本发明涉及医学设备、医学诊断学和细胞计数领域。

微观流体系统已显示用于研究细胞功能、细胞和组织工程改造、疾病诊断、血样制备和药物开发的独特希望。最近，微观流体从全血中分离白细胞亚群的纯群体的用途已吸引了用于即时现场(point-of-care)诊断学的许多兴趣。尽管在细胞分离方法后的原理可以容易地适应于广泛临床应用，但检测这些分离的细胞仍是待解决的技术挑战。

用于检测和定量微型设备内的表面固定细胞的光学显微镜术的使用不代表用于即时现场应用的最佳解决方案。这是因为光学检测方法依赖于可以增加检测的成本和复杂性的稳定光程、透镜作用、滤光和聚焦装置。此外，由于在单次时可用的小检测面积，光学检测趋向于是低通量的。同时，大多数一般使用的细胞计数策略如流式细胞术和阻抗测量(即Coulter计数器)不能应用于附着在表面上的细胞，尽管小型化平台已由几个研究者实现。通过基质阻抗感知检测附着细胞的可替代技术要求在电极表面上的细胞覆盖度达到用于可检测测量的接近一致。仍未报道使用非光学方法检测在相对大体积中的大表面积上的少数细胞的研究-包括甚至微量设备的微升体积，尽管存在关于在微观流体应用中的非光学检测法的需要。

细胞的检测和计数对于医学诊断学特别是AIDS、癌症诊断和病原体检测是基本的。尽管检测细胞的大多数现有方法是光学的(即，显微镜术)，但电检测是明显更简单、更廉价的，并且更顺应即时现场设备。迄今，基于阻抗光谱学(即，由细胞的存在引起的电阻抗中变化的检测)的完整细胞的电检测和计数已证明是非常实际且价廉的，但局限于大细胞群体或同质细胞类型(例如，红细胞的Coulter计数)。

发明概述

在一个方面，本发明的特征在于计数样品中的细胞(例如，哺乳动物、真菌、原生生物或细菌细胞)的方法，这通过下述实现：将样品引入通道内，使通道内的细胞裂解，并且测量起因于裂解的至少一种细胞组分的至少一种性质。在这个方面，细胞组分指示通道中裂解的细胞数目。

在另一个方面，本发明的特征在于计数样品中的细胞(例如哺乳动物、真菌、原生生物(protest)或细菌细胞)的方法，所述方法包括下述步骤：将样品引入通道(例如，微观流体通道)内，将非导电溶液引入通道内(例如，糖溶液)，对通道应用电场，测量通道的阻抗，用裂解性非导电溶液(例如，去污剂溶液)替换非导电溶液，并且允许至少一种细胞裂解，对通道应用电场，并且测量通道的阻抗。在这个方面，裂解后阻抗中的减少指示样品中的细胞数目。在这个方面，例如使用自顶向下(top-down)电极、IDT电极或双轨(two rail)电极测量阻抗。希望地，裂解前非导电溶液的阻抗大于1,000欧姆、大于10,000欧姆、大于100,000欧姆、大于1,000,000欧姆或更大。

在另一个方面，本发明的特征在于诊断受试者中的状况的方法，这通过下述实现：将包含细胞群体(例如，CD4辅助细胞)的样品(例如，人血样)引入通道内，使通道内的细胞群体裂解，并且测量起因于裂解的至少一种细胞组分的至少一种性质。在这个方面，细胞组分指示通道中裂解的细胞数目，并且细胞数目对于状况是在诊断上有价值的。

在另一个方面，本发明的特征在于用于计数细胞的试剂盒，包括设备、非导电溶液(例如，糖溶液)和裂解性非导电溶液(例如，去污剂溶液)。在这个方面，设备包括微观流体通道和电极(例如，自顶向下电极、IDT电极和双轨电极)，以测量微观流体通道的阻抗。在前述方面的任何一个中，去污剂可以是triton-X或tween-20。

在前述方面的任何一个中，细胞组分可以是离子(例如，钾、钙和钠)或酶(例如，乳酸脱氢酶)。

在前述方面的任何一个中，起因于裂解的性质可以是阻抗。在这个方面，阻抗可以使用自顶向下电极、IDT电极和双轨电极进行测量。

在前述方面的任何一个中，阻抗可以例如使用单个频率(例如，760Hz)或使用离子敏感性电极(例如，钾、钠或钙离子特异性电极)进行测量。

可替代地，起因于裂解的性质可以是质量。在这个方面，质量可以使用微观或毫微机械共振器进行测量。

在前述方面的任何一个中，测量可以包括光学检测、表面等离振子共振或侧向流动扩散测定。

在一个优选实施方案中，性质使用荧光探针进行测量，并且离子是钾。在另一个优选实施方案中，细胞组分是核，并且起因于裂解的性质是阻抗。在另外一个优选实施方案中，微观流体通道具有10μl的体积。

在上述方法的任何一种中，细胞群体和状况可以选自表1。

表1

  细胞群体   状况   嗜中性粒细胞   免疫抑制药物治疗的作用   单核细胞   血细胞分类计数   淋巴细胞   AIDS   淋巴细胞   免疫抑制药物治疗的作用   淋巴细胞B   对感染的免疫应答   循环肿瘤细胞   癌症   树突细胞   免疫应答

  细胞群体   状况   红细胞   疟疾   结核敏感性CD8T细胞   潜伏的结核   血小板   抗凝血药物治疗的作用   内皮祖细胞   脉管系统的健康状态   淋巴细胞   脑膜炎   淋巴细胞   泌尿道感染

“裂解”指细胞膜(例如，植物细胞、动物细胞和细菌细胞的膜)的破坏。为了本发明的目的，术语“裂解”意欲包括细胞膜的完全破坏(“完全裂解”)、细胞膜的不完全破坏(“部分裂解”)和细胞膜的透化。术语“裂解”还意欲包括其他生物膜(例如核膜和线粒体膜)的破坏。

