一种紫菜多糖酶及其应用
阅读：983发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种紫菜多糖酶及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种紫菜多糖酶及其应用。紫菜多糖酶Por16B_Wf具有新颖的 氨 基酸序列及良好的酶学性质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。以Por16B_Wf为 基础 ，本发明建立了一种紫菜多糖的定量检测方法：将紫菜多糖酶Por16B_Wf与待测样品进行混合反应，使样品中含有的紫菜多糖 水 解 为还原糖，加入对羟基苯甲酰肼(pHBH)与还原糖发生显色反应，将显色吸光值代入标准曲线，即可得知样品中的紫菜多糖的含量。该检测方法具有快速、准确、特异性强等优点。，下面是一种紫菜多糖酶及其应用专利的具体信息内容。
1.一种紫菜多糖酶，其特征在于：为紫菜多糖酶Por16B_Wf，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.如权利要求1所述紫菜多糖酶，其特征在于：所述紫菜多糖酶Por16B_Wf的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为7.0，且在pH 5.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定；该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月，在25℃的温度范围内放置24h后仍能保持90％的初始活力；酶动力学常数Km为2.73mg/mL，Kcat为38.20s-1，Km/Kcat为14μM-1s-1，Vmax为66.23U/mg。
3.权利要求1中所述紫菜多糖酶的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.2及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。
4.权利要求1中所述的紫菜多糖酶的制备与纯化方法。
5.如权利要求1所述的紫菜多糖酶在紫菜多糖定量检测中的应用。
6.一种紫菜多糖的定量检测方法，其特征在于：采用权利要求1中所述的紫菜多糖酶Por16B_Wf与样品反应，测定400-420nm处的吸光值。
7.如权利要求6所述的紫菜多糖的定量检测方法，其特征在于：检测时采用对羟基苯甲酰肼(pHBH)作为显色剂。
8.如权利要求7所述的紫菜多糖的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)紫菜多糖溶液的配制：称取化学级或以上纯度的紫菜多糖溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的紫菜多糖标准溶液；
(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中制备pHBH母液，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成10-100mg/mL的pHBH溶液；
(3)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度紫菜多糖溶液分别与适量的Por16B_Wf酶液混合进行反应，酶的添加量为5-20μL，反应时间为1-30min，反应温度为20-
60℃；反应后于100℃金属浴放置5-10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-
420nm；将相同浓度梯度的紫菜多糖溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度紫菜多糖溶液所对应的吸光值增量；以紫菜多糖标准溶液浓度为横坐标，以各浓度紫菜多糖的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
(4)样品测定：向样品中加入一定量Por16B_Wf重复步骤(3)的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的紫菜多糖浓度，进而可得到样品中的紫菜多糖含量。
9.如权利要求8所述的紫菜多糖的定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中的缓冲液pH为7.0-9.0。
10.如权利要求8所述的紫菜多糖的定量检测方法，其特征在于：步骤(4)测定前根据样品性质对样品进行适当前处理。
一种紫菜多糖酶及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 紫菜具有可食用性且营养价值较高，是目前最具商业价值的海洋藻类之一。紫菜多糖是紫菜中主要的水溶性多糖，存在于细胞壁和细胞间隙中，是一种以(1→4)-6-OSO3-α-L-吡喃半乳糖与(1→3)-β-D-吡喃半乳糖交替组成的线性结构。有研究表明紫菜多糖具有清除活性氧自由基、抑制癌细胞生长、降低胆固醇等多种生理活性。
[0003] 紫菜多糖的定量检测是紫菜多糖质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前，常用的紫菜多糖定量检测方法是苯酚-硫酸法和液相色谱-串联质谱法等。苯酚-硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但其重现性受试验条件影响较大，且耗费时间，样品和试剂消耗较多。液相色谱-串联质谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定紫菜多糖组成单糖的含量合计得到紫菜多糖含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。
[0004] 紫菜多糖酶能特异性降解紫菜多糖。但目前对于紫菜多糖酶的研究较少，迄今为止国内外报道了五种紫菜多糖酶，其中包括国内报道的一种，且目前仅有国内的一种酶有生化性质的研究，但该酶的稳定性较差，失活快，实际应用时具有很大的局限性，会导致较大的实验误差。
[0005] 对羟基苯甲酰肼(pHBH)是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。
