入250μL pHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在410nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与κ-卡拉胶溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.1024x+0.0712，R2值为0.9991。
[0063] (4)样品测定：称取适量样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL 样品溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.1024x+0.0712，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而折算出该火腿肠中的κ-卡拉胶含量为8.12mg/mL。
[0064] 实施例7：测定一款软糖中的κ-卡拉胶含量
[0065] (1)κ-卡拉胶溶液的配制：称取化学级的κ-卡拉胶溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为0.30mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL的κ-卡拉胶标准溶液；
[0066] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/L HCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/L NaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mL pHBH溶液。
[0067] (3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度κ-卡拉胶溶液分别与100U Cgk1_Wa(缓冲液补足至375μL)于30℃反应30min。反应后于100℃金属浴放置7min使酶灭活，加入250μL pHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在415nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与κ-卡拉胶溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以κ-卡拉胶标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.1115x+0.0140，R2值为0.9996。
[0068] (4)样品测定：称取适量样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL 样品溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.1115x+0.0140，计算出反应体系中的κ-卡拉胶浓度，进而折算出该软糖中的κ-卡拉胶含量为17.42mg/mL。
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