“选择性裂解”指对异质细胞群体(例如人血样)应用试剂，从而使得裂解所需细胞亚群，同时不希望的细胞仍保持完整。

“透化”指细胞膜这样的破坏，从而使得在相同程度上膜对其正常不可透过的特定细胞内组分能够逸出细胞，同时其他组分仍保留在细胞内。

“细胞组分”指在细胞内或其上发现的任何化学种类或复合物。为了本发明的目的，这个术语意欲包括生物化合物或复合物(例如，酶、核酸、蛋白质、细胞器和细胞膜复合物)，以及其他种类(例如，离子和有机分子)。

“至少一种细胞组分的性质”指特定细胞组分的可测量特征。

附图简述

图1A是显示阻抗测量设置的图解。将样品通过入口(箭标)经由注射器泵递送到微通道内。

图1B是显示使用阻抗光谱学测量细胞离子释放的图解。在微观流体设备内分离的靶细胞被裂解，以释放细胞内离子。这导致体积电导变化的增加，这可以使用表面图案化电极和阻抗光谱学进行监控，以检测细胞数目。

图1C-图1E是显示电极布局和设备装配细节的示意图：(C)叉指(IDT)共面电极，(D)简单双轨共面电极和(E)自顶向下电极。电极在底部载玻片(对于IDT和双轨电极设计)或在两个载玻片(对于自顶向下电极设计)上形成图案，其中使用标准净室(cleanroom)技术和金湿法蚀刻方法。所有设备通过使2片载玻片与50μm厚的PDMS垫圈(三角形)结合进行制备。在盖玻片上钻孔，并且与PDMS口装配，以充当样品入口和出口。

图2A和2B是显示随细胞浓度而变的阻抗谱和阻抗变化的曲线图，其中使用在芯片外(off-chip)获得的细胞裂解物。在IDT设备上测量的DI水和具有不同起始细胞浓度的细胞裂解物的(A)阻抗大小和(B)相谱。在每个细胞浓度时在100-106Hz频率范围中执行3-5次扫描。

图2C-2E是显示随细胞浓度而变的在重对数尺度中标绘的在760Hz时测量的阻抗大小的曲线图，其中使用(C)自顶向下电极、(D)IDT电极和(E)双轨电极。(C)-(E)中的实心点是拟合二参数幂方程的实验测量。最小二乘方拟合显示为曲线图中的实线和方程。误差条指示来自在单个设备内的3-5次连续测量的标准差。

图3A是显示随细胞浓度而变的用于拟合阻抗谱和引出的电导的电路模型示意图。在我们的研究中使用等价电路，以模拟用于引出体积溶液电导Rsol的电极/电解质系统，所述Rsol与细胞离子释放直接关联。

图3B和3C是显示在IDT电极芯片中使用具有3000个细胞/mL细胞浓度的在芯片外细胞裂解物样品标绘的阻抗大小(B)和相(C)谱的曲线图。十字是实验数据并且实线显示拟合曲线。

图3D-3F是显示体积电导的曲线图。Rsol从使用(D)自顶向下电极、(E)IDT电极和(F)双轨电极测量的谱引出。使用所有电极几何结构观察到测量的体积溶液电导(实心点)和细胞浓度之间的线性关系，并且最佳拟合显示为(D)-(F)中的实线和方程。(D)-(F)中的误差条指示来自在单个设备内的3-5次连续测量的标准差。

图4是显示在荧光显微镜下观察到的在不同浓度低电导率糖溶液中随时间而变的活细胞百分比的曲线图。使CD4+T细胞捕获在抗体固定的设备中，随后以10mL/分钟在不同浓度的糖溶液中流动2分钟。溶液流动停止后，使细胞在室温下在这种溶液中温育8分钟，并且每30秒在荧光显微镜下计数完整细胞数目。通过完整细胞数目除以在每种糖溶液注射前的细胞总数目来计算完整细胞百分比。

图5A是显示在细胞捕获和在芯片上(on-chip)裂解的过程期间在760Hz下的阻抗大小的曲线图。分别的温育步骤在曲线图之上标记，并且这些标记的步骤之间的阴影区是在溶液交换过程中的过渡态。在裂解溶液注射前和后10分钟的阻抗降低与细胞裂解相关，并且用作细胞数目指示物。

图5B是显示电导变化与在微观流体设备内捕获的细胞数目比较的曲线图。体积溶液电导从阻抗谱中引出，并且采取在裂解溶液中的流动前和后10分钟的阻抗降低作为计数细胞的指示物。这种电导变化与在微观流体芯片内捕获的细胞数目成比例增加，从而暗示固定细胞可以通过其离子释放的电测量进行计数。关系的非线性可能起于离子在测量时间内的不完全扩散。图中的每个数据点代表来自1个设备的测量。

发明详述

一般而言，本发明的特征在于定量样品中的细胞或其组分的方法，这通过下述实现：使细胞裂解，随后为至少一种细胞组分的测量。本发明的方法对于定量例如在与细胞大小相比较大的表面积或体积上的小细胞数目尤其有用。在优选实施方案中，本发明的方法在微观流体设备中执行。

在其中需要定量在细胞异质混合物(例如，来自人血样)内的一种或多种细胞亚群的本发明的方面中，本发明的特征在于所需细胞亚群的选择性裂解。可替代地或另外地，本发明的特征在于在裂解前分离一种或多种所需细胞亚群。在这个方面，一种或多种所需细胞群体可以以小体积在微观流体设备中被捕获。在这些实施方案中，仅裂解且定量所需亚群。

I.使细胞裂解的方法

本发明的裂解方法包括完全裂解、部分裂解、选择性裂解和细胞的透化。在一个实施方案中，裂解方法包括化学裂解(例如，用低渗(hyopotonic)溶液)，或使用去污剂例如triton-X、tween-20和其他商购可得的去污剂的裂解或部分裂解，以及裂解物用于细胞或其组分计数的后续分析。

在另一个实施方案中，本发明的方法的特征在于电裂解(例如，通过应用足以引起细胞裂解的直流电、交流电或脉冲电场)和裂解物用于细胞计数的后续分析。电裂解可以通过使电极构建到用于测量阻抗的芯片内来完成(例如，参见下文)，或可以用另外的电极组来执行，例如在与用于测量阻抗的电极构建相对的表面上。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于机械裂解和裂解物用于细胞计数的后续分析。机械裂解方法包括对细胞应用超声波，使细胞冷冻且融化，使细胞加热，对细胞使用微尺度或毫微尺度的针、锋利探针、刀刃和脊以及本领域已知的其他工具在芯片上的匀浆。

