用于从C1底物生产蛋白质，食品和有用副产品的微生物和人工生态系统
阅读：3发布：2020-05-21
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1.一种生物和化学方法，其用于捕获和转化仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子，成为经合成代谢生物合成产生的含有两个或更多个碳原子的有机分子，所述方法包含：
将仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子引入适于维持化学自养微生物的环境中；
将气态底物引入适于维持化学自养微生物的环境中；
其中所述仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子被所述微生物用作碳源以用于生长和/或生物合成；
经所述化学自养微生物中含有的至少一种化学合成碳固定反应和至少一种合成代谢生物合成途径在所述环境内将所述仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子转化为所述含有两个或更多个碳原子的有机分子产物；
其中所述化学合成固定反应和合成代谢生物合成途径至少部分地由电子供体和电子受体所提供的化学和/或电化学能量驱动，所述电子供体和电子受体已经化学和/或电化学和/或热化学地产生和/或从所述环境外部的至少一个来源引入所述环境。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是细菌细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含CO2作为碳源。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含H2和/或O2作为能源。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含热解气体或生产气体或合成气。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含气体混合物，所述气体混合物包含H2和/或CO2和/或CO。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物在适合于所述微生物生长和生物产物产生的条件下在所述气体底物存在下培养时产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为贪铜菌属(Cupriavidus sp.)或罗尔斯顿菌属(Ralstonia sp.)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为杀虫贪铜菌(Cupriavidus
necator)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物和/或由所述微生物产生的营养物用于向一种或多种其它生物馈送或提供营养。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为氢氧混合气微生物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述气态底物包含H2和/或CO2。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述气态底物为热解气体或生产气体或合成气。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述气态底物衍生自城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、生物气、酸气、甲烷水合物、轮胎、石油焦、污水、粪肥、秸秆、木质纤维素能源作物、木质素、作物残余物、甘蔗渣、锯屑、林业残余物、食物垃圾、废地毯、废塑料、垃圾填埋气体、海带、海藻和/或木质纤维素生物质。
15.根据权利要求1所述的方法，其中从所述培养基中回收氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子供体和/或仅含有一个碳原子的分子是通过作用于有机质的热化学过程产生，所述热化学过程包含以下中的至少一种：气化；热解；蒸汽重整；自动重整。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子供体和/或仅含有一个碳原子的有机分子是通过甲烷蒸汽重整产生。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中在将所述气体输送到所述微生物之前，使用水煤气变换反应调节来自气化和/或热解和/或自动重整和/或蒸汽重整的输出气体中的氢气与一氧化碳的比率。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括选自以下属中的一种或多种的微生物：贪铜菌属、红球菌属(Rhodococcus sp.)、氢弧菌属(Hydrogenovibrio sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)、戈登氏属(Gordonia sp.)、节细菌属(Arthrobacter sp.)、链霉菌属(Streptomycetes sp.)、红杆菌属(Rhodobacter sp.)和/或黄色杆菌属(Xanthobacter)。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子供体包括但不限于以下还原剂中的一种或多种：氨；铵；一氧化碳；连二亚硫酸盐；元素硫；烃类；氢；偏亚硫酸氢盐；一氧化氮；亚硝酸盐；硫酸盐，如硫代硫酸盐，包括但不限于硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3)；硫化物，如硫化氢；亚硫酸盐；硫代硫酸盐；连亚硫酸盐；呈溶解相或固相的过渡金属或其硫化物、氧化物、硫属化物、卤化物、氢氧化物、氢氧化合物、磷酸盐、硫酸盐或碳酸盐；以及固态电极材料中的导电或价带电子。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子受体包括以下中的一种或多种：二氧化碳；氧；亚硝酸盐；硝酸盐；三价铁或其它过渡金属离子；硫酸盐；或固态电极材料中的价带或导电带孔。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物转化步骤之前是一个或多个化学预处理步骤，在所述化学预处理步骤中，所述微生物所需的所述电子供体和/或电子受体和/或碳源和/或矿物质营养物从至少一种输入化学品中产生和/或精制，和/或从来自所述碳固定步骤的化学品回收，和/或由来自其它工业、采矿、农业、污水或废物产生过程的废物流产生或包含在其中。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子供体和/或电子受体使用温室气体排放较低的可再生、替代或常规能量源产生或回收，并且其中所述能量源选自以下中的至少一种：光生伏打、太阳热能、风能、水电、核能、地热、增强地热、海洋热能、海浪能和潮汐能。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述电子供体和/或电子受体在电网供电超过电网需求时使用电网电力产生，并且其中存储罐缓冲所述电子供体和/或电子受体的产生，以及其在所述化学合成反应中的消耗。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机化学产物包括具有5个碳或更多个碳的碳主链的化合物。
26.根据权利要求1所述的方法，其中分子氢充当电子供体并且经使用以下中的至少一种的方法产生：水电解；水的热化学分解；盐水电解；硫化氢的电解和/或热化学分解。
27.根据权利要求26所述的方法，其中使用以下中的一种或多种进行用于产生氢的水电解：质子交换膜(Proton Exchange Membranes；PEM)、如KOH的液体电解质、碱性电解、固体聚合物电解质电解、高压电解、蒸汽高温电解(high temperature electrolysis of steam；HTES)。
28.根据权利要求26所述的方法，其中使用以下中的一种或多种进行用于产生氢的水的热化学分解：氧化铁循环、氧化铈(IV)-氧化铈(III)循环、锌-氧化锌循环、硫-碘循环、铜-氯循环、钙-溴-铁循环、杂化硫循环。
29.根据权利要求1所述的方法，其中分子氢充当电子供体并且经已知产生氢伴随低或无二氧化碳排放的电化学或热化学过程产生，所述电化学或热化学过程包括以下中的一种或多种：实现碳捕获和封存(carbon capture and sequestration；CCS)的甲烷蒸汽重整；
实现CCS的煤气化；Kvaerner工艺和产生碳黑产品的其它工艺；实现CCS的生物质的气化或热解；产生生物炭副产物的生物质的热解。
30.一种用于生产氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质的方法，其包含在适合于所述微生物生长和氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质生产的条件下，在生物反应器中培养根据权利要求1所述的微生物，所述生物反应器包含气态底物和包含用于生长和生物产物产生的其它营养物的培养基，其中所述微生物产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
31.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种化学合成反应和至少一种合成代谢生物合成途径导致生物化学物质的形成，所述生物化学物质包括以下中的至少一种：氨基酸；
肽；蛋白质；脂质；多糖；和/或维生素。
32.根据权利要求1所述的方法，其中生物质和/或生物化学物质经所述至少一种化学合成反应产生，并且其中所述生物质和/或生物化学物质具有作为以下中的至少一种的应用：作为用于发酵的有机碳和/或氮源；作为用于其它微生物或生物生长的营养源；作为人类的营养源或食物成分；作为动物的饲料；作为制造或化学过程的原料或化学中间产物；作为医药、药用或营养物的来源；作为肥料；作为土壤添加剂；和/或作为土壤稳定剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中来自所述化学合成反应的所述碳源和/或氮源用于发酵以产生生物化学品，所述生物化学品包括以下中的至少一种：商业酶、抗生素、氨基酸、蛋白质、食品、食品成分；维生素、脂质、生物塑料、多糖、营养保健品、药品。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述动物饲料用于饲养以下中的一种或多种：
牛、绵羊、鸡、猪、鱼、贝类、昆虫、无脊椎动物和珊瑚。
35.根据权利要求34所述的方法，其中使用从C1源生物合成的营养物生长所述贝类或珊瑚，产生碳酸盐材料，所述碳酸盐材料将CO2螯合成具有高反照率的固体矿化形式。
用于从C1底物生产蛋白质，食品和有用副产品的微生物和人
工生态系统
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本发明主题涉及使用气态底物，如合成气或生产气体或热解气体或H2与CO2气体混合物作为碳源和能源，在微生物系统中生物制备氨基酸和蛋白质以及其它生物质成分。本发明还涉及微生物氨基酸、蛋白质和其它生物质成分用于向其它异养生物、动物或人类馈送或提供营养的用途。根据本发明产生的氨基酸、蛋白质和其它生物质成分可以被其它生物消耗并用作的营养物，以用于产生食物和其它生物基产物。
[0004] 本公开涉及能够经由培养在含碳气体(如合成气、生产气体、CO2、一氧化碳和含有氢气的前述各者的混合物)上生长的细菌或其它微生物来生产氨基酸、蛋白质和其它生物质成分的组合物和生产氨基酸、蛋白质和其它生物质成分的方法。本公开进一步涉及将来自气态输入的碳固定到有用的有机分子(如氨基酸、蛋白质和其它营养物)中的方法。可以对本发明的细菌和/或微生物进行基因工程改造，以用于本文所述的本发明的方法或其它方面。在本文所述的本发明的一些其它方面中，微生物未经基因工程改造。
[0005] 本公开还涉及将碳从气体固定成有用的有机分子(例如氨基酸、蛋白质和其它营养物)的方法。本发明进一步描述经由将二氧化碳或其它无机碳源和无机能量(包括来自无机化学物质的化学能或直接来自电源的无机能量)转化成碳基产物，并且特别是氨基酸、蛋白质和其它具有商业价值的营养物来赋予生物产生碳基产物和/或促进生物产生碳基产物的能力的机制。
[0006] 本公开进一步涉及人工生态学、工程营养系统、封闭生态系统、微观世界、连续培养系统、生物再生和闭环生命支持系统。
背景技术
[0007] 需要可持续和可再生的氨基酸、蛋白质和其它营养物来帮助满足不断增长的食物需求。还需要减少向大气排放的二氧化碳和其它温室气体(GHG)的量，以及减少基于食品生产系统中的煤、石油和天然气的全球能源消耗。全球经济需求的增加给土地和水资源带来了越来越大的压力。也给用于生产食品和其它农业衍生产品的传统的化石烃投入带来了增加的压力。包括现代农业的许多行业在很大程度上依赖于化石烃源作为农作物生产和加工的投入的可用性。当前现有实践的具有成本效益的替代方案可以帮助缓解土地使用、自然栖息地、水、化石资源需求、原材料成本和温室气体排放的上涨压力。
[0008] 已知经由天然生物化学代谢过程固定气态碳的生物系统。基于高等植物作物的光合作用的当前农业系统就是一个实例。还开发藻类系统，以通过光合作用反应从CO2产生食物和其它农业衍生的产物。还存在利用固定碳原料(如糖)的异养反应和产物，其间接依赖于光合作用。目前，畜牧业和水产养殖业一般具有呈各种饲料形式的光合作用产物作为最终输入。通常使用人工或复合饲料，其是饲料的混合物，以及配制成含有所需量的必需营养物和能量的维生素和矿物质预混物。这些饲料通常是农业生产的作物的产物。或在某些情况下，其来源于自然界中野生生物的收获或觅食。在这种生产的基础上通常是直接或间接消耗的初级生产者的光合营养层。用于说明野生光合初级生产者的直接消费的食物生产的实例是在未开垦土地上的放牧牲畜。用于经由间接消耗野生光合初级生产者来说明食物生产的实例是在水产养殖中使用鱼粉，所述鱼粉来源于如沙丁鱼和凤尾鱼的野生鱼群，而这些鱼群继而以光合藻类为食。然而，当前农业，畜牧业和水产养殖实践以及目前使用的基于光合作用的饲料面临许多问题和限制。
[0009] 全球人口的增加加上人均海产品消费的增加导致对海产品的需求不断增加。虽然需求在增加，但许多海洋鱼群已经被过度捕捞。水产养殖有助于满足这一日益增长的需求，并改善世界许多地区的营养和粮食安全。由于全球野生鱼类的捕捞停滞不前，专家表示几乎所有新的海产品都必须养殖。根据联合国粮食与农业组织(Food&Agriculture Organization；FAO)的数据，到2030年全球每年将需要另外4000万吨海产品，以满足当前的消费速率，并且“由于捕捞渔业产量停滞不前，预计鱼食品产量的主要增加来自水产养殖……为了维持2030年的人均消费水平，还需要额外的2700万吨水产养殖产量。”伴随着水产养殖的快速增长，生产水产养殖饲料的行业也在增长。
[0010] 鱼类是最节能的动物之一，并且水产养殖是生产动物蛋白的最具资源效率的方法之一。具体来说，鱼类将食物转化为体重的量比陆地动物更多。“饲料转化率”(FCR)表示生产一磅动物产品所消耗的饲料磅数。发现鲑鱼-饲料密集度最高的养殖鱼类-比其它形式的蛋白质产生(如经由鸡、猪或牛)有效得多。据报道鲑鱼的FCR为1.2，而鸡：1.9；猪：5.9；和奶牛：8.7。此外，水产养殖的碳足迹通常只是陆地上畜牧业的一小部分。美国国家海洋和大气管理局(The National Oceanic and Atmospheric Administration；NOAA)关于水产养殖的基本问题http：//www.nmfs.noaa.gov/aquaculture/faqs/faq_aq_101.html以全文引用的方式并入本文中。
[0011] 向养殖鱼类饲喂专为满足其营养需求而设计的饮食。这种饲料可能含有保持其健康和生长所需的所有必需营养物，并且通常成干燥颗粒形式。鱼类的营养需求因物种而异。食草鱼吃可能含有植物蛋白(例如大豆、玉米)、植物油、矿物质和维生素的饲料混合物。在野外，食肉鱼如鲑鱼吃其它鱼类。然而，即使是食肉鱼，大量的饮食也可能包括植物蛋白、油、矿物质和维生素。
[0012] 在实践中，大部分水产养殖饲料包含动物蛋白质来源，并且特别是鱼粉。水产养殖饲料中的鱼粉组分通常来自野生捕捞的鱼类。然而，捕获野生鱼类喂养其它圈养鱼的普遍做法被认为是不可持续的。水产养殖业面临的主要挑战是减少对食物链底层野生捕捞物种的严重依赖。在全球范围内，水产养殖使用大约半公吨的野生全鱼来生产一公吨的养殖海产品。相对于所“投入”(在饮食中)的鱼量，所“获得”(作为海产品)的鱼量-称为“鱼进/鱼出”(FIFO)转换率在物种之间差异很大。由大豆和渔业副产品制成的新饲料有助于降低对过度捕捞鱼类的依赖，但专家警告说，需要做更多工作以确保在不摧毁环境或耗竭海洋的其它物种的情况下扩大养鱼业。大约3/4的鱼粉和油是由捕获称为饵料鱼的小型公海(深海)鱼类产生，所述饵料鱼如凤尾鱼、鲱鱼(herring)、鲱鱼(menhaden)、毛鳞鱼、沙丁鱼(pilchard)、沙丁鱼(sardines)和鲭鱼。虽然它们几十年来一直是猪和家禽饲料的主要成分，但由于过去二十年全球水产养殖的增长，越来越多的饵料鱼资源被用于制造水产饲料。自2000年以来，水产养殖在饵料鱼捕捞中的份额几乎翻了一番，并且现在消耗近70％的全球鱼粉供应和近90％的世界鱼油。用于这些各种用途的捕获导致沙丁鱼、凤尾鱼和其它天然饵料鱼的减少。许多国家正在将船只开往南极洲，每年捕获超过20万吨小磷虾-一种企鹅、海豹和鲸鱼的主要食物来源。对于当前水产养殖实践的批评者来说，这被称为“清空食物链底端以便生产出相对便宜的蛋白质”，并被描述为“生态疯狂”。
[0013] 水产养殖前景面临的挑战是提高效率和可持续性。随着鱼粉成本上升，水产养殖生产者正在尝试开发用于水产养殖饲料的具有成本效益且健康的替代品。正在研究的潜在替代品包括来自植物的膳食和油(一般来说是蛋白质和食用油的最大来源)、鱼类加工废物、酵母、藻类、昆虫、臭虫和其它特殊膳食以及海藻。
[0014] 鱼民也逐渐转向养殖杂食性鱼类，如罗非鱼，这些鱼类可以很容易地使用含有大豆和其它谷物的饲料。罗非鱼是一种杂食性食草动物，以浮游植物、附生生物、水生植物、小型无脊椎动物、底栖动物、碎屑、细菌和与碎屑相关的细菌膜为食。尼罗罗非鱼可以通过将悬浮颗粒(包括浮游植物和细菌)截留在口腔粘液上来过滤饲料，但据报道，其主要营养来源是通过在附生生物垫上进行表面放牧获得。早期的幼年罗非鱼和幼鱼是杂食性的，主要以浮游动物和底栖动物为食，但也以碎屑、芦苇和浮游植物为食。罗非鱼胃的pH值随着饱满度而变化，并且当饱满时可以低至1.4，从而促进蓝绿色和绿色藻类和硅藻的溶解。罗非鱼对蛋白质、脂质、维生素、矿物质和碳水化合物的需求因成熟度而异。
[0015] 鱼类在早期发育阶段的饮食要求通常与成人不同。几乎所有的幼鱼(包括食草动物)通常都是食肉动物，并且以浮游动物和小型无脊椎动物(如幼虫、鱼苗和幼龄阶段的甲壳类动物)为食。大多数海洋有鳍鱼类物种的产量目前依赖于活饲料来维持有鳍鱼类幼虫度过生命的最初几周。这种活体饲料常常包含浮游动物，所述浮游动物是生活在淡水、咸水或海水或其它盐水中的微生物或小生物。浮游动物生物包括轮虫[轮虫动物门]、枝角目(例如水蚤属(Daphnia sp.)、裸腹蚤属属(Moina sp.))、亚类桡足类(例如剑水蚤)和卤虫(卤虫属)。据报道，浮游动物的经济产量目前阻碍了某些海洋有鳍鱼的成功的水产养殖。
[0016] 水产养殖的未实现潜力已经导致一些科学家、经济学家和政策制定者认为其是我们为世界新兴人口提供食物的最佳选择之一，预计到2050年人口将从70亿增加到90亿。为了充分发挥这种潜力，需要用于水产养殖饲料的新的蛋白质和其它营养物的来源。
[0017] 已经将细菌和其它微生物细胞应用于在异养发酵系统中将糖原料加工成有用的有机化合物，如蛋白质和氨基酸。然而，这些系统存在明显缺陷。异养发酵易受污染，因为可以在固定碳营养物上生长并与生产菌株竞争的其它异养微生物在直接环境中普遍存在。异养技术通常在与当前食品生产模式的竞争方面受到限制，因为基本上使用食物来源制造另一种食物来源。这可能导致许多负面的环境影响。
[0018] 除了需要新的蛋白质和其它营养来源喂养动物，这些动物又被消耗，或作为宠物饲养，或以其它方式被人类利用，需要替代蛋白质和其它营养来源供人类直接食用。这种需求特别紧迫的一个领域是人类太空飞行领域，其需要满足机组人员需求的生命支持系统-O2、H2O和食品-并消除其废物-CO2、污水和热量。食品供应是长期任务的体重和体积的主要来源。需要在不需要重新补给的情况下运行更长时间的生命支持系统。这类系统的基本要求是能够将人类和舱室废物产物转化为有用的产物，如氧气、饮用水、食品和消耗品。需要能够随着生长而食用的食品生产，并且其有助于延长可靠的自动生长和收获。生物系统的功率损失是一个重要因素。需要有效利用可靠的核和/或太阳能系统的生物系统。
[0019] 化学自养微生物代表用于碳固定过程的光合生物的一个略微探索替代品，其可以解决上文所述的许多未满足的需求，同时避免本文所述的光合作用的限制，同时仍然利用数十亿年的酶促进化以催化碳固定反应和C1原料的合成。用于将CO2和其它形式的无机碳固定到有机化合物的的由化学自养生物进行的化学合成反应由存储在无机化学物质中的势能驱动，而不是由光的辐射能量驱动[Shively等人(1998)《微生物学年评(Annu.Rev.Microbiol.)》52：191-230；Smith等人(1967)《细菌学杂志(JBacteriol)》94(4)：972-983；Hugler等人(2005)《细菌学杂志》187(9)：3020-27；Scott和Cavanaugh(2007)《应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)》73(4)：1174-79]。在化学自养生物中发生的碳固定生物化学途径包括还原性三羧酸循环、Calvin-Benson-Bassham循环[Shively等人见上文，van Kaulen等人(1998)《微生物学年评》，191-230]和Wood-Ljungdahl途径[Ljungdahl(1986)40：415-50；Lee等人(2008)《生物技术及生物工程(Biotechnology and Bioengineering)》101(2)：209-228；Fischer等人(2008)《代谢工程(Metabolic Engineering)》10：295-304]。化学自养微生物一般是可以(如在光合暗反应中)进行CO2固定，但是可以从无机外源摄取CO2固定所需的还原剂，而不是必须通过光合光反应在内部产生还原剂的微生物。仍然必须进行对应于光合作用光反应的能量收集步骤，但是其可以利用非生物过程，例如利用光伏或太阳能热技术收集光能。
[0020] 化学自养生物特别适用于CO2-有机化学物质转化的混合化学/生物过程，其中生物学步骤仅限于CO2固定。此CO2固定步骤大致对应于光合作用中发生的暗反应。这种混合化学/生物方法比用于生产生物基产品的更传统的异养或光合生物过程更少受到关注。然而，这类混合方法存在许多潜在优点，其包括能够有效组合经由数十亿年进化在固定CO2方面获得的酶促能力，与大量非生物能量转换技术(如太阳能PV、太阳热能、风能、地热，水电、或核能)，以便有效地和干净地从供电CO2碳源为总体生物化学生产过程供能。此外，在这类混合过程中，在没有直接光照要求的情况下进行碳固定的微生物可以包含在比实际用于培养光合微生物的环境更受控制和保护的环境中，所述环境更不易于水和营养物损失、污染或天气损害。竖直而不是水平结构可以更容易地满足生物反应器容量的增加，使其可能更具土地效率。混合的化学/生物系统提供CO2到有机分子过程的可能性，所述过程避免光合作用的许多缺点，同时保留从CO2和其它简单无机输入进行复杂和不同有机合成的生物能力。
[0021] 先前描述了化学自养微生物在捕获CO2气体并将CO2气体转化为固定碳的应用。然而，这些方法中的许多方法都存在缺点，这些缺点限制了其有效性、经济可行性、实用性和商业采用。
[0022] 需要打破与大规模可持续地大幅增加农业产出相关的瓶颈。与水平扩展且占地较广并且为水密集型的传统农业操作相比，需要具有紧凑性竖直扩展的生物生产。需要缓解食物与自然的冲突，和土地使用的冲突以及自然栖息地的破坏。
[0023] 气体到化学品(gas-to-chemical；GTC)技术提供允许在有机分子的生产中利用废碳源的益处。这些潜在的废物来源包括：高度木质纤维素废物-经由气化转化为合成气(synthesis gas；syngas)；和废CO2，其例如经由提供二氢从工业烟道气中捕获。合成气是一般含有H2、CO和CO2作为主要组分的混合气体，其可经由甲烷和/或液化石油气或生物气的蒸汽重整或任何有机、易燃、碳基物质的气化产生，所述碳基物质包括但不限于生物质、废有机质、各种聚合物、泥炭和煤。许多气化过程可用于生产合成气。许多气化过程使碳基原料在高温(500-1500℃)下部分氧化，限制氧供应以防止完全燃烧，从而取决于原料和反应条件产生具有不同组成的合成气，使得H2：CO的比值可以在0.5∶1到3∶1范围内。伴随合成气混合物中CO2的增加，经由在水煤气变换反应中CO与蒸汽的反应，可以升高合成气的氢组分和/或降低CO组分。
[0024] 合成气转化为化学品的一些主要技术包括化学催化方法，如费-托(Fischer-Tropsch；FT)以及甲醇或其它混合醇的合成方法，生产氨和脲的Haber-Bosch反应，以及生物合成气发酵方法。
[0025] 在气体生物过程中使用合成气和/或CO2和/或可再生H2有可能利用比经由异养或光养生物合成可能更便宜和更灵活且更可具扩展性的能源和/或碳源以用于可持续化学品和燃料的生物合成。在合成气生物过程中，合成气充当微生物培养的碳源和能源。
[0026] 基于气态原料(如合成气)的生物过程可以在有机化合物的生物合成中产生比高占地和水密集型的基于异养或光养的技术低得多的负面环境和食物生产影响。然而，目前的生物GTL和GTC技术通常产生相对短链醇或其它短链有机化合物作为主要产物。这些当前的生物转化都没有产生具有商业竞争力的氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。目前生物GTC技术中使用的合成气消耗微生物通常不太适合合成中长碳链分子，如大多数氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。
[0027] 虽然已知来自简单的C1和无机前体，如H2、CO2、CO、H2O、NH3、CH4、CH3OH、HCOH的氨基酸和肽的非生物合成，但这类方法目前与为人类、动物和其它异养生物的饮食提供蛋白质或蛋白质衍生物的生物学方法相比不具有竞争性。阻碍物理化学、非生物方法的挑战包括低产率和副反应，产生潜在有毒的副产物。
[0028] 需要鉴定一组微生物，其可以在常规和可扩展的含有的反应容器中生长，并且在商业上可行的方法中产生商业上可行的有机碳链组，特别是超过四个碳原子长的有机碳链组。需要鉴定代谢上不受典型的固定碳输入(如糖)限制的微生物，和可以另外利用合成气、生产气体以及经由H2/CO2气体混合中间产物引导的大量非生物碳源和能源用于合成滴入分子的微生物。这将导致原料灵活性远远超过可比较的异养系统。需要鉴别和使用可以利用电子供体(如氢气)的微生物进行生长和碳固定，所述电子供体存在于合成气、生产气体中并且还可以轻易通过大量非生物可再生和/或低CO2排放能量技术生成。
[0029] 需要一种从低成本或可持续的原料生产氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的生物方法。需要一种将低成本合成气和/或CO2转化为更高价值的有机化学品的生物方法，所述有机化学品包括但不限于氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。
发明内容
[0030] 响应发明人在制造本发明时已经认识到的所属领域中的需要，本文提出一种用于从低成本和可持续原料生产有机化学品的系统，所述有机化学品包括但不限于氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。在一些实施例中，本发明可以将这些高价值有机化合物的有效生产与废物碳源的处理和/或与CO2的捕获结合起来，这可以产生额外的收入和/或社会价值。
[0031] 本发明允许使用天然存在的或经工程改造的微生物将CO2气体和/或合成气和/或生产气体和/或甲烷转化为更高价值的中长链碳链长度氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。本发明技术允许开发新的天然或经典培育和/或基因增强的微生物菌株，其可用于生物气体到化学品(GTC)过程中的合成气生物加工，以产生和/或分泌各种相对长链的有机化合物，所述有机化合物是滴入，并且目前仅从高等植物农作物或动物来源中大量生产。
[0032] 本发明涉及微生物的选择和/或育种和/或工程改造，包括但不限于氢氧化、一氧化碳氧化和氢氧混合气微生物，具有在气态碳源(如合成气和/或CO2)上生长和合成生物质的天然能力，使得生产微生物在气体培养下合成目标化学产品。本发明的微生物和方法可以实现生物化学品的低成本合成，其可以与石化产品和高等植物衍生的氨基酸、蛋白质和其它生物营养物在价格方面竞争。在某些实施例中，预测这些氨基酸、蛋白质和其它生物营养物具有比经异养或微生物光养合成产生的氨基酸、蛋白质和其它生物营养物低得多的价格。
[0033] 本发明涉及一种包含微生物的组合物，所述微生物将合成气和/或气态CO2和/或CO2气体和H2气体的混合物与氮源(包括但不限于氨，铵和/或尿素)一起转化，成为一种或多种氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。在一些实施例中，所述组合物包含微生物，其中所述微生物是以下中的一种或多种：氢氧化化学自养微生物；一氧化碳氧化微生物；氢氧混合气微生物。更广泛地说，氢氧混合气微生物、耗氢微生物、一氧化碳自养菌和化学自养生物能够捕获CO2或CO作为其唯一碳源以支持生物生长。在一些实施例中，此生长包括氨基酸和蛋白质的生物合成。氢氧混合气微生物和其它耗氢微生物可以使用H2作为减少电子的来源以用于呼吸和生化合成。在本发明的一些实施例中，氢氧混合气生物和/或耗氢微生物和/或一氧化碳自养菌和/或其它化学自养微生物连同溶解在水溶液中的无机矿物质一起在气体流上生长，所述气体包括但不限于以下中的一种或多种：CO2；CO；H2。在一些实施例中，氢氧混合气微生物和/或耗氢微生物和/或一氧化碳自养菌和/或其它化学自养和/或甲烷氧化微生物将温室气体(GHG)转化为包括氨基酸和蛋白质的生物分子。
