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熊果酸类中性胆固醇酯 水解酶抑制剂及其应用

阅读：747发布：2020-05-11

专利汇可以提供熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种熊果酸类中性胆固醇脂水解酶抑制剂及其应用，属生物医药技术领域。该熊果酸类化合物可以强效地、选择性地抑制NCEH1的活性，进而提高羧酸酯类外源性前体药物的口服生物利用度。此类抑制剂可抑制氯吡格雷代谢非活性产物，作为氯吡格雷的增效剂。此类抑制剂还可以通过抑制NCEH1参与脂肪代谢，缓解脂质异位沉积诱导的胰岛素抵抗发展至糖耐量受损。体外活性测定发现该类化合物(3‑羧丙酰基‑熊果酸)抑制NCEH1的IC50可达12纳摩，且其对另一个人体羧酸酯酶(hCE2)没有明显抑制，选择性高达6919倍。此外，该类化合物还具有良好的安全性，制备工艺简单、合成收率高等优势，提示该类化合物显示具有良好的应用前景。，下面是熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂在制备氯吡格雷酯类药物中的应用，其特征在于：以氯吡格雷为探针底物，该类抑制剂结构通式如式(1)所示：
该抑制剂通过作为氯吡格雷酯类药物的增效剂，通过抑制NCEH1的活性减少氯吡格雷非活性代谢产物的生成，进而提高该酯类药物的药理活性。
2.按照权利要求1所述的熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂在制备氯吡格雷酯类药物中的应用，其特征在于该类化合物可择性的强效抑制NCEH1的活性，IC50达12纳摩，抑制羧酸酯酶hCE2的IC50与抑制中性胆固醇酯水解酶NCEH1的IC50比率可达6919倍。

说明书全文

熊果酸类中性胆固醇酯 水解酶抑制剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，主要涉及一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂及其应用。

背景技术

[0002] 中性胆固醇酯水解酶1(Neutral Cholesterol Ester Hydrolase 1,NCEH1)，是人体内分布的一种重要丝氨酸水解酶。NCEH1主要分布在脂肪和肝脏细胞中，其在体内参与胆固醇酯、脂肪酸酯的水解代谢，进而调控人体脂类代谢平衡。近年来国内外研究表明，肥胖和II型糖尿病患者脂肪组织中的NCEH1的活性明显提升，且其与肌肉、肝脏中胰岛素抵抗的发病机制有密切关系(Hepatology,2012；56:2188-2198；Nat Chem Biol,2014；10:113-121)。抑制脂肪细胞中的NCEH1，不仅可减少血浆游离胆固醇和脂肪酸的水平，同时还可通过调控脂类代谢并提高胰岛素的敏感度，进而缓解肥胖和2型糖尿病等代谢病的症状。此外，多数羧酸酯类、酰胺类、硫酯类、氨甲酸酯类的口服前体药物可被胃肠道和肝脏中分布的NCEH1快速水解，在吸收入血之前就被水解成水溶性较大的产物，降低了药物的口服生物利用度。例如，NCEH1可水解多种含有酯键的药物或酯类前药，例如血管转化酶抑制剂(咪达普利，地拉普利)，麻醉剂(哌替啶，可卡因)及心血管药物氯吡格雷。氯吡格雷作为一种羧酸酯前药，约90％的氯吡格雷被hCE1水解为非活性的代谢产物，仅有10％的前药可被细胞色素P450代谢(Am J Ther 2010；17:210-215.)。因此，通过抑制NCEH1的活性，可减少氯吡格雷非活性代谢产物的生成，进而可以起到增强氯吡格雷药效的作用。

[0003] 综上所述，研发安全强效的NCEH1特异性抑制剂，一方面可用于缓解脂质异位沉积诱导的胰岛素抵抗发展至糖耐量受损，另一方面可将其与酯类药物共服，进而降低酯类药物的首过代谢或非活性水解代谢，从而提高生物利用度并改善其体内治疗效果。