[0006] 所以，找到一种特异性强、活力高、稳定性好的紫菜多糖酶，对于紫菜多糖的定量检测具有非常重要的意义。
发明内容
[0007] 本发明要解决的技术问题是已报道的紫菜多糖酶不稳定，失活快，实际应用时具有很大的局限性，限制了采用酶法检测紫菜多糖含量技术的发展。
[0008] 为解决上述问题，本发明提供一种新型紫菜多糖酶Por16B_Wf，该酶与其他已知酶的序列相似度最高为79％(最相近序列为Zobellia galactanivorans所产的PorB)。该酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为7.0，且在pH 5.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定；该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月，在25℃的温度范围内放置24h后仍能保持90％的初始活力。而且该酶具有良好的反应特异性，对于紫菜多糖具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。综上，紫菜多糖酶Por16B_Wf具有良好的应用潜力，特别是应用于检测紫菜多糖含量，具有操作简便、准确度高、稳定性好的特点。
[0009] 为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
[0010] 一种紫菜多糖酶，为紫菜多糖酶Por16B_Wf，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0011] SEQ ID NO.1：
[0012] QQSPTFIDGEDPKPDNTKWKLVKNMSDEFNGTKVDEEKWQISGQGWIGRAPGLFLADNVKVTNGSLQITTTMLPKPIIKNNKEFTHGGGYVGSRNGMTYGYYECEMKANKTFMSSTFWLINEGKNIKGCDKRTTELDIQECVGQITNDAEWMKNFDQAMNSNTHSRNIPEGCNYIKGSEKSGATIGAKVYNDFHVYGVWWKSKDEILFFLDGKFQSKVKPPSDFDIEMYLRMVVETYDWNPVPADGGMAYSKEDRTTTYNWVRSWTLVNPKK
[0013] 该酶与其他已知酶的序列相似度最高为79％(最相近序列为Zobellia galactanivorans所产的PorB)。利用MEGA6将Por16B_Wf与CAZy数据库中的GH16家族紫菜多糖酶序列构建系统发育树，结果如图3所示：可以看出紫菜多糖酶Por16B_Wf处于GH16家族紫菜多糖酶的系统发育树中。因此，Por16B_Wf是紫菜多糖酶GH16家族的一个新成员。将紫菜多糖酶Por16B_Wf氨基酸序列进行Blast分析并利用ClustalX2将Por16B_Wf与GH16家族已报道的4条紫菜多糖酶序列进行多序列比对，结果如图4所示：这4个紫菜多糖酶分别是来源于Bacteroides plebeius DSM 17135的BpGH16B(Genbank EDY95423.1)，来源于Zobellia galactanivorans DsijT的PorB(Genbank CAZ95074.1)，来源于Zobellia galactanivorans DsijT的PorA(Genbank CAZ96750.1)和来源于Wenyingzhuangia T
fucanilytica CZ1127的Por16A_Wf(Genbank WP_068825731.1)，由图4可知，Por16B_Wf除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，表明Por16B_Wf是GH16家族中一种新颖的紫菜多糖酶。
fucanilytica CZ1127的Por16A_Wf(Genbank WP_068825731.1)，由图4可知，Por16B_Wf除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，表明Por16B_Wf是GH16家族中一种新颖的紫菜多糖酶。
[0014] 上述紫菜多糖酶Por16B_Wf对于紫菜多糖具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。其最适反应温度为40℃，其最适反应pH值为7.0，且在pH 5.0-10.0的pH值范围内基本保持稳定；该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月，在25℃的温度范围内放置24h后仍能保持90％的初始活力；酶动力学常数Km为2.73mg/mL，Kcat为38.20s-1，Km/Kcat为14μM-1s-1，Vmax为66.23U/mg。以上可知，相较于其他紫菜多糖酶，本发明的紫菜多糖酶Por16B_Wf酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，同时对于底物结合的特异性强、酶解速率快，是用于紫菜多糖定量检测的理想的酶。
[0015] 一种编码上述紫菜多糖酶Por16B_Wf的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。
[0016] SEQ ID NO.2：