[0034] 在本发明的某些实施例中，用于捕获和转化CO2的光合系统(如基于藻类或高等植物的那些)的众所周知的缺点被规避，而经过数十亿年的发展，从CO2进行复杂的有机合成以产生有价值的生物化学物质(如但不限于氨基酸和蛋白质)的独特的生物学能力仍然被利用。
[0035] 在一些实施例中，组合物包含微生物，其中所述微生物选自红球菌属(Rhodococcus)或戈登氏属(Gordonia)。在一些实施例中，组合物包含微生物，其中所述微生物为混沌红球菌(Rhodococcus opacus)。在一些实施例中，组合物包含微生物，其中所述微生物为混沌红球菌(Rhodococcus opacus)(DSM 43205)或红球菌属(Rhodococcus sp.)(DSM 3346)。在一些实施例中，组合物包含微生物，其中所述微生物选自罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)或贪铜菌属(Cupriavidus)。在一些实施例中，组合物包含微生物，其中所述微生物为钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。在一些非限制性实施例中，钩虫贪铜菌的菌株为DSM 531或DSM 541。
[0036] 在一个方面，提供天然或经工程改造的微生物，其能够将气态底物(如生产气体或合成气或含有H2和CO2和/或CO和/或CH4的另一种气体混合物)转化为氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。微生物使用气态底物作为碳源和/或能源。在一些实施例中，能够在气态底物上生长的微生物用编码氨基酸、蛋白质或其它生物营养物的生物合成所需基因的多核苷酸转化。在一些实施例中，从微生物细胞或微生物生长培养基中回收氨基酸、蛋白质、其它生物营养物或全细胞产物。可用于本文所述的微生物生长过程的生产气体可以来自包括废物原料和/或生物质残余物原料的气化的来源，或来自工业过程的废气或天然气或生物气的蒸汽重整。
[0037] 在一个方面，提供非天然存在的微生物，其能够作为碳源和/或能源在气态底物上生长，并且其中所述微生物包括至少一种外源核酸。在一些实施例中，微生物为细菌细胞。举例来说，在一些实施例中，细菌细胞为贪铜菌属或罗尔斯通氏菌属，例如但不限于杀虫贪铜菌。在一些非限制性实施例中，微生物为杀虫贪铜菌DSM 531或DSM 541。在一些非限制性实施例中，微生物为罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)N-1，DSM 13513。
[0038] 在一些实施例中，气态底物包括CO2作为碳源。在一些实施例中，气态底物包括H2和/或O2作为能源。在一些实施例中，气态底物包括生产气体、合成气或热解气体。在一些实施例中，气态底物包括气体混合物，其包含H2和/或CO2和/或CO。
[0039] 在一些实施例中，当在气体底物存在下在适于微生物生长和生物产物生产的条件下培养时，微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。
[0040] 在一些实施例中，外源基因由非天然存在的微生物中的编码序列编码，所述微生物携带在广宿主范围质粒上。在一些实施例中，外源基因编码序列处于非天然诱导型启动子的控制之下。在一些实施例中，诱导型启动子衍生自大肠杆菌(E.coli)ara操纵子。
[0041] 在一些实施例中，外源基因的编码序列(CDS)经密码子优化以在如本文所述的微生物中表达，所述微生物例如但不限于罗尔斯顿菌属(Ralstonia)或贪铜菌属物种，例如杀虫贪铜菌。
[0042] 在另一方面，提供使用如本文所述的经工程改造微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的方法，所述经工程改造微生物能够在气态底物上作为碳源和/或能源生长，并且包括至少一种外源核酸。在一些实施例中，在适合于微生物生长的条件下，如本文所述的非天然存在的微生物在生物反应器中培养，所述生物反应器包括气态底物和培养基(例如液体生长培养基)，所述培养基包括用于生长和生物产物生产的其它营养物，其中微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。
[0043] 在一些实施例中，生物反应器中的气态底物包括H2和/或CO2。在一些实施例中，气态底物为生产气体、合成气或热解气体。在一些实施例中，气态底物为天然气或生物气。在一些实施例中，气态底物衍生自城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、生物气、酸气、甲烷水合物、轮胎、石油焦、污水、粪肥、秸秆、木质纤维素能源作物、木质素、作物残余物、甘蔗渣、锯屑、林业残余物、食物垃圾、废地毯、废塑料、垃圾填埋气和/或木质纤维素生物质。
[0044] 在一些实施例中，从培养基中回收氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。在一些实施例中，培养基为包括水相和有机相的双相液体培养基，并且通过在有机相中的提取或反应性提取来回收氨基酸、蛋白质和/或其它生物营养物。
[0045] 另一方面，提供用于产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的微生物和方法。在一些实施例中，提供天然或非天然存在的微生物，其能够作为碳源和/或能源在气态底物上生长，其中所述微生物包括零或至少一种外源核酸，并且其中所述微生物生物合成氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。在一些实施例中，提供一种用于在如本文所述的天然或非天然存在的微生物中产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的方法，所述微生物能够在气态底物上作为碳源和/或能源生长，包括零个或一个或多个外源核酸，并且生物合成氨基酸、蛋白质和其它生物营养物，所述方法包括在适合微生物生长和氨基酸、蛋白质和其它生物营养物生产的条件下，在包括气态底物和培养基的生物反应器中培养天然或非天然存在的微生物(例如液体生长培养基)，所述培养基包括用于生长和生物产品生产的其它营养物，其中所述微生物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。
[0046] 在一些实施例中，本发明的微生物用于从工业烟道气中捕获CO2并产生富含蛋白质的生物质。在一些实施例中，这种富含蛋白质的生物质是商品。在一些实施例中，富含蛋白质的生物质用作单细胞蛋白质(single cell protein；SCP)。在一些实施例中，富含蛋白质的生物质用作水产养殖饲料或用于水产养殖饲料配制物或肥料。在一些实施例中，富含蛋白质的生物质用作水产养殖和/或其它动物饲料和/或植物肥料产品中使用的鱼粉的高蛋白质替代物。在一些非限制性实施例中，本发明既用于GHG还原，又用于生产用于包括但不限于动物饲料或鱼粉、酪蛋白、乳清或大豆粉的替代品的应用的高蛋白产品。
[0047] 在一个方面，提供一种生物和化学方法，其用于捕获并转化仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子，成为经由合成代谢生物合成产生的含有两个或更多个碳原子的有机分子，所述方法包含：将仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子引入适于维持化学自养微生物的环境；将气态底物引入适于维持化学自养微生物的环境中；其中仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子被微生物用作碳源以用于生长和/或生物合成；经由至少一种化学合成碳固定反应和化学自养微生物中包含的至少一种合成代谢生物合成途径，在环境内将仅含有一个碳原子的无机和/或有机分子转化为含有两个或更多个碳原子的有机分子产物；其中化学合成固定反应和合成代谢生物合成途径至少部分地由电子供体和电子受体提供的化学和/或电化学能量驱动，所述电子供体和电子受体已经化学和/或电化学和/或热化学地产生和/或从环境外部的至少一个来源引入环境中。
[0048] 在一些实施例中，所述微生物为细菌细胞。在一些实施例中，所述微生物为氢氧混合气微生物。在一些实施例中，所述微生物为贪铜菌属或罗尔斯顿菌属。在一些实施例中，所述微生物为杀虫贪铜菌。在一些实施例中，微生物包括选自以下属中的一种或多种的微生物：贪铜菌属、红球菌属、氢弧菌属(Hydrogenovibrio sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)、戈登氏属、节细菌属(Arthrobacter sp.)、链霉菌属(Streptomycetes sp.)、红杆菌属(Rhodobacter sp.)和/或黄色杆菌属(Xanthobacter)。
[0049] 在一些实施例中，所述气态底物包含CO2作为碳源。在一些实施例中，所述气态底物包含H2和/或O2作为能源。在一些实施例中，所述气态底物包含热解气体或生产气体或合成气。在一些实施例中，所述气态底物包含气体混合物，所述气体混合物包含H2和/或CO2和/或CO。在一些实施例中，所述气态底物包含H2和/或CO2。
[0050] 在一些实施例中，当在气体底物存在下在适于微生物生长和生物产物生产的条件下培养时，所述微生物产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。在一些实施例中，从培养基中回收氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
[0051] 在一些实施例中，由所述微生物产生的所述微生物和/或营养物用于向一种或多种其它生物馈送或提供营养。
[0052] 在一些实施例中，所述气态底物为热解气体或生产气体或合成气。在一些实施例中，所述气态底物衍生自城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、生物气、酸气、甲烷水合物、轮胎、石油焦、污水、粪肥、秸秆、木质纤维素能源作物、木质素、作物残余物、甘蔗渣、锯屑、林业残余物、食物垃圾、废地毯、废塑料、垃圾填埋气和/或木质纤维素生物质。
[0053] 在一些实施例中，所述电子供体和/或仅含有一个碳原子的分子经由作用于有机质的热化学过程产生，所述有机物质包含以下中的至少一种：气化；热解；蒸汽重整；自动重整。在一些实施例中，所述电子供体和/或仅含有一个碳原子的有机分子经由甲烷蒸汽重整产生。在一些实施例中，在将气体输送到微生物之前，使用水煤气变换反应调节来自气化和/或热解和/或自动重整和/或蒸汽重整的输出气体中的氢气与一氧化碳的比率。
[0054] 在一些实施例中，所述电子供体和/或电子受体使用温室气体排放较低的可再生、替代或常规电源产生或回收，并且其中所述电源选自以下中的至少一种：光生伏打、太阳热能、风能、水电、核能、地热、增强地热、海洋热能、海浪能和潮汐能。
[0055] 在一些实施例中，所述电子供体和/或电子受体在电网供电超过电网需求期间使用电网电力产生，并且其中储存罐缓冲所述电子供体和/或电子受体的产生，以及其在所述化学合成反应中的消耗。
[0056] 在一些实施例中，分子氢充当电子供体并且通过使用以下中的至少一种的方法产生：水的电解；水的热化学分解；盐水电解；硫化氢的电解和/或热化学分解。在一些实施例中，使用以下中的一种或多种进行用于产生氢的水电解：质子交换膜(Proton Exchange Membranes；PEM)、液体电解质(如KOH)、碱性电解、固体聚合物电解质电解、高压电解、高温蒸汽电解(high temperature electrolysis of steam；HTES)。在一些实施例中，使用以下中的一种或多种进行用于产生氢的水的热化学分解：氧化铁循环、氧化铈(IV)-氧化铈(III)循环、锌-氧化锌循环、硫-碘循环、铜-氯循环、钙-溴-铁循环、杂化硫循环。
[0057] 在一些实施例中，分子氢充当电子供体并且经由已知产生氢伴随低或无二氧化碳排放的电化学或热化学过程产生，所述电化学或热化学过程包括以下中的一种或多种：实现碳捕获和封存(carbon capture and sequestration；CCS)的甲烷蒸汽重整；实现CCS的煤气化；Kvaemer工艺和产生碳黑产品的其它工艺；实现CCS的生物质的气化或热解；产生生物炭副产物的生物质的热解。
[0058] 在一些实施例中，所述电子供体包括但不限于以下中的一种或多种：氨；铵；一氧化碳；连二亚硫酸盐；元素硫；烃类；偏亚硫酸氢盐；一氧化氮；亚硝酸盐；硫酸盐，如硫代硫酸盐，包括但不限于硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3)；如硫化氢的硫化物；亚硫酸盐；硫代硫酸盐；连亚硫酸盐；呈溶解相或固相的过渡金属或其硫化物、氧化物、硫属化物、卤化物、氢氧化物、氢氧化合物、硫酸盐或碳酸盐；和固态电极材料中的导电或价带电子。在一些实施例中，所述电子受体包含以下中的一种或多种：二氧化碳；氧；亚硝酸盐；硝酸盐；三价铁或其它过渡金属离子；硫酸盐；或固态电极材料中的价带或导电带孔。
[0059] 在一些实施例中，所述生物转化步骤之前是一个或多个化学预处理步骤，在所述化学预处理步骤中，所述微生物所需的所述电子供体和/或电子受体和/或碳源和/或矿物质营养物从至少一种输入化学品中产生和/或精制，和/或从来自所述碳固定步骤的化学品回收，和/或由来自其它工业、采矿、农业、污水或废物产生过程的废物流产生或包含在其中。
[0060] 在一些实施例中，有机化学产品包括具有五个碳或更长碳的碳主链的化合物。
[0061] 在一些实施例中，提供用于产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质的方法，其包含在适合微生物生长和氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质生产的条件下，在生物反应器中培养如本文所述的微生物，所述生物反应器包含气态底物和包含用于生长和生物产品产生的其它营养物的培养基，其中所述微生物产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。
[0062] 在一些实施例中，至少一种化学合成反应和至少一种合成代谢生物合成途径导致生物化学物质的形成，所述生物化学物质包括以下中的至少一种：氨基酸；肽；蛋白质；脂质；多糖；和/或维生素。
[0063] 在一些实施例中，生物质和/或生物化学物质经由所述至少一种化学合成反应产生，并且其中所述生物质和/或生物化学物质具有作为以下中的至少一种的应用：作为用于发酵的有机碳和/或氮源；作为用于其它微生物或生物生长的营养源；作为人类的营养源或食物成分；作为动物的饲料；作为制造或化学过程的原料或化学中间产物；作为医药、药用或营养物的来源；作为肥料；作为土壤添加剂；和/或作为土壤稳定剂。
[0064] 在一些实施例中，来自所述化学合成反应的碳和/或氮源用于发酵以产生生物化学品，所述生物化学品包括以下中的至少一种：商业酶、抗生素、氨基酸、蛋白质、食品、食品成分；维生素、脂质、生物塑料、多糖、营养保健品、药品。在一些实施例中，所述动物饲料用于馈送以下中的一种或多种：牛、羊、鸡、猪、鱼、贝类、昆虫、脊椎动物、珊瑚。在一些实施例中，使用从C1源生物合成的营养物生长所述贝类或珊瑚，产生碳酸盐材料，所述碳酸盐材料将CO2隔离成具有高反照率的固体矿化形式。
附图说明
[0066] 将参考附图借助于实例描述本发明的非限制性实施例，附图中的一些是示意性的并且不意欲按比例绘制。为了清晰，并未在每一个图中标注每一个组件，也未示出本发明的每个实施例的每一个组件，其中图示对本领域普通技术人员理解本发明不是必须的。
[0067] 图1展示氢氧混合气微生物的代谢途径。
[0068] 图2展示光密度(OD)与生物量密度之间的相关性。
[0069] 图3展示杀虫贪铜菌在气体中的血清瓶生长中的生长曲线。
[0070] 图4展示对于在气体上的血清瓶生长中的杀虫贪铜菌的生长，顶部空间压力随时间的变化。
[0071] 图5展示血清瓶中杀虫贪铜菌消耗的每摩尔H2产生的干生物量。
[0072] 图6展示在生物反应器中在H2/CO2/O2上生长的氢氧混合气微生物杀虫贪铜菌的生长曲线。
[0075] 图9展示红球菌属的脂肪酸谱DSM 3346。
[0076] 图10展示用于在气体上生长杀虫贪铜菌的生物反应器和支持系统的示意图。
[0077] 图11展示两个20L生物反应器，其在通风橱中使杀虫贪铜菌在气体上生长。
[0079] 图13展示试管，其含有杀虫贪铜菌的粗己烷提取物，所述提取物包含油和聚合物。
[0080] 图14展示从杀虫贪铜菌中提取的油样品，所述杀虫贪铜菌在作为唯一碳源的CO2和作为氢和电子的唯一来源的H2上生长。
[0081] 图15展示超声处理前为棕色(左图所示)和超声处理后(如右图所示)的杀虫贪铜菌的生物质浆液。在超声处理之前，浆液具有棕色，并且在超声处理之后，在完全细胞破碎的情况下，生物质的颜色从棕色变为奶油色。
[0082] 图16展示从杀虫贪铜菌提取的油中存在的脂肪酸的碳链长度分布。
[0083] 图17展示在生物反应器中在H2、CO2和O2气体的混合物上生长的海洋氢弧菌(Hydrogenovibrio marinus)菌株DSM 11271。
[0084] 图18展示示意性地示出的用于生长荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)菌株DSM 1710的气体递送系统和培养瓶。
[0085] 图19展示荚膜红假单胞菌的显微照片。
[0086] 图20展示离心后回收的荚膜红假单胞菌生物质的球团。
[0087] 图21展示用于在作为用于生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)菌株DSM 432的两升玻璃发酵罐系统的示意图。
[0088] 图22展示示意性示出的图21中描绘的生物反应器的磁头板。
[0089] 图23展示用于生长自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)的反应器系统的示意图，所述反应器系统包括压力计；气体流量计；安全和止回阀；0.2微米过滤器；生物反应器容器、传感器、激活器和控制器；冷凝器和泡沫捕集器；和出风口。
[0090] 图24展示用于生长自养黄杆菌的气体递送系统的示意图。
[0091] 图25展示自养黄杆菌的OD600与细胞干重(cell dry weight；CDW)之间的相关性。
[0092] 图26展示在H2/CO2/O2上生长的氢氧混合气微生物自养黄杆菌的生长曲线。
[0093] 图27展示用于生产水产养殖饲料的CO2+可再生H2。
[0094] 图28展示具有化学自养初级生产者的复合多阶段生命支持系统或生态系统。
[0095] 图29展示杀虫贪铜菌系统的部分材料平衡。
[0096] 图30展示杀虫贪铜菌闭环生命支持系统的示意流程图。
[0097] 图31展示由能够进行氢氧反应以产生用于动物饲料或其它营养物或营养制品的富含蛋白质的生物质的微生物进行的捕获CO2的实施例的工艺流程图。
[0098] 图32展示将废CO2和非高峰间歇性可再生能量转化成高蛋白饲料、肥料和营养物的集成系统的示意图。除了CO2的捕获和有价值营养物的产生，在低需求期间所述系统减轻电网由于过量可再生发电而产生的压力。通过允许可再生能源即使在低需求时期也能继续产生，其还可以更充分地利用可再生能源。
具体实施方式
[0099] 本文提供用于氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的生物合成生产的方法和系统。在某些实施例中，提供在气态底物上产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的天然或经工程改造微生物，所述气态底物包括但不限于生产气体、合成气、尾气、热解、氢氧混合气和含有H2和CO2，和/或CO和/或CH4的气体混合物。气态底物可以用作碳和/或能源和/或电子供体和/或电子受体的来源，以用于微生物的生长和生物产物的生物合成。
[0100] 在某些实施例中，本发明主题包含能够在合成气或生产气体和/或H2和/或CO2，和/或CO和/或CH4和/或其它废气上生长的野生型或经工程改造微生物，所述微生物能够产生包括但不限于赖氨酸和/或甲硫氨酸的氨基酸。
[0101] 在本发明的某些实施例中，氨基酸和/或肽，和/或蛋白质和/或维生素由简单的C1和无机前体合成，所述无机前体包括但不限于以下中的一种或多种：H2、CO2、CO、H2O、NH3、CH4、CH3OH、HCOH、脲。
[0102] 在一些实施例中，本发明涉及产生一种或多种氨基酸或蛋白质或维生素的方法，其包含将细菌细胞暴露于合成气和/或生产气体和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4；其中所述细菌细胞能够将气态CO2和/或其它C1分子固定到一种或多种氨基酸或蛋白质或维生素，并且其中所述微生物包含零或至少第一种外源核酸。在一些实施例中，细胞利用所述气态底物作为还原当量和/或代谢能的来源，以用于合成一种或多种氨基酸或蛋白质或维生素。在一些实施例中，微生物通过其天然机器产生氨基酸和/或蛋白质和/或维生素。
[0103] 在一些实施例中，本发明涉及产生氨基酸和/或蛋白质和/或蛋白质生物质和/或维生素的方法，其中所述方法包含在生物反应器或溶液中用包含合成气和/或生产气体和/或CO2和/或H2气体和/或CO和/或CH4的原料培养天然菌株或经工程改造微生物。
[0104] 在一些实施例中，本发明涉及包含本文所述的组合物或细菌或微生物细胞的生物反应器。在一些实施例中，本发明涉及用于产生一种或多种氨基酸、蛋白质或营养物的系统，其包含生物反应器，其包含：(a)包含本文所述的细胞的微生物群体；(b)连接到原料源的入口，其允许递送包含合成气或生产气体和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4的原料。
[0105] 在本发明的另一个方面，本发明涉及在包含本文所述的细胞或组合物的微生物群体中产生分子或分子混合物的方法，其中所述方法包含：在包含合成气或生产气体和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4的原料中培养包含本文描述的细胞或组合物的微生物群体。
[0106] 在一些实施例中，本发明涉及在包含本文所述的组合物的细胞的微生物群体中产生氨基酸，或蛋白质或其它营养物的方法，其中所述方法包含：在包含合成气或生产气体和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4的原料中培养包含本文所述的细胞或组合物的微生物群体。
[0107] 在一些实施例中，本发明涉及制备一种或多种氨基酸或蛋白质或其它营养物的方法，其包含(a)在合成气或生产气体和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4存在下在反应容器或生物反应器中培养本文所述的细胞，其中所述细胞产生和/或分泌一种或多种氨基酸，或蛋白质或其它营养物，其数量等于或大于至少10％细胞的总干细胞质量；和(b)从反应容器中分离一种或多种氨基酸，或蛋白质，或其它营养物，或全细胞产物。在一些实施例中，所述方法进一步包含在从反应容器或生物反应器中分离后纯化一种或多种氨基酸，或蛋白质，或其它营养物，或全细胞产物。在一些实施例中，一种或多种氨基酸，或蛋白质，或其它营养物，或全细胞产物是提供给另一种生物的饲料或营养物供应或肥料的组分，或其前体，或包括在其中。在某些非限制性实施例中，其它生物为异养生物，并且在某些这类实施例中，动物包括但不限于以下中的一种或多种：浮游动物、贝类或其它无脊椎动物、鱼、鸟或哺乳动物。
[0108] 在一些实施例中，本发明涉及产生一种或多种氨基酸的方法，其包含将细菌细胞和/或古细菌细胞和/或其它微生物细胞暴露于合成气和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4；其中所述细胞能够将气态CO2和/或其它C1碳源固定到一种或多种氨基酸和/或蛋白质和/或维生素；其中所述化合物从生物反应器中回收并进料到第二个或更多个另外的反应器和/或工艺步骤，其中所述化合物经过后处理以产生包括但不限于以下中的一种或多种的产物：肥料、水产养殖饲料、动物饲料、人体营养或维生素。
[0109] 在一些实施例中，本发明提供经由化学和生物过程从含二氧化碳的气流和/或大气二氧化碳或呈溶解、液化或化学结合形式的二氧化碳捕获二氧化碳的组合物和方法，所述化学和生物过程利用专性或兼性化学自养微生物，并且特别是化学自养生物，和/或含有来自一个或多个碳固定过程步骤中的化学自养微生物的酶的细胞提取物。本发明还提供用于回收、加工和使用化学合成反应的化学产物的组合物和方法，所述化学合成反应由化学自养生物进行以将无机碳固定到作为中间或成品化学品的有机化合物，其包括但不限于氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。本发明还提供产生、加工和递送化学合成和维持化学自养培养物所需的化学营养物的组合物和方法，其包括但不限于提供化学合成所需的电子供体和电子受体。本发明还提供用于维持有利于化学合成和化学自养生长的环境，以及回收和再循环未使用的化学营养物和工艺用水的组合物和方法。
[0110] 在一些实施例中，本文公开的微生物经重组工程改造以表达一种或多种酶，以进行氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的生物合成生产。在一些实施例中，底物或中间产物转向微生物细胞中氨基酸、蛋白质和/或其它生物营养物(例如乙酰-CoA、丙酮酸或丙二酰-CoA)的合成。在一些非限制性实施例中，沿着各种生物合成途径的一些碳通量部分被引导到靶向氨基酸、蛋白质和其它生物营养物的生物合成中。
[0111] 本发明的某些实施例的一个特征为在C1碳源转化的整个过程内包括一个或多个工艺步骤，其利用化学营养微生物和/或来自化学营养微生物的酶作为生物催化剂，以用于将C1化学品转化为较长碳链有机分子(即C2或更长，并且在一些实施例中，C5或更长的碳链分子)，所述C1碳源包括但不限于一氧化碳、甲烷、甲醇、甲酸盐或甲酸，和/或含有C1化学品的混合物，所述混合物包括但不限于由各种气化、热解或蒸汽重整的固定碳原料和/或甲烷原料产生的各种合成气组合物。在一些这类实施例中，将含C1合成气或工艺气体或呈液体形式或溶解于溶液中的C1化学品泵送或以其它方式添加到含有营养培养基和化学营养微生物的容器或外壳中。在一些这类情况下，化学营养微生物使用以下各者进行生物化学合成以将C1化学物质延长成更长的碳链有机化学物质：存储在C1化学物质中的碳和电子，和/或来自分子氢和/或固态电极材料中的价态或导电电子和/或泵送到或以其它方式提供给营养培养基的电子供体的以下列表中的一种或多种的电子或氢，其包括但不限于以下中的一种或多种：氨；铵；一氧化碳；连二亚硫酸盐；元素硫；烃类；偏亚硫酸氢盐；一氧化氮；亚硝酸盐；硫酸盐，如硫代硫酸盐，包括但不限于硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3)；如硫化氢的硫化物；亚硫酸盐；硫代硫酸盐；连亚硫酸盐；呈溶解相或固相的过渡金属或其硫化物、氧化物、硫属化物、卤化物、氢氧化物、氢氧化合物、硫酸盐或碳酸盐。电子供体可以在化学合成呼吸反应中被电子受体氧化。在某些实施例中，用于本发明的微生物呼吸的电子受体包括但不限于以下中的一种或多种：氧气、二氧化碳、三价铁或其它过渡金属离子、硝酸盐、亚硝酸盐、氧气、或固态电极材料中的电洞。在某些非限制性实施例中，所述化学营养微生物为氢氧混合气或氢氧微生物。
[0112] 在某些实施例中，本发明涉及包含零个或多个外源核酸序列的化学营养细菌菌株。本发明部分地源于以下发现：化学营养细菌和特定的相关微生物在化学品、蛋白质、饲料、肥料、单体、油、燃料和来自气态和废碳原料的其它生物物质的经济和大规模生产中提供无法预料的优势，以及用于修饰这些微生物以改善在这些应用中的性能的基因技术和系统的发现。由本发明的微生物合成的蛋白质、脂质和其它生物化学物质可以应用于包括但不限于以下各者的用途：石油化学替代品、单体、用于生产聚合物的原料、润滑剂、作为肥料中的成分、动物饲料、食品、个人护理品和化妆品。在本发明的一些实施例中，可以使用酶促和化学过程产生维生素、氨基酸和/或蛋白质。一些实施例使得能够生产动物饲料和/或肥料。此外，本发明提供培养和/或修饰化学营养细菌以实现改进的氨基酸和/或蛋白质产率和/或降低的生产成本的方法。在一些实施例中，与未经基因修饰的相同细菌相比，经基因修饰的细菌产生更多某种类型或多种类型的维生素或氨基酸分子。
[0113] 本发明涉及赋予所述碳基产物(包括但不限于专性或兼性化学营养生物中的化学物质、单体、聚合物、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、营养品或药物产品或其中间产物)的生产和/或分泌的方法和机制，使得这些生物将二氧化碳和/或其它形式的无机碳和/或合成气和/或其它C1化合物(如甲醇和/或热解反应的液体、气态和固体产物，如热解气体和/或油)转化为所关注碳基产物，并且特别是这类生物用于化学品、单体、聚合物、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、动物饲料、肥料、营养品或药物产品或其中间产物的商业生产的用途。
[0114] 在一些实施例中，本发明还提供与化学合成反应步骤串联和/或并联发生的化学处理步骤的组合物和方法：将未精制的原料输入化学品转化为适于支持化学合成碳固定步骤的更加精制的化学品；将能量输入转换成可用于驱动化学合成的化学形式，并且特别转化为呈电子供体和电子受体形式转化为化学能；在适于支持化学合成碳固定的条件下，将从工业或大气或水生源捕获的无机碳引入碳固定步骤或所述过程的步骤；进一步将化学合成碳固定步骤的输出产物加工成适于储存、运输和销售的形式，其中所述产物包括但不限于氨基酸和/或蛋白质和/或维生素和/或生物质。完全化学的非生物工艺步骤与生物化学合成碳固定步骤的组合构成本发明的总碳捕获和转化过程。与其它生命形式相比，本发明利用将化学自养微生物整合在化学过程流内作为生物催化剂的独特容易性。虽然不打算受到理论限制，但这种独特的能力和设施似乎源于化学自养生物通过其化学合成存在方式自然地作用于生物和非生物化学物质的界面处的事实。