发明内容

[0004] 本发明涉及一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)强效抑制剂及其应用，该熊果酸类化合物具有乌苏烷骨架结构，其可以强效地、选择性地抑制NCEH1的活性，进而提高羧酸酯类外源性前体药物的口服生物利用度。此类抑制剂可抑制氯吡格雷代谢非活性产物，作为氯吡格雷的增效剂。此类抑制剂还可以通过抑制NCEH1参与脂肪代谢，缓解脂质异位沉积诱导的胰岛素抵抗发展至糖耐量受损。体外活性测定发现3-羧丙酰基-熊果酸抑制NCEH1的IC50可达12纳摩，且其对另一个人体羧酸酯酶(hCE2)没有明显抑制，选择性高达6919倍，且该类化合物的安全性较好，同时还具有制备工艺简单、收率高等优势，提示该类化合物显示具有良好的应用前景。

[0005] 本发明提供了一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂，其结构通式如式(1)所示：

[0006]

[0007] 其中，R1为羟基、羰基、酯基中的任意一种；R2为羟基、羧基、酯基、酰胺基中的任意一种。

[0008] 一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂，该类化合物可强效地、选择性地抑制NCEH1的活性，抑制NCEH1的IC50可达12纳摩，其抑制人羧酸酯酶2的IC50与抑制中性胆固醇酯水解酶的IC50比率可达6919倍。

[0009] 一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂的应用，该NCEH1抑制剂与酯类前体药物共服时，通过抑制人体胃肠道及肝脏内的NCEH1的活性，减少胃肠水解及首过效应，提高口服酯类前物的生物利用度。

[0010] 一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂的应用，该抑制剂可通过抑制NCEH1的活性减少血浆游离胆固醇和脂肪酸的水平，进而通过调控脂类代谢并提高胰岛素的敏感度，缓解脂质异位沉积诱导的胰岛素抵抗发展至糖耐量受损。

[0011] 一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂的应用，该抑制剂可与部分酯类药物合用并抑制人肠及肝脏内的NCEH1活性，减少酯类药物的首过代谢，提高口服酯类药物的生物利用度。

[0012] 一种熊果酸类中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂，该类抑制剂可作为氯吡格雷等酯类药物的增效剂，其可通过抑制NCEH1的活性减少氯吡格雷非活性代谢产物的生成，进而提高酯类药物的药理活性。

[0013] 本发明提供的熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂在减弱酯类药物的水解代谢，增加活性代谢的应用方面，该类抑制剂的化学成分可以单体或复方与常用辅料混合后制成剂型使用，也可与酯类按不同比例混合后作为药物组合物使用。

[0014] 本发明涉及一种熊果酸类化合物的中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂及其应用，优点如下：

[0015] 1、价廉易得：本发明提供的新型中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂以廉价的熊果酸为原料，经化学合成获得，合成工艺简单易行，收率较高。

[0016] 2、高抑制活性：该新型中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制剂在人组织微粒体中对NCEH1的半数抑制浓度IC50可达12nM。

[0017] 3、高选择性：体外活性测定发现该类化合物抑制羧酸酯酶2的IC50与中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)的IC50比率可达6919。附图说明

[0018] 图1. 3-羧丙酰基-熊果酸的1H-NMR谱图；

[0019] 图2. 3-羰基-熊果酸的1H-NMR谱图；

[0020] 图3. 3-羧丙酰基-熊果酸抑制NCEH1的抑制曲线；

[0021] 图4. 3-羧丙酰基-熊果酸抑制NCEH1的抑制曲线(氯吡格雷为探针底物)；

具体实施方式

[0022] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

[0023] 本发明所采用的设备及其型号为：荧光发射/激发光谱是由SynergyH1全功能微孔1 13
板检测仪检测完成；H-NMR谱图和 C-NMR谱图是由核磁共振波谱仪(Avance II 400MHz)检测完成。