[0017] CAACAGTCACCAACTTTTATTGATGGAGAAGACCCAAAACCAGACAATACAAAATGGAAATTGGTTAAAAATATGTCCGATGAGTTTAATGGTACAAAGGTAGATGAAGAAAAATGGCAAATATCTGGTCAAGGATGGATCGGTAGGGCGCCAGGATTATTTCTTGCTGATAATGTAAAAGTTACAAATGGAAGTTTGCAAATAACCACAACCATGTTGCCAAAACCAATAATAAAAAATAATAAGGAGTTTACGCATGGAGGTGGTTATGTTGGATCTAGAAACGGGATGACTTATGGTTATTATGAGTGTGAAATGAAGGCTAATAAAACATTTATGTCTTCTACTTTTTGGTTGATAAATGAAGGAAAAAACATAAAAGGCTGTGATAAAAGAACCACAGAATTAGACATACAAGAATGCGTTGGACAAATTACAAATGATGCTGAGTGGATGAAAAATTTTGACCAAGCCATGAATTCCAATACACATAGTCGAAATATTCCTGAAGGTTGTAATTATATTAAAGGTTCAGAAAAATCAGGAGCCACTATTGGAGCAAAGGTATATAACGATTTTCACGTGTATGGTGTTTGGTGGAAGTCTAAAGATGAAATACTTTTCTTTTTAGATGGTAAATTTCAATCGAAAGTAAAACCACCATCCGATTTTGATATTGAGATGTATTTAAGAATGGTTGTTGAAACTTATGATTGGAATCCAGTTCCAGCTGATGGTGGAATGGCCTACTCTAAAGAAGATAGAACCACCACTTATAATTGGGTTAGGTCTTGGACATTGGTAAATCCTAAAAAATAA
[0018] 依据上述发现，本发明基于紫菜多糖Por16B_Wf建立了一种紫菜多糖的定量检测方法，采用Por16B_Wf与样品反应，测定400-420nm处的吸光值，具有特异、快速、简便等优点。
[0019] 进一步的，测定时采用对羟基苯甲酰肼(pHBH)作为显色剂。
[0020] 具体包括如下及同等作用步骤：
[0021] (1)紫菜多糖溶液的配制：称取化学级或以上纯度的紫菜多糖溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的紫菜多糖标准溶液；
[0022] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中制备pHBH母液，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成10-100mg/mL的pHBH溶液。这是因为pHBH在碱性条件下与还原端显色而在酸性条件下易于保存；
[0023] (3)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度紫菜多糖溶液分别与适量的Por16B_Wf酶液混合进行反应，酶的添加量为1-1000U，反应时间为1-30min，反应温度为20-60℃，在以上参数范围内，Por16B_Wf均具有较高的酶解活力，保证酶解反应的快速进行；酶的添加量与反应时间需相互对应，加酶量少则增加反应时间，保证样品酶解彻底；Por16B_Wf在20℃-60℃范围内均有较高酶解活力且能保持稳定；反应后于100℃金属浴放置5-
10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-420nm；将相同浓度梯度的紫菜多糖溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度紫菜多糖溶液所对应的吸光值增量；以紫菜多糖标准溶液浓度为横坐标，以各浓度紫菜多糖的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-420nm；将相同浓度梯度的紫菜多糖溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度紫菜多糖溶液所对应的吸光值增量；以紫菜多糖标准溶液浓度为横坐标，以各浓度紫菜多糖的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
[0024] (4)样品测定：向样品溶液中加入一定量Por16B_Wf重复步骤(3)的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的紫菜多糖浓度，进而可得到样品中的紫菜多糖含量。
[0025] 进一步的，步骤(1)中的缓冲液pH为7.0-9.0。Por16B_Wf在pH 6.0-9.0的范围内具有较高的酶解活力及稳定性。
[0026] 进一步的，步骤(4)测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] (1)本发明提供了一种紫菜多糖酶，该酶与其他已知酶的序列相似度最高为79％。其酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，同时对于底物结合的特异性强、酶解速率快，是用于检测紫菜多糖定量检测的理想的酶。
[0029] (2)本发明的紫菜多糖酶对于紫菜多糖具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。
[0030] (3)本发明紫菜多糖的定量检测方法利用紫菜多糖酶降解样品中的紫菜多糖形成还原糖，还原糖可与pHBH发生显色反应，且溶液颜色与还原糖浓度成正比，通过检测反应液反应前后的吸光值增量，即可得知检测样品中的紫菜多糖含量。该检测方法线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。附图说明
[0031] 图1：本发明的紫菜多糖酶Por16B_Wf目的基因电泳图谱；
[0032] 图2：本发明的紫菜多糖酶Por16B_Wf纯化后的电泳图；
[0033] 图3：Por16B_Wf与所有已知GH16家族紫菜多糖酶构建的系统发育树；其中，星号为紫菜多糖酶Por16B_Wf；
[0034] 图4：Por16B_Wf多序列比对结果；其中，黑框内为Por16B_Wf的保守残基。
具体实施方式
[0035] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036] 实施例1：紫菜多糖酶Por16B_Wf在大肠杆菌中克隆表达及获取
[0037] 在2216E培养基中培养Wenyingzhuangiafucanilytica CZ1127T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-GACACGGATCCAAAGACAAAGTAGCAGTAAATGATACTACA；5’-GACACCTCGAGCTATTGATATACTCTTACATAATCTATTTC)，以全基因组为模板进行PCR，PCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 20s，42℃ 22s，72℃ 60s，22个循环，最后72℃持续5min，得到了紫菜多糖酶Por16B_Wf基因片段，连接至pET-28a(+)载体，构成重组质粒。将重组质粒导入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。在含卡那霉素的LB培养基中利用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，诱导温度为17℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为紫菜多糖酶Por16B_Wf的粗酶液。