[0115] 除非另外定义，否则在本文中本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。Singleton等人，《微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)》，第二版，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)，纽约(New York)(1994)和Hale&Markham，《哈珀柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology)》，哈珀永久(Harper Perennial)，纽约(NY)(1991)向技术人员提供了本发明中所用的许多术语的通用词典。类似于或等效于本文中所描述的任何方法和材料的任何方法和材料可用于实践或测试本发明。
[0116] 除非另外指明，否则本发明的实践将采用所属领域技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。以下文献中充分解释了这类技术，例如：《分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1994)；《PCR：聚合酶链反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《基因转移和表达实验指南(Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual)》(Kriegler，1990)。
[0117] 本文中所提供的数值范围包括界定所述范围的数目。
[0118] 除非另外指明，否则分别地，核酸以5′到3′定向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基定向从左到右书写。
[0119] 定义
[0120] 除非上下文明确规定，否则“一(a/an)”和“所述”包括多个引用，因此除非明确相反地指示，否则如本文中在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一(a/an)”和“所述”应理解为意味“至少一个”。
[0121] 如本文中在说明书中和在权利要求书中所使用，短语“和/或”应理解为意指如此结合的元件中的“任一者或两者”，即，元件在一些情况下结合地存在并且在其它情况下分离地存在。除非明确相反指示，否则除通过“和/或”条目所具体地识别的元件以外的其它元件可视情况存在，而无论它们与所具体地识别的元件相关或不相关。因此，作为非限制性示例，当与如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施例中指代A而没有B(任选地包括除B以外的元素)；在另一个实施例中，指代B而没有A(任选地包括除A以外的元素)；在又一个实施例中，指代A和B两者(任选地包括其它元素)；等。
[0122] 当提及如量、暂时持续时间等的可测量值时，如本文所用的术语“约”意味着涵盖从指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％变化，因为这类变化适合于执行所公开的方法。
[0123] 术语“氨基酸”指代含有与称为α-碳的碳结合的胺基和羧基的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-和L-异构体，以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。在一些实施例中，单个“氨基酸”可具有多个侧链部分，如每个延伸的脂芳族或芳香族主链支架可获得的。除非上下文另外明确说明，否则如本文所用的术语氨基酸意欲包括氨基酸类似物。
[0124] 术语“Aufwuchs”(德语中的“表面生长”或“过度生长”)是粘附在水生环境中的开放表面的小动物和植物的集合，如有根植物的部分。在海洋和淡水环境中，藻类-尤其是绿藻和硅藻-构成aufwuchs群体的主要组成部分。小型甲壳类动物、轮虫和原生动物也常见于淡水和海洋中，但昆虫幼虫、寡毛类动物和缓动动物是淡水水流动物群所特有的。
[0125] 术语“生物质”指代通过细胞的生长和/或繁殖产生的物质。生物质可含有细胞和/或细胞内内容物以及细胞外物质，包括但不限于细胞分泌的化合物。
[0126] 术语“生物反应器”或“发酵罐”指代其中生长和维持细胞的封闭或部分封闭的容器。细胞可以但不必保持在液体悬浮液中。在一些实施例中，细胞可以替代地生长和/或保持与另一种非液体底物接触，保持在非液体底物上或非液体底物内，所述非液体底物包括但不限于固体生长支持材料。
[0127] 术语“催化剂”指代化学参与者，例如分子或大分子结构，其加速化学反应发生的速度，其中一种或多种反应物转化为一种或多种产物，而催化剂本身不转化为产物，或在化学反应完成时以其它方式改变或消耗。在催化剂参与一个化学反应后，因为其没有变化，所以其可能参与进一步的化学反应，作用于另外的反应物以产生额外的产物。为了加速化学反应，催化剂降低了反应途径上的活化能障碍，使其在较冷的温度下发生，或在给定的温度下更快地发生。以这种方式，可以实现系统更快速地达到化学平衡的方法。催化剂包含作为蛋白质催化剂的酶。
[0128] 术语“纤维素材料”指代具有高纤维素量的任何材料，其为具有式(C6H10O5)n的多醣，一般由数百到数千β(1→4)连接的d葡萄糖单体组成。纤维素材料的来源包括但不限于纸板、棉花、玉米秸秆、纸张、木屑、锯末、甜菜浆、甘蔗根和柳枝稷。
[0129] 术语“CoA”或“辅酶A”指代用于缩合参与脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化、乙酰基或其它酰基转移以及其它乙酰化的酶的有机辅因子。
[0130] 术语“辅因子”包括酶发挥其催化活性所需的所有分子。在一些实施例中，辅因子是与底物分开的任何分子。
[0131] 在权利要求书以及说明书中，所有过渡短语，如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等都应是被理解为开放式的，即包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语。
[0132] 术语“外源基因”指代已经重组导入细胞的核酸，其编码RNA和/或蛋白质的合成。在一些实施例中，通过转化引入外源基因。在一些实施例中，通过电穿孔将外源基因引入细胞中。转化细胞可以称为重组细胞，其中可以引入另外的外源基因。放入宿主物种中的外源基因可以来自不同的物种(这称为异源)，或其可以天然存在于同一物种内(这是如下定义的同源物)。因此，外源基因包含整合在不同于基因天然存在的位置的基因组、附加体或质粒的区域内或引入其中的同源基因。可以将外源基因的多个复本引入细胞中。外源基因可以超过一个复本存在于宿主细胞或转化细胞内。在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到10,000个范围内(包括1和10,000个)复本。在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到10,00个范围内(包括1和10,00个)复本。在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到10,000个范围内(包括1和10,000个)复本。
在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到10,00个范围内(包括1和10,
00个)复本。在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到500个范围内(包括1和500个)复本。在一些实施例中，外源基因由细胞维持为进入基因组的插入或作为附加分子。在一些实施例中，微生物包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、
80、90、100或1000个编码一种或多种外源蛋白质的一种或多种核酸的复本。
在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到10,00个范围内(包括1和10,
00个)复本。在一些实施例中，微生物包含编码外源蛋白质的核酸的在1到500个范围内(包括1和500个)复本。在一些实施例中，外源基因由细胞维持为进入基因组的插入或作为附加分子。在一些实施例中，微生物包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、
80、90、100或1000个编码一种或多种外源蛋白质的一种或多种核酸的复本。
[0133] 如本文所用，术语“可表达形式”指代含有可操作地连接于编码序列的必需调节元件，使得当存在于细胞中时，将表达编码序列的基因构建体，所述编码序列编码能够赋予细胞酶活性的酶或其片段。在本发明的一些实施例中，包含本发明的微生物或细菌细胞的组合物包含不超过10种外源核酸序列的可表达形式。
[0134] 术语“木质纤维素材料”是由纤维素、半纤维素和木质素构成的任何材料，其中碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)与木质素紧密结合。木质纤维素材料包含农业残留物(包括玉米秸秆和甘蔗渣)、大多数生物质能源作物、木材残余物(包括锯木厂和造纸厂废弃物)以及大部分城市垃圾。
[0135] 术语“脂质”指代可以溶解在非极性溶剂(如但不限于氯仿和/或醚)中并且在水中也具有低溶解度或无溶解度的分子类别。脂质分子的疏水特性通常由分子内存在长链烃部分引起。脂质含有以下分子类型：烃、脂肪酸(饱和和不饱和)、脂肪醇、脂肪醛、羟基酸、二酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、鞘脂、甾醇(如胆固醇和类固醇激素)、脂溶性维生素(如维生素A、D、E和K)、聚酮化合物、萜类化合物和蜡。
[0136] 术语“裂解物”指代含有由细胞裂解产生的混合物和/或细胞内容物溶液的液体。在一些实施例中，本发明的方法包含细胞裂解物中化学品或化学品混合物的纯化。在一些实施例中，本发明的方法包含在细胞裂解物中氨基酸和/或蛋白质的纯化。
[0137] 术语“裂解”指代质膜和如果存在细胞的细胞壁的破裂，使得大量的细胞内物质逃逸到细胞外空间。可以使用电化学、机械、渗透、热或病毒手段进行裂解。在一些实施例中，本发明的方法包含进行本文所述的细胞或微生物的裂解，以便使化学品或化学品的混合物与生物反应器的内容物分离。在一些实施例中，本发明的方法包含进行本文所述的细胞或微生物的裂解，以便使氨基酸或氨基酸和/或蛋白质的混合物与生物反应器的内容物分离。
[0138] 如本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。举例来说，当在列表中分隔多个项目时，“或”或“和/或”将解释为包括性的，即，包括至少一个，但也包括数个元件或元件列表中的超过一个元件和任选地额外未列出的项目。只有明确相反指示的术语，如“仅仅……中的一个”或“恰好……中的一个”或当在权利要求书时使用时“由……组成”将指代包括多个元件或元件列表中的恰好一个元件。一般来说，如本文所使用的术语“或”当前面有排它性术语(例如“...中的任一个”、“...中的一个”、“仅仅...中的一个”或“恰好...中的一个”、基本上由...组成”)时将仅仅解释为指示排它性的替代方案(即，“一个或其它但不是两个”)时，在用于权利要求中时，将具有其用于专利法领域的普通含义。
[0139] “附生生物”为藻类、蓝细菌、异养微生物和碎屑的复杂混合物，其附着在大多数水生生态系统的水下表面。其充当无脊椎动物、蝌蚪和一些鱼类的重要食物来源。
[0140] “滴度”指代在微生物发酵过程中每单位体积由微生物产生的物质的量。举例来说，生物量滴度可以表示为每升溶液产生的生物量的克数。
[0141] “产量”指代由进料(例如糖)产生的产物相对于如果所有进料物质转化为产物将产生的物质总量的量。举例来说，氨基酸产率可以表示为相对于如果100％的进料转化为氨基酸的理论产率，所产生的氨基酸的％。
[0142] “生产力”指代在微生物发酵过程中每单位时间每单位体积由微生物产生的物质的量。举例来说，生物质生产率可以表示为每小时每升溶液产生的生物质的克数。
[0143] 如本文中所使用，术语“多核苷酸”指代具有任何长度和任何三维结构和单链或多链(例如单链、双链、三重螺旋等)的聚合物形式的核苷酸，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或经修饰形式，其包括经修饰核苷酸或碱基或其类似物。由于遗传密码被简并，因此多于一个密码子可用于编码一种特定氨基酸，且本发明涵盖编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的经修饰核苷酸或核苷酸类似物，只要多核苷酸在使用条件下保持所要功能即可，包括增加核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、2′-O-Me、硫代磷酸酯等)。出于检测或捕获的目的，还可以并入标记，例如放射性或非放射性标记或锚，例如生物素。术语多核苷酸还包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以为天然存在的或非天然存在的。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。多核苷酸可以含有RNA、DNA或两者，和/或其修饰形式和/或类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团置换。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸盐被P(O)S(“硫代酸盐”)、P(S)S(“二硫代酸盐”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”)取代的实施例，其中每个R或R′独立地为H或任选地含有(--O--)键的被取代或未被取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连接基团都必须相同。多核苷酸可以为线性或环状的或包含线性和环状部分的组合。
[0144] 如本文所用，“多肽”指代由氨基酸组成的组合物，并且被所属领域技术人员认为是蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规的单字母或三字母编码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以为直链或支链的，其可以包含经修饰氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖已经被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；所述介入例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰(例如与标记组分结合)。定义内还包括例如含有氨基酸的一种或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及所属领域中已知的其它修饰的多肽。
[0145] 如本文中所用，“载体”是指被设计成将核酸引入到一或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒子等。
[0146] 如本文中所使用，术语“表达”指代基于基因的核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。
[0147] 如本文所用，“表达载体”指代含有DNA编码序列(例如基因序列)的DNA构建体，其与能够在宿主中实现编码序列表达的一种或多种合适的控制序列可操作地连接。这类控制序列包括影响转录的启动子、控制这类转录的任选的操纵序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录与翻译终止的序列。载体可以为质粒、噬菌体颗粒或简单地为潜在的基因组插入物。在被转移到合适宿主中之后，载体可独立于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些实例中其自身可集成到基因组中。质粒为最常用的表达载体形式。然而，本发明意欲包括提供等效功能并且在所属领域中为已知或变得已知的表达载体的的这类其它形式。
[0148] “基因”指代DNA区段，其涉及产生多肽且包括编码区之前和之后的区域以及个别编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0149] 如本文中所使用，术语“宿主细胞”指代其中可转染有产生多肽的重组表达载体以表达所述多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且子代可能由于自然、偶然或故意的突变而未必与初始母体细胞完全相同(在形态或总基因组DNA互补序列方面)。宿主细胞包括在体内经表达载体转染或转化的细胞。
[0150] 术语“重组”指代基因物质(即核酸、其编码的多肽以及包含这类多核苷酸的载体和细胞)，其已被修饰以改变其序列或表达特征，如通过使编码序列突变以产生改变的多肽，使编码序列与另一个基因的序列融合，将基因置于不同启动子的控制下，在异源生物中表达基因，在降低或升高的水平下表达基因，以与其天然表达谱不同的方式有条件地或组成性地表达基因等。一般来说，重组核酸、多肽和基于其的细胞已由人类操纵，使得其与在自然界中所发现的相关核酸、多肽和细胞不相同。
[0151] 术语“衍生自”涵盖术语“源自”、“获自”、“可获自”、“分离自”和“产生自”，并且一般来说指示一种规定物质在另一种规定物质中找到其来源或具有可以参考另一种规定物质描述的特征。
[0152] 术语“培养”指代使细胞(例如微生物细胞)群体在合适的生长条件下、在液态或固态培养基中生长。
[0153] 在将核酸序列插入细胞中的上下文中，术语“引入”包括“转染”、“转化”或“转导”并且指代将核酸序列并入至真核或原核细胞中，在所述真核或原核细胞，核酸序列可并入至所述细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成能独立复制的复制子或暂时表达。
[0154] 如本文中所使用，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”指代非天然(例如异源性或外源性)核酸序列整合到其基因组中或作为经过多个代维持的游离质粒的细胞。
[0155] 如本文所用，术语“回收”、“隔离”、“纯化”和“分离”指代从与其天然相关的至少一种组分中除去的材料(例如蛋白质、核酸或细胞)。举例来说，这些术语可以指如其自然状态下所见(例如完整生物系统)通常附有物质的组分实质上或基本上不含所述物质。
[0156] 如本文所用，“野生型”、“天然的”和“天然存在的”蛋白质为天然存在的蛋白质。术语“野生型序列”指代自然界中可见或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施例中，野生型序列为蛋白质工程化项目(例如制造变异蛋白质)的起点。关于微生物的“野生型”指代自然界中存在的微生物。
[0157] “化学自养”指代通过化学电子受体氧化化学电子供体获得能量并合成生物从二氧化碳生存和生长所需的所有有机化合物的生物。
[0158] “岩石自养”指代特定类型的化学自养，其中生物利用无机化学电子受体氧化无机化学电子受体作为能源。
[0159] 术语“氢氧混合气”指代分子氢和氧气的混合物。“氢氧混合气微生物”是一种微生物，其可以使用氢作为电子供体，并且在呼吸作用中使用氧作为电子受体来产生细胞内能量载体，例如腺苷-5′-三磷酸(ATP)。术语“氢氧”和“氢氧微生物”可分别与“氢氧混合气”和“氢氧混合气微生物”同义使用。氢氧混合气微生物一般通过氢化酶使用分子氢，其中一些从H2捐赠的电子用于还原NAD+(和/或其它细胞内还原当量)，并且一些来自H2的电子用于有氧呼吸。氢氧混合气微生物一般经由包括但不限于卡尔文氏循环(Calvin Cycle)或反向柠檬酸循环的途径自养地固定CO2[“嗜热菌(Thermophilic bacteria)”，Jakob Kristjansson，第5章，第III部分，CRC出版社，(1992)]。
[0160] “异养”指代不能合成生物从二氧化碳生存和生长所需的所有有机化合物，并且必须利用有机化合物进行生长的生物。
[0161] “氢氧化剂”指代利用还原的H2作为电子供体来产生细胞内还原当量和/或呼吸的微生物。
[0162] “产乙酸菌”指代产生乙酸盐和/或至多C4链长的其它短链有机酸作为无氧呼吸产物的的微生物。
[0163] “产甲烷菌”指代产生甲烷作为无氧呼吸产物的微生物。
[0164] “甲基营养菌”指代可以使用还原的一碳化合物(例如但不限于甲醇或甲烷)作为碳源和/或作为其生长的电子供体的微生物。
[0165] “极端微生物”指代与大多数生命形式通常所容忍的地球表面或海洋上的条件相比，在物理或地球化学极端条件(例如高温或低温、pH值或高盐度)下茁壮成长的微生物。
[0166] “嗜热菌”指代一种在45到122℃之间的对于生命而言相对较高温度下生长的极端微生物。
[0167] “超嗜热菌”指代一种在高于60℃(140°F)的对于生命而言极端炎热的环境中茁壮成长。
[0168] “嗜酸菌”指代一种在高酸性条件下(通常在pH 2.0或更低)下茁壮成长的极端微生物。
[0169] “嗜盐菌”指代一种在盐浓度非常高的环境中茁壮成长的极端微生物。
[0170] “嗜冷菌”指代一种能够在10℃及以下的低温下生长和繁殖的极端微生物。
[0171] “生产气体”指代气体混合物，其含有各种比例的H2、CO和CO2并且具有通常在标准条件下每单位体积的天然气的二分之一与十分之一之间的热值。生产气体可以从各种原料以各种方式产生，所述方式包括气化、蒸汽重整或碳基原料的自动重整。除了H2、CO和CO2之外，生产气体可以含有其它成分，包括但不限于甲烷、硫化氢、可冷凝气体、焦油和灰分，这取决于生成过程和原料。混合物中N2的比例可以较高或较低，这取决于空气是否用作反应器中的氧化剂，以及反应的热量是通过直接燃烧还是通过间接热交换提供。
[0172] “合成气”或“合成气体”指代一种气体混合物，其类似于生产气体含有H2和CO，但是其已根据H2和CO含量以及用于合成特定类型的化学产品(如但不限于甲醇或费-托柴油)的杂质的比率和量来更加专门定制。
[0173] “碳源”指代微生物从中获得有机生物合成所需的碳的分子类型。
[0174] “能源”指代在有氧呼吸中被氧氧化的电子供体，或被氧化的电子供体和在无氧呼吸中被还原的电子受体的组合。
[0175] “双相生长环境”指代含有两种不混溶液相的生长环境。
[0176] 术语“气化”一般指代高温方法，其将碳基材料转化为气体混合物，所述气体混合物包括氢气、一氧化碳和称为合成气体、合成气或生产气体的二氧化碳。所述方法一般涉及部分燃烧和/或外部产生的热量的施加以及氧气和/或蒸汽的受控添加，使得存在不足的氧气以使碳基材料完全燃烧。
[0177] 术语“疏水性”指代在水中具有低溶解度并且在疏水相中比在水相中具有更高溶解度的物质。
[0178] 术语“微生物(microorganism/microbe)指代微观单细胞生命形式，其包括但不限于细菌、真菌和藻类微生物。
[0179] 术语“分子”意指包含一个或多个原子的任何不同或可区分的物质结构单元，并且包括例如烃、脂质、多肽和多核苷酸。
[0180] 术语“含油的”指代富含油或大量生产油的物质。
[0181] 术语“有机化合物”指代含有碳原子的任何气态、液态或固态化合物，除了被认为是无机的以下例外：碳化物、碳酸盐、碳的简单氧化物、氰化物和纯碳的同素异形体，如金刚石和石墨。
[0182] 术语“前体”或“……的前体”为产生一种或多种成品组分的中间产物。
[0183] 术语“产生”包括细胞内和细胞外化合物的产生，其将包括从细胞分泌化合物。
[0184] 除非本文另外定义，否则结合本公开使用的科学与技术术语将具有所属领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括多个并且多个术语应包括单数。通常根据所属领域熟知的常规方法进行本公开的方法和技术。一般来说，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、基因学和蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术为所属领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则本公开的方法和技术一般根据所属领域熟知和如本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法进行。
[0185] 从气态能源和碳底物生产氨基酸、蛋白质和其它生物营养物
[0186] 在一些实施例中，提供天然或经工程改造微生物，其能够将生产气体或含有H2和/或CO和/或CO2和/或CH4的气体混合物转化为氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。在一些实施例中，提供天然或经工程改造微生物，其能够将生产气体或含有H2和/或CO和/或CO2和/或CH4的气体混合物转化为维生素。在某些实施例中，维生素为B族维生素，其包括但不限于以下中的一种或多种：维生素B1、B2和/或B12。
[0187] 在一些实施例中，本发明的主题包含天然微生物，其能够在合成气，和/或H2和CO2，和/或CO，和/或CH4和/或其它废气上生长，并且其能够使用所述气体作为生长底物产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物。在其它实施例中，本发明的主题包含能够在合成气，和/或H2和CO2，和/或CO，和/或CH4和/或其它废气上生长并且能够产生维生素B1、维生素B2和/或维生素B12和/或其它维生素的天然微生物。
[0188] 在一些实施例中，本发明提供通过在生物反应器或溶液中合并含碳气体和天然或经工程改造菌株微生物来产生氨基酸、蛋白质和其它生物营养物(包括但不限于维生素)的方法，所述微生物将含碳气体(如合成气、生产气体、CO2、一氧化碳和/或其含有氢气的混合物；和/或气态或液态C1化合物(包括但不限于甲醇或甲烷))转化为氨基酸、蛋白质和/或其它生物营养物(包括但不限于维生素)。
[0189] 在所述方法的一些实施例中使用的生产气体可以来自包括废物原料和/或生物质残余物原料的气化，或来自工业过程的废气，或含甲烷的气体(包括但不限于天然气、生物气、垃圾填埋气、闲置天然气和/或燃烧天然气)的重整。在一些实施例中，可使用本文所述的经工程改造或天然微生物和方法将甲烷转化为氨基酸、蛋白质和/或其它生物营养物(包括但不限于维生素)。在本发明的一些实施例中，本发明用于在天然气价格最低，并且遥远，并且特别是已知出现“闲置”和燃烧天然气的地区(如在美国、中东、西非和俄罗斯)生产氨基酸和/或蛋白质和/或维生素。
[0190] 在一些实施例中，本发明的主题包含具有一种或多种外源基因的经工程改造微生物。
[0191] 化学自养生物能够使用存储在无机化学品中用以驱动反应的势能，而不是微生物在进行光合作用时来自光线的辐射能量来执行将CO2和/或其它形式的无机碳固定到有机化合物的化学合成反应[Shively等人(1998)见上文；Smith等人(1967)见上文；Scott和Cavanaugh(2007)见上文]。在化学自养生物中发生的碳固定生物化学途径包括还原性三羧酸循环、Calvin-Benson-Bassham循环[Shively，等人(1998)见上文]和Wood-Ljungdahl途径[Ljungdahl(1986)见上文；Lee等(2008)见上文；Fischer等人(2008)见上文]。
[0192] 本发明的某些非限制性实施例涉及野生型或经基因修饰的微生物和包含这类微生物的组合物，其中所述微生物包含零个或一个或多个外源基因，并且其中所述微生物在含碳气体上生长或利用选自以下的气态原料：合成气、CO2、H2、CO、CH4或包含选自合成气、CO2、H2、CO或CH4的一种或多种气体的气体混合物。
[0193] 在一些实施例中，本发明主题的微生物选自罗尔斯顿菌属微生物。在一些实施例中，微生物为真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)。在一些实施例中，微生物选自贪铜菌属微生物。在一些实施例中，微生物为杀虫贪铜菌。在一些实施例中，微生物为杀虫贪铜菌DSM531或DSM541。在一些实施例中，微生物选自氢杆菌属。在一些实施例中，微生物为嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)。在一些实施例中，微生物含有反向三羧酸循环(rTCA)，也称为反向柠檬酸循环或反向Krebs循环。[参见例如，Miura，A.，Kameya，M.，Arai，H.，Ishii，M.&Igarashi，Y《. 嗜热氢杆菌的还原性三羧酸循环中的可溶性NADH依赖性延胡索酸还原酶(A soluble NADH-dependent fumarate reductase in the reductive tricarboxylic acid cycle of Hydrogenobacter thermophilus TK-6)》《.细菌学杂志(J Bacteriol)》190：7170-7177，doi：JB.00747-08[pii]10.1128/JB.00747-08(2008).；
Shively等人(1998)见上文，其以全文引用的方式并入本文中。
Shively等人(1998)见上文，其以全文引用的方式并入本文中。
[0194] 在一些实施例中，微生物为混沌红球菌或贾斯汀红球菌(Rhodococcus jostii)或红球菌属。在一些非限制性实施例中，微生物为混沌红球菌DSM 43205和/或红球菌属DSM 3346。在一些实施例中，天然或工程菌株包括但不限于利用氢的微生物，其包括但不限于红球菌属或戈登氏属、罗尔斯通氏菌属或贪铜菌属。在一些实施例中，组合物包含微生物，其中微生物可以在H2/CO2和/或合成气上天然生长，并且其中微生物可以自然地将脂质累积到按重量计细胞生物质的50％或更多。在一些实施例中，微生物具有向脂肪酸生物合成途径向下传送高通量碳的天然能力。在一些实施例中，表现出这些性状的微生物为混沌红球菌(DSM 43205或DSM 43206或DSM 44193)。