[0024] 实施例1

[0025] 3-羧丙酰基-熊果酸的合成

[0026] 室温，依次将熊果酸(228.4mg,0.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(122.4mg,1.0mmol)、琥珀酸酐(200.2mg,2mmol)加入到二氯甲烷(15mL)溶液中，加完室温搅拌反应，监测反应进程。反应完全后，加水(25mL)，1M HCl溶液调pH＝2-3，乙酸乙酯萃取三次(40mL×3)，合并有机相水洗(30mL×1)、饱和氯化钠溶液洗(25mL×1)，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，粗产物柱1
层析(二氯甲烷/甲醇＝100/1-20/1梯度洗脱)得白色固体，产率60-70％。H-NMR谱图如图1所示。

[0027] 产物的核磁共振波谱具体如下：

[0028] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.04(brs,2H),5.13(s,1H),4.41(dd,J＝11.4,4.7Hz,1H),2.50-2.45(m,4H),2.11(d,J＝11.3Hz,1H),1.99-1.75(m,4H),1.64-1.40(m,11H),
1.34-1.26(m,4H),1.06(s,3H),1.02-0.98(m,2H),0.91(s,6H),0.87-0.85(m,1H),0.81(s,
9H),0.76(s,3H).

[0029] 其结构式如下：实施例2

[0030] 3-羰基-熊果酸的合成

[0031] 室温，将熊果酸(456.7mg,1.0mmol)、溶于丙酮(20mL)溶液中，冷却到0℃，缓慢滴加配制好的三氧化铬的浓硫酸的溶液(三氧化铬：浓硫酸：水＝1.824g：1.57mL：7.6mL)，加完室0℃搅拌反应，监测反应进程。反应完全后，异丙醇淬灭反应，整除丙酮后，加水(30mL)二氯甲烷萃取三次(50mL×3)，合并有机相水洗(30mL×1)、饱和氯化钠溶液洗(30mL×1)，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，粗产物柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20/1-5/1梯度洗脱)得白色固体，产率65-75％。1H-NMR谱图如图2所示。

[0032] 产物的核磁共振波谱具体如下：

[0033] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.26(s,1H),2.64-2.46(m,1H),2.39-2.35(m,1H),2.20(d,J＝11.2Hz,1H),2.07-1.82(m,5H),1.75-1.58(m,4H),1.58-1.19(m,11H),1.13(s,1H),1.09(s,6H),1.06(s,3H),1.03(s,3H),0.96(s,3H),0.86(d,J＝6.4Hz,3H),0.83(s,3H).[0034] 其结构式如下：

[0035] 实施例3

[0036] 熊果酸类化合物对中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制能力的定量评估以D-荧光素甲酯(DME)的水解代谢为探针反应，应用生物发光，借助人肝微粒体体外孵育体系，测定熊果酸类化合物对中性胆固醇酯水解酶(NCEH1)抑制的IC50：

[0037] a.50微升体外代谢反应体系中，含有pH为6.5的磷酸缓冲液，人肝微粒体蛋白浓度为2μg/ml，抑制剂终浓度范围为0.1μM-80μM，于37℃条件下在酶标仪上震荡预孵10分钟；

[0038] b.向反应体系中加入D-荧光素甲酯(DME)底物(终浓度3μM)起始反应，在酶标仪上震荡孵育反应10分钟；

[0039] c.向反应体系中加入Luciferin Detection Reagent(promga，UA)终止反应，应用酶标仪bioluminescence测定30分钟，integration time：1s/孔，gain：135，应用生物发光(bioluminescence)持续进行震荡20分钟，每隔2分钟检测一次在酶标仪检测分析；对水解产物D-荧光素进行定量检测。

[0040] 实施例4

[0041] 熊果酸类化合物对羧酸酯酶2抑制能力的定量评估

[0042] 以对荧光素DDAB(6,8-dichloro-7-oxo-7,9-dihydroacridin-2-yl benzoate)的水解代谢为探针反应，借助人肝微粒体体外孵育体系，测定五环三萜类化合物对羧酸酯酶2抑制的IC50：