[0038] 上述得到的粗酶液经HisTrapTM HP纯化及HiTrapTM Desalting脱盐后得到纯化酶液。1U活力定义为1min内生成1μmol还原糖的活力，重组酶发酵液的活力为45.31U/mg。
[0039] 实施例2：紫菜多糖酶Por16B_Wf在枯草芽孢杆菌中克隆表达及获取
[0040] 在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-TGCCAAGTTATTATTCCAACAGTCACCAACTTTTATTG；5’-GTTATGTTAGATCTCTTATTTTTTAGGATTTACCAATGT)，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到紫菜多糖酶Por16B_Wf基因片段，连接至pHT01载体，构成重组质粒。将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并利用异丙基硫代半乳糖苷在LB培养液中进行诱导表达，诱导温度为37℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为紫菜多糖酶Por16B_Wf的粗酶液。重复实施例1中纯化操作，获取纯酶液，检测重组酶发酵液的活力为60.71U/mg。
[0041] 实施例3：紫菜多糖酶Por16B_Wf在毕赤酵母中克隆表达及获取
[0042] 在2216E培养基中培养Wenyingzhuangiafucanilytica CZ1127T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-TAACAGTTATTATTCCAACAGTCACCAACTTTTATTG；5’-TGGATGTTAGATCTCTTATTTTTTAGGATTTACCAATGT)，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到紫菜多糖酶Por16B_Wf基因片段，连接至pPIC9k载体，构成重组质粒，加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中构成重组细胞；筛选阳性克隆并接种于YPD培养基中，30℃培养20h，然后接种于BMGY培养基，30℃、200rpm下摇床培养至OD600＝2.0，离心收集菌体，弃上清，用BMMY培养基重悬沉淀，29℃下200rpm用甲醇诱导培养72h。诱导结束后，离心收集上清液，即为粗酶液。检测重组酶发酵液的活力为82.84U/mg(1U活力定义为1min内生成1μmol还原糖的活力)。
[0043] 实施例4：对本发明方法进行准确性验证
[0044] 利用本发明方法与苯酚-硫酸法测定样品中紫菜多糖含量：
[0045] (1)紫菜多糖溶液的配制：称取化学级的紫菜多糖溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为2.00mg/mL、3.00mg/mL、4.00mg/mL、5.00mg/mL、6.00mg/mL的紫菜多糖标准溶液；
[0046] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/L HCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/LNaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mLpHBH溶液。
[0047] (3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度紫菜多糖溶液分别与10U Por16B_Wf(缓冲液补足至375μL)于35℃反应20min。反应后于100℃金属浴放置10min使酶灭活，加入250μLpHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在415nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与紫菜多糖溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以紫菜多糖标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.2194x+0.1035，R2值为0.9976。
[0048] (4)样品测定：称取适量样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL样品溶液，重复步骤(3)所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.2194x+0.1035，计算出反应体系中的紫菜多糖浓度，进而折算出样品中的紫菜多糖含量。
[0049] (5)根据国标SN/T 4260-2015中苯酚-硫酸法测定样品中的紫菜多糖含量。
[0050] 每种方法分别进行三次平行测定，结果如下表所示。
[0051] 本发明方法 苯酚-硫酸法
测定平行1(mg/mL) 4.96 5.06
测定平行2(mg/mL) 5.04 5.01
测定平行3(mg/mL) 5.00 4.96
测定平均值(mg/mL) 5.00 5.01
测定平行1(mg/mL) 4.96 5.06
测定平行2(mg/mL) 5.04 5.01
测定平行3(mg/mL) 5.00 4.96
测定平均值(mg/mL) 5.00 5.01
[0052] 从以上结果可以看出，本发明方法测定结果与苯酚-硫酸法测定结果基本没有偏差，说明本发明方法具有良好的准确性。
[0053] 实施例5：对本发明方法进行特异性验证