[0195] 本发明涉及包含放线菌(Actinobacteria)类细胞的细胞和组合物，其包含零个或一个或多个外源基因。本发明还涉及包含诺卡氏菌科(Nocardiaceae)细胞的细胞和组合物，其包含零个或一个或多个外源基因。本发明还涉及包含棒状杆菌属(Corynebacterium)、戈登氏属、红球菌属、分枝杆菌属和冢村菌属(Tsukamurella)细胞的细胞和组合物，其包含零个或一个或多个外源基因。在一些实施例中，本发明涉及包含零个或一个或多个外源基因的诺卡氏菌科的细胞，其中所述细胞并非分枝杆菌属的细胞。在一些实施例中，本发明提供包含红球菌属细胞的细胞和组合物，其包含零个或一个或多个外源基因，并且在一些实施例中，所述细胞为以下物种的菌株：红球菌属、混浊红球菌、食醚红球菌(Rhodococcus aetherivorans)；桔橙红球菌(Rhodococcus aurantiacus)；拜科罗尔红球菌(Rhodococcus baikonurensis)；耐硼红球菌(Rhodococcus boritolerans)；马红球菌(Rhodococcus equi)；嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)；类棒杆菌红球菌(Rhodococcus corynebacterioides)；类棒杆菌诺卡菌(Nocardia corynebacterioides)(同义词：Nocardia corynebacterioides)；红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)；聚集红球菌(Rhodococcus fascians)；圆红球菌(Rhodococcus globerulus)；沟戈登氏红球菌(Rhodococcus gordoniae)；贾斯汀红球菌(Rhodococcus jostii)；朝鲜红球菌
(Rhodococcus koreensis)；克罗彭斯特红球菌(Rhodococcus kroppenstedtii)；马鞍山红球菌(Rhodococcus maanshanensis)；海生红球菌(Rhodococcus marinonascens)；混浊红球菌；渗透红球菌(Rhodococcus percolatus)；酚醛红球菌(Rhodococcus phenolicus)；
Rhodococcus polyvorum；吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)；玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)；椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)；(同义词：昆虫诺卡氏菌(Nocardia rhodnii))；赤红球菌(Rhodococcus ruber)(同义词：红色链丝菌
(Streptothrix rubra))；红球菌属RHAl；三角状红球菌(Rhodococcus triatomae)；月寒红球菌(Rhodococcus tukisamuensis)；弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)(同义词：Tsukamurella wratislaviensis)；云南红球菌(Rhodococcus yunnanensis)；或佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)。在一些实施例中，包含零个或一个或多个外源基因的细胞为以下中的一种或多种：菌株混沌红球菌DSM号43205或43206；红球菌属DSM号3346。在一些实施例中，本发明涉及红球菌属细胞或包含红球菌属细胞的组合物，其中所述细胞并非选自马红球菌或聚集红球菌的物种。
(Rhodococcus koreensis)；克罗彭斯特红球菌(Rhodococcus kroppenstedtii)；马鞍山红球菌(Rhodococcus maanshanensis)；海生红球菌(Rhodococcus marinonascens)；混浊红球菌；渗透红球菌(Rhodococcus percolatus)；酚醛红球菌(Rhodococcus phenolicus)；
Rhodococcus polyvorum；吡啶红球菌(Rhodococcus pyridinivorans)；玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)；椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)；(同义词：昆虫诺卡氏菌(Nocardia rhodnii))；赤红球菌(Rhodococcus ruber)(同义词：红色链丝菌
(Streptothrix rubra))；红球菌属RHAl；三角状红球菌(Rhodococcus triatomae)；月寒红球菌(Rhodococcus tukisamuensis)；弗氏红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)(同义词：Tsukamurella wratislaviensis)；云南红球菌(Rhodococcus yunnanensis)；或佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)。在一些实施例中，包含零个或一个或多个外源基因的细胞为以下中的一种或多种：菌株混沌红球菌DSM号43205或43206；红球菌属DSM号3346。在一些实施例中，本发明涉及红球菌属细胞或包含红球菌属细胞的组合物，其中所述细胞并非选自马红球菌或聚集红球菌的物种。
[0196] 在一些实施例中，微生物来自棒杆菌亚目(corynebacterineae)或伯克氏菌科(burkholderiaceae)。在一些实施例中，细胞或包含一种或多种细胞的组合物并非大肠杆菌。在一些实施例中，本发明的细胞对动物或植物无致病性。在一些实施例中，本发明的细胞对人类无致病性。在一些实施例中，细胞或包含一种或多种细胞的组合物来自罗尔斯顿菌属。在一些实施例中，包含一种或多种细胞的细胞或组合物来自物种真氧产碱杆菌或杀虫贪铜菌或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)。在一些实施例中，包含零个或一个或多个外源基因的细胞是菌株杀虫贪铜菌DSM号531或541。
[0197] 在一些实施例中，本发明的微生物可以将蛋白质积累到总细胞质量的超过60％和/或超过70％和/或超过80％。在一些非限制性实施例中，微生物为杀虫贪铜菌DSM号531或541。
[0198] 在一些实施例中，组合物包含可以在H2/CO2和/或合成气上天然生长的微生物，并且其中微生物可以将聚羟基丁酸酯(PHB)或聚羟基烷酸酯(PHA)天然地聚集到按重量计细胞生物质的50％或更多。在一些实施例中，微生物具有经由乙酰-CoA代谢中间产物引导高通量碳的天然能力，其可以导致脂肪酸生物合成，以及许多其它合成途径(包括PHA和PHB合成)，以及氨基酸。在一些实施例中，表现出这些性状的微生物为杀虫贪铜菌(DSM 531或DSM 541)。
[0199] 在一些实施例中，天然或经工程改造菌株包括但不限于自养棒状杆菌(Corynebacterium autotrophicum)。在一些实施例中，天然或经工程改造菌株包括但不限于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在一些实施例中，微生物为海洋氢弧菌。在一些实施例中，微生物为夹膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
[0200] 在一些实施例中，微生物为氢氧或氢氧混合气菌株。在一些实施例中，微生物包含以下氢氧混合气微生物中的一种或多种：嗜火液菌(Aquifex pyrophilus)、风产液菌(Aquifex aeolicus)或其它产液菌属(Aquyexsp.)；杀虫贪铜菌、耐金属贪铜菌或其它贪铜菌属；自养棒状杆菌或其它棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)；脱硫戈登氏菌(Gordonia desulfuricans)、食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia polyisoprenivorans)、红核戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)、疏水戈登氏菌(Gordonia hydrophobica)、威斯特菲尼亚戈登氏菌(Gordonia westfalica)和其它戈登氏菌属；自养诺卡氏菌(Nocardia autotrophica)、灰暗诺卡氏菌(Nocardia opaca)或其它诺卡菌属；紫色非硫光合细菌，包括但不限于类球红细菌、沼泽红假单胞菌、夹膜红假单胞菌、绿色红假单胞菌
(Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonas blastica)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas
spheroides)、嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)和其它红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)和红杆菌属(Rhodobacter sp.)；深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)和其它红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；混浊红球菌(Rhodococcus opacus)和其它红球菌属；大豆根瘤菌(Rhizobiumjaponicum)和其它根瘤菌属(Rhizobium)；桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)和其它荚硫菌属(Thiocapsa sp.)；敏捷假单胞菌
(Pseudomonas facilis)、黄假单胞菌(Pseudomonas flava)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)、氢噬热假单胞菌(Pseudomonas hydrogenothermophila)、帕氏假单胞菌(Pseudomonas palleronii)、类黄假单胞菌(Pseudomonas pseudoflava)；嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)；噬热假单胞菌(Pseudomonas thermophile)和其它假单胞菌属；全养氢丛毛杆菌(Hydrogenomonas pantotropha)、真氧氢单胞菌(Hydrogenomonas eutropha)、易捷氢单胞菌
(Hydrogenomonas facilis)和其它氢单胞菌属(Hydrogenomonas sp.)；嗜热氢杆菌
(Hydrogenobacter thermophiles)、嗜盐氢杆菌(Hydrogenobacter halophilus)、嗜氢氢杆菌(Hydrogenobacter hydrogenophilus)和其它氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)；弧岛嗜氢杆菌(Hydrogenophilus islandicus)和其它嗜氢菌属(Hydrogenophilus)；海洋氢弧菌和其它氢弧菌属；海热产水菌(Hydrogenothermus marinus)和其它氢嗜热菌属
(Hydrogenothermus)；幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyllori)和其它螺旋杆菌属
(Helicobacter sp.)；自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、黄黄色杆菌
(Xanthobacter flavus)和其它黄色杆菌属(Xanthobacter sp.)；黄色氢嗜菌
(Hydrogenophaga flava)、帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)、类黄色氢嗜菌(Hydrogenophaga pseudoflava)和其它噬氢菌属(Helicobacter)；慢性大豆根瘤菌
(Bradyrhizobium japonicum)和其它短根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)；真氧产碱杆菌和其它罗尔斯通氏菌属；富养产碱杆菌、敏捷产碱杆菌(Alcaligenes facilis)、嗜氢产碱杆菌(Alcaligenes hydrogenophilus)、广泛产碱杆菌、争论产碱杆菌(Alcaligenes
paradoxus)、粪产杆菌(Alcaligenes ruhlandii)和其它产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)；
无枝酸菌属(Amycolata sp.)；自养水螺菌(Aquaspirillum autotrophicum)和其它水螺菌属(Aquaspirillum sp.)；节杆菌菌株11/X、甲基养节杆菌(Arthrobacter
methylotrophus)和其它节细菌属(Arthrobacter sp.)；生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)和其它固氮螺旋菌属(Azospirillum)；争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)和其它贪噬菌属Variovorax sp.)；敏捷噬酸菌(Acidovorax facilis)和其它食酸菌属(Acidovorax sp.)；施氏芽孢杆菌(Bacillus schlegelii)、热泉芽孢杆菌(Bacillus tusciae)和其它芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；极端耐热细菌(Calderobacterium
hydrogenophilum)和其它热杆菌属(Calderobacterium)；胶德克斯氏菌(Derxia gummosa)和其它德克斯氏菌属(Derxia sp.)；自热黄杆菌(Flavobacterium autothermophilum)和其它黄杆菌属(Flavobacterium sp.)；水生弯杆菌Microcyclus aquaticus)和其它微环菌属；戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordoniae)和其它分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)；
脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)和其它副球菌属(Paracoccus sp.)；海珀尔女神菌(Persephonella marina)、圭亚那海盆地珀尔女神菌(Persephonella guaymasensis)和其它女神菌属(Persephonella sp.)；Renobacter vacuolatum和其它Renobacter sp.；蓝色链霉菌(Streptomycetes coelicoflavus)、灰色链霉菌(Streptomycetes griseus)、黄质产色链霉菌(Streptomycetes xanthochromogenes)、热蓝紫色链霉菌Streptomycetes thermocarboxydus)和其它链霉菌属(Streptomycetes sp.)；红色热发热菌(Thermocrinis ruber)和其它热发热菌属(Thermocrinis sp.)；沃特斯氏菌属(Wautersia sp.)；蓝细菌(cyanobacteria)，包括但不限于类颤藻鱼腥藻(Anabaena oscillarioides)、螺旋鱼腥藻(Anabaena spiroides)、柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)和其它鱼腥藻属(Anabaena sp.)，和钝顶节螺藻(Arthrospira platensis)、极大节螺藻(Arthrospira maxima)和其它节螺藻属(Arthrospira sp.)；绿藻，包括但不限于斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和其它栅列藻属(Scenedesmus sp.)、雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardii)和其它衣藻属(Chlamydomonas sp.)、针形纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、Rhaphidium polymorphium和其它Rhaphidium sp.；以及包括氢氧微生物的微生物的聚生体。
(Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonas blastica)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas
spheroides)、嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)和其它红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)和红杆菌属(Rhodobacter sp.)；深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)和其它红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；混浊红球菌(Rhodococcus opacus)和其它红球菌属；大豆根瘤菌(Rhizobiumjaponicum)和其它根瘤菌属(Rhizobium)；桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)和其它荚硫菌属(Thiocapsa sp.)；敏捷假单胞菌
(Pseudomonas facilis)、黄假单胞菌(Pseudomonas flava)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)、氢噬热假单胞菌(Pseudomonas hydrogenothermophila)、帕氏假单胞菌(Pseudomonas palleronii)、类黄假单胞菌(Pseudomonas pseudoflava)；嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)；噬热假单胞菌(Pseudomonas thermophile)和其它假单胞菌属；全养氢丛毛杆菌(Hydrogenomonas pantotropha)、真氧氢单胞菌(Hydrogenomonas eutropha)、易捷氢单胞菌
(Hydrogenomonas facilis)和其它氢单胞菌属(Hydrogenomonas sp.)；嗜热氢杆菌
(Hydrogenobacter thermophiles)、嗜盐氢杆菌(Hydrogenobacter halophilus)、嗜氢氢杆菌(Hydrogenobacter hydrogenophilus)和其它氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)；弧岛嗜氢杆菌(Hydrogenophilus islandicus)和其它嗜氢菌属(Hydrogenophilus)；海洋氢弧菌和其它氢弧菌属；海热产水菌(Hydrogenothermus marinus)和其它氢嗜热菌属
(Hydrogenothermus)；幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyllori)和其它螺旋杆菌属
(Helicobacter sp.)；自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、黄黄色杆菌
(Xanthobacter flavus)和其它黄色杆菌属(Xanthobacter sp.)；黄色氢嗜菌
(Hydrogenophaga flava)、帕氏嗜氢菌(Hydrogenophaga palleronii)、类黄色氢嗜菌(Hydrogenophaga pseudoflava)和其它噬氢菌属(Helicobacter)；慢性大豆根瘤菌
(Bradyrhizobium japonicum)和其它短根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)；真氧产碱杆菌和其它罗尔斯通氏菌属；富养产碱杆菌、敏捷产碱杆菌(Alcaligenes facilis)、嗜氢产碱杆菌(Alcaligenes hydrogenophilus)、广泛产碱杆菌、争论产碱杆菌(Alcaligenes
paradoxus)、粪产杆菌(Alcaligenes ruhlandii)和其它产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)；
无枝酸菌属(Amycolata sp.)；自养水螺菌(Aquaspirillum autotrophicum)和其它水螺菌属(Aquaspirillum sp.)；节杆菌菌株11/X、甲基养节杆菌(Arthrobacter
methylotrophus)和其它节细菌属(Arthrobacter sp.)；生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)和其它固氮螺旋菌属(Azospirillum)；争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)和其它贪噬菌属Variovorax sp.)；敏捷噬酸菌(Acidovorax facilis)和其它食酸菌属(Acidovorax sp.)；施氏芽孢杆菌(Bacillus schlegelii)、热泉芽孢杆菌(Bacillus tusciae)和其它芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；极端耐热细菌(Calderobacterium
hydrogenophilum)和其它热杆菌属(Calderobacterium)；胶德克斯氏菌(Derxia gummosa)和其它德克斯氏菌属(Derxia sp.)；自热黄杆菌(Flavobacterium autothermophilum)和其它黄杆菌属(Flavobacterium sp.)；水生弯杆菌Microcyclus aquaticus)和其它微环菌属；戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordoniae)和其它分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)；
脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)和其它副球菌属(Paracoccus sp.)；海珀尔女神菌(Persephonella marina)、圭亚那海盆地珀尔女神菌(Persephonella guaymasensis)和其它女神菌属(Persephonella sp.)；Renobacter vacuolatum和其它Renobacter sp.；蓝色链霉菌(Streptomycetes coelicoflavus)、灰色链霉菌(Streptomycetes griseus)、黄质产色链霉菌(Streptomycetes xanthochromogenes)、热蓝紫色链霉菌Streptomycetes thermocarboxydus)和其它链霉菌属(Streptomycetes sp.)；红色热发热菌(Thermocrinis ruber)和其它热发热菌属(Thermocrinis sp.)；沃特斯氏菌属(Wautersia sp.)；蓝细菌(cyanobacteria)，包括但不限于类颤藻鱼腥藻(Anabaena oscillarioides)、螺旋鱼腥藻(Anabaena spiroides)、柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)和其它鱼腥藻属(Anabaena sp.)，和钝顶节螺藻(Arthrospira platensis)、极大节螺藻(Arthrospira maxima)和其它节螺藻属(Arthrospira sp.)；绿藻，包括但不限于斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和其它栅列藻属(Scenedesmus sp.)、雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardii)和其它衣藻属(Chlamydomonas sp.)、针形纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、Rhaphidium polymorphium和其它Rhaphidium sp.；以及包括氢氧微生物的微生物的聚生体。
[0201] 在一些非限制性实施例中，本发明涉及包含用于支持消耗ATP的生物合成反应和细胞维持的ATP的组合物和借助于使用无机电子供体和电子受体的用于产生ATP的能量保存反应(包括但不限于氢氧反应)，使用化学自养代谢产生用于支持消耗ATP的生物合成反应和细胞维持的ATP而不共同产生甲烷或短链有机酸(如乙酸或丁酸)的方法。
[0202] 已经表征许多不同的微生物，其能够作为电子供体和/或碳源(即一氧化碳营养微生物)在一氧化碳上生长。在一些情况下，一氧化碳营养微生物害可以使用H2作为电子供体和/或以混合营养方式生长。在一些情况下，一氧化碳营养微生物是兼性化学自养生物。[《原核生物学(Biology of the Prokaryotes)》，J Lengeler，G.Drews，H.Schlegel编，《约翰·威利父子公司》，2009年7月10日，以全文引用的方式并入本文。]在一些实施例中，微生物包含以下一氧化碳营养型微生物中的一种或多种：不动杆菌属(Acinetobacter sp.)；一氧化碳产碱杆菌(Alcaligenes carboxydus)和其它产碱杆菌属(Alcaligenessp.)；节细菌属(Arthrobacter sp.)；氮单胞菌属(Azomonas sp.)；固氮菌属(Azotobacter sp.)；施氏芽孢杆菌(Bacillus schlegelii)和其它芽孢杆菌属；类黄色嗜氢菌(Hydrogenophaga pseudoflava)和其它噬氢菌属(Hydrogenophaga sp.)；氢碳酸假单胞菌(Pseudomonas carboxydohydrogena)、嗜一氧化碳假单胞菌(Pseudomonas carboxydovorans)、餐伴假单胞菌(Pseudomonas compransoris)、Pseudomonas gazotropha、好热嗜一氧化碳假单胞菌(Pseudomonas thermocarboxydovorans)和其它假单胞菌属；大豆根瘤菌和其它根瘤菌属；
链霉菌G26、热自养链霉菌(Streptomyces thermoautotrophicus)和其它链霉菌属
(Streptomyces sp.)。在本发明的某些实施例中，使用一氧化碳营养微生物。在某些实施例中，使用能够化学无机自养的一氧化碳营养微生物。在某些实施例中，使用能够在呼吸和/或生物合成中使用H2作为电子供体的一氧化碳营养微生物。
链霉菌G26、热自养链霉菌(Streptomyces thermoautotrophicus)和其它链霉菌属
(Streptomyces sp.)。在本发明的某些实施例中，使用一氧化碳营养微生物。在某些实施例中，使用能够化学无机自养的一氧化碳营养微生物。在某些实施例中，使用能够在呼吸和/或生物合成中使用H2作为电子供体的一氧化碳营养微生物。
[0203] 在一些实施例中，微生物包含专性和/或兼性化学自养微生物，其包括以下中的一种或多种：厌氧醋菌属(Acetoanaerobium sp.)；醋杆菌属(Acetobacterium sp.)；产醋菌属(Acetogenium sp.)；无色杆菌属(Achromobacter sp.)；双面菌属(Acidianus sp.)；不动杆菌属(Acinetobacter sp.)；马杜拉放线菌属(Actinomadura sp.)；气单孢菌属(Aeromonas sp.)；产碱菌属(Alcaligenes sp.)；产碱杆菌属(Alcaliqenes sp.)；水螺菌属(Aquaspirillum sp.)；弓形杆菌属(Arcobacter sp.)；金杆菌属(Aureobacterium sp.)；芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；贝日阿托氏菌属(Beggiatoa sp.)；丁酸杆菌属(Butyribacterium sp.)；羧基嗜热菌属(Carboxydothermus sp.)；梭菌属(Clostridium sp.)；丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)；脱卤素杆菌属(Dehalobacter sp.)；脱卤拟球菌属(Dehalococcoide sp.)；脱卤螺旋菌属(Dehalospirillum sp.)；脱硫杆菌属(Desulfobacterium sp.)；脱硫念珠菌属(Desulfomonile sp.)；脱硫肠状菌属
(Desulfotomaculum sp.)；脱硫弧菌属(Desulfovibrio sp.)；脱硫叠球菌属
(Desulfurosarcina sp.)；外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira sp.)；肠杆菌属