[0043] a.200微升体外代谢反应体系中，含有pH为7.4的磷酸缓冲液，人肝微粒体蛋白浓度为5μg/ml，抑制剂终浓度范围为0.5μM-100μM，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

[0044] b.向反应体系中加入DDAB底物(终浓度10μM)，起始反应；于37℃条件下反应15分钟后，加入200μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

[0045] c.采用高速冷冻离心机，在20 000×g的条件下，高速离心上述体系5分钟后，取上清，进行酶标仪检测分析；对代谢水解产物进行定量检测。

[0046] 表1熊果酸类化合物对羧酸酯酶的抑制

[0047]

[0048]

[0049] 熊果酸类化合物对NCEH1呈现出很好的抑制活性，各化合物的半数抑制浓度如表1所示。从所得实验数据可以看出，改造熊果酸(3位羟基酰化或氧化成羰基)可以明显提高其对NCEH1的抑制活性，同时显著增强对NCEH1的选择性。改造后3-羧丙酰基-熊果酸对NCEH1抑制活性可达12纳摩，抑制羧酸酯酶2的IC50与抑制中性胆固醇酯水解酶的IC50比率可达6919。改造后3-羰基-熊果酸对NCEH1抑制活性可达37纳摩，抑制羧酸酯酶2的IC50与抑制中性胆固醇酯水解酶的IC50比率可达258。3-羧丙酰基-熊果酸抑制NCEH1的抑制曲线如图3所示。

[0050] 实施例5

[0051] 3-羧丙酰基-熊果酸缓解伊立替康导致的大鼠腹泻的研究

[0052] 将21只大鼠随机分为三组：A组：伊立替康腹泻模型组、B组：3-羧丙酰基-熊果酸+伊立替康腹泻模型组、C组：正常对照组，每组各7只大鼠。A组大鼠尾静脉注射伊立替康(Pfizer(Perth)Pty Limited，150mg/kg/d)，持续三天给大鼠注射药物，于第四天出现迟发型腹泻现象且腹泻严重，后腹泻逐渐好转，于第九天腹泻彻底消失。C组对照组大鼠尾部注射等体积的生理盐水。B组在注射伊立替康药物前三天开始，每天进行一次3-羧丙酰基-熊果酸200mg/kg灌胃，其余A、C两组大鼠用等体积蒸馏水进行灌胃。分别观察记录A、B、C三组大鼠腹泻体征，对大鼠的肠道组织进行切片检查。

[0053] (1)大鼠的腹泻状况评估

[0054] 注射氯吡格雷后第四天开始观察记录大鼠的腹泻变化，连续观察记录五天，每天早晚各两次：结果如表2所示。

[0055] 表2大鼠的腹泻变化

[0056]

[0057] (2)肠粘膜损伤程度评估

[0058] 于注射CPT-11后d7处死，距回盲瓣5cm处取回肠3cm、盲肠1cm、肛门至上7～9cm取结肠组织3cm，10％甲醛固定，以备光镜观察。大鼠肠组织HE染色切片观察，将在10％的甲醛中固定的小肠组织，进行常规石蜡包埋、切片、酒精梯度脱水、HE染色，观察各组大鼠肠粘膜组织形态变化。肠粘膜损伤程度按Chiu式六级评分法进行组织病理评分(Arch Surg 1970；101:478-83)。

[0059] 对肠黏膜损伤程度评估进行分级，如下表3所示

[0060] 表3肠黏膜损伤程度评估分级表

[0061]级别肠粘膜组织形态变化
1级：层次清晰，结构完整，绒毛排列紧密；
2级：上皮下出现间质水肿，肠绒毛顶端上皮毛细血管充血；
3级上皮下出现间质水肿，上皮层从肠粘膜的固有层分离；
4级：侧面肠粘膜脱落，大部分肠粘膜顶端变光滑；
5级：肠绒毛变光滑，肠粘膜固有层细胞构成增加；
6级：肠粘膜固有层脱落分解，出血并伴有溃疡。