本发明的特征还在于在性质上是生物学的裂解。例如，裂解可以是由裂解病毒感染的结果，与免疫系统组分相互作用的结果(例如，暴露于补体)，或与成孔生物分子(例如，孔蛋白)相互作用的结果。

本发明的特征还在于在细胞异质混合物内的细胞亚群的特异性裂解。在这个方面，诱导裂解的试剂可以与结合部分连接，所述结合部分与在所需细胞亚群上的细胞表面标记特异性结合。可替代地，裂解试剂可以以这样的浓度或大小引入，所述浓度或大小足以使所需细胞亚群裂解，但不足以使剩余的不希望的细胞裂解。其他裂解方法是本领域已知的。

II.测量细胞内容物的方法

本发明的特征在于通过测量通过细胞裂解释放的细胞内内容物来定量细胞的方法。本发明的方法可以是全定量、半定量、或定性的，这依赖于所需精确性。

A.电

本发明的特征在于用于测量细胞的细胞内内容物的电方法。在一个实施方案中，样品中的细胞用等渗、非导电溶液(例如，8.5％蔗糖)漂洗。细胞保持完整，同时周围介质的电导率大大降低，并且测量的阻抗增加。接下来，加入低渗、非导电溶液(例如，2％蔗糖)，裂解细胞。细胞内离子从细胞释放到介质内导致电导率中的增加，以及阻抗中可测量的降低。因为目前存在于介质中的基本上所有离子都来自细胞，所以细胞的绝对数目可以基于测量的阻抗进行测定。在相同设备中已知参考溶液的事前或后续测量可以用于校准每次测量。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于使用温和去污剂以释放完整细胞核。核的数目可以使用微型coulter计数器进行计数。Coulter计数器通过测量当颗粒经过导电介质中的小孔时阻抗中的变化工作。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于使用离子敏感性电极或微电极，以检测特异性离子(例如，钾、钠或钙)的浓度，并且裂解物中的离子浓度可以与捕获的细胞数目关联。

B.光学

本发明的特征还在于用于测量优选在微观流体设备上的细胞的细胞内内容物的方法。在一个实施方案中，本发明的特征在于基于胞质酶的活性测量的半定量比色法。这个类别中的一个例子是乳酸脱氢酶(LDH)测定，这测量细胞质酶LDH在其从细胞中释放后的活性。这个实施方案可能涉及用表面活性剂裂解固定的细胞(例如，富集的群体)以释放LDH，随后使裂解物与酶促溶液混合，所述酶促溶液在与LDH反应后改变颜色。最终溶液的光学吸光度在使用已知细胞浓度的裂解物获得的标准曲线上作图，以估计裂解细胞数目。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于使用表面等离振子共振(SPR)的半定量光谱法。在这个实施方案中，裂解物中的特定组分例如蛋白质可以使用特异性抗体或其他捕获部分捕获在金属表面上，并且捕获的物质可以使用SPR光谱学进行定量。在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于检测裂解物溶液中的钾离子的基于寡核苷酸的荧光探针。荧光信号可以与细胞数目关联。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于对于细胞裂解物的毛细管离子电泳。这种方法可以与UV吸光度的测量组合使用，以测定与细胞浓度关联的特异性离子的存在。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于基于侧向流动扩散的测定。在这种方法中，细胞数目基于细胞裂解物中分子内容物的扩散进行测定。识别且与细胞裂解物中的靶分子结合的分子带可以形成图案。可以将裂解物引入侧向流动设备中，并且在特定浓度阈值下通过靶分子行进的距离可以与原始样品中的细胞数目关联。

C.机械

本发明的特征在于用于定量细胞的细胞内内容物的机械方法。质量是可以用于定量细胞数目的基本性质。在这个实施方案中，细胞裂解物可以使用微观和毫微机械共振器进行干燥并且称重，所述共振器允许测量下至毫尘克(attogram)范围的质量。可替代地，特异性裂解物组分可以使用抗体官能化(或其他捕获部分)支架进行捕获且称重。特异性蛋白质的质量随后可以与裂解物中的细胞数目关联。

III.适应症

本文描述的方法可以广泛用于自动化检测和计数任何细胞群体。该方法用于检测和计数样品中的所有细胞，或与样品的剩余细胞分离的细胞。本发明特别适合于自动化检测和定量相对低浓度的细胞，例如100-1000个细胞/毫升。在一个实施方案中，本发明的特征在于来自血液样品的CD4+细胞的计数。本发明还可以用于例如计数来自血液的罕见上皮癌细胞，计数在其表面上表达的指示疾病的特异性抗原受体的细胞，计数来自血液的靶嗜中性粒细胞，计数来自血液的特异性单核细胞，并且计数在其他体液例如尿、脑脊液、唾液和痰中的细胞。

在本发明的一些方法中，具有特定细胞表面抗原的细胞的定量用于诊断或评估特定医学状况。细胞可以首先使用对于所需细胞表面抗原特异性的结合部分进行捕获，并且随后使用上述方法中的任何一种进行定量。表2阐述了其中特异性细胞计数是多种医学和临床诊断学所需的应用的示例性列表。表2还阐述了可以用于分离所示细胞群体的示例性捕获分子。

表2

  细胞群体   捕获分子   应用   嗜中性粒细  胞   抗CD66   血细胞分类计数，监控免疫抑制药  物治疗   单核细胞   抗CD 14   血细胞分类计数   淋巴细胞   抗CD4   AIDS监控   淋巴细胞   抗CD8   CD4/CD8数目比用于监控儿科  AIDS   淋巴细胞   抗CD45   免疫抑制药物治疗   淋巴细胞B   抗CD 19   监控对感染的免疫应答   循环肿瘤细  胞   抗EPCAM   癌症监控   树突细胞   抗CD83   监控免疫应答-一般的   红细胞   抗顶端膜抗原1  (AMA-1)   疟疾诊断   红细胞   抗-PfEMP1(寄生  虫衍生蛋白质)   疟疾诊断   结核敏感性  CD8T细胞   抗P MHC五聚体  A2-SL9   诊断潜伏的结核   血小板   抗CD41   监控抗凝血药物治疗   内皮祖细胞   抗CD34   监控脉管系统的健康状态   淋巴细胞   抗CD3   脑脊液中的总淋巴细胞计数用于脑  膜炎诊断/监控和尿中的总淋巴细  胞计数用于泌尿道感染诊断/监控