(Enterobacter sp.)；真杆菌属(Eubacterium sp.)；铁原体属(Ferroplasma sp.)；盐硫小杆菌属(Halothibacillus sp.)；氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)；氢单胞菌属
(Hydrogenomonas sp.)；钩端螺菌属(Leptospirillum sp.)；金属球菌属(Metallosphaera sp.)；甲烷杆菌属(Methanobacterium sp.)；甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter sp.)；甲烷球菌属(Methanococcus sp.)；甲烷类球菌属(Methanococcoides sp.)；产甲烷菌属(Methanogenium sp.)；甲烷叶菌属(Methanolobus sp.)；甲烷微菌属(Methanomicrobium sp.)；甲烷盘菌属(Methanoplanus sp.)；甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.)；甲烷螺菌属(Methanospirillum sp.)；甲烷热菌属(Methanothermus sp.)；甲烷丝状菌属
(Methanothrix sp.)；微球菌属(Micrococcus sp.)；硝化菌属(Nitrobacter sp.)；硝化杆菌属(Nitrobacteraceae sp.)、硝化球菌属(Nitrococcus sp.)、亚硝化球菌属
(Nitrosococcus sp.)；硝化刺菌属(Nitrospina sp.)、硝化螺旋菌属(Nitrospira sp.)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus sp.)；亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira sp.)；亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio sp.)；硝化刺菌属(Nitrospina sp.)；嗜油单胞菌属(Oleomonas sp.)；副球菌属(Paracoccus sp.)；消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.)；浮霉菌属(Planctomycetes sp.)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)；红杆菌属(Rhodobacter sp.)；红球菌属
(Rhodococcus sp.)；红环菌属(Rhodocyclus sp.)；红微菌属(Rhodomicrobium sp.)；红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)；红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；希瓦氏菌属
(Shewanella sp.)；铁球菌属(Siderococcus sp.)；链霉菌属(Streptomycessp.)；硫化杆菌属(Sulfobacillus sp.)；硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)；嗜热丝菌属(Thermothrix sp.)、硫杆菌属(Thiobacillus sp.)；硫微螺菌属(Thiomicrospira sp.)；辫硫菌属(Thioploca sp.)；球硫细菌属(Thiosphaera sp.)；发硫菌属(Thiothrix sp.)；卵硫细菌属(Thiovulum sp.)；硫-尾矿氧化剂；氢-氧化剂；铁-氧化剂；产乙酸菌；和产甲烷菌；包括化学自养生物的微生物的聚生体；原产于以下中的至少一个的化学自养生物：热液喷口、地热喷口、温泉、冷泉、地下含水层、盐湖、盐水地层、矿山、酸性矿山排水、矿山尾矿、油井、炼油厂废水、煤层、深亚表面；废水和污水处理厂；地热发电厂、硫磺油田和土壤；和选自以下中的一种或多种的极端微生物：嗜热微生物、超嗜热菌、嗜酸菌、嗜盐菌和嗜冷菌。
(Desulfotomaculum sp.)；脱硫弧菌属(Desulfovibrio sp.)；脱硫叠球菌属
(Desulfurosarcina sp.)；外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira sp.)；肠杆菌属
(Enterobacter sp.)；真杆菌属(Eubacterium sp.)；铁原体属(Ferroplasma sp.)；盐硫小杆菌属(Halothibacillus sp.)；氢杆菌属(Hydrogenobacter sp.)；氢单胞菌属
(Hydrogenomonas sp.)；钩端螺菌属(Leptospirillum sp.)；金属球菌属(Metallosphaera sp.)；甲烷杆菌属(Methanobacterium sp.)；甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter sp.)；甲烷球菌属(Methanococcus sp.)；甲烷类球菌属(Methanococcoides sp.)；产甲烷菌属(Methanogenium sp.)；甲烷叶菌属(Methanolobus sp.)；甲烷微菌属(Methanomicrobium sp.)；甲烷盘菌属(Methanoplanus sp.)；甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.)；甲烷螺菌属(Methanospirillum sp.)；甲烷热菌属(Methanothermus sp.)；甲烷丝状菌属
(Methanothrix sp.)；微球菌属(Micrococcus sp.)；硝化菌属(Nitrobacter sp.)；硝化杆菌属(Nitrobacteraceae sp.)、硝化球菌属(Nitrococcus sp.)、亚硝化球菌属
(Nitrosococcus sp.)；硝化刺菌属(Nitrospina sp.)、硝化螺旋菌属(Nitrospira sp.)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus sp.)；亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira sp.)；亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio sp.)；硝化刺菌属(Nitrospina sp.)；嗜油单胞菌属(Oleomonas sp.)；副球菌属(Paracoccus sp.)；消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.)；浮霉菌属(Planctomycetes sp.)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)；红杆菌属(Rhodobacter sp.)；红球菌属
(Rhodococcus sp.)；红环菌属(Rhodocyclus sp.)；红微菌属(Rhodomicrobium sp.)；红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)；红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；希瓦氏菌属
(Shewanella sp.)；铁球菌属(Siderococcus sp.)；链霉菌属(Streptomycessp.)；硫化杆菌属(Sulfobacillus sp.)；硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)；嗜热丝菌属(Thermothrix sp.)、硫杆菌属(Thiobacillus sp.)；硫微螺菌属(Thiomicrospira sp.)；辫硫菌属(Thioploca sp.)；球硫细菌属(Thiosphaera sp.)；发硫菌属(Thiothrix sp.)；卵硫细菌属(Thiovulum sp.)；硫-尾矿氧化剂；氢-氧化剂；铁-氧化剂；产乙酸菌；和产甲烷菌；包括化学自养生物的微生物的聚生体；原产于以下中的至少一个的化学自养生物：热液喷口、地热喷口、温泉、冷泉、地下含水层、盐湖、盐水地层、矿山、酸性矿山排水、矿山尾矿、油井、炼油厂废水、煤层、深亚表面；废水和污水处理厂；地热发电厂、硫磺油田和土壤；和选自以下中的一种或多种的极端微生物：嗜热微生物、超嗜热菌、嗜酸菌、嗜盐菌和嗜冷菌。
[0204] 这类生物还包括但不限于能够承受各种环境参数的极端情况的极端微生物，所述环境参数如温度、辐射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH值、氧张力和化学品。其包括超嗜热菌，如热液口火裂片菌(Pyrolobus fumarii)；嗜热菌，如铅色聚球藻(Synechococcus lividis)；嗜温菌和嗜冷菌，如嗜冷杆菌(Psychrobacter)。极端嗜热硫代谢菌，如热变形菌属(Thermoproteus sp.)、热网菌属(Pyrodictium sp.)、硫化叶菌属(Sulfolobus sp.)、双面菌属(Acidianus sp.)。耐放射生物包括耐放射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)。耐压生物包括耐压生物(piezophiles)或嗜压生物(barophiles)。干燥剂耐受性和脱水生物包括嗜旱生物；微生物和真菌。耐盐生物包括嗜盐菌，如盐杆菌科(Halobacteriacea)和杜氏盐藻(Dunaliella salina)。pH耐受生物包括嗜碱菌(alkaliphiles)，如盐碱杆菌属(Natronobacterium)、坚强芽孢杆菌OF4(Bacillus firmus OF4)、螺旋藻属(Spirulina sp.)和嗜酸菌，如类蓝藻(Cyanidium caldarium)、铁原体属(Ferroplasma sp.)。耐受纯CO2的气体耐受性生物包括类蓝藻且金属耐受性生物包括耐金属生物(metalotolerants)，如酸阿尔曼铁原体(Ferroplasma acidarmanus)、罗尔斯通氏菌属。
[0205] 在一些实施例中，本发明还提供一种组合物，其中微生物是氢氧化化学自养生物和/或一氧化碳自养菌和/或甲基营养生物和/或甲烷氧化菌。在一些实施例中，本发明进一步提供一种组合物，其中微生物能够在作为唯一电子供体和/或还原氢原子源和/或碳源的合成气和/或生产气体和/或热解气体上生长。在一些实施例中，本发明进一步提供一种组合物，其中微生物能够在作为唯一电子供体和/或还原氢原子源和/或碳源的未处理粗甘油上生长。
[0206] 在本发明的某些实施例中，使用的微生物是天然存在的和/或非基因修饰的(非GMO)微生物和/或非致病性的和/或依赖于周围环境不存在的生物过程所提供的特定环境条件。
[0207] 本发明的某些实施例利用微生物或微生物聚生体，使用微生物学领域中已知的方法，经由在目标电子供体(包括但不限于以下中的一种或多种：氢和/或CO和/或合成气和/或甲烷)，和电子受体(包括但不限于以下中的一种或多种：氧和/或硝酸盐和/或三价铁和/或CO2)，以及环境条件(例如温度、pH值、压力、DO、盐度、各种杂质和污染物的存在等)存在下生长，所述微生物或微生物聚生体从环境样品中分离并富含所需微生物。
[0208] 在一些实施例中，本发明进一步提供一种方法，其中用于生物合成和/或呼吸的电子供体包括但不限于以下中的一种或多种：还原剂：氨；铵；一氧化碳；连二亚硫酸盐；元素硫；氢；偏亚硫酸氢盐；氧化氮；亚硝酸盐；硫酸盐，如硫代硫酸盐，包括但不限于硫代硫酸钠(Na2S2O3)或硫代硫酸钙(CaS2O3)；如硫化氢的硫化物；亚硫酸盐；硫代硫酸盐；连亚硫酸盐。
[0209] 在一些实施例中，微生物为甲烷氧化菌。在一些实施例中，微生物属于甲基球菌(Methylococcus)属。在一些实施例中，微生物为荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)。在一些实施例中，微生物为甲基营养菌。在一些实施例中，微生物属于甲基杆菌(Methylobacterium)属。在一些实施例中，微生物来自以下物种中的一种或多种：扎氏甲基杆菌(Methylobacterium zatmanii)；扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)；
氯甲烷甲基杆菌(Chlorylobacterium chloromethanicum)。
氯甲烷甲基杆菌(Chlorylobacterium chloromethanicum)。
[0210] 在一些实施例中，所要求保护的发明的微生物不依赖于用以生长和/或合成以下中的一种或多种的光：氨基酸和/或蛋白质和/或其它营养物。在一些实施例中，所要求保护的发明的微生物不需要任何类型的糖或任何类型的有机化合物或任何类型的固定碳来生长和/或合成以下中的一种或多种：氨基酸和/或蛋白质和/或其它营养物。在一些实施例中，要求保护的发明的微生物为兼性微生物。
[0211] 碳链长度大于C4的有机分子的生产通过合成代谢生物合成途径(如脂肪酸生物合成)和各种氨基酸生物合成途径在生物学上最常见且有效地完成[Fischer，Klein-Marcuschamer，Stephanolpoulos，《代谢工程(Metabolic Engineering)》(2008)10，295-
304]。进入脂肪酸生物合成途径的初始分子是乙酰基-辅酶A(乙酰基-CoA)，其为一种可以从中获得许多高价值生物化学物质的中心代谢产物。在一些实施例中，本发明利用具有天然存在途径的微生物将CO、CO2和/或H2和/或CH4转化为乙酰基-CoA。在一些实施例中，本发明利用可经由还原性三羧酸循环、Calvin-Benson-Bassham循环和/或Wood-Ljungdahl途径固定CO和/或CO2的微生物。在一些实施例中，本发明利用经由甲烷氧化途径固定C1化合物的微生物。在一些实施例中，微生物天然产生酶，所述酶利用气态电子供体(如存在于合成气和/或生产气体中)作为还原剂催化气态无机碳固定以产生乙酰基-CoA、丙酮酸、丙二酰基-CoA中的一种或多种，其中这类酶促蛋白包括但不限于乙酰基-CoA合酶、乙酰基-CoA合成酶二硫化物还原酶、腺苷钴胺类咕啉/铁硫蛋白、一氧化碳脱氢酶、氢化酶和甲基转移酶。
304]。进入脂肪酸生物合成途径的初始分子是乙酰基-辅酶A(乙酰基-CoA)，其为一种可以从中获得许多高价值生物化学物质的中心代谢产物。在一些实施例中，本发明利用具有天然存在途径的微生物将CO、CO2和/或H2和/或CH4转化为乙酰基-CoA。在一些实施例中，本发明利用可经由还原性三羧酸循环、Calvin-Benson-Bassham循环和/或Wood-Ljungdahl途径固定CO和/或CO2的微生物。在一些实施例中，本发明利用经由甲烷氧化途径固定C1化合物的微生物。在一些实施例中，微生物天然产生酶，所述酶利用气态电子供体(如存在于合成气和/或生产气体中)作为还原剂催化气态无机碳固定以产生乙酰基-CoA、丙酮酸、丙二酰基-CoA中的一种或多种，其中这类酶促蛋白包括但不限于乙酰基-CoA合酶、乙酰基-CoA合成酶二硫化物还原酶、腺苷钴胺类咕啉/铁硫蛋白、一氧化碳脱氢酶、氢化酶和甲基转移酶。
[0212] 不同于分别存在于产甲烷菌和产乙酸菌中的产甲烷、产乙酸和产溶剂途径，其可产生具有净ATP产生或零净消耗(即ATP中性)的短链有机化合物(C1-C4)，合成代谢生物合成途径(如脂肪酸合成)涉及净ATP消耗。举例来说，以下给出从乙酰基-CoA开始合成棕榈酸(C16)的净反应：
[0213] 8乙酰基-CoA+7ATP+H2O+14NADPH+14H+-＞棕榈酸+8CoA+14NADP++7ADP+7Pi
[0214] 在GTC过程中使用专性产甲烷菌或产乙酸菌生产经由合成代谢生物合成制备的分子(如氨基酸、蛋白质或脂质)的缺点是在呼吸作用中专性使用CO2作为电子受体以用于生产合成代谢生物合成(如脂肪酸合成或氨基酸合成)所需的ATP。如果H2是电子供体，那么在产乙酸菌或产甲烷菌中呼吸所消耗的每个H2产生的ATP相对较低：每4个H2一个ATP用于甲烷的呼吸产生[K.，Kaster，A.K.，Seedorf，H.，Buckel，W.&Hedderich，R《.产甲烷古细菌：节约能源的生态相关差异(Methanogenic archaea：ecologically relevant differences in energy conservation)》《. 自然评论：微生物学(Nat Rev Microbiol)》6，579-591，doi：nrmicrol931[pii]，以全文引用的方式并入本文中。]或乙酸产生，和每10个H2一个ATP以用于丁酸产生。[Papoutsakis，《生物技术与生物工程(Biotechnology&Bioengineering)》(1984)26，174-187；Heise，Muller，Gottschalk，《细菌学杂志(J.Bacteriology)》(1989)
5473-5478；Lee，Park，Jang，Nielsen，Kim，Jung，《生物技术与生物工程》(2008)101(2)209-
228，其以全文引用的方式并入本文中。
5473-5478；Lee，Park，Jang，Nielsen，Kim，Jung，《生物技术与生物工程》(2008)101(2)209-
228，其以全文引用的方式并入本文中。
[0215] 在一些实施例中，本发明涉及微生物或包含微生物的组合物，其中所述微生物能够从无机电子供体(如但不限于H2和/或CO)产生ATP而不合成甲烷或短链有机酸(包含两个到四个碳长的碳链长度的短链有机酸)。在一些非限制性实施例中，本发明涉及微生物或包含微生物的组合物，其中所述微生物从与除用于呼吸的CO2之外的电子受体结合的无机电子供体(如但不限于H2和/或CO)产生ATP。
[0216] 本发明的某些实施例应用氢氧化和/或CO氧化和/或CH4氧化微生物，其在用于ATP产生的能量保存反应中使用更多的电负性电子受体，如但不限于O2。举例来说，将氢氧反应2H2+O2→2H2O与ATP产生相结合的氢营养氢氧或氢氧混合气微生物与在呼吸时使用CO2作为电子受体的产乙酸菌或产甲烷菌相比，呼吸每消耗一个H2和/或其它电子供体可以产生产生更多的ATP。举例来说，氢氧混合气微生物在呼吸作用中使用H2作为电子供体和CO2作为电子受体，在呼吸中每消耗一个H2可以产生至少两个ATP[Bongers《，细菌学杂志》，(1970年10月)145-151，以全文引用的方式并入本文中。]，这比进行产甲烷作用或产乙酸作用的微生物在呼吸作用中每消耗一个H2所产生的ATP多八倍。由于这个原因，使用可以在呼吸作用和ATP产生中利用更多电负性电子受体的微生物(如但不限于氢氧混合气微生物)从合成气或H2进行合成代谢生物合成(如但不限于氨基酸或蛋白质或脂肪酸生物合成)可比使用产乙酸菌或产甲烷菌(如目前用于生物GTC技术中的那些)更加有效。
[0217] 在某些实施例中，用于呼吸作用的氢氧反应与氧化磷酸化酶促连接。在某些实施例中，由此形成的ATP和/或其它细胞内能量载体用于氨基酸和/或蛋白质的合成代谢合成。在一些实施例中，本发明涉及氢氧混合气微生物或包含氢氧混合气微生物的组合物，其中所述微生物包含至少零个或一个或多个外源核酸序列，所述外源核酸序列编码零个或多个酶以使得能够从含碳气体原料(包括但不限于合成气或生产气体或废CO2与可再生的H2或CO或含甲烷的气体的组合)生物合成有用的所关注碳基产物(包括但不限于化学品、单体、聚合物、蛋白质、多糖、维生素、营养品、抗生素或药物产品或其中间产物)。在一些非限制性实施例中，本发明涉及微生物或包含微生物的组合物，其中所述微生物需要少于4个H2以经由呼吸产生一个ATP。在其它非限制性实施例中，本发明涉及微生物或包含微生物的组合物，其中所述微生物通过呼吸每消耗一个H2产生超过一个ATP。在其它非限制性实施例中，本发明涉及微生物或包含微生物的组合物，其中所述微生物经由呼吸作用每消耗一个H2产生至少两个ATP，或经由呼吸作用每消耗一个H2产生至少2.5个ATP。
[0218] 在一些实施例中，本发明涉及包含微生物的组合物，所述微生物将合成气和/或生产气体和/或气态CO2和/或H2和/或CO和/或CH4转化为一种或多种有机化合物，其中少于10重量％的微生物产生的有机化合物为甲烷。在一些实施例中，本发明涉及包含微生物的组合物，所述微生物将所述气态底物转化为一种或多种有机化合物；其中少于10重量％的有机化合物是碳链长度为4或更少的游离有机酸。
[0219] 在本发明的某些实施例中，微生物还原CO2，从而产生细胞物质和H2O.在某些实施例中，通过用分子氧氧化氢来获得进行这种还原的代谢途径所需的能量。在本发明的某些实施例中，生物系统和/或组分直接充当CO2还原剂，但不充当O2生产者。在某些实施例中，用于呼吸作用的O2从另一系统获得并提供给生物系统和/或组分。在某些实施例中，其它系统涉及水的电解和/或热解。
[0220] 使用氢氧微生物相比于严格厌氧产乙酸或产甲烷微生物用于碳捕获应用和/或合成气转化应用的优点是氢氧微生物的较高氧耐受性。在本发明的一些实施例中，使用耐受好氧和/或微好氧条件的微生物。由于氢氧微生物的较高氧耐受性，氢氧微生物一般在从烟道气进行碳捕获应用方面相比于严格厌氧产乙酸或产甲烷微生物具有一定优势。因为工业烟道气为本发明的某些实施例的CO2的期望来源，所以与专性厌氧产甲烷菌或产乙酸菌相比，氢氧微生物的相对较高的氧耐受性可以使得在典型的烟气中发现的2-6％O2含量可以被更好地耐受。在本发明的某些实施例中，含有CO2的烟道气或任何其它类型的输入气体混合物中2％或更多的O2含量被微生物培养物耐受和/或用于微生物呼吸作用。
[0221] 使用氢氧微生物用于碳捕获应用和/或合成气转化应用相比于使用产乙酸菌的另一个优点在于经由由氢氧反应驱动的呼吸作用产生ATP产生可以轻易并入到工艺流中的水产物，而不是一般不希望的酸生成的乙酸或丁酸产物，其可以通过降低溶液pH或累积到抑制或毒性水平来损害微生物。在本发明的一些实施例中，细胞呼吸作用的主要产物为水。
[0222] 在一些实施例中，微生物能够在作为唯一的电子供体和碳源的未处理的粗甘油和/或葡萄糖和/或甲醇和/或乙酸盐上生长。在一些实施例中，微生物能够在有机碳源上以兼养方式生长并使用无机电子供体或碳源。
[0223] 在某些实施例中，本发明提供的微生物包括选自真核植物、藻类、蓝细菌、绿硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、极端微生物、酵母、真菌、变形菌的细胞系、其经工程改造生物和合成生物。在某些实施例中，使用螺旋藻。
[0224] 在某些实施例中，使用紫色非硫细菌，其包括但不限于以下属：螺旋菌属(Phaeospirillum)、红球样菌属(Rhodobaca)、红细菌属(Rhodobacter)、红微菌属
(Rhodomicrobium)、红球形菌属(Rhodopila)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红海菌属(Rhodothalassium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红弧菌属(Rodovibrio)和蔷薇螺旋菌属(Roseospira)。
(Rhodomicrobium)、红球形菌属(Rhodopila)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红海菌属(Rhodothalassium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红弧菌属(Rodovibrio)和蔷薇螺旋菌属(Roseospira)。
[0225] 用于生长与本发明相关的细胞的液体培养物可以容纳在所属领域已知和使用的任何培养容器中。在一些实施例中，生物反应器容器中的大规模生产可用于产生大量所需分子和/或生物质。
[0226] 本发明的某些实施例的另一个优点涉及用于容纳、分离和/或保护培养环境的生物反应器容器。在本发明的一些非限制性实施例中可用于培养和生长微生物以产生有机化合物的示例性培养容器包括大规模微生物培养的所属领域普通技术人员已知的那些，所述有机化合物包括但不限于以下中的一种或多种：氨基酸、蛋白质和其它营养物。可用于本发明的某些实施例的这类培养容器包括但不限于以下中的一种或多种：气升式反应器；生物洗涤塔；鼓泡塔；搅拌釜反应器；连续搅拌釜反应器；逆流、上流、膨胀床反应器；蒸煮器，特别是如在污水和废水处理或生物修复的现有技术中已知的蒸煮器系统；过滤器，包括但不限于滴滤过滤器、旋转生物接触器过滤器、旋转盘、土壤过滤器；流化床反应器；气升式发酵罐；固定细胞反应器；环管反应器；膜生物膜反应器；帕丘卡罐；填充床反应器；活塞流反应器；静态混合器；滴流床反应器；和/或竖直轴生物反应器。在某些实施例中，容器底座、壁板、壁、内衬和/或顶部可由一种或多种材料构成，所述材料包括但不限于沥青、水泥、陶瓷、粘土、混凝土、环氧树脂、玻璃纤维、玻璃、碎石、塑料、沙子、密封剂、土壤、钢或其它金属以及其合金、石头、焦油、木材和其任何组合。在本发明的某些实施例中，其中微生物需要腐蚀性生长环境和/或通过碳固定反应产生腐蚀性化学物质，所属领域和工程领域中已知的耐腐蚀材料可用于内衬接触生长媒介的容器的内部。
[0227] 在某些实施例中，本发明中的微生物培养是为了实施基因修饰和/或用于生产有机化合物，特别是在某些实施例中生产以下中的一种或多种：氨基酸、蛋白质和其它营养物而进行。以基因操作为目的的微生物培养通常以小的台式规模进行，并且通常在选择基因修饰性状的条件下进行。
[0228] 旨在商业生产有机化合物，并且特别是氨基酸、蛋白质和其它营养物的微生物培养通常在更大规模的生物反应器(例如500L、1,000L、5,000L、10,000L、50,000L、100,000L、1,000,000L生物反应器体积和更高)中进行。在某些实施例中，使用本发明的方法使本发明的化学自养生物在生物反应器内的液体培养基中生长。在一些实施例中，含有微生物的生物反应器由不透明材料构成，所述不透明材料使培养物保持在接近或完全黑暗的环境中。
由不透明材料(如钢和/或其它金属合金和/或钢筋混凝土和/或玻璃纤维和/或各种高强度塑料材料)构成的生物反应器可设计成具有巨大的工作体积。在本发明的一些实施例中，使用由50,000或更大体积的钢或其它金属合金构成的发酵罐。在本发明的一些实施例中，利用能够包含高于环境压力的正顶部空间压力的生物反应器。在本发明的一些实施例中，使用3,000,000升和更大体积的蛋形或圆柱形消化池或竖直轴生物反应器。在一些实施例中，包含微生物的生物反应器不允许光穿透其所含液体体积的一部分或大部分或全部。在一些实施例中，在不显著暴露于光或完全不暴露于光的情况下培养细菌细胞或微生物细胞。在某些实施例中，不需要将电转换为光。
由不透明材料(如钢和/或其它金属合金和/或钢筋混凝土和/或玻璃纤维和/或各种高强度塑料材料)构成的生物反应器可设计成具有巨大的工作体积。在本发明的一些实施例中，使用由50,000或更大体积的钢或其它金属合金构成的发酵罐。在本发明的一些实施例中，利用能够包含高于环境压力的正顶部空间压力的生物反应器。在本发明的一些实施例中，使用3,000,000升和更大体积的蛋形或圆柱形消化池或竖直轴生物反应器。在一些实施例中，包含微生物的生物反应器不允许光穿透其所含液体体积的一部分或大部分或全部。在一些实施例中，在不显著暴露于光或完全不暴露于光的情况下培养细菌细胞或微生物细胞。在某些实施例中，不需要将电转换为光。
[0229] 按照本发明的方法，在一些实施例中，在没有光的情况下，在含有气态碳源(例如但不限于合成气或生产气体或尾气或热解气体或H2和CO2气体混合物)的培养基中生长和维持微生物以产生氨基酸，或蛋白质，或其它营养物或全细胞产物；其中这类生长被称为化学自养生长。在一些实施例中，本发明涉及培养用于大规模生产氨基酸或蛋白质或其它营养物或全细胞产物的细胞的方法。在一些实施例中，本发明涉及在体积为50,000升或更大的生物反应器中培养细胞的方法，所述生物反应器通常由低成本，坚固且不透明的材料(如钢或其它金属合金或钢筋混凝土或土方工程)构成。这类生物反应器的大小、深度和结构决定细胞将在接近或完全黑暗的环境中生长。在一些实施例中，在含有气态无机碳作为主要或唯一碳源的培养基中，并且在没有任何光照的情况下，根据本发明的方法培养微生物以用于合成氨基酸，或蛋白质，或其它营养物或全细胞产物。这种类型的生长被称为化学自养生长。在某些非限制性实施例中，CO2-固定步骤中使用的微生物并非光合作用的。在某些非限制性实施例中，生物反应器设计不将培养物限制在薄层中，或具有透明壁，以便在整个容器中提供光，如光合微生物通常所必需的。
[0230] 在本发明的一些实施例中，化学自养生物能够直接从氧化还原化学而非阳光获得生长所需的能量，同时在所有天气条件下全年夜以继日地消耗CO2促进和/或实现连续的CO2捕获操作，而无需任何人工照明。相比之下，藻类和高等植物可以在夜间或低光照水平下成为净CO2发射体。由于在本发明的某些实施例中缺乏光需求，在本发明的某些实施例中应用由不透明材料构成，对可见光不透明的从商业生物过程得到的常规且经过验证的设备和基础设施，而不需要任何人工照明。在本发明的某些实施例中，通过竖直缩放而不是仅水平缩放来满足系统容量的增加。这与使用藻类、蓝细菌或高等植物捕获CO2的光养方法形成对比。虽然已经提出了各种竖直耕作方案用于光合系统，但从实际上和经济上讲，光养系统必须水平扩展，例如就藻类而言在浅池塘或光生物反应器中水平扩展。这导致大量的地理覆盖范围和许多负面的环境影响。
[0231] 在其中另外需要人工照明来生长光合生物(如藻类或高等植物)的情况(如竖直耕作)下，在本发明的某些竖直耕作类实施例中，CO2转换不需要将电转换为光。在本发明的某些非限制性实施例中，用水电解取代电向光的转化，以支持自养CO2吸收和生物合成。在本发明的某些非限制性实施例中，电转化为电子供体(如但不限于经由电解的氢)相比于电转化为光存在巨大的能量效率优势。利用人工照明生长的藻类或高等高等植物系统受到藻类对光能的低效利用以及电能向光能的低效转化的挑战。在本发明的某些实施例中，就CO2捕获和/或生物质产生而言，在人工照明下生长的藻类或高等植物培养物将比本发明的CO2捕获和/或生物质生产系统需要更多的电力。在本发明的某些实施例中，就CO2捕获和/或生物质产生而言，在人工照明下生长的藻类或高等植物培养物所需要的电力将比本发明的CO2捕获和/或生物质生产系统多至少十倍。对于在人工照明下生长的藻类或高等植物，排热要求几乎与电输入成正比。在本发明的某些实施例中，就在人工照明下生长的CO2捕获和/或生物质产生而言，排热要求低于可比较的藻类或高等植物系统。在本发明的某些实施例中，就在人工照明下生长的CO2捕获和/或生物质产生而言，排热要求比可比较的藻类或高等植物系统低至少十倍。