[0062] 光镜下观察各组大鼠盲肠肠粘膜组织结构，发现正常对照组大鼠肠粘膜组织均未见明显变化，而伊立替康模型组大鼠可观察到盲肠和结肠观察到肠壁变厚,粘膜下充血水肿，灶状淋巴细胞浸润，腺体排列不规整等现象。住的注意的是这些变化在3-羧丙酰基-熊果酸组大鼠肠粘膜组织中明显减轻。

[0063] 此外，实验结果显示，3-羧丙酰基-熊果酸(B组)大鼠腹泻评分为1.57，与伊立替康腹泻模型组(A组)2.57相比，腹泻程度明显下降(P＜0.05)。同时，3-羧丙酰基-熊果酸(B组)大鼠重度腹泻的发生率低于模型组(A组)。各组大鼠腹泻情况比较如表4所示。

[0064] 表4各组大鼠腹泻情况比较

[0065]

[0066] 注：与腹泻模型组比较：*P<0.05

[0067] 以上实验结果表明，3-羧丙酰基-熊果酸不仅能够降低大鼠因注射伊立替康而导致的迟发型腹泻和肠粘膜损伤，而且对腹泻的发生有明显的抑制作用。大鼠小肠肠黏膜损伤程度评估发现，B组(3-羧丙酰基-熊果酸组)肠粘膜损伤程度低于A组(模型组)。

[0068] 实施例6

[0069] 3-羧丙酰基-熊果酸对氯吡格雷的抑制动力学研究

[0070] 以氯吡格雷的水解代谢为探针反应，借助人肝微粒体体外孵育体系，通过监测氯吡格雷非活性代谢路径产物氯吡格雷酸的生产速率，考察3-羧丙酰基-熊果酸对氯吡格雷非活性代谢的催化中性胆固醇酯水解酶的半数抑制浓度IC50及抑制动力学常数Ki：

[0071] 1、IC50值的测定

[0072] a.200微升体外代谢反应体系中，含有pH为6.5的磷酸盐缓冲液，人肝微粒体蛋白浓度为20μg/mL，抑制剂3-羧丙酰基-熊果酸终浓度范围分别为0.001μM-100μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

[0073] b.向反应体系中加入氯吡格雷底物(终浓度60μM)，起始反应；于37℃条件下反应60分钟后，加入100μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

[0074] c.采用高速冷冻离心机，在20 000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，在waters TQ-D液质联用仪进行检测定量分析。

[0075] 2、Ki值的测定

[0076] a.200微升体外代谢反应体系中，含有pH为6.5的磷酸盐缓冲液，人肝微粒体蛋白浓度为20μg/ml，底物氯吡格雷的浓度点为：20μM、60μM、120μM、180μM，抑制剂3-羧丙酰基-熊果酸终浓度范围分别为0.001μM-100μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

[0077] b.向反应体系中分别加入不同浓度的氯吡格雷底物起始反应；于37℃条件下反应60分钟后，加入100μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

[0078] c.采用高速冷冻离心机，在20 000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，在waters TQ-D液质联用仪进行检测定量分析。

[0079] 表5 3-羧丙酰基-熊果酸对氯吡格雷非活性代谢的抑制作用

[0080]

[0081] 实验结果如表5所示表明，3-羧丙酰基-熊果酸对参与氯吡格雷非活性代谢的中性胆固醇酯水解酶呈现出较好的抑制活性。从所得实验数据可以看出，3-羧丙酰基-熊果酸可以有效的抑制参与氯吡格雷非活性代谢的中性胆固醇酯水解酶，且抑制半数有效浓度IC50在1μM以下。3-羧丙酰基-熊果酸抑制NCEH1的抑制曲线(氯吡格雷为探针底物)如图4所示。因此，共服该类中性胆固醇酯水解酶抑制剂能够减少氯吡格雷体内代谢的非活性代谢产物的生成，可以作为氯吡格雷的增效剂。

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