此外，应当指出细胞计数的组合将对于多种医学应用有用。这些可以包括(i)血细胞分类计数-包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板，(ii)儿科AIDS诊断(例如，CD4与CD8比)，(iii)疟疾(PfEMPs(寄生虫衍生蛋白质)实验对象组)，(iv)用于监控且区分病毒和细菌感染的单核细胞和淋巴细胞。此外，本发明包含了其中单独或组合捕获特异性细胞的任何细胞计数。

IV.实施例

为了解决检测固定在相对大表面积上或在大体积中的少量细胞的需要，我们研究了细胞内离子从固定在微观流体通道中的裂解细胞的释放，其中使用表面形成图案的电极，以通过阻抗光谱学测量体积电导变化。哺乳动物细胞包含相当大量的离子，并且经过细胞膜的离子转运的紧密控制对于正常细胞功能和对周围环境的应答是重要的。当细胞悬浮于低渗介质中时，细胞内离子的被动扩散和主动抽吸至细胞外环境用于调整至低渗环境。此处，我们显示通过细胞内离子的控制释放，可以执行阻抗测量以测定微观流体通道中存在的细胞数目。使用捕获且固定的CD4T细胞作为例子，根据我们在从全血中分离这些细胞的先前成功，我们证实细胞裂解物阻抗光谱学具有20个细胞/μL的检测阈值，这足够用于临床和研究应用。

基于细胞离子释放的阻抗光谱学的建模

由于离子释放的电导与电容变化比较

当细胞释放离子时，影响体积电导和电容。在一般的哺乳动物细胞中，细胞质离子浓度是约150mM(Aidley，等人，Ion Channels：Moleculesin Action，Cambridge University Press，Cambridge，UK，1996.)。给定0.2pL的体积，一般的淋巴细胞因此包含总共3x10-14摩尔离子。在10μL微型室(在这个研究中使用的微观流体设备的体积)中裂解后，这些离子促成离子浓度的3nM增加。因此，对于每100个淋巴细胞，在10μL室中的完全裂解将使溶液离子浓度增加0.3μM。如果我们通过假定所有释放的离子都是钾和氯离子，并且钾和钠离子具有可比较的电迁移率(Ohno，编辑，Electrochemical Aspects of Ionic Liquids，Wiley-Interscience，c2005，Hoboken，NJ，2005.)来简化情况，那么溶液电导率可以根据离子浓度中0.3μM的增加计算为增加0.03/MΩ-cm(Omega Engineering，Technical Conductivity and Resistivity.Accessed：December 30，2006.)。这个电导率变化超过用去离子水可见的增加(0.055/MΩ-cm)的50％。在比较中，电容仅微弱地依赖于在稀释溶液中的离子浓度。对于氯化钠溶液，例如，对于在稀释溶液中离子浓度(＜100mM)中的每纳摩尔增加，介电常数仅降低10-7。使用相似计算，相对于去离子水(80的介电常数)，从100个淋巴细胞中释放的总离子仅使溶液电容减少4x10-7。这个变化比体积电导中的变化低几个数量级。因此，细胞离子释放主要促成溶液电导变化，这可以使用阻抗光谱学容易地检测。

阻抗谱的建模

为了理解随细胞数目而变的溶液电导，我们执行建模研究以从使用表面形成图案的电极中获得的阻抗谱引出在微观流体设备中的体积电导。电解质溶液中的电极可以使用如图3A中所示的等价电路进行建模(Gomez-Sjoberg，等人，J.Microelectromech.Syst.，2005，14，829-838.Gomez，等人，Sens.Actuator B-Chem.，2002，86，198-208.)，其中Cdi，是介电电容(它包含来自电极周围的所有材料，包括溶液的介电贡献)，Rsol是体积溶液阻抗(经过本体溶液的电荷转运)，Zdl是界面阻抗(所谓的Warburg阻抗)，其解释在界面处的离子梯度中的变化，并且Rser是在芯片上的线路的电阻。界面阻抗可以表示为

其中j＝√(-1)，n和B是依赖于电解质和电极性质的参数。这是将一直正确地拟合在整个频率范围内的测量数据的最简单模型。

材料与方法

化学制品

蔗糖购自Mallinckrodt Baker，Inc.(Paris，Kentucky)。葡萄糖和锥虫蓝溶液(0.4％)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。Ficoll-PaquePlus购自GE Healthcare Amersham Biosciences Corp(Piscataway，NJ)。3-巯基丙基三甲氧基硅烷购自Gelest(Morrisville，PA)。金载玻片得自Fisher Scientific(Fair Lawn，NJ)。磷酸缓冲盐水(PBS)得自Mediatech(Herndon，VA)。冻干的牛血清清蛋白(BSA)得自Aldrich ChemicalCo.(Milwaukee，WI)。偶联剂GMBS(N-γ-马来酰亚胺丁酰氧琥珀酰亚胺酯)和NeutrAvidin得自Pierce Biotechnology(Rockford，IL)。生物素化的小鼠抗人抗CD4(克隆13b8.2)购自Beckman Coulter(Somerset，NJ)。

设备

制造3种类型的设备，从而实现3种不同的电极设计，包括叉指(IDT)共面电极、简单双轨共面电极和上及下电极(图1C-D)。金电极使用标准光刻法和金湿法蚀刻方法进行构建。IDT电极指是3.8mmx15μm，具有35μm的间距。它们覆盖在微观流体通道内的整个区域，并且插入3个相同区段内，以探测室的不同部分。关于IDT电极的连接轨和简单双轨电极的轨是100μm宽，具有3.8mm的间距。上下电极是5cmx4mm金垫。