[0232] 在本发明的某些实施例中，通过使生物过程与周围环境分离提供的对恶劣条件的相对较高的耐受性使得本发明的生物过程能够在不利于开放藻类系统或传统农业的条件下操作。在本发明的某些非限制性实施例中，利用冬季的低温降低由于H2和CO2产生蛋白质的反应是放热而引起的工艺冷却成本。
[0233] 为了举例说明在本发明的某些实施例中生物反应器的应用，用生产细胞接种含有营养培养基的生物反应器。一般来说，在细胞开始倍增之前将遵循迟缓期。迟缓期后，细胞倍增时间减少，且培养物进入对数期。对数期后最终会增加倍增时间，虽然不打算受理论限制，但认为这是由于传质限制，包括氮或矿物质来源的营养物耗尽，或抑制性化学物质的浓度升高，或由微生物感知的群体。当培养物进入稳定期时，生长减缓然后停止。在某些实施例中，在稳定期之前存在算术生长期。为了收获细胞团，在对数期和/或算术期和/或在稳定期收获某些实施例中的培养物。脂质的积累通常可以通过氮源或除碳或电子源(例如氢)之外的其它关键营养物的耗尽来触发。在许多物种中，这表明细胞储存由过量碳源和能源产生的脂质。
[0234] 生物反应器或发酵器用于通过细胞生理周期的各个阶段培养细胞。生物反应器用于培养细胞，所述细胞可以保持在其生长曲线中的特定阶段。生物反应器的使用在许多方面有利于培养化学自养生长。对于某些实施例，用于产生蛋白质或动物饲料的富含蛋白质的细胞团在液体悬浮液中生长至高密度。通常，在生物反应器中促进生长条件的控制，所述控制包括控制溶解的二氧化碳、氧气和其它气体(如氢)，以及其它溶解的营养物、微量元素、温度和pH值。
[0235] 在一些实施例中，使用工艺条件来增强对天然或表达酶的生物合成的影响。在一些实施例中，用于增强对天然或表达酶的影响的工艺条件为温度。
[0236] 营养培养基以及气体可以作为批量添加或周期性地或响应于检测到的消耗或编程设定点添加到生物反应器中，或在培养物生长和/或维持期间连续添加。对于某些实施例，接种时的生物反应器在生长开始时用起始批次的营养培养基和/或气体填充，并且在接种后不添加额外的营养培养基和/或气体。对于某些实施例，在接种后定期添加营养培养基和/或气体。对于某些实施例，在接种后响应于检测到的营养物和/或气体的消耗添加营养培养基和/或气体。对于某些实施例，在接种后连续添加营养培养基和/或气体。对于某些实施例，添加的营养培养基不含任何有机化合物。
[0237] 在某些实施例中，将培养物接种到生物反应器中的方法包括但不限于从栖息于另一生物反应器的现有培养物中转移培养物，或从培养箱中培养的种子库中培养。在某些实施例中，菌株的种子库可以以包括但不限于粉末、液体、冷冻或冻干形式以及任何其它合适形式的形式运输和储存，这些形式可由所属领域的技术人员容易地识别。在某些非限制性实施例中，保留的细菌培养物保持在代谢失活的冻干状态，直到需要重新启动。在某些实施例中，当在非常大的反应器中建立培养物时，在接种全尺寸容器之前，培养物在逐渐变大的中等规模容器中生长和建立。
[0238] 对于某些实施例，生物反应器具有能够混合营养培养基的机制，所述营养培养基包括但不限于以下中的一种或多种：旋转搅拌棒、叶片、叶轮或涡轮机；旋转、摇动或转动容器；气举、鼓泡；通过再循环管道将发酵液从容器底部再循环到顶部，使发酵液流过环和/或静态混合器。培养基可以连续或间歇混合。
[0239] 在某些实施例中，含有营养培养基的微生物可以部分或完全，周期性地或连续地从本发明的生物反应器中移除，并且在某些实施例中用新鲜的无细胞培养基替换，以在某些实施例中将细胞培养物维持在指数生长期，和/或补充生长培养基中的耗尽营养物和/或移除抑制性废物。营养物
[0240] 生物反应器中标准的端口可用于将气体、液体、固体和/或浆液输送到封闭本发明的微生物的生物反应器容器中和/或从其中排出。许多生物反应器具有用于不同目的的多个端口(例如用于培养基添加、气体添加、用于pH和DO的探针、取样的端口)，并且给定端口可以在发酵过程中用于各种目的。举例来说，可以使用端口在一个时间点向生物反应器添加营养培养基，并且可以在另一时间用于取样。优选地，可以在不将污染物或入侵物种引入生长环境的情况下进行采样口的多次使用。可以向采样口提供能够控制样品流动或连续采样的阀门或其它致动器。对于某些实施例，生物反应器配备有至少一个适于培养接种的端口，其可另外用于其它用途，包括培养基或气体添加。生物反应器端口能够控制进入培养环境的气体组成和流速。举例来说，端口可以用作进入生物反应器的气体入口，通过所述入口泵送气体。
[0241] 对于一些实施例，可以泵入生物反应器的气体包括但不限于以下中的一种或多种：合成气、生产气体、热解气体、氢气、CO、CO2、O2、空气、空气/CO2混合物、天然气、生物气、甲烷、氨气、氮气、惰性气体，如氩气以及其它气体。在一些实施例中，泵入系统的CO2可来自包括但不限于以下的来源：来自有机质气化的CO2；来自用以生成生石灰CaO的石灰石CaCO3的煅烧的CO2；来自甲烷蒸汽重整的CO2，如来自氨、甲醇或氢制造的CO2副产物；来自燃烧、焚烧或灼烧的CO2；糖的厌氧或好氧发酵的CO2副产物；甲烷氧化生物过程的CO2副产物；来自废水处理的CO2；来自磷酸钠生产的CO2副产物；地质或地热产生或发出的CO2；从酸性气体或天然气中移出的CO2。在某些实施例中，碳源是海水或其它表面或地下水体中的CO2和/或碳酸氢盐和/或碳酸盐。在某些实施例中，碳源为来自大气的CO2。在某些非限制性实施例中，使用如但不限于CO2去除组件(CDRA)的设备从作为闭环生命支持系统的一部分的封闭舱室捕获CO2，所述CO2去除组件(CDRA)用于国际空间站(ISS)。
[0242] 在本发明的某些实施例中，含有二氧化碳的烟道气在未处理的废气的温度、压力和气体组成特征下从烟囱中捕获，并且以最小的改变引导到发生碳固定的反应容器中。在烟道气中不存在对生物有害的杂质的一些实施例中，在进入反应容器时烟道气的改性可以限于将气体泵送通过反应器系统所需的压缩和/或将气体温度降低到适合暴露于微生物的温度所需的热交换。在某些实施例中，在引入生物反应器之前，使用碳捕获技术和所属领域熟知的方法纯化和/或浓缩存在于烟道气或其它混合气流中的CO2。
[0243] 在其中携带二氧化碳的烟道气通过用于将二氧化碳溶解到溶液中的系统(如碳捕获和/或微生物转化领域中众所周知的)的实施例中，具有降低的CO2含量的经洗涤烟道气(其通常主要包括惰性气体，如氮气)在某些实施例中可以释放到大气中。
[0244] 在本发明的某些实施例中，碳源为工业烟道或废气中所含有和/或来自天然来源(包括但不限于地质和地热来源)的CO2和/或CO。在某些实施例中，所使用的含CO2和/或CO的烟道气和/或废气是从以下行业或部门中的一个或多个排放的：油；电力；天然气；水泥；化学品；钢；冶金；发酵；废水处理。在本发明的某些非限制性实施例中，相对小的占地面积，促进生物过程与产生CO2和/或其它碳废物的工业设施的配置，所述工业设施包括但不限于以下中的一种或多种：化石发电厂；炼油厂；沥青砂提纯设施；天然气或石油钻井作业；乙醇蒸馏厂；水泥制造业；铝制品，氯碱制造商，钢铁铸造厂；地热发电厂。在本发明的某些实施例中，与工业烟道气来源相关的废热进一步用于本发明的制备方法中，以用于包括但不限于生物质干燥的步骤。
[0245] 在某些实施例中，除二氧化碳外，或代替二氧化碳作为替代碳源的气体溶解在溶液中并进料到培养液中和/或直接溶解到包括但不限于气态电子供体和/或碳源(例如氢和/或CO和/或甲烷气体)的培养液中。在本发明的某些实施例中，输入气体可包括其它电子供体和/或电子受体和/或碳源和/或矿物质营养素，例如但不限于合成气的其它气体成分和杂质(例如烃类)；氨；硫化氢；和/或其它酸性气体；和/或O2；和/或含有颗粒和灰分的矿物质。
[0246] 在本发明的某些实施例中，将气体溶解于本发明的培养液中，所述培养液包括但不限于：气态电子供体，例如但不限于以下中的一种或多种：氢气、一氧化碳、甲烷、硫化氢或其它酸性气体；气态碳源，例如但不限于以下中的一种或多种CO2、CO、CH4；电子受体，例如但不限于空气(例如20.9％氧气)中或作为纯O2或富含O2的气体的氧气。在一些实施例中，使用发酵工程领域的技术人员已知的压缩机、流量计和流量阀系统使得这些和其它气体溶解到溶液中，所述系统将气体馈送到用于将气体分散到溶液中的以下广泛使用的系统中的一种或多种：喷射设备；扩散器，包括但不限于圆顶、管状、圆盘或环形几何形状；粗或细泡沫曝气器；文丘里设备。在本发明的某些实施例中，还可以使用桨式曝气器等进行表面曝气和/或气体传质。在本发明的某些实施例中，通过用叶轮或涡轮机以及液压剪切装置进行机械混合来增强气体溶解以减小气泡尺寸。在通过保持吸收气体的微生物的反应器系统之后，在某些实施例中，残余气体可以再循环回到生物反应器，或燃烧用于工艺加热，或灼烧，或注入地下，或释放到大气中。在本发明的某些实施例中，利用H2作为电子供体，可以通过将H2鼓泡通过培养基，或通过将其扩散通过与液体培养基相互作用的所属领域中已知的氢渗透性-水不可渗透膜将H2加入培养容器中。
[0247] 在某些实施例中，微生物在微需氧条件下在H2和CO2以及其它溶解的营养物上生长和繁殖。在某些实施例中，在以下中的一种或多种条件下将C1化学品(例如但不限于一氧化碳、甲烷、甲醇、甲酸盐或甲酸和/或含有C1化学品的混合物(包括但不限于由各种气化、热解或蒸汽重整的固定碳原料产生的各种合成气组合物)转化为较长链有机化学品(即C2或更长，和在一些实施例中，C5或更长的碳链分子)-：需氧、微氧、缺氧、厌氧和/或兼性条件。
[0248] 在本发明的一些实施例的培养液中也可以保持受控量的氧气，并且在某些实施例中，氧气将主动溶解到供给培养液的溶液中和/或直接溶解到培养液中。在需要将空气或氧气泵送到培养液中以维持目标DO水平的本发明的某些需氧或微需氧实施例中，可以将氧气泡以最佳直径注入发酵液中以进行混合和氧气转移。在《环境研究杂志(Environment Research Journal)》1999年5月/6月第307-315页中已报道最佳直径为2mm。在本发明的某些需氧实施例中，可以使用剪切氧气泡的方法来实现这种气泡直径，如美国专利第7,332,077号中所述。。在某些实施例中，避免平均直径大于7.5mm和/或腾涌的气泡。
[0249] 在一些实施例中，本发明的主题转化燃料气体，包括但不限于合成气、生产气体、热解气体、生物气、尾气、烟道气、CO、CO2、H2和其混合物。在一些实施例中，燃料气体的热含量为每标准立方英尺(scf)至少100BTU。在本发明的一些实施例中，使用生物反应器容纳和生长微生物，所述生物反应器配备有用于气体输送的细泡扩散器和/或高剪切叶轮。
[0250] 在一些实施例中，氧气在用于氨基酸或蛋白质或其它营养物或全细胞产物的生物合成的微生物的呼吸作用中用作电子受体。在一些实施例中，使用强电子受体(包括但不限于O2，来最大化通过合成代谢途径产生的产物(例如氨基酸、脂肪酸或维生素)的效率和产率。使用O2作为电子受体的关键挑战是保持O2水平足以使好氧微生物生长良好并有效地产生合成代谢产物，同时还在生物反应器中保持适当和安全水平的易燃H2和O2混合物，以及其它燃料气体/O2混合物，以尽量减少爆炸风险。在一些实施例中，定制或专用反应器设计用于将发酵液中的O2控制在对微生物最佳的水平，同时避免危险的气体混合物。在一些实施例中，使用生物反应器设计，所述设计避免H2和O2的危险混合物，同时为微生物提供必需水平的这些气体用于细胞能量、碳固定，以及用于产生氨基酸、或蛋白质或其它营养物，或全细胞。
[0251] 如果气体入口位于液体介质的表面下方使得气体起泡或喷射通过介质，那么引入和/或提高进入生物反应器的气体流速可以促进培养物的混合并产生湍流。在某些实施例中，通过由气体起泡和/或喷射液体介质和/或气体堵塞液体介质提供的湍流来促进混合。在一些实施例中，生物反应器包括用于气体逸出和压力释放的出气口。在一些实施例中，进气口和出气口优选地配备有止回阀以防止气体回流。
[0252] 在生物反应器内发生化学合成反应的某些实施例中，将一种或多种类型的电子供体和一种或多种类型的电子受体以推注添加形式，或周期性地或连续地泵送或以其它方式添加到反应容器中含有化学自养生物的营养培养基中。在细胞呼吸作用中由电子从电子供体转移到电子受体所驱动的化学合成反应将无机二氧化碳和/或其它溶解的碳酸盐和/或其它碳氧化物固定成有机化合物和生物质。
[0253] 在某些实施例中，使用用于培养物生长和生产的营养培养基，其包含含有合适的矿物质、盐、维生素、辅因子、缓冲液和微生物生长所需的其它组分的水溶液，这是所属领域的技术人员已知的[Bailey和Ollis，《生物化学工程基础(Biochemical Engineering Fundamentals)》，第2版；第383-384页和第620-622页；McGraw-Hill：纽约(1986)]。
[0254] 在某些实施例中，如所属领域已知的用于维持和生长微生物培养物的化学品包括在本发明的营养培养基中。在某些实施例中，这些化学品可包括但不限于以下中的一种或多种：氮源，如氨、铵(例如氯化铵(NH4Cl)、硫酸铵((NH4)2SO4))、硝酸盐(如硝酸钾(KNO3))、尿素或有机氮源；磷酸盐(例如磷酸二钠(Na2HPO4)、磷酸钾(KH2PO4)、磷酸(H3PO4)、二硫代磷酸钾(K3PS2O2)、正磷酸钾(K3PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4))；硫酸盐；酵母提取物；隔离铁；钾(例如磷酸钾(KH2PO4)、硝酸钾(KNO3)、碘化钾(KI)、溴化钾(KBr))；和其它无机盐、矿物质和微量营养物(如氯化钠(NaCl)、硫酸镁(MgSO47H2O)或氯化镁(MgCl2)、氯化钙(CaCl2)或碳酸钙(CaCO3)、硫酸锰(MnSO47H2O)或氯化锰(MnCl2)、氯化铁(FeCl3)、硫酸亚铁(FeSO47H2O)或氯化亚铁(FeCl24H2O)、碳酸氢钠(NaHCO3)或碳酸钠(Na2CO3)、硫酸锌(ZnSO4)或氯化锌(ZnCl2)、钼酸铵(NH4MoO4)或钼酸钠(Na2MoO42H2O)、硫酸亚铜(CuSO4))或氯化铜(CuCl22H2O)、氯化钴(CoCl26H2O)、氯化铝(AlCl36H2O)、氯化锂(LiCl)、硼酸(H3BO3)、氯化镍NiCl26H2O)、氯化锡(SnCl2H2O)、氯化钡(BaCl22H2O)、硒酸铜(CuSeO45H2O)或亚硒酸钠(Na2SeO3)、偏钒酸钠(NaVO3))、铬盐)。在某些实施例中，可以使用由Schlegel等人配制的无机盐培养基(MSM)[《嗜热菌(Thermophilic bacteria)》，Jakob Kristjansson，第5章，第III节，CRC出版社，(1992)]。
[0255] 本发明的方面涉及细菌细胞的生长和/或表达。在一些实施例中，与本发明相关的细菌细胞可以在任何类型(富含或最小)的培养基中培养，包括发酵培养基和任何组合物。如所属领域普通技术人员所理解的，常规优化将允许使用各种类型的培养基。所选择的培养基可以补充各种附加组分。补充组分的一些非限制性实例包括葡萄糖、抗生素、用于基因诱导的IPTG和ATCC微量矿物质补充剂。类似地，可以通过常规实验优化本发明的细胞的培养基和生长条件的其它方面。举例来说，pH值和温度是可以优化的因素的非限制性实例。在一些实施例中，如培养基选择、培养基补充物和温度的因素可影响所需分子的产生水平。在一些实施例中，可以优化补充组分的浓度和量。在一些实施例中，优化培养基补充一种或多种补充组分的频率，以及在收获所需分子之前培养培养基的时间量。
[0256] 在某些实施例中，源自生物质的焚烧或气化的灰分含有可用于本发明的矿物质营养素。在某些实施例中，产生含有灰分的矿物质的焚烧或气化的生物质包括但不限于以下中的一种或多种：粪便、排泄物和/或尿液。在某些非限制性实施例中，尿液用作营养源，包括但不限于氮源。在某些非限制性实施例中，尿液用水稀释。在某些非限制性实施例中，尿液和/或焚烧和/或气化产物用作本发明的生物有机体的营养物。在某些非限制性实施例中，焚烧和/或气化的主要产物(包括但不限于CO2、水蒸汽、H2、CO和/或灰中的无机矿物营养物)可以由本发明的生物轻易利用。
[0257] 有机质的需氧分解的最终产物通常为二氧化碳、水、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐和类似的高度氧化化合物。在本发明的某些实施例中，来自活性污泥法的CO2和/或水和/或无机矿物质营养素用作本发明中的原料和/或营养物和/或电子受体的来源。在本发明的某些实施例中，CH4和/或CO2和/或水和/或氨和/或硫化氢和/或源自厌氧污泥消化的其它无机矿物质营养物被用作本发明中的原料和/或营养源。在某些实施例中，腐殖质用作碳源和/或电子受体或供体。
[0258] 包括氮(呈(包括但不限于)氨形式)，以及磷和死鱼的水产养殖污染正在成为一种普遍的危害，特别是在亚洲，90％的养殖鱼位于亚洲。在本发明的某些实施例中，水产养殖污染被用作营养源，包括但不限于本发明的微生物的氮源和/或磷源。在某些实施例中，通常用于污水或废水处理厂或垃圾填埋场的废物替代地用于生产本发明的微生物方法的营养物。在某些实施例中，这些废物流包括但不限于以下中的一种或多种：氨、尿素、尿液、粪便、鱼类废物和/或其它动物废物。在某些实施例中，本发明的微生物方面能够增加可以通过水产养殖系统再循环的水和/或营养物，和/或减少来自水产养殖系统的排放。在某些实施例中，电子供体和/或碳源(包括但不限于以下中的一种或多种：H2、CO、CH4、CO2)；和/或其它营养物和/或水通过众所周知的方法由鱼类废物和/或其它动物废物(包括但不限于粪便和/或废鱼部分(如鱼头)和/或其它动物残余物和/或微生物细胞材料和/或折射成废水处理的有机质产生，所述方法包括但不限于以下中的一种或多种：气化、热解、焚烧和/或厌氧消化。在某些实施例中，通过气化和/或热解和/或焚烧产生的H2O和/或CO2和/或其它可冷凝和不可冷凝的气体和/或灰分残余物和/或热量被用作本发明中的原料或输入物，如但不限于以下中的一种或多种：CO2作为碳源；H2O作为程序用水来源；可冷凝和/或不可冷凝的气体作为原料和营养源；灰作为无机矿物质营养源和/或用于pH控制的碱源；热量作为工艺热量和/或能量的来源。病原微生物可以在厌氧废物处理过程中存活。在某些实施例中，进入所述过程的原始废物原料中存在的所有病原微生物通过上述气化和/或热解和/或焚烧步骤或导致一种或多种C1捕获的步骤和生物转化步骤被杀死。
[0259] 在某些实施例中，通过本发明的微生物生物过程产生的营养物用于再循环农业、水产养殖、养耕共生或水培系统。在某些非限制性实施例中，在所述再循环水产养殖或养耕共生系统中产生的生物包括但不限于以下中的一种或多种：罗非鱼、鲑鱼、军曹鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤鱼、虾、贝类。在某些非限制性实施例中，所述再循环水产养殖系统中的鱼缸位于陆地上或漂浮在水体中。在本发明的某些实施例中，微生物生物过程用作浮动养鱼场的营养源。在某些这样的实施例中，浮动养鱼场基于改装的油轮或其它大型远洋船。在某些实施例中，本发明用作漂浮或悬浮鱼笼的营养源。在某些这样的实施例中，笼子用于鲑鱼养殖。
[0260] 利用废物衍生的原料和/或营养物的本发明的某些实施例能够实现食物环的闭合。
[0261] 在本发明的某些实施例中，不需要可耕地和/或淡水和/或杀虫剂和/或除草剂和/或抗生素。在某些实施例中，使用废物源部分或完全满足对肥料(例如用于微生物生长的无机矿物质或有机营养物)的需要，所述废物源包括但不限于以下中的一种或多种：灰烬、生物质、污水、废水。在本发明的某些实施例中，海水用作工艺用水和/或无机碳和/或其它矿物质营养素和/或肥料的来源。
[0262] 在某些实施例中，营养化学品(例如，电子供体和受体以及碳源和各种矿物质营养素)的浓度在生物反应器内保持接近或处于其各自的最佳水平以实现最佳碳吸收和/或固定和/或有机化合物的转化和/或产生，所述浓度根据所用的微生物而变化，但是对于培养微生物领域的普通技术人员而言，无需过度实验就已知或可确定。
[0263] 在本发明的某些实施例中，监测和/或控制生物反应器中的以下参数中的一个或多个：废产物水平；pH值；温度；盐度；溶解氧；溶解二氧化碳气体；液体流速；搅拌速率；气压。在某些实施例中，影响化学自养生长的操作参数用传感器(例如，用以测量电子供体/受体浓度的溶解氧探针或氧化还原探针)监测，且/或基于来自传感器的反馈通过使用设备(包括但不限于致动阀、泵和搅拌器)手动或自动控制。在某些实施例中，进入的发酵液以及进入的气体的温度是受控制的装置，例如但不限于冷却器、加热器和/或热交换器。
[0264] 在本发明的某些实施例中，在稳定状态下使用连续流入和去除营养培养基和/或生物质来维持微生物培养和生物反应，在所述稳定状态中细胞群和环境参数(例如细胞密度、pH值、DO、化学浓度)随着时间的推移以恒定水平为目标。在某些实施例中，恒定水平是原料转化和/或目标有机化合物产生的最佳水平。在某些实施例中，可以通过直接取样，通过光密度与细胞密度的相关性和/或用粒度分析仪监测细胞密度。在某些实施例中，水解和生物质保留时间可以解耦，以允许独立控制发酵液化学和细胞密度。在某些实施例中，稀释速率可以保持足够高，使得水力停留时间与生物质保留时间相比相对较低，获得高度补充的发酵液以用于细胞生长和/或原料转化和/或有机化合物的产生。在某些实施例中，稀释速率设定在培养液和营养补充和/或废物产物去除以及来自泵送、增加的投入和随稀释速率上升的其它需求的增加的工艺成本之间的最佳技术经济权衡。
[0265] 在本发明的某些实施例中，控制微生物培养物的pH值。在某些实施例中，将pH值控制在微生物维持和/或生长和/或原料转化和/或有机化合物产生和/或存活的最佳范围内。为了解决pH的降低，在某些实施例中，中和步骤可以直接在生物反应器环境中进行，或在通过再循环回路将培养基再循环回培养容器之前进行。某些实施例的发酵液中酸的中和可以通过添加碱来实现，所述碱包括但不限于以下中的一种或多种：石灰石、石灰、氢氧化钠、氨、氢氧化铵、苛性钾、氧化镁、氧化铁、碱性灰。在某些实施例中，所用的碱是由无二氧化碳排放的来源产生，所述来源如天然存在的碱性矿物质，包括但不限于以下一中的种或多种：
氧化钙、氧化镁、氧化铁、铁矿石、含金属氧化物的橄榄石、含金属氧化物的蛇纹石、含金属氧化物的超镁铁矿床，以及来自地下碱性盐水含水层的液体。如果使用石灰石进行中和，那么通常会释放二氧化碳。在某些实施例中，这种CO2可以保留或引导回生物反应器中以通过化学合成吸收和/或以某种其它方式利用和/或隔离，而不是释放到大气中。
氧化钙、氧化镁、氧化铁、铁矿石、含金属氧化物的橄榄石、含金属氧化物的蛇纹石、含金属氧化物的超镁铁矿床，以及来自地下碱性盐水含水层的液体。如果使用石灰石进行中和，那么通常会释放二氧化碳。在某些实施例中，这种CO2可以保留或引导回生物反应器中以通过化学合成吸收和/或以某种其它方式利用和/或隔离，而不是释放到大气中。
[0266] 在某些实施例中，源自生物质的燃烧、焚烧或气化的灰用于pH值控制。在某些实施例中，产生碱性灰的焚烧或气化生物质包括但不限于以下中的一种或多种：粪便、排泄物和/或尿液。
[0267] 在本发明的某些实施例中，化学自养微生物的水性悬浮液将一种或多种电子供体和CO2转化为原生质。在某些实施例中，可以使用氢氧化微生物的水性悬浮液将氢和二氧化碳转化成细菌原生质。在某些实施例中，可以使用一氧化碳-氧化微生物的水性悬浮液将一氧化碳和氢气和/或水转化为原生质。在某些实施例中，可以使用甲烷氧化微生物的水性悬浮液将甲烷转化为原生质。在某些实施例中，悬浮液中的微生物为细菌或古细菌。在某些非限制性实施例中，H2-氧化化学自养微生物的水性悬浮液或生物膜将H2和CO2以及一些其它溶解的矿物质营养素转化为生物化学物质和原生质。在某些实施例中，其它溶解的矿物质营养素包括但不限于氮源、磷源和钾源。在某些实施例中，所产生的原生质对人和/或其它动物和/或其它异养生物具有食物价值。在某些实施例中，某些生物化学品可以从原生质和/或细胞外培养液中提取，其具有营养价值和/或在各种有机化学或燃料应用中具有价值。在某些实施例中，驱动这种原生质产生的细胞内能量来源于电子受体对电子供体的氧化。在某些非限制性实施例中，电子供体包括但不限于以下中的一种或多种：H2；CO；CH4。在某些非限制性实施例中，电子受体包括但不限于O2。在某些非限制性实施例中，能量产生反应或呼吸作用的产物包括但不限于水。在某些实施例中，来自用于驱动这种来自CO2的生物化学物质和原生质合成的呼吸作用的细胞内能量被储存并携带在生化分子(包括但不限于ATP)中。对于本文某些实施例中使用的氢氧混合气微生物，电子受体是O2，且呼吸产物是水。
[0268] 在一些实施例中，经由以下中的一种或多种方法优化产生的氨基酸分子的蛋白质产生和分布：控制生物反应器条件、控制营养物水平、细胞的遗传修饰。在本发明的某些实施例中，通过维持特定的生长条件(例如氮、氧、磷、硫的水平，微量营养物，如无机离子，和(如果存在)任何通常不被视为营养物或能源的调节分子)来控制和优化通向氨基酸，或蛋白质或其它营养物或全细胞产物的途径以生产化学产品。在本发明的某些实施例中，可以通过根据生物的需要将发酵液保持在需氧、微需氧、缺氧、厌氧或兼性条件下来优化溶解氧(DO)。兼性环境被认为是具有由水柱分层引起的需氧上层和厌氧下层的兼性环境。本发明中公开的微生物对氨基酸或蛋白质或其它营养物或全细胞产物的生物合成可以在对数期期间或在细胞倍增停止的稳定期期间之后发生，条件是有足够的碳供应和能源和其它营养源。
[0269] 本文所述的生物反应器、培养条件、异养和化学营养生长、维持和氨基酸，或蛋白质，或其它营养物或全细胞产物生产方法的具体实例可以任何合适的方式组合以提高微生物生长和氨基酸、或蛋白质，或其它营养物，或全细胞生产的效率。
[0270] 在本发明的某些非限制性实施例中，CO2的生物合成还原利用通过水电解产生的O2电子受体和/或H2电子供体。在本发明的某些非限制性实施例中，通过水电解产生的部分O2和所有H2加入到本发明的微生物的水性悬浮液中。在某些非限制性实施例中，进料至微生物水性悬浮液的H2与O2摩尔数的摩尔比大于2：1。在通过水电解产生O2电子受体和H2电子供体的某些非限制性实施例中，在已经满足本发明的微生物的H2和O2的所有代谢需求之后仍存在O2剩余。在某些这类实施例中，将剩余的O2供应给人和/或其它需氧生命形式和/或作为化学副产物储存和销售。
[0271] 在某些非限制性实施例中，CO2已经从工业烟道气中移出，或从地质源截取，否则其将自然地排放到大气中，或从封闭的舱室大气中移出。在某些实施例中，无机营养盐在过程开始时和/或与气体同时进料。在某些实施例中，微生物在所提供的H2和CO2以及无机盐(营养物)上生长和繁殖。在某些实施例中，微生物氧化H2作为原生质合成的能量来源。在某些非限制性实施例中，以一定的固定速率收获细胞：维持稳态群体和气体摄取速率。本发明的某些非限制性实施例用于闭环生命支持应用中。在某些非限制性实施例中，本发明可用于取代或置换将H2和CO2转化为甲烷的萨巴捷反应(Sabatier reaction)。在某些非限制性实施例，并非通过萨巴捷反应从H2和CO2生产甲烷，营养物(包括但不限于以下中的一种或多种：蛋白质、脂肪、糖和多糖)使用H2和CO2生产。在某些非限制性实施例中，本发明执行有用的功能，包括但不限于以下中的一种或多种：CO2还原；需要进行最小程度的改性以用于食物用途的生物质的合成尿液中的尿素和其它营养物的利用。在某些非限制性实施例中，在本发明中使用由液体和/或固体生物和/或其它碳基废物的气化、重整或焚烧产生的灰中的CO2和/或CO和/或矿物质营养素。出于说明目的而提供的过程的非限制性示例的输入和输出在图29中示出。图30中展示出于说明目的给出的过程的非限制性示意流程图。
[0272] 在本发明的某些非限制性实施例中，进行以下中的一种或多种功能：CO2还原；可用作食物或营养源的细胞物质的合成；减少含氮废物和利用尿素、氨、铵和/或硝酸盐。
[0273] 在本发明的某些非限制性实施例中，使用封闭的培养容器，并在压力下将氢气、氧气和CO2供应至容器。在某些非限制性实施例中，通过气体传感器控制进入腔室的气流以保持腔室中固定的H2、O2和CO2浓度。在某些非限制性实施例中，通过容器中的机械搅拌将气体和培养基混合，以使气体最大化扩散到液体中。在某些非限制性实施例中，氢气和氧气由水电解槽供应，并且CO2从废物源或通常排放到大气或舱室空气中的来源捕获。在某些非限制性实施例中，工艺流流向生物质收获单元。在某些非限制性实施例中，离心作用用于将固体与液体分离。在某些非限制性实施例中，将液体再循环或送到水回收，例如水回收单元。在某些实施例中，通过微生物的呼吸作用产生的水和/或通过由微生物产生的营养物供给的异养物产生的水可以再循环到电解池和/或返回到生物反应器。在某些实施例中，水副产物可用于部分抵消电解产生H2的水需求。在某些实施例中，水副产物是可以纯化和销售，或提供用于植物或其它生物的生长，或以其它方式提供给其它水消费者的副产物。在某些非限制性实施例中，在水回收单元处除去可能以其它方式积聚在系统中的非所需物质。在某些非限制性实施例中，再生水在水电解槽中重复使用。在某些非限制性实施例中，向培养容器提供营养组合物以维持目标培养基组合物。在某些非限制性实施例中，提供尿液作为营养物。在某些实施例中，生成的生物质被加工用作食品或其它生物基产品。
[0274] 在本发明的某些非限制性实施例中，本发明的一种或多种微生物的连续培养或分批或补料分批培养是三步骤闭合生命支持循环的中间步骤，所述三步骤闭合生命支持循环是针对将人体代谢废物：尿素和二氧化碳转化为透气氧气和食物来源和/或营养补充剂。在本发明的这些实施例中，除了化学自养CO2-固定步骤之外，完整循环的另外两个步骤为(1)收集和回收从舱室大气中除去的CO2和(2)电解水以产生用于舱室供应的透气氧气，以及副产物氢气，所述副产物氢气被供给到封闭的培养容器的气相中。在某些非限制性实施例中，细菌在与作为碳源的CO2废物一起生长期间使用废尿素作为部分或唯一的氮源。在某些非限制性实施例中，从稳态培养物收获的过量细胞是人、动物或其它异养生物的潜在食物和/或植物的肥料。
[0275] 不受理论限制，人们认为鱼类和其它水产养殖生物的相对较高的FCR是由于如冷血和生活在浮力环境中，并且因此抗重力较少的因素。在某些非限制性实施例中，经饲养通过本发明产生的蛋白质和/或其它营养物的生物是冷血的食物产生物种。在某些实施例中，经饲养通过本发明产生的蛋白质和/或其它营养物的生物是并非温血动物的异养生物，例如但不限于微生物、真菌、动物细胞培养物和/或冷血动物。在某些非限制性实施例中，细胞和/或生物生活在浮力环境中。在某些非限制性实施例中，生物为定居的。
[0276] 在某些实施例中，根据本发明产生的蛋白质和/或其它营养物用于养鱼的技术和科技，其包括但不限于以下中的一种或多种：孵化场；池塘养殖；网箱养殖；再循环系统；综合多营养水产养殖；综合农业和水产养殖；养耕共生。