[0054] 用本发明方法分别对三种混合溶液中的紫菜多糖进行定量。
[0055] 步骤一，紫菜多糖溶液的配制：称取化学级的紫菜多糖溶于pH7.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度为8.00mg/mL的紫菜多糖溶液；同时制备浓度均为8.00mg/mL的琼胶、卡拉胶、褐藻胶溶液；将琼胶、卡拉胶、褐藻胶溶液分别与紫菜多糖溶液等体积混匀制备成混合溶液，混合溶液的紫菜多糖浓度为4.00mg/mL。
[0056] 步骤二，pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/LHCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/L NaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mL pHBH溶液。
[0057] 步骤三，定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度紫菜多糖溶液分别与200U Por16B_Wf(缓冲液补足至375μL)于25℃反应15min。反应后于100℃金属浴放置5min使酶灭活，加入250μLpHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在400nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与紫菜多糖溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以紫菜多糖标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.2444x+0.0226，R2值为0.9990。
[0058] 步骤四，样品测定：分别取375μL混合溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.2444x+0.0226，计算出反应体系中的紫菜多糖浓度，进而折算出混合溶液中的紫菜多糖含量。
[0059] 平行测定三次，测定结果如下。
[0060] 紫菜多糖、琼胶 紫菜多糖、卡拉胶 紫菜多糖、褐藻胶
测定平行1(mg/mL) 4.02 4.08 3.98
测定平行2(mg/mL) 4.00 3.99 4.04
测定平行3(mg/mL) 4.04 3.95 4.04
测定平均值(mg/mL) 4.02 4.01 4.02
相对误差(％) 0.5％ 0.25％ 0.5％
测定平行1(mg/mL) 4.02 4.08 3.98
测定平行2(mg/mL) 4.00 3.99 4.04
测定平行3(mg/mL) 4.04 3.95 4.04
测定平均值(mg/mL) 4.02 4.01 4.02
相对误差(％) 0.5％ 0.25％ 0.5％
[0061] 从以上结果可以看出，本发明方法具有良好的特异性。
[0062] 实施例6：测定一种紫菜中的紫菜多糖含量
[0063] (1)紫菜多糖溶液的配制：称取化学级的紫菜多糖溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL的紫菜多糖标准溶液；
[0064] (2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/L HCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/LNaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mLpHBH溶液。
[0065] (3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度紫菜多糖溶液分别与150U Por16B_Wf(缓冲液补足至375μL)于35℃反应25min。反应后于100℃金属浴放置6min使酶灭活，加入250μLpHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在410nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与紫菜多糖溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以紫菜多糖标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.2247x+0.0147，R2值为0.9990。
[0066] (4)样品测定：以市场购得的紫菜为例，称取适量紫菜样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL样品溶液，重复步骤三所述步骤，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.2247x+0.0147，计算出反应体系中的紫菜多糖浓度，进而折算出样品中的紫菜多糖含量。该紫菜样品中紫菜多糖含量为22.43±0.42mg/mL。
[0067] 最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种溴化铈晶体及其制备方法 | 2020-05-08 | 130 |
| 一种路易斯酸催化腈类化合物水解制备羧酸类化合物的方法 | 2020-05-08 | 936 |
| 贵金属钛硅分子筛及其合成方法和应用以及环己烯氧化方法 | 2020-05-08 | 901 |
| 一种烃基亚磺酸锌系列化合物的制备方法 | 2020-05-08 | 877 |
| 熊果酸类中性胆固醇酯水解酶抑制剂及其应用 | 2020-05-11 | 747 |
| 一种基于氮化镁薄膜的光电探测器件及其制备方法 | 2020-05-08 | 810 |
| 一种制备氨基己酸的方法 | 2020-05-08 | 337 |
| 一种表面活性剂的制备方法 | 2020-05-08 | 31 |
| 一种含醋心的巧克力及其制作方法 | 2020-05-08 | 860 |
| 一种酶法定量检测κ-卡拉胶的方法 | 2020-05-08 | 774 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