对于所有设备，顶端和底部载玻片(75mmx25mm)与具有5cmx4mm开口的50μm厚的PDMS垫圈结合，形成闭合的微观流体通道。PDMS垫圈通过使PDMS旋涂(spin-coating)在透明载玻片上，随后手工切割所需大小的窗口进行制备。在顶端玻璃上钻2个孔，并且与PDMS口装配，以形成流体入口和出口。用于测量来自在芯片外裂解物的阻抗的设备在装配后直接使用。用于细胞捕获和在芯片上裂解的设备用单克隆CD4抗体进行官能化，并且用包含1％BSA和1mM EDTA的PBS进行预处理，如先前所述(Cheng，等人，Lab Chip，2007，7，170-178.)。

细胞制备和在芯片上的细胞分离

外周血单核细胞(PBMCs)通过Ficoll密度梯度离心(Ferrante，等人，J.Immunol.Methods，1980，36，109-117.English，等人，J.Immunol.Methods，1974，5，249-252.)由新鲜抽取的血液制备，并且维持在RPMI-1640培养基中。为了分离CD4+T淋巴细胞，将维持在RPMI-1640培养基中的PBMCs以5μL/分钟的流速注射入抗CD4抗体官能化的微电极设备内进行不同时间长度，随后使用包含1％BSA和1mM EDTA的PBS从设备中漂洗未结合的细胞。在微观流体设备内捕获的细胞数目在相差显微镜下进行人工计数(Cheng，等人，Lab Chip，2007，7，170-178.)。

用于阻抗测量的在芯片外的样品制备

为了制备在芯片外的细胞裂解物，培养的PBMCs使用血细胞计数器进行人工计数，随后用RPMI-1640在eppendorf管中稀释至0-3,500个细胞/μL的不同浓度，具有1mL的终体积。其后，使细胞在1200g下沉淀5分钟，并且用1mL低导电介质(8.5％蔗糖和0.3％葡萄糖)轻轻洗涤3次。最后一次洗涤后，使细胞重悬浮于1mL无菌去离子水中，并且在室温下静置20分钟用于细胞裂解。随后从最低浓度开始以15μL/分钟的流速，将每种细胞裂解物注射入微电极设备内，并且在信号稳定后获得阻抗谱。设备在裂解物注射之间用去离子水以50μL/分钟的流速漂洗，直至阻抗测量达到关于去离子水的原始值。

使用糖溶液的在芯片上的细胞裂解的光学表征

为了鉴定在控制速率下裂解细胞的低导电介质，我们使包含8.5％蔗糖和0.3％葡萄糖的低电导生存力维持溶液稀释至不同终浓度。使用注射器泵(Harvard Apparatus)将这些溶液以15μL/分钟的流速顺次注射入具有捕获的CD4+T淋巴细胞的微观流体通道内进行1分钟，并且允许细胞在每种溶液中裂解10分钟。这些细胞使用Fluo-3进行预染色，并且通过表面固定的抗体在微观流体通道中捕获，其中使用先前描述的方法(Cheng，等人，Lab Chip，2007，7，170-178.)。在实验过程自始至终每30秒获取荧光图像，并且计数荧光细胞数目以估计完整细胞数目。

用于阻抗光谱学的在芯片上的制备

为了检测表面固定的细胞，使用包含8.5％蔗糖和0.3％葡萄糖的低电导率洗涤溶液以20μL/分钟的流速从通道中洗掉在PBS缓冲液中存在的离子，直至阻抗信号稳定。接下来，包含2％蔗糖和0.07％葡萄糖的低电导细胞裂解溶液以10μL/分钟的速率流动1分钟用于细胞裂解。引入裂解溶液后，流动停止，并且细胞在这种溶液中维持另外10分钟，以允许细胞裂解达到稳定状态。细胞裂解后，将去离子水以20μL/分钟的流速注射5-10分钟以获得参考谱。整个过程自始至终连续监控阻抗。

阻抗光谱学测量

使用Agilent 4284 LCR计(Agilent Technologies Inc.，Palo Alto，CA)获得阻抗测量。微电极设备通过铂探针与LCR计连接；实验设置的示意图显示于图1A中。阻抗测量过程通过定制的Lab View(NationalInstruments Corp.，Austin，TX)虚拟仪器和GPI B界面自动化。阻抗谱在100Hz-1MHz的频率范围中进行测量，其中使用1.5的频率增加因子，和250mV的振幅。

结果

在这个研究中使用的所有设备都由在具有5cmx4mmx50μm尺度的通道内形成图案的表面微电极组成。当用特异性抗体固定并且在控制流动条件下操作时，这个通道设计先前已显示以高效率(＞90％)从未加工的全血中特异性分离CD4+T淋巴细胞(纯度＞95％)(Cheng，等人，Lab Chip，2007，7，170-178.)。在目前的研究中，我们进一步使微电极在抗体官能化的微通道中形成图案用于电检测分离的细胞的目的。使用对于在芯片上的细胞裂解和计数合适的电极布局(图1C)，由于在通道内85％亲和表面面积的维持，对于从全血中的CD4+T细胞分离，分离纯度和得率保持超过90％。

使用在芯片外的细胞裂解物的阻抗测量

为了测试使用阻抗光谱学的来自原代细胞的离子释放的检测灵敏度，我们首先在具有去离子水的eppendorf管中使已知浓度的PBMCs裂解，并且使用3种不同电极设计的微观流体设备测量裂解物的阻抗：上下电极、IDT共面电极和简单双轨共面电极。图2A和2B显示对于使用IDT电极测量的0-3,000个细胞/μL的细胞浓度随频率而变的阻抗大小和相谱。我们观察到每个大小谱具有2个区域——在100Hz-10kHz频率范围中的恒定阻抗区和在更高频率范围(＞100kHz)下阻抗减少的区域。随着逐渐增加的细胞浓度，在低频率范围中在阻抗大小中存在一致减少，和相峰值至更高频率的移动。这强烈暗示细胞浓度的半定量测量可以使用细胞离子释放进行测定。得自其他2种电极设计的阻抗大小谱显示相似的性质，但不同的绝对值；使用双轨电极测量的阻抗大小比来自IDTs的那些高2个数量级，来自IDTs的那些比上下电极高2个数量级。其中在大小谱上阻抗开始降低的转变点对于上下电极在约10kHz时发生，但对于简单双轨电极移动至约1kHz。