[0277] 本发明涉及包含细胞的生物反应器，所述细胞包含至少一种内源或外源核酸序列，其编码氨基酸、蛋白质或其它营养物的途径酶。在一些实施例中，系统包含两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个生物反应器，其中至少一个包含细胞，所述细胞包含至少一种内源或外源核酸序列，其编码氨基酸、或蛋白质或其它营养物的途径酶。在一些实施例中，生物反应器系统包含至少第一和第二生物反应器，其中第一生物反应器包含细胞，所述细胞包含至少一种编码氨基酸或蛋白质，或其它营养物的途径酶的内源或外源核酸序列；且其中第二生物反应器包含衍生自不同物种的微生物，其中来自不同物种的微生物包含至少一种内源或外源核酸序列。在一些实施例中，生物反应器系统包含：第一生物反应器，其包含本发明的细胞；和第二生物反应器，其包含浮游动物，和/或微藻、酵母菌、细菌、真菌、动物和/或植物细胞。在一些实施例中，所述系统包含：包含本发明的细胞的第一生物反应器和包含多细胞动物和/或水产养殖的第二罐或容器。
[0278] 在某些实施例中，本发明的微生物用于饲养水生滤食性动物。在某些实施例中，水生滤食性动物从液体悬浮液中收获本发明的细胞和/或生物合成产物。在某些实施例中，通过水生滤食性动物的作用收获本发明的细胞和/或生物合成产物，避免了与生物质的固-液分离和/或脱水和/或干燥相关的成本。圆蛤类是一种软体动物，其用两个短虹吸管过滤水进出其壳体，从而吸收浮游生物、细菌和氧气。牡蛎消耗含氮化合物(硝酸盐和氨)、磷酸盐、浮游生物、碎屑、细菌和溶解的有机质，将其从水中除去。在本发明的某些实施例中，使用滤食性动物如但不限于圆蛤类和/或牡蛎。在某些非限制性实施例中，使用美洲牡蛎(Crassostrea virginica)。在利用滤食性动物的本发明的某些实施例中，罗非鱼和/或银鲤和/或鳙包括在滤食性动物中。参见例如Taub，Ballard，K，Palmer，F.(1973)《通过连续藻类培养生产贝类(Production Of Shellfish By Continuous Algal Culture)》
.Proc.Nat.Shellfish Assoc.63；10-11(摘要)和Taub，F.B.等人1973年《.作为水产养殖饲料的藻类养殖(Algal culture as aquaculture feed)》.《渔业研究(Research in fisheries)》，其以全文引用的方式并入本文中。
.Proc.Nat.Shellfish Assoc.63；10-11(摘要)和Taub，F.B.等人1973年《.作为水产养殖饲料的藻类养殖(Algal culture as aquaculture feed)》.《渔业研究(Research in fisheries)》，其以全文引用的方式并入本文中。
[0279] 在本发明的某些非限制性实施例中，本发明的微生物与其它生物保持共生关系和/或营养关系。在本发明的某些非限制性实施例中，将本发明的微生物饲喂给滤食性摄食生物，例如但不限于以下中的一种或多种：蛤蜊；牡蛎；贻贝；和/或其它软体动物；卤虫；浮游动物；和/或滤食性摄食鱼类。在某些实施例中，经饲喂根据本发明产生的蛋白质和其它营养物的生物可以在天然或人工来源的容器中生长，所述容器包括但不限于：生物反应器；生物洗涤塔；填充床反应器；活塞流反应器；大桶；水箱和特别是水产养殖、养耕共生和水培的现有技术中已知的水箱系统；消化池；塔；池塘；池；水库；井；泻湖；蓄水池；洞穴；溶洞；矿井；和采石场。含有生物的结构的容器壁、边界或内衬可由一种或多种材料构成，所述材料包括但不限于钢、其它金属和其合金、塑料、玻璃纤维、陶瓷、玻璃、混凝土、水泥、焦油、沥青、密封胶、木材、土壤、沙子、粘土、石头和其任何组合。在某些非限制性实施例中，生物(如但不限于滤食性摄食)也可以在更开放的结构(如畜圈)中生长。
[0280] 在本发明的某些实施例中，可以在与化学合成工艺步骤串联或平行发生的工艺步骤中隔离另外的二氧化碳，其中二氧化碳和/或其它溶解的碳酸盐与矿物质(包括但不限于氧化物或氢氧化物或溶解的金属阳离子)反应以形成碳酸盐或碳酸氢盐产物。在某些实施例中，可以通过生物的催化作用隔离其它二氧化碳和/或其它溶解的碳酸盐，所述生物在(一个或多个)生物步骤中将二氧化碳和/或溶解的碳酸氢盐和/或溶解的碳酸盐和/或溶解的金属阳离子转化为固体碳酸盐或生物矿物质。
[0281] 在某些实施例中，向一种或多种生物饲喂衍生自本发明的微生物的微生物和/或营养物，所述一种或多种生物天然地将二氧化碳和/或溶解的碳酸氢盐和/或溶解的碳酸盐和/或溶解的金属阳离子转化为固体碳酸盐或生物矿物质。在某些所述实施例中，生物产生含碳酸盐的材料，包括但不限于壳或礁材料。在某些实施例中，产生含碳酸盐材料的生物是滤食性动物。在所产生贝类的全部量中，75％到90％通常由壳组成。这些壳由95％碳酸钙构成，且其余为有机质和其它化合物。
[0282] 在某些非限制性实施例中，在本发明的微生物方法中产生的营养物用于生长贝类，所述贝类由75到90重量％的壳材料构成，其碳酸钙含量为约95％。在某些实施例中，产生含碳酸盐材料的生物包括但不限于以下中的一种或多种：牡蛎、蛤、贻贝、其它软体动物和珊瑚。在某些所述实施例中，形成可食用产品，例如但不限于肉，以及含有固体不可食用碳酸盐的材料，包括但不限于壳。在某些实施例中，产生肉和壳的生物包括但不限于牡蛎、蛤、贻贝和其它软体动物。
[0283] 在某些实施例中，在固体碳酸盐生物材料中隔离隔离的碳超过生物的可食用部分中含有的碳。在某些实施例中，经由提供微生物生物质作为水产养殖饲料，隔离隔离到壳中的碳以一定量抵消在根据本发明产生的微生物生物质营养转化为可食用的贝类生物质而以CO2形式损失的碳。在某些实施例中，在碳酸盐材料(包括但不限于壳或珊瑚)中隔离的碳超过在所述营养转化中损失的碳，使得在将微生物细胞团转化为生物(包括但不限于贝类或珊瑚)时，捕获的碳净增加。
[0284] 在某些实施例中，通过本发明隔离在碳酸盐生物材料中的碳与固定在微生物生物质中的碳相比与大气隔离的时间更长。在某些实施例中，通过本发明在碳酸盐生物材料中隔离的碳与包含在经饲喂根据本发明产生的微生物和/或其营养物的生物的软组织中的碳相比与大气隔离的时间长得多。在某些实施例中，将在碳酸盐生物材料(包括但不限于壳和/或珊瑚)中捕获的碳隔离超过一百年。参见例如M.R.Hamester，P.S.Balzer和D.Becker，《获自牡蛎和贻壳的碳酸钙的表征和聚丙烯的并入(Characterization of calcium carbonate obtained from oyster and mussel shells and incorporation in polypropylene)》，《材料研究(Materials Research)》，第15卷，第204-208页，2012.[在线].可用：http：//www.scielo.br/scielo.php？script＝sci_arttext&pid＝S1516-
14392012000200006&nrm＝iso，和G.-L.Yoon，B.-T.Kim，B.-O.Kim和S.-H.Han《，碎牡蛎壳的化学-机械特征(Chemical-mechanical characteristics of crushed oyster-
shell)》，《废物管理(Waste Management)》，第23卷，第9期，第825-834页，2003年1月.[在线].可用：http：//dx.doi.org/10.1016/s0956-053x(02)00159-9，以及来自英国斯旺西大学的可持续水产养殖研究中心的Ingrid Lupatsch的名为《对饲喂活牟氏角毛藻的幼年太平洋牡蛎长牡蛎的能量和蛋白质需求的研究(Studies On Energy And Protein
Requirements Of Juvenile Pacific Oyster Crassostrea Gigas Fed Live
Chaetoceros Muelleri)》的文章，其以全文引用的方式并入本文中。
14392012000200006&nrm＝iso，和G.-L.Yoon，B.-T.Kim，B.-O.Kim和S.-H.Han《，碎牡蛎壳的化学-机械特征(Chemical-mechanical characteristics of crushed oyster-
shell)》，《废物管理(Waste Management)》，第23卷，第9期，第825-834页，2003年1月.[在线].可用：http：//dx.doi.org/10.1016/s0956-053x(02)00159-9，以及来自英国斯旺西大学的可持续水产养殖研究中心的Ingrid Lupatsch的名为《对饲喂活牟氏角毛藻的幼年太平洋牡蛎长牡蛎的能量和蛋白质需求的研究(Studies On Energy And Protein
Requirements Of Juvenile Pacific Oyster Crassostrea Gigas Fed Live
Chaetoceros Muelleri)》的文章，其以全文引用的方式并入本文中。
[0285] 本发明的某些实施例涉及用于滤食性生物生长的分批或连续浮游动物培养系统和/或水产养殖系统。本发明的某些非限制性实施例可包括培养反应器；筛选系统，其配置成将浮游动物和/或滤食性生物保持在反应器内；微生物饲养单元，其中将本发明的一种或多种微生物饲喂给浮游动物和/或滤食性生物；pH调节和控制系统；和氧气输送系统。在某些实施例中，收获滤食性生物的卵。在某些实施例中，所收获的卵为卤虫的卵。在某些实施例中，从饲养卤虫的圈占地的水表面撇去卤虫卵。在某些实施例中，然后将收获的卵清洗和/或冷冻和/或浓盐水处理和/或测试和/或干燥。
[0286] 本发明的某些非限制性实施例的另一个特征涉及由化学自养微生物使用用以将二氧化碳和/或其它C1原料固定到有机化合物的电子供体的来源，生产或再循环。可以使用来自许多不同的可再生和/或低碳排放能源技术的能量，在本发明的某些实施例中以电化学或热化学方式生产或再循环用于二氧化碳捕获和碳固定的电子供体，所述能量包括但不限于：光伏、太阳能、风能、水电、核能、地热、增强地热、海洋热能、海浪能、潮汐能。可以生长化学自养生物的许多还原的无机化学物质(例如H2、CO、H2S、亚铁、铵、Mn2+)可以使用所属领域中熟知的电化学和/或热化学方法和化学工程科学容易地生产，所述化学工程科学可由各种无二氧化碳排放或低碳排放和/或可再生能源提供动力所述能源包括但不限于光伏、太阳能、风能、水力发电、核能、地热、增强地热、海洋热能、海浪能或潮汐能。
[0287] 在使用分子氢作为电子供体的本发明的某些实施例中，H2通过化学和工艺工程的领域和科学所熟知的方法产生，其包括但不限于以下中的一种或多种：经由电解水，包括但不限于使用质子交换膜(PEM)、液体电解质(如KOH)、碱性电解、固体聚合物电解质电解、高压电解、蒸汽高温电解(HTES)的方法；和/或通过包括但不限于氧化铁循环、氧化铈(IV)-氧化铈(III)循环、锌-氧化锌循环、硫-碘循环、铜-氯循环、钙-溴-铁循环、杂化硫循环的方法进行的水的热化学分解；和/或硫化氢的电解；和/或硫化氢的热化学分解；和/或已知产生氢以及低或无二氧化碳排放的其它电化学或热化学方法，包括但不限于：实现碳捕获和隔离(CCS)的甲烷重整；实现CCS的煤气化；Kvaemer方法和生产碳黑产品的其它方法；实现CCS的生物质的气化或热解。在本发明的某些实施例中，产生H2的方法包括但不限于由可再生电能和/或来自低GHG源的电能提供动力的电解。在本发明的某些实施例中，电解由以下中的一种或多种提供动力：太阳能，包括但不限于光伏和/或太阳热能；风能、水力发电；核能；地热；增强地热；海洋热；海浪能；潮汐能。
[0288] 在本发明的某些实施例中，微生物生物过程与农业或水产养殖过程整合并向其提供营养物。在某些实施例中，使用可再生能量和/或来自低GHG来源的能量来满足所述农业或水产养殖过程的电力和/或热需求。
[0289] 在本发明的某些实施例中，在电网的非高峰需求时间期间产生的可再生能源用于生产工艺的H2原料。在本发明的某些实施例中，H2和CO2气体的现场存储仅在可再生发电超过电力需求期间使得能够从电网转移电力。在某些实施例中，允许电力在较高需求期间照常流入电网。在本发明的某些实施例中，所述过程不会破坏可再生电源，而是能够更完全地利用可再生发电容量，例如但不限于风能和太阳能。即使在发电超过电网需求(例如，非高峰风力或太阳能发电)期间，本发明的某些实施例也允许持续的可再生操作和发电。
[0290] 在本发明的某些实施例中，氢电子供体不一定在低或无二氧化碳排放情况下产生，然而氢是使用化学和工艺工程的领域已知的方法从废物、可持续或低价值能源和/或碳源产生的。这些方法包括但不限于原料的气化、热解、蒸汽重整或自热重整，所述原料例如但不限于以下中的一种或多种：城市固体废物、黑液、农业废物、木材废物、闲置天然气、生物气、酸性气体、甲烷水合物、液化石油气、石油焦、轮胎、污水、粪肥、秸秆、海藻和海带、以及总体而言低价值、高木质纤维素生物质。
[0291] 在本发明的某些实施例中，使用含有H2和/或CO和/或CO2的合成气或生产气体作为电子供体和/或碳源。在某些实施例中，合成气或生产气体中含有的H2和/或CO和/或CO2由使用可再生和/或低GHG能源和转化过程(例如本文中所描述的那些中的一种或多种)产生的H2补充。
[0292] 在某些实施例中，用于产生本发明的生物过程中所使用的电子供体和/或碳源的气化、热解、焚烧和/或厌氧消化也产生有用的副产物，所述副产物包括但不限于电和/或工艺用热，所述电和/或工艺用热用于微生物生物过程，和/或相关的农业或水产养殖系统，和/或提供给电网或公用设施，或以其它方式提供给周围的消费者。
[0293] 在某些实施例中，经由如气化、热解或蒸汽重整的方法以产生氢和/或CO的副产物形式产生的工艺用热经回收并在转化过程中其它地方利用以提高总体能量效率。化学和/或热量和/或电副产物可以伴随分子氢和/或CO的产生，所述分子氢和/或CO可以尽可能在本发明的某些实施例的转化过程中的其它地方使用，例如以便提高效率。
[0294] 在某些实施例中，可以制备另外的化学副产物(例如，超出可以在本发明的某些实施例的转化过程中内部使用的化学副产物)以便销售从而产生额外的收入流。在生产分子氢和/或CO中产生的余热或电能副产物(例如，超出可在所述过程内部使用的那些)可以被递送出售，例如通过热交换和传输以及发电和传输的领域和科学已知的方法(包括但不限于以可以出售到电网中的形式将工艺热量转换成电力)，用于另一种化学和/或生物过程。
[0295] 在利用H2作为电子供体的本发明的某些实施例中，可能存在使用可再生和/或无CO2排放的能量输入在H2产生中形成的化学副产物。如果例如使用水作为氢源，那么氧可以是通过包括但不限于电解或热化学水分解的过程的水分解的副产物。在使用水作为氢源以及氢氧混合气微生物的本发明的某些实施例中，一些氧副产物可以通过氢氧反应的呼吸作用用于产生ATP和/或其它细胞内能量载体。在本发明的某些实施例中，通过水分解产生的氧气超过呼吸作用所需的氧气，以便维持系统中氢氧混合气微生物和/或其它需氧生物进行碳固定和有机化合物生产的最佳条件，所述氧气可以通过商业氧气生产的领域和科学中已知的工艺步骤将其加工成适于销售的形式。
[0296] 本发明的某些实施例中的电子供体也可以从污染物或废物中提取或精制，所述污染物或废物包括但不限于以下中的一种或多种：工艺气体；尾气；强化采油排气；闲置天然气；生物气；垃圾填埋气；和酸性气体。在本发明的某些实施例中，含有H2和/或CH4和/或CO的尾气用作电子供体和/或碳的来源。在某些实施例中，来自炼油厂的尾气用作电子供体和/或碳的来源。
[0297] 在某些非限制性实施例中，仅含有一个碳原子的有机化合物通过生物质和/或其它有机质(例如来自废物或低价值来源的生物质和/或其它有机物)的气化和/或热解产生；和/或通过甲烷或天然气(例如闲置天然气，或以其它方式会灼烧或释放到大气中的天然气)、或生物气、或垃圾填埋气体的甲烷蒸汽重整产生，并作为合成气和/或其它气体或C1化合物流提供到微生物培养物中；在某些实施例中，合成气或生产气体中氢气与一氧化碳的比率可通过如水煤气变换反应的手段调节，和/或其中在将气体输送到微生物培养物之前，氢气与CO2的比率可通过如碳捕获的手段调节。
[0298] 在一些实施例中，通过本发明产生的生物质被转化为动物饲料或掺入动物饲料配制物中或用作人类营养的来源。
[0299] 大部分高等植物对许多不同动物为不可食用的，所述动物包括但不限于人和其它非反刍动物。这可能导致许多缺点，包括将能量和碳引入非所需副产物或废物中。这会降低所需产品的产率并增加废物处理和处置的额外负担。
[0300] 在本发明的某些实施例中，就CO2捕获和/或生物质产生而言，与相当的高等植物作物相比，更大通量的碳和/或能量被引导到目标生物质产物中。在某些实施例中，本发明中产生的生物质的不可食用部分与可食用部分的比率低于高等植物作物。
[0301] 在某些实施例中，在人工照明下生长的高等植物培养物每单位重量产生的可食用生物质需要比本发明多至少30倍的电力。高等植物作物的生长周期相对较长，因此食物收获是周期性的，并且消费通常与产量不匹配。这种产量与消费之间的不匹配通常需要相对广泛的保存和储存以防止浪费。
[0302] 在本发明的某些实施例中，由本发明的微生物产生的生物质产量和由动物或其它异养生物进行的生物质产物消耗比基于高等植物作物的相当系统更紧密地匹配。在本发明的某些实施例中，与基于高等植物作物的类似系统相比，需要较少的生物质保存和/或存储。在本发明的某些实施例中，与相当的高等植物作物相比，食物浪费量较低。
[0303] 在一些实施例中，本发明的微生物每升液体培养悬浮液产生至少1mg的目标碳基产物。在一些实例中，产物由生物分泌到培养基中。在其它实例中，产物在发酵过程中保留在生物中。在某些情况下，可以通过裂解细胞并分离产物来回收产物。在其它情况下，产品可以在完整生物中具有商业价值，而无需从生物中大量制备或纯化产物。
[0304] 在某些实施例中，可以使用工艺工程领域中已知的设备和技术从水性发酵液溶液中回收生物合成化学产物和/或废弃的营养物，并且针对本发明的特定实施例的化学产品，所述设备和技术包括但不限于：溶剂萃取；水萃取；蒸馏；分馏；胶结；化学沉淀；碱性溶液吸收；在活性炭、离子交换树脂或分子筛上的吸收或吸附；溶液pH值和/或氧化还原电位的改变，蒸发器、分级结晶器、固/液分离器、纳米过滤和其所有组合。
[0305] 在本发明的某些实施例中，进行细胞团与液体悬浮液的分离。在某些实施例中，此分离通过微生物培养领域中已知的方法进行。细胞团收获技术的实例提供于例如1998年1月8日出版的PCT申请第WO08/00558号；美国专利第5,807,722号；美国专利第5,593,886号和美国专利第5,821,111号中，其以全文引用的方式并入本文中，所述技术包括但不限于以下中的一种或多种：离心；絮凝；浮选；使用膜性、中空纤维、螺旋卷绕或陶瓷过滤系统过滤；真空过滤；切向流动过滤；澄清；沉降；水力旋流器。在细胞团可以固定在基质上的某些实施例中，可以通过包括但不限于重力沉降或过滤的方法收获细胞团，并通过刮擦或液体剪切力与生长基质分离。
[0306] 在某些实施例中，在除去细胞团后留下的液体可以泵送到系统中以除去和/或回收生物过程的溶解的化学产物和/或未反应的营养物。在某些实施例中，未反应的营养物和/或水被尽可能回收并再循环和/或在某些实施例中作为副产物出售和/或适当处置。在某些实施例中，在将水和/或未反应的营养物返回生物反应器之前，使用所属领域已知的方法和技术除去废产物和/或污染物和/或任何抑制性和/或有害化合物。
[0307] 在涉及化学自养微生物的本发明的某些实施例中，氧化金属阳离子的溶液可以在一个或多个化学合成反应步骤之后保留。在其它非限制性实施例中，富含溶解的金属阳离子的溶液也可以由在所述方法的某些气体输入中携带的颗粒和杂质产生，例如来自燃煤设备或煤或城市固体废物(MSW)的气化。
[0308] 在金属阳离子存在于有利于除去的工艺流中的本发明的一些实施例中，工艺流可以通过包括但不限于以下的方法剥离金属阳离子：在铁屑、钢丝绒、铜或锌粉上胶结；化学沉淀为硫化物或氢氧化物沉淀物；电解沉积以电镀特定金属；在活性炭或离子交换树脂上吸收、溶液pH值和/或氧化还原电位的改变、反渗透和/或溶剂萃取。在本发明的某些实施例中，回收的金属可以再循环和/或出售以获得额外的收入流。
[0309] 在某些实施例中，游离和/或溶解的有机分子可通过包括但不限于细胞排泄或分泌或细胞裂解的手段从微生物释放到工艺流溶液中。
[0310] 在某些实施例中，可以使用工艺工程领域中已知的设备和技术在本发明的某些实施例中从水溶液中回收和/或再循环化学产物和/或未反应的营养物，并且针对本发明的特定实施例的化学产品，所述设备和技术包括但不限于：溶剂萃取；水萃取；蒸馏；分馏；胶结；化学沉淀；碱性溶液吸收；在活性炭、离子交换树脂或分子筛上的吸收或吸附；溶液pH值和/或氧化还原电位的改变，蒸发器、分级结晶器、固/液分离器、纳米过滤、反渗透和其所有组合。
[0311] 在某些实施例中，化学产品和/或未反应的营养物流入支持其它生物生长的环境中。在某些实施例中，流出水和未反应的营养物用于灌溉和施肥高等植物。罗非鱼和其它水生动物能够从培养水中吸收矿物质。在某些实施例中，未反应的矿物质营养物流入罗非鱼和/或其它水生动物的生长环境中。在本发明的某些实施例中，无机营养物从本发明的化学自养生物反应器流到含有动物(包括但不限于罗非鱼)的水产养殖系统，并刺激培养系统中活饲料生物和植物(包括但不限于浮游植物)的产生。在某些实施例中，来自生物反应器流出物的无机和/或有机营养物充当肥料，其增加池塘和/或水产养殖和/或养耕共生和/或水培中使用的其它圈占地的主要产量。
[0312] 在某些实施例中，本发明的化学自养生成的生物质由碳源(包括但不限于以下中的一种或多种：CO2、CO、CH4、CH3OH)产生；流到或以其它方式应用于农业和/或水产养殖和/或养耕共生和/或水培系统，其中所述生物质通过供应有机质和碎屑来补充和/或置换直接刺激较高营养水平的有机肥。在某些实施例中，所述有机质代表物种的直接食物来源，所述物种包括但不限于可以以碎屑和植物副产物为食的物种，包括但不限于罗非鱼。
[0313] 在本发明的某些非限制性实施例中，每天施用化学自养生成的有机质的干重为鱼类生物质的2-4％。在某些这些实施例中，监测水产养殖圈占地中的DO和/或pH值和/或水透明度。在某些这些实施例中，如果DO低于4.0mg/l且/或pH值高于9.0且/或水透明度低于25cm，那么有机质的输入物悬浮。
[0314] 在某些实施例中，向混养物供给从本发明的生物反应器流出的有机质和/或无机营养物。在某些实施例中，混养物包含罗非鱼和/或鲤鱼和/或虾。参见例如，《尼罗罗非鱼-肥料和施肥(Nile tilapia-Fertilizers and fertilization)》，联合国粮食及农业组织(FAO)，http：//www.fao.org/fishery/affris/species-profiles/nile-tilapia/fertilizers-and-fertilization/en/，其以全文引用的方式并入本文中。
[0315] 在本发明的某些实施例中，在本发明的微生物方法中产生的营养物用于对实施混养的池塘施肥。在某些实施例中，通过本发明的微生物方法产生的营养物用于对植物作物(包括但不限于水稻)施肥。在某些实施例中，将本发明的微生物方法中产生的营养物饲养到综合的多营养水产养殖系统中，所述系统包括但不限于以下中的一种或多种：有鳍鱼、鲍鱼、贝类、海藻、海带和/或其它无脊椎动物(包括但不限于海参)。
[0316] 某些化学自养物种可达到的高生长速率可使其匹配或超过可通过光合微生物实现的每单位现存生物质的最高碳固定率和/或生物质产量。在某些实施例中，可以产生过剩的生物质。在某些实施例中，可以从系统中除去细胞团的过剩生长以产生生物质副产物。在一些实施例中，可以从系统中除去细胞团的过剩生长以便在微生物培养物中维持所需(例如最佳的)微生物群体和细胞密度，以实现持续的高碳捕获和固定速率和/或原料转化率。
[0317] 在某些实施例中，用于回收化学产品和/或营养物和再循环水和/或去除废物的工艺中使用的化学品对人类具有低毒性，并且如果暴露于循环回到生物反应器的工艺流，那么对于在本发明的所述具体实施例中使用的特定微生物具有低毒性或无毒性。
[0318] 在本发明的某些实施例中，如果在收获/分离/产物回收过程中已从培养物中除去过量的细胞，那么除去的过量细胞可以与新鲜营养培养基一起返回到生物反应器内的细胞培养物中，在某些情况下，使得在一个或多个生物反应器反应步骤中保留足够和/或最佳的细胞数量和密度。在某些实施例中，这可以促进实现目标和/或最佳原料转化和/或有机化合物的生产。在某些实施例中，可以例如使用气升式或间歇泵将通过收获/分离/产物回收系统除去的细胞再循环回到培养容器中。在某些实施例中，再循环回到培养容器中的细胞不暴露于絮凝剂，除非这些试剂对微生物无毒。
[0319] 为了帮助将生物质产物加工成有用的产物，可以使用熟知的方法将在本发明的某些实施例中收获的微生物细胞打开，所述方法包括但不限于以下中的一种或多种：球磨、空化压力、超声处理、均匀化或机械剪切。
[0320] 在一些实施例中收获的生物质可以在一个或多个工艺步骤中干燥。生物质干燥可以在本发明的某些实施例中使用熟知的技术进行，所述技术包括但不限于以下中的一种或多种：离心、转鼓干燥、蒸发、冷冻干燥、加热、喷雾干燥、真空干燥和/或真空过滤。在本发明的某些实施例中，废热可用于干燥生物质。在某些实施例中，来自用作碳源的工业烟道气源的热量浪费可用于干燥生物质。在某些实施例中，如上所述的来自电子供体和/或C1碳源的产生的热副产物可用于干燥生物质。
[0321] 在本发明的某些实施例中，在干燥后或在无需先前干燥步骤的情况下进一步加工生物质以帮助分离和生产有用的生物化学品。在某些实施例中，这种另外的处理涉及从微生物生物质中分离蛋白质或脂质内容物或维生素或其它靶向生物化学物质。在某些实施例中，脂质的分离可以通过使用非极性溶剂来萃取脂质来执行，所述溶剂例如但不限于以下中的一种或多种：己烷、环己烷、乙醚、醇(异丙醇、乙醇等)、磷酸三丁酯、超临界二氧化碳、三辛基氧化膦、仲胺和叔胺或丙烷。在某些实施例中，可以使用包括但不限于以下中的一种或多种的溶剂萃取其它有用的生物化学品：氯仿、丙酮、乙酸乙酯和四氯乙烯。
[0322] 在一些实施例中，本发明提供通过在生物反应器或溶液中组合一种或多种生物合成途径来生产氨基酸和/或蛋白质的方法，所述生物合成途径包括但不限于氨基酸生物合成途径、含碳气体和经工程改造或天然微生物，所述经工程改造或天然微生物将含碳气体(如合成气、生产气体、CO2、一氧化碳和其含有氢气的混合物)和/或气态或液态C1化合物(包括但不限于甲醇或甲烷)转化成氨基酸和/或蛋白质。在一些实施例中，使用化学、化学工程和食品科学的领域和科学中已知的方法将氨基酸和/或蛋白质包括在动物饲料配制物中。
[0323] 在本发明的某些实施例中，将通过本发明产生的蛋白质生物质用作替代性蛋白质来源。在某些实施例中，其用作鱼粉或酪蛋白或乳清或大豆粉的替代品。在本发明的某些实施例中，根据本发明生产的蛋白质用于饲料或肥料配制物中代替鱼粉或酪蛋白或乳清或大豆粉或其它植物蛋白。在本发明的某些非限制性实施例中，蛋白质产物不缺乏任何必需氨基酸。在某些非限制性实施例中，蛋白质产物不缺乏赖氨酸和/或甲硫氨酸。在某些非限制性实施例中，蛋白质生物质不含有大量抗营养因子。在某些实施例中，蛋白质生物质不含有大量的以下中的一种或多种：棉子酚、芥子油苷、皂苷、胰蛋白酶抑制剂。在某些实施例中，蛋白质生物质用作非常规蛋白质来源，其适用于包括但不限于尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的物种。
[0324] 氢氧混合气微生物的工程改造描述于2012年9月19日提交的题为《INDUSTRIAL FATTY ACID ENGINEERlNG GENERAL SYSTEM FOR MODIFYING FATTY ACIDS(用于改性脂肪酸的工业脂肪酸工程改造总体系统)》的美国专利申请第2013/0089899中。出于所有目的，本申请以全文引用的方式并入本文中。
[0325] 使用氢氧混合气微生物转化合成气、生产气体或高能量密度分子中的其它含H2和CO2和/或CO的气体混合物描述于2012年10月26日题为《USE OF OXYHYDROGEN MICROORGANISMS FOR NON-PHOTOSYNTHETIC CARBON CAPTURE AND CONVERSlON OF
INORGANIC AND/OR C1 CARBON SOURCES INTO USEFUL ORGANIC COMPOUNDS(使用氢氧微生物用于非光合碳捕获和将无机和/或C1碳源转化为有用的有机化合物)》的美国专利申请第
2013/0149755号中。出于所有目的，本申请以全文引用的方式并入本文中。
INORGANIC AND/OR C1 CARBON SOURCES INTO USEFUL ORGANIC COMPOUNDS(使用氢氧微生物用于非光合碳捕获和将无机和/或C1碳源转化为有用的有机化合物)》的美国专利申请第
2013/0149755号中。出于所有目的，本申请以全文引用的方式并入本文中。
[0326] 使用化学营养微生物将CO2转化为有用的有机化学品描述于在美国以申请号2013/0078690公开且名为《利用化学自养微生物将二氧化碳和/或其它无机碳源化学合成固定到有机化合物的生物和化学过程，以及额外的有用产物的产生(BIOLOGICAL AND CHEMICAL PROCESS UTILIZING CHEMOAUTOTROPHIC MICROORGANISMS FOR THE
CHEMOSYTHETIC FIXATION OF CARBON DIOXIDE AND/OR OTHER INORGANIC CARBON
SOURCES INTO ORGANIC COMPOUNDS，AND THE GENERATlON OF ADDITIONAL USEFUL
PRODUCTS)》的在2010年5月12日提交的PCT国际申请号PCT/US2010/001402中。出于所有目的，本申请以全文引用的方式并入本文中。
CHEMOSYTHETIC FIXATION OF CARBON DIOXIDE AND/OR OTHER INORGANIC CARBON
SOURCES INTO ORGANIC COMPOUNDS，AND THE GENERATlON OF ADDITIONAL USEFUL
PRODUCTS)》的在2010年5月12日提交的PCT国际申请号PCT/US2010/001402中。出于所有目的，本申请以全文引用的方式并入本文中。