为了检查阻抗谱区分细胞浓度的能力，我们对于3种类型的电极设计标绘出与细胞浓度比较在760kHz下的阻抗大小(图2C-2E)。由于对于所有3种电极在这个频率下阻抗大小的最大分离，我们选择760kHz作为测量频率。阻抗大小对细胞浓度的应答在重对数尺度曲线中是线性的，类似于在与我们的研究相关的范围中在简单电解质溶液的电阻和溶质浓度之间的关联(Omega Engineering，Technical Conductivity andResistivity.Accessed：December 30，2006.)。这指出来自细胞的离子内容物的释放和其中细胞裂解的介质的后续电导与细胞数目成比例。此外，使用离子释放以检测细胞看起来是非常灵敏的，并且可以检测在低导电溶液中少至20个细胞/微升。

阻抗建模和参数引出

因为细胞离子释放主要促进体积电导变化，所以我们使用图3A中所示的电路模型以拟合阻抗大小和相谱，其中使用在MATLAB中的最小二乘方标准，以引出体积电导值Gsol＝1/Rsol。通过迭代模型中的每个初始条件，模型和实验数据之间的最小二乘方误差降到最低，至10-13或更小的值(Vetter，Electrochemical kinetics：theoretical and experimentalaspects，New York：Academic Press，1967.Evgenij Barsoukov和J.R.Macdonald，编辑，Impedance spectroscopy：theory，experiment，andapplications，Hoboken，NJ.：Wiley-Interscience，c2005.，2005.)。随后终止拟合，并且引出且记录参数。

图3B和3C显示使用来自包含3,000个细胞/μL溶液的裂解物的阻抗大小和相谱的一般拟合：测量(十字)和拟合曲线(实线)之间的紧密匹配指出所选择的电路模型良好地预测实验系统。

从所有谱中引出体积电导后，我们标绘随细胞浓度而变的体积溶液电导(图3D-3F中的实心圆圈)。对于所有3种电极设计，溶液电导随着促成离子浓度的细胞数目线性增加，从而证实我们关于离子释放和溶液电导变化与细胞数目成比例的假设。我们还观察到Rsol值控制在100-10kHz的中间频率范围中的阻抗大小测量。这指出体积电导可以通过测量在单个频率下的阻抗大小进行估计，其中使用简单的手提式设置代替LCR计。

电导曲线的斜率代表每种电极设计的测量灵敏度。我们观察到上下电极具有最高的检测灵敏度(9.18×10-7/(欧姆·细胞))，而简单双轨电极具有最低的灵敏度(9.92×10-11/(欧姆·细胞))；IDT电极的检测灵敏度在两者之间(1.90×10-8/(欧姆·细胞))。为了容易显现在微观流体设备内的细胞以及细胞离子释放的灵敏检测，我们选择IDT电极用于进一步的细胞捕获和在芯片上的裂解实验。

使用低渗糖溶液的在芯片上的细胞裂解的光学表征

证实使用在芯片外的裂解物和阻抗光谱学通过其离子释放检测细胞的可行性后，我们对测试这种策略检测且定量在微观流体设备内捕获的细胞有兴趣。为了完成在芯片上的细胞裂解物阻抗光谱学，我们需要首先用非导电、等渗溶液替换富含电解质的全血或盐水缓冲液，以减少在微观流体通道中的本底电导率且确立基线测量。使用DI水用于细胞裂解的在芯片外的实验无法直接应用于在芯片上的细胞裂解，因为悬浮于DI水中的细胞立即裂解，并且裂解物可以在阻抗测量前从芯片中洗掉。给定细胞在其中裂解的介质尽可能是非导电的需要，以及洗掉来自血样自身的离子和蛋白质内容物的需要，我们评估了作为细胞洗涤和细胞稳定溶液的不同的低导电介质。我们发现包含8.5％蔗糖和0.3％葡萄糖的基于糖的洗涤溶液满足离子去除和细胞稳定的2个标准。这种溶液的阻抗接近于去离子水，但细胞生存力可以维持超过60分钟(Chiou，等人，Nature 2005，436，370-372.)。这种溶液用去离子水进一步稀释可以预期减少溶液摩尔渗透压浓度，从而使得裂解速度可以通过稀释因子中的调整得到控制。

为了测试在低电导率糖溶液中的淋巴细胞生存力和裂解，我们分离在官能化微通道内的来自PBMCs的CD4+T淋巴细胞，如所述的(Cheng，等人，Lab Chip，2007，7，170-178.)。洗掉未结合的细胞后，我们引入低导电8.5％蔗糖/0.3％葡萄糖洗涤溶液，以及更低渗的糖溶液。糖溶液流动停止后，通过荧光显微镜术每30秒计数在成像区域(600mmx800mm)上的完整细胞数目。图4显示在8.5％蔗糖/0.3％葡萄糖溶液中与时间比较的活细胞百分比，并且在这种溶液的不同稀释度中。淋巴细胞在8.5％蔗糖/0.3％葡萄糖中保持完整至少30分钟；裂解在更稀释的糖溶液中加速。基于这些结果，8.5％蔗糖/0.3％葡萄糖溶液用作初始洗涤溶液，并且选择包含2％蔗糖和0.07％葡萄糖的溶液用于在芯片上的细胞裂解。用这种组合，我们观察到在溶液交换的第一分钟中最高达15％的捕获细胞裂解，从而使由于流动的离子丧失降到最低，而约80％的细胞在10分钟内裂解，从而使得及时测量成为可能。

用于在芯片上的细胞裂解的阻抗光谱学

就细胞洗涤和裂解最优化无离子、低导电溶液后，我们接下来测量在芯片上的细胞捕获和细胞裂解后的阻抗变化。从培养基中捕获CD4+T细胞，用PBS溶液漂洗，用等渗的8.5％蔗糖/0.3％葡萄糖溶液再次漂洗。测量阻抗基线后，将低电导性细胞裂解溶液(2％蔗糖/0.07％葡萄糖)引入微观流体设备内，并且允许细胞裂解10分钟。用去离子水获得参考谱。实验自始至终，连续获得阻抗谱。然而，在100-10,000Hz之间的单个频率下的阻抗测量非常良好地反映起于细胞裂解的溶液电性质的变化。例如，图5A显示在芯片上的细胞裂解前和后在760Hz的频率下获得的阻抗大小的一般变化。当细胞在PBS中时，由于盐水缓冲液的高离子浓度，阻抗大小保持在低千欧姆范围中。在引入低导电的8.5％蔗糖/0.3％葡萄糖洗涤溶液后，阻抗急剧增加至超过10千欧姆。当细胞在洗涤溶液中维持于稳定状态时，阻抗大小略微减少，可能是由于在低渗环境中的低水平细胞离子释放。注射无离子2％蔗糖/0.07％葡萄糖裂解溶液后，我们注意到初始阻抗突升。这随后为阻抗的突然下降和随后较缓慢的阻抗减少。在细胞裂解过程中的这种两相阻抗降低匹配在相同溶液中细胞裂解的光学观察(图4)，从而暗示阻抗大小的减少起于捕获细胞的裂解。

应用上文描述的拟合程序后，在裂解溶液引入前和后10分钟，我们从阻抗谱和电导变化中引出体积电导。当我们比较这个电导变化与在微观流体设备内的手工细胞计数时(图5B)，显而易见的是体积电导变化与促成离子的捕获细胞数目成比例。这成功地证实细胞可以通过细胞裂解物的阻抗和电导的电测量在微观流体设备内进行检测和计数。

讨论

我们在此处描述了使用阻抗光谱学通过基于细胞离子释放的体积电测量检测且定量微观流体设备中的固定细胞的方法。由于其对于管理HIV感染患者的临床重要性(Department of Health and Human Services(October 6，2005)Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents inHIV-1-Infected Adults and Adolescents.Accessed 20 March 2006.)，我们选择CD4+T淋巴细胞作为用于检测的靶细胞。微观流体CD4计数器的最直接用途将是区分200个细胞/μL的CD4阈值用于治疗决策(Centersfor Disease Control and Prevention Revised classification for HIV infectionand expanded surveillance case definition for AIDS among adolescents andadults in MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report 1-19(1992).World Health Organization(4 November 2005)Patient MonitoringGuidelines for HIV Care and ART.Accessed 20 March 2006.)。细胞裂解物阻抗光谱学的检出限明显符合这个要求，并且显示在开发可以即时现场使用的微观流体CD4计数诊断工具中的希望。此外，这种细胞计数策略并不限于血细胞的检测，还可以应用于具有丰富离子内容物的任何生物靶。就我们所知，分离且检测在平方毫米大小面积上的1个细胞，或检测在微升体积中的20个细胞的能力，代表使用非光学方法计数固定细胞的最灵敏方法。

在本研究中使用的微芯片设备由在微观流体通道内制造的表面形成图案的微电极组成。微通道壁用单克隆抗CD4抗体进行官能化，并且电极使用牛血清清蛋白进行钝化。选择通道设计和样品流动条件，以确保以高效率从全血中特异性分离CD4+T淋巴细胞，如先前所述(Cheng，等人，Lab Chip，2007，7，170-178.)。用对于在芯片上的细胞裂解和计数合适的电极布局(图1C)，由于＞85％亲和表面面积的维持，来自全血的分离纯度和得率保持超过90％。当在光学显微镜下观察时，非常少细胞非特异性附着在电极表面上，从而证实用于细胞分离预期的设备性能。

使用表面电极通过完全细胞裂解和体积电导测量进一步检测分离的细胞。作为鉴定产生最佳检测灵敏度的频率范围的努力，我们在这个研究中获得随频率而变的阻抗大小和相谱，并且使谱拟合电路模型以引出体积电导。用最佳频率范围(在图2A中的100-10,000Hz)的了解和Rsol值在这些频率下控制阻抗大小的观察，人们通过使用手提式设置监控在单个频率下(例如760Hz)的阻抗大小，可以以秒估计体积电导。因此，从细胞捕获到细胞裂解和检测的整个过程可以在少于10分钟内完成。

特别地，对于HIV感染患者中CD4细胞的检测和监控，200个细胞/μL用作临床决策点。我们在此处显示免疫亲和细胞捕获方法与电检测法的整合可以满足这个检测阈值。我们描述的微观流体设备能够从血液中分离特异性细胞类型并且定量细胞数目，并且可以充当用于手提式仪器的一次性使用的药液筒，以提供在即时现场背景中简单、快速和花费得起的细胞计数。

与光学相反，电检测细胞的能力呈现了下述关键优点：(i)无标记检测，(ii)可自动化，和对开发小型台式或手提式仪器的适应性，(iii)与微观流体设备的可整合性；和(iv)在生理学和临床上相关的细胞浓度范围中的检测灵敏度。与计数细胞的其他电方法相比较，细胞裂解物阻抗光谱学显示检测在灵敏度中几个数量级的改善。这是由于细胞在无离子、低电导率糖溶液中稳定时减少的本底电导和在低渗裂解后从哺乳动物细胞释放的丰富的离子内容物。溶液电导在细胞裂解过程中的变化从阻抗测量谱中引出。我们证实细胞裂解物的体积电导与原始细胞数目成比例，这构成细胞裂解物阻抗光谱学的基础。这种方法足够灵敏以检测在具有10μL体积和2cm2脚印(footprint)的设备中的低至20个细胞/微升，这代表＜10-4体积替换和＜10-4表面覆盖度。

为了测量在微观流体设备中的体积电导，我们使微通道内的表面电极形成图案并且使用简单电路对阻抗谱建模，所述简单电路包含与总体溶液电阻(Rsol)总和和界面阻抗(Zdl)平行的介电电容(Cdi)。根据实验拟合，我们观察到Zdl的大小一般比溶液电阻Rsol小得多。因此，Rsol在低频率范围下(依赖于电极几何结构＜1-10kHz)控制电路，从而导致相对恒定的阻抗，不依赖于频率变化。在低频率范围中Rsol的支配也作为相谱的凸峰观察到。随着溶液的离子浓度增加，体积溶液电阻减少，从而使其中Rsol支配的范围移动至更高频率，并且降低在那个相同范围中的总体阻抗。另一方面，在高频率范围中(10-100kHz)，介电电容器(Cdi)占支配地位，从而导致随着频率增加的阻抗大小降低。在甚至更高的频率下(＞100kHz)，电化学设备和连接线的电感都促成阻抗谱，从而导致所有阻抗曲线的合并，这与溶液电导率无关(Katz，等人，Electroanalysis，2003，15，913-947.)。

使用阻抗光谱学在微型设备中监控生物离子释放是研究微生物代谢和生长的良好确立的技术(Gomez-Sjoberg，等人，J.Microelectromech.Syst，2005，14，829-838.Gomez，等人，Sens.Actuator B-Chem.，2002，86，198-208.)。然而，相似的方法先前对于哺乳动物细胞尚未报告，可能是由于其对无离子环境的不耐受性，所述无离子环境是减少用于通过细胞释放的离子的灵敏测量的本底电导所必需的。我们在此处证实在无离子糖溶液中维持原代细胞生存力的可能性和通过阻抗光谱学测量由于细胞离子释放的体积电导变化的可行性。这个策略在原理上不同于检测贴壁细胞的非光学策略，例如表面阻抗光谱学、场效应传感器和机械支架(Koch，等人，J.Micromech.Microeng.，1999，9，159-161.Ehret，等人，Biosens.Bioelectron.，1997，12，29-41.Fromherz，等人，Science，1991，252，1290-1293.Bull，等人，Am.J.Clin.Pathol.，1965，44，678和Tiruppathi，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，7919-7923.Giaever，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1991，88，7896-7900.)。这些方法基于检测细胞的电或物理性质和周围介质之间的差异。这种差异一般是小的；因此特征性传感元件和靶实体通常具有可比较的尺寸用于灵敏检测，除非差异是人工增强的(Katz，等人，Electroanalysis，2004，16，19-44.Wang，Anal.Chim.Acta，2003，500，247-257.)。相比之下，在我们的方法中，电信号通过利用在靶细胞内预先存在的大量离子得到放大。这允许以非常低表面覆盖度或体积替换灵敏检测细胞，无需显著的另外操作。

我们策略的另一个优点是传感器设计中的灵活性。使用简单双轨、共面电极或上下电极灵敏测量体积阻抗的可能性指出，人们可以使用简单金属板或线以用更不复杂的技术实现我们的方法，而无需牺牲检出限。当比较3种电极几何结构时，上下电极显示最高的检测灵敏度，而简单双轨电极具有最低的检测灵敏度。假定流体通道中的溶液是简单导体，在每种条件下测量的理论电导可以使用下面等式进行计算：

G＝σm A/L(2)

其中σ是溶液电导率，A是在电极之间的溶液横断面面积，L是电极之间的间距，并且m是电极重复。因为溶液电导率不依赖于设备设计，所以这种几何因素基本上决定测量灵敏度。当几何因子(m A/V)就本研究中使用的3种电极设计进行计算时，我们对于上下、IDT和简单电极分别获得400、150和0.065cm的值。这个几何因子顺序匹配我们的来自电导图的测量灵敏度(图3d-3f)。然而，当我们使用Eq.2计算理论电导时，这通过假定每个细胞在完全裂解后释放10-14摩尔离子，预测的电导比使用在芯片外的裂解物获得的测量高1-3个数量级，从而指出在体积中的离子不促成导电至相同的水平。事实上，DeSilva等人已假定通过与固定蛋白质桥接的面内电极岛的电导通过水合蛋白质层的离子电导控制(Desilva，等人，Biosens.Bioelectron.，1995，10，675-682.)。将他们的模型应用于我们的系统，占支配地位的电导层可以接近于基质，并且比通道尺寸薄得多，从而解释了测量和使用Eq.2计算的电导之间的偏差。当使用IDT电极在芯片上和在芯片外裂解实验之间比较阻抗大小时，我们还观察到数量级差异。这个差异可能解释这2种类型设备的分别制备：用于在芯片外裂解物实验的设备不实施表面修饰，而用于在芯片上裂解的那些在电极之间的缝隙中包含多层化学制品和蛋白质，从而改变缝隙的电性质。此外，用于在芯片上裂解实验的电极用清蛋白预处理，这可能改变在电极上的电子转移动力学和离子扩散特征(Katz，等人，Electroanalysis，2003，15，913-947.)。尽管在这2种类型设备之间的绝对阻抗大小中的差异，使用在相同制备下的设备获得的测量清楚地显示可比较的性能，如用参考溶液谱观察到的。

应当指出的有趣观察是当使细胞维持在低导电洗涤溶液中时的轻微阻抗降低。这可能指出来自捕获的细胞的离子释放，尽管在光学显微镜术下有完整形态学。因为洗涤溶液是轻微低渗的(270mOsm)，所以当首先暴露于洗涤溶液时细胞可能膨胀。已知瞬时渗透膨胀和随后的调节性体积减少(RVD)引起由K+和Cl-通道的平行激活诱导的KCl流出(Pedersen，等人，Comp.Biochem.Physiol.A-Mol.Integr.Physiol.，2001，130，385-399.Okada，等人，J.Physiol.-London，2001，532，3-16.Pasantes-Morales，等人，Neurochem.Res.，2000，25，1301-1314.Charras，等人，Nature 2005，435，365-369.)，这可以导致观察到的溶液电导减少。这个观察暗示可能使用电方法直接研究对低渗溶液和RVD的细胞应答。与基于细胞大小的光学测量的常规方法相比较，此种测量可以提供更佳的灵敏度，所述常规方法是低流通量的并且倾向于测量误差。响应环境摩尔渗透压浓度中的变化的细胞离子释放和体积调整还可以解释如图4中观察到的异质细胞裂解。因为已报告记忆和天然T细胞包含不同的离子储备(Sigova，等人，FEBS Lett.，1999，447，34-38.)，所以这些细胞具有调整至低渗条件的不同能力，并且显示不同的裂解速度是不惊讶的。

其他实施方案

上述说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此引入作为参考。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管本发明已结合具体实施方案进行了描述，但应当理解如要求保护的本发明不应不当地限制于此种具体实施方案。事实上，对于本领域技术人员显而易见的用于执行本发明的所述模式的各种修饰预期在本发明的范围内。

其他实施方案在权利要求中。

与相关申请的交叉参考

本申请要求于2007年4月20日提交的美国临时申请号60/925,368的利益，所述美国临时申请在此引入作为参考。

发明背景