[0327] 本发明的方面涉及用于产生用于工业应用的分子的工程生物。如本文所用，“工程改造生物”和“工程改造微生物”和“非天然存在的微生物”可互换使用，并且指代重组表达包含至少一种外源基因的核酸的生物。在一些实施例中，这类核酸编码如本文所述的酶。可以通过常规技术鉴别与本发明相关的基因的同源物和等位基因。本发明还涵盖称为“引物”或“引物组”的核酸，其在严格条件下与本文所述基因杂交。如本文使用的术语“严格条件”纸袋所属领域熟悉的参数。核酸杂交参数可以发现于编写这类方法的参考文献中，例如《分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》，J.Sambrook等人编，第四版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2012或《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》，F.M.Ausubel等人编，约翰·威利父子公司，美国纽约。
[0328] 本发明的一些实施例的另一个特征涉及通过人工方法修饰本发明的微生物，所述方法包括但不限于加速诱变(例如使用紫外线或化学处理)、基因工程改造或修饰、杂交、合成生物学或传统选育。微生物的可能修饰包括但不限于旨在产生增加的氨基酸和/或维生素和/或蛋白质的数量和/或质量的微生物的那些。
[0329] 后处理转化
[0330] 生产动物或水产养殖饲料
[0331] 在一些实施例中，然后使用化学、化学工程和食品科学的领域和科学熟知的方法和工艺将根据本发明产生的蛋白质和/或蛋白质生物质转化为动物饲料。在某些实施例中，通过本发明产生的饲料用于生长生物，所述生物包括但不限于以下中的一种或多种：其它微生物、酵母菌、真菌、浮游动物、贝类或其它无脊椎动物；鱼类；鸟类；哺乳动物。在某些非限制性实施例中，鱼类包括但不限于以下中的一种或多种：罗非鱼；三文鱼；军曹鱼。在某些非限制性实施例中，鸟类包括但不限于鸡或火鸡。在某些非限制性实施例中，哺乳动物包括但不限于以下中的一种或多种：兔、山羊、绵羊、猪、牛。在某些非限制性实施例中，通过本发明产生的饲料用于生长活饲料，所述活饲料进而维持有鳍鱼幼鱼度过生命的最初几周。在某些实施例中，这种活饲料包含浮游动物。在某些实施例中，根据本发明产生的饲料用于生长包括但不限于以下中的一种或多种的浮游动物生物：轮虫[轮形动物门(Phylum Rotifera)]；水蚤类目(例如水蚤属(Daphnia sp.)、裸腹蚤属(Moina sp.))；桡足亚类(例如剑水蚤)；卤虫(卤虫属)。
[0332] 在本发明的一些实施例中，来自细菌产生的蛋白质中的超过90％的氮被消耗氨基酸或肽或蛋白质或蛋白质生物质的生物吸收。在一些实施例中，本发明的微生物细胞在饲喂另一种生物之前煮沸。在其它实施例中，在喂食另一种生物之前，将细胞超声处理，或以其它方式裂解或破裂。
[0333] 利用生物系统进行食品生产的主要挑战之一是在蛋白质、碳水化合物和脂肪的量之间获得适当的膳食平衡。通常考虑用于食物合成的微生物系统倾向于产生蛋白质不成比例地高的生物质。在本发明的某些实施例中，使用油质菌株，其相对于蛋白质含量产生更高比例的脂肪和油。在某些实施例中，所用的油质菌株属于红球菌属。
[0334] 在某些实施例中，利用产生碳水化合物或多糖的菌株，其相对于蛋白质含量产生更高比例的碳水化合物或多糖。在某些实施例中，所用的产生碳水化合物或多糖的菌株是海马氏弧菌(Hydrogenovibrio marinus)。
[0335] 含碳酸盐材料的生产
[0336] 在某些实施例中，通过本发明产生的蛋白质和/或其它营养物用于生长生物合成含有碳酸盐的生物材料的生物(包括但不限于壳和/或珊瑚)。贻贝和牡蛎壳中含有高含量的碳酸钙，可用于药物配制物，建筑中或聚合物材料中的填料。
[0338] 在某些实施例中，根据本发明生产的壳(包括但不限于牡蛎和/或蛤和/或扇壳)壳用作铺筑材料或硬景观。在某些实施例中，壳用作砾石和/或碎石保护层(topping)的替代物。在某些实施例中，壳用于铺设车道和/或路径和/或庭院和/或庭院和/或地掷球球场。在某些实施例中，包括但不限于牡蛎壳的壳用作景观美化材料和/或营养丰富的土壤改良剂和/或天然害虫威慑物。
[0339] 在某些实施例中，根据本发明生产的牡蛎壳和/或其它壳或钙质材料与建筑材料组合物中的飞灰和/或高炉矿渣一起使用。G.-L.Yoon，B.-T.Kim，B.-O.Kim和S.-H.Han，《碎牡蛎壳的化学-机械特征(Chemical-mechanical characteristics ofcrushed oyster-shell)》，《废物管理(Waste Management)》，第23卷，第9期，第825-834页，2003年1月.[在线].可用：http：//dx.doi.org/10.1016/s0956-053x(02)0O159-9；E.-I.Yang，S.-T.Yi和Y.-M.Leem，《取代细骨料的牡蛎壳对混凝土特征的影响：第i部分.基本特性(Effect of oyster shell substituted for fineaggregate on concrete characteristics：Part i.fundamental properties)》，《水泥与混凝土研究(Cement and Concrete Research)》，第35卷，第11期，第2175-2182页，2005年11月.[在线].可用：http：//dx.doi.org/10.1016/j.cemconres.2005.03.016；H.Yoon，S.Park，K.Lee和J.Park《，作为砂浆中的骨料的取代物的牡蛎壳(Oyster shell as substitute for aggregate in mortar)》，《废物管理与研究(Waste Management&Research)》，第22卷，第3期，第158-170页，2004年6月.[在线].可用：http：//dx.doi.org/10.1177/0734242x04042456，其以全文引用的方式并入本文中。
[0340] 在某些实施例中，在本发明中生产的壳(包括但不限于牡蛎壳)经粉碎并用作高速公路铺路中的成分。在某些实施例中，使用根据本发明制备的壳生产平纹(tabby)。在某些实施例中，在生石灰生产过程中排放的CO2被本发明的微生物重新捕获和再利用。在某些实施例中，壳聚糖由本发明中生产的壳制成。
[0341] 在某些实施例中，产生的碳酸盐材料(包括但不限于壳和/或珊瑚)具有反射性。在某些实施例中，这类碳酸盐材料具有高反照率。在某些实施例中，这种碳酸盐材料用于反射表面和地球工程中以减少或抵消全球变暖。在某些实施例中，碳酸盐材料用于反射硬景观中。在某些实施例中，碳酸盐材料用于浅色或反射道路和高速公路。参见例如R.G.Watts，《全球气候变化的工程应对：规划研究与发展议程(Engineering Response to Global Climate Change：Planning a Research and DevelopmentAgenda)》，泰勒-弗朗西斯(Taylor&Francis)，1997年。[在线].可用：https：//books.google.com/books？id＝nArq-K7ZiacC，其以全文引用的方式并入本文中。
[0342] 在某些实施例中，根据本发明制备的钙质材料(包括但不限于牡蛎壳)用于制备沥青瓦的颗粒。在某些实施例中，所述瓦变白和/或具有增加的反射率和/或具有增加的反照率。在某些实施例中，根据本发明生产的壳(包括但不限于牡蛎壳)用作浅色或太阳能反射沥青的保护层。在某些非限制性实施例中，由于较低的UV降解和/或在较低温度下保持较低的流动趋势，这种沥青比黑色沥青持续时间更长。在某些实施例中，本发明的壳或其它碳酸盐材料用于填充路面上部中的空隙的水泥砂浆中以产生热反射路面。参见例如S.Ishiguro和M.″，Yamanaka，《使用再生利用材料热控制路面温度(Heat control of pavement surface temperature using recycled materials)》，第三届可持续建筑材料与技术国际会议，P.Claisse，E.Ganjian和T.Naik编，考文垂大学和威斯康星大学密尔沃基副产物利用中心，考文垂大学和威斯康星大学密尔沃基副产品利用中心，2013年8月.[在线].可用：http：//www.claisse.info/Proceedings.htm，和John W.Gadja与Martha G.VanGeem的《对波特兰水泥混凝土和沥青水泥混凝土铺筑材料的六种环境影响的比较(A Comparison of Six Environmental Impacts of Portland Cement Concrete and Asphalt Cement Concrete Pavements)》，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，包括但不限于根据本发明生产的牡蛎壳的钙质材料在透水性混凝土中用作骨料。在某些实施例中，根据本发明生产的钙质材料可以与建筑材料组合物中的其它消费前再生水泥材料(如飞灰或高炉矿渣)组合。参见例如K.N.Kelley，《Use of recycled oyster shells as aggregate for pervious concrete(使用再生牡蛎壳作为透水性混凝土的骨料)》，硕士论文，佛罗里达大学，2009，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，根据本发明制备的壳不含可检测量的Hg或Pb。在某些实施例中，根据本发明生产的壳、珊瑚或其它碳酸盐材料用于礁重建。在某些实施例中，根据本发明生产的壳或其它碳酸盐材料出售给家禽饲料工业。
[0343] 本发明的应用不限于在说明书中阐述或在附图中说明的构造细节和组件布置。本发明能够具有其它实施例并且能够以各种方式实践或实施。
[0344] 以下实施例旨在说明而非限制本发明。
[0345] 实例
[0346] 实例1
[0347] 杀虫贪铜菌菌株DSM 531在作为生长的唯一能源和碳源的H2和CO2以及O2气体的混合物上生长。
[0348] 遵循以下方案用于使用气密血清瓶中的气体混合物进行的实验。
[0349] 实验接种物：5体积％，取自另一个H2生长的血清瓶培养物。
[0350] 向初始H2生长的血清瓶培养物给予来自溶源发酵液(LB)生长的杀虫贪铜菌接种物的5％接种物，并在从原始LB生长的培养物接种后在H2/CO2/O2气体混合物上生长约72小时。从存储在-80℃下的甘油原料中回收原始LB生长的接种物。
[0351] 在160ml带塞并密封的Wheaton玻璃血清瓶(VWR产品号16171-385)中进行在气体上的血清瓶生长。液体培养基的体积为20ml。使用Wheaton手动压接器(VWR#80078-996)用橡胶塞(VWR#100483-774)和铝密封圈(VWR#89047-008)塞住瓶子。20ml工作体积包括19ml最低限度盐培养基(MSM)，如《喜温细菌(Thermophilic Bacteria)》，CRC Press，Boca Raton，FL，Jacob K.Kristjansson编，1992，第87页，表4+1ml接种物(即5％接种物)中所描述。
[0352] 将MSM分配在瓶中，并如下添加气态化合物：在无菌条件下将无菌MSM转移到瓶中。在无菌条件下将5％气体培养的接种物接种到瓶子中，并用橡胶塞塞住瓶子并密封。通过歧管将气体混合物在15psig下加入瓶中。在加入气体混合物后，将密封件用铝卷曲以密封血清瓶。然后将瓶子置于摇瓶培养箱中。
[0353] 从在30℃，250RPM下培育的16个血清瓶(14个实验重复，2个对照)获得以下实验结果。使用如上所述的歧管用67％H2、24％空气(4.8％O2)、9％CO2混合气体同时吹扫全部16个血清瓶。在连接血清瓶之前，使用气相色谱(GC)确认通过歧管的气体组合物。在7个时间点处死瓶子进行分析。分别在T0和最后一个时间点处死两个阴性对照。阴性对照瓶具有与实验瓶相同的制剂减去接种物，并用于检测任何污染和/或非生物损失或从瓶顶部空间的气体泄漏。对阴性对照获取气体顶部空间压力读数样品以观察进入液体介质中的任何非生物CO2和H2吸附和/或由于泄漏导致的气体损失。
[0354] 取样和分析程序
[0355] 所有样品均在无菌条件下使用注射器和针头进行瓶子实验。使用Beckman Coulter DU720UV/Vis分光光度计在650nm下使用100微升样品测量光密度(OD)。
[0356] 在每个时间点，处死一到三个实验重复瓶以进行分析。使用连接到针头的压力计测量血清瓶内的气体消耗。测量每个处死瓶的顶部空间气体压力，并通过气密注射器取出顶部空间气体样品以进行气相色谱(GC)分析。通过GC进行的气体顶部空间样品的分析使用经由气密注射器注入GC的100uL顶部空间气体样品。在每个时间点定量血清瓶中H2、CO2、O2和N2的气体顶部空间含量。为了对发酵液进行取样，用EtOH擦拭血清瓶的隔膜，并使用瓶压将瓶子的全部液体内容物取出到30mL注射器中。移μ取100μL样品从而在650nm下进行OD测量。将样品在4℃下以12,000G离心15min。粒料在10mL无菌PBS中重悬浮，涡旋，并经由预称重0.45μm过滤器真空过滤。将过滤器干燥并称重过滤器+生物质保留物以测定生物质干重。通过在60℃下干燥24小时，并在干燥器中冷却到室温并称重来测定在膜过滤器(0.45μm)上收集的细胞的干重。继续这种干燥和重新称重的循环，直到重量保持恒定。建立OD与生物质密度(每单位体积的干细胞重量)之间的相关性。
[0357] OD与生物质密度之间的相关性展示于图2中。此实验的生长曲线展示于图3中。对于各个实验重复测量的OD由菱形符号表示，并且平均OD由实线表示。对数生长发生在9与30小时之间。由于生长培养物消耗气体，顶部空间气体压力随时间的变化展示于图4中。
[0358] 假设顶部空间气体的理想气体定律(PV＝nRT)，计算气体的总摩尔数，考虑样品点的温度变化。通过GC测定每个瓶子顶部空间中各自气体的比例。使用气体顶部空间结果和所测量的干重，测定细胞重量与消耗的H2摩尔数的比例。图5展示如通过每个相应瓶的顶部空间压力测量和GC分析所测定，相对于消耗的H2摩尔数作图的每个处死瓶的测量的干生物质。这些结果表明，每摩尔消耗的H2合成6.7到7.2克干细胞质量，或每克H2 3.3-3.6克细胞质量。
[0359] 实例2
[0360] 将杀虫贪铜菌菌株DSM 531在作为生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长到38克/升干细胞密度。
[0361] 遵循以下方案用于在搅拌釜生物反应器中使用包括H2、CO2和O2的气体混合物进行的实验。
[0362] 装置：使用定制的500mL玻璃发酵罐和PEEK顶板，分批生长培养物。用商业控制器(Electrolab，Fermac 360，英国)控制和监测温度和pH值。将磁力搅拌棒的组合和280mL/min的连续循环用于混合。再循环可以从反应器的底部液体部分取出并通过喷雾器返回顶部空间以控制发泡或反向运行以将顶部空间气体和泡沫再循环到发酵液的底部。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气，每个都调节到20psi。将H2和空气输送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E401/E401，20psi)，其设定气体的相对分数。然后通过可变面积流量计将H2/空气混合物输送到每个发酵罐；可以通过流量计的针阀调节到相同H2/空气组合物的每个发酵罐的流速。将CO2气体分流并输送到每个发酵罐的各个可变面积流量计。CO2和H2/空气管线成为输送到发酵罐的单一管线。使用压力计监测发酵罐的气体输送压力。经由四个2微米扩散石(p/n KEG592，http：//morebeer.com/products/diffusion-stone-2-micron-oxygen.html)将气体混合到发酵液中，并经由冷凝器从反应器中排到泡沫溢流瓶，然后到排气系统。
[0363] 培养基：用于此实验的培养基描述于实例1中。用2N NH4OH或2N NaOH进行pH值控制。从5M NH40H、Fluke 318612(保持在4℃下)(120mL)+高压灭菌的milliQ-H2O(180mL)制备2N NH4OH。
[0364] 自养接种物：杀虫贪铜菌DSM 531接种物取自H2/CO2/O2生长的血清瓶培养物。由存储在-80℃下保存的0.5mL甘油储备液制备DSMZ 531菌株的接种物。根据实例1中描述的血清瓶方案，在H2/CO2/O2气体混合物上开始复苏培养，在气密血清瓶中将0.5mL甘油储备液加入20mL最低限度盐培养基(MSM)中。然后在标准H2/CO2/O2气体顶部空间下将这个初始血清瓶(1mL到20mL新鲜MSM)传代培养到2个血清瓶中。将这些血清瓶在30℃，250RPM下培育。甘油储备液在气体上的初始复苏需要2天，传代培养需要额外一天生长。提供两种血清瓶培养物作为生物反应器的接种物。获取接种物的光密度(OD)以及用于DNA分析的样品。气体生长的接种物的OD为约1。接种发酵罐以得到初始为约0.1的OD。换句话说，血清瓶发酵液在生物反应器中以1∶10的比例稀释。使用60mL注射器将接种物从血清瓶转移到生物反应器。接种后，获得T0OD。一般来说，所有OD测量均使用Beckman Coulter DU720UV/Vis分光光度计进行。
[0365] 发酵罐操作：
[0366] 碱添加-用2N NH4OH控制pH值
[0367] 泡沫控制-如果泡沫填充超过1/2顶部空间，并且不受顶部空间喷涂或再循环控制，那么使用消泡剂。(A8011，Sigma Antifoam C Emulsion，www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8011？lang＝en®ion＝US)
[0368] 营养改良-除了碱添加NH4OH所提供的氮营养外，在运行期间添加其它矿物质营养物，以延长生长并防止发生任何矿物质营养限制。
[0369] 图6给出根据此方案在H2/CO2/O2气体底物上生长的氢氧混合气微生物杀虫贪铜菌的生长曲线的实例。在650nm下测量的最终OD为132，并且在H2/CO2/O2气体底物上生长的最终干生物质密度为38克/升。对数生长持续第一天和半天；然而，在第五天的运行结束时，生物质仍然以线性速率累积。
[0370] 实例3
[0371] 测试来自红球菌属和贪铜菌属的微生物在不同碳源上生长的能力(图7)。将在30℃下于LB琼脂平板上生长的菌株的菌落转移到含有10％(V/V)的所指示培养基的烧瓶中，在30℃和250rpm下持续3-20天。混浊红球菌菌株DSM 44193展现仅在如在补充有40g/L葡萄糖的MSM培养基(1L培养基A：9g Na2HPO4.12H2O、1.5g H2PO4、1.0g NH4Cl和0.2g MgSO4.7H2O/1L；10ml培养基B：50mg柠檬酸铁铵和100mg CaCl2/100ml；10ml培养基C：5g NaHCO3/100ml；
和1ml微量矿物质溶液：100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)上于650nm下通过光密度(OD)所测量的异养生长条件下生长。混浊红球菌菌株DSM 43205在异养条件下显示出相同的生长速率，达到OD＝9.0。菌株DSM 43205也能够在自养条件下生长(补充有66.7％H2、9.5％CO2、5％O2和18.8％N2的MSM培养基)。混浊红球菌(DSM 3346)展现在异养条件和化学自养条件下(DSMZ培养基81：1L用于化学无机营养生长的矿物质培养基：2.9g
Na2HPO4.2H2O、2.3g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.5g MgSO4.7H2O、0.5g NaHCO3、0.01g CaCl2.H2O和
0.05g Fe(NH4)柠檬酸盐/1L；和5ml微量矿物质溶液，补充有80％H2、10％CO2和10％O2)的生长。杀虫贪铜菌(DSM 531)能够在异养和化学自养条件下生长(针对菌株DSM 43205描述的培养基)(图7)。用pSeqCO2转化的杀虫贪铜菌(DSM 531)能够在补充有300、400和500μg/ml卡那霉素的LB培养基上生长，其OD600分别为1.47、1.52和1.51。未转化的细胞在对照(仅LB)上展现生长并且在300μg/ml卡那霉素上展现一些生长，而在400和500μg/ml卡那霉素上未检测到生长。
和1ml微量矿物质溶液：100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)上于650nm下通过光密度(OD)所测量的异养生长条件下生长。混浊红球菌菌株DSM 43205在异养条件下显示出相同的生长速率，达到OD＝9.0。菌株DSM 43205也能够在自养条件下生长(补充有66.7％H2、9.5％CO2、5％O2和18.8％N2的MSM培养基)。混浊红球菌(DSM 3346)展现在异养条件和化学自养条件下(DSMZ培养基81：1L用于化学无机营养生长的矿物质培养基：2.9g
Na2HPO4.2H2O、2.3g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.5g MgSO4.7H2O、0.5g NaHCO3、0.01g CaCl2.H2O和
0.05g Fe(NH4)柠檬酸盐/1L；和5ml微量矿物质溶液，补充有80％H2、10％CO2和10％O2)的生长。杀虫贪铜菌(DSM 531)能够在异养和化学自养条件下生长(针对菌株DSM 43205描述的培养基)(图7)。用pSeqCO2转化的杀虫贪铜菌(DSM 531)能够在补充有300、400和500μg/ml卡那霉素的LB培养基上生长，其OD600分别为1.47、1.52和1.51。未转化的细胞在对照(仅LB)上展现生长并且在300μg/ml卡那霉素上展现一些生长，而在400和500μg/ml卡那霉素上未检测到生长。
[0372] 实例4
[0373] 在一组实验中，将来自在30℃下于LB琼脂平板上生长的红球菌菌株的菌落转移到含有指定生长培养基和气体混合物的气密血清瓶中。(原始LB生长的接种物预先从存储在-80℃下的甘油储备液中回收)。在160ml带塞并密封的Wheaten玻璃血清瓶(VWR产品号
16171-385)中进行在气体上的血清瓶生长。液体培养基的体积为10到20ml。使用Wheaton手动压接器(VWR#80078-996)用橡胶塞(VWR#100483-774)和铝密封圈(VWR#89047-008)塞住瓶子。在无菌条件下将无菌生长培养基转移到瓶中。在无菌条件下将接种物引入瓶中，并用橡胶塞塞住瓶子并密封。将气体混合物加入瓶中。在加入气体混合物后，将密封件用铝卷曲以密封血清瓶。然后将瓶子置于摇瓶培养箱中。将瓶子在30℃，250RPM下培育。使用注射器和针在无菌条件下取得所有样品。通过在650nm下在分光光度计中测量光密度(OD)来评估生长。
16171-385)中进行在气体上的血清瓶生长。液体培养基的体积为10到20ml。使用Wheaton手动压接器(VWR#80078-996)用橡胶塞(VWR#100483-774)和铝密封圈(VWR#89047-008)塞住瓶子。在无菌条件下将无菌生长培养基转移到瓶中。在无菌条件下将接种物引入瓶中，并用橡胶塞塞住瓶子并密封。将气体混合物加入瓶中。在加入气体混合物后，将密封件用铝卷曲以密封血清瓶。然后将瓶子置于摇瓶培养箱中。将瓶子在30℃，250RPM下培育。使用注射器和针在无菌条件下取得所有样品。通过在650nm下在分光光度计中测量光密度(OD)来评估生长。
[0374] 混浊红球菌菌株DSM 43205展现在以下培养基中在化学自养条件下的生长：MSM培养基(1L培养基A：9g Na2HPO4.12H2O、1.5g H2PO4、1.0g NH4Cl和0.2g MgSO4.7H2O/1L；10ml培养基B：50mg柠檬酸铁铵和100mg CaCl2/100ml；10ml培养基C：5g NaHCO3/100ml；和1ml微量矿物质溶液：100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)，其补充有含有66.7％H2、9.5％CO2、5％O2和18.8％N2的气体混合物。液体体积为20mL，气体顶部空间体积为140mL。
[0375] 红球菌属DSM 3346展现在以下培养基中在化学自养条件下的生长：DSMZ培养基81(1L用于化学无机营养生长的矿物质培养基：2.9g Na2HPO4.2H2O、2.3g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.5g MgSO4.7H2O、0.5g NaHCO3、0.01g CaCl2.2H2O和0.05g Fe(NH4)柠檬酸盐/1L；和5ml微量矿物质溶液)，其补充有含有80％H2、10％CO2、和10％O2的气体混合物。液体体积为10mL，且气体顶部空间体积为150mL。
[0376] 72小时后收获细胞，并通过气相色谱和质谱(GC/MS)测定每种菌株产生的中性脂质(如三酰基甘油(TAG))中所含的脂肪酸谱。DSM 43205的脂肪酸谱展示于图8中，且DSM 3346的脂肪酸谱展示于图9中。图8和9展示x轴上的特定脂肪酸链类型相对于在v轴上给出的每种相应脂肪酸链类型占从中性脂质部分回收的脂肪酸总量的百分比。占总脂肪酸的百分比，DSM43205分别产生36％、6％和27％的16、17和18碳脂肪酸，。占总脂肪酸的百分比，DSM 3346分别产生66％、4％和27％的16、17和18碳脂肪酸。
[0377] 实例5
[0378] 使用如上所述的MSM培养基和H2/CO2/O2气体混合物在生物反应器中培养混浊红球菌菌株DSM 43205。气体混合物的组成为66.7％H2、9.5％CO2、5％O2和18.8％N2。通过离心使细胞团与培养物的上清液分离。弃去上清液，且对生物质团粒进行氯仿/甲醇(C/M)萃取。来自生物质的粗提物的重量分析显示40％可溶于氯仿/甲醇的的生物质包含的脂质，和14％可溶于己烷的包含的脂质。将脂质应用于Silica-60柱，且分离不同的脂质群组并用有机溶剂(包括己烷、氯仿、异丙醇、甲醇和丙酮)从柱洗脱。进行温和的碱性甲基化以使非脂肪酸脂质甲基化，并进行酸甲基化以使脂肪酸甲基化。通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析脂肪酸甲酯(FAME)。
[0379] 对于FAME分析，在Agilent 6890N GC/MS(Agilent，Santa Clara，CA)上在HP1 60m柱×0.25mm ID上检测化合物。将样品置于GC小瓶插入物中，己烷最终体积为50□L。使用自动注射器注入样品，注射器温度为250℃，并在分离式烟囱(8∶1)中运行，初始GC温度为100℃，以10℃/min的速率升温到150℃的最终温度，然后以3℃/min的速率升温到250℃，最后以10℃/min的速率升温到312℃(其保持7分钟)。峰值ID通过NIST08文库，并与已知标准(Supelco 37Component FAME Mix)比较完成。通过在注射前加入每个样品的外标(十一酸甲酯)完成定量，并通过内标(1，2-二十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)定量提取效率。
[0380] GC-MS分析揭示，与气体混合物一起培养的混浊红球菌菌株DSM 43205产生含有大量ω-7脂肪酸的三酰基甘油，其包括棕榈油酸(C16∶1，也称为9-十六碳烯酸)和异油酸(C18∶1，也称为11-十八碳烯酸)。脂质含量的进一步分析展示，作为总脂肪酸含量的百分比，13％C16∶1ω7脂肪酸(棕榈油酸)和21％C18∶1ω7脂肪酸(异油酸)。
[0381] 实例6
[0382] 混浊红球菌菌株DSM 43205在作为生长的唯一能源和碳源的H2和CO2以及O2气体的混合物上在1升瓶中生长。从存储在-80℃下的水+MSM储备液等分试样中回收接种物。如上所述，使用的培养基是MSM。将存储在-80℃下的储备液的等分试样接种到小血清瓶中的MSM(20ml)中。在160ml带塞并密封的Wheaton玻璃血清瓶中如上所述在气体上进行血清瓶生长，其中气体混合物由67％H2、24％空气(4.8％O2)、9％CO2组成。将瓶子置于摇瓶培养箱中并在30℃，250RPM下培育。
[0383] 在大约72小时的生长之后，通过离心并重新悬浮在新鲜的MSM中，从气体血清瓶培养物中制备高密度传代培养物接种物。将高密度接种物接种到带有气密盖的1L玻璃瓶中的100ml MSM中，所述玻璃瓶具有两个允许气体流入和流出的阀门。将以下比例的气体混合物提供给1L瓶的顶部空间：H2：71％；O2：4.2％；N2：15.8％；CO2：9.0％。
[0384] 加入气体后，将密封的1升瓶置于28℃和200rpm下的摇瓶培养箱中。气体每天更新一次。培养物在气体上生长，直至650nm下的最终OD达到OD＝1.27。
[0385] 在1L瓶中在气体上生长后，对最终回收的细胞进行DNA测序，以确认最终培养物的菌株属性。使用27F和800R引物测定16S rRNA序列。使用两种引物，top BLAST hit分别鉴别为红球菌属(Rhodococcus sp.)、混浊红球菌、弗氏红球菌，基因银行号EU127452.1、AB032565.1和AY940038.1。
[0386] 实例7
[0387] 许多氢氧物种为公众可获得的或可使用本文所述的技术分离。举例来说，至少238种不同的红球菌菌株和至少55种不同的贪铜菌菌株可从公共DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)菌株保藏中心以及来自许多其它属的菌株(包括氢氧微生物，其包括海洋水弧菌(Hydrogenovibrio)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、氢杆菌(Hydrogenobacter)、黄色杆菌(Xanthobacter)和
Hydrogenothermus)获得。氢氧化菌株也可以通过常规方法获得，例如使用富集方法从土壤样品或地热流体样品中分离。
Hydrogenothermus)获得。氢氧化菌株也可以通过常规方法获得，例如使用富集方法从土壤样品或地热流体样品中分离。
[0388] 用于氢氧生长的菌株的测试和产生有机化合物的能力在所属领域为常规的，所述有机化合物包括在要求保护的化学合成条件下具有碳数C5或更大的碳原子的那些，包括但不限于氨基酸和蛋白质。举例来说，红球菌菌株使用CO2作为碳源在氢氧条件下生长的能力可以如上文在实例4-6中所述进行。使用CO2作为碳源在氢氧(氢氧混合气)条件下生长的其它方法描述于《喜温细菌》，Jakob Kristjansson，第5章，第III节，CRC出版社，1992年，第86-88页，并且已经发现适用于广泛种类的各种菌株。评估有机化合物(如由氢氧物种化学合成产生的那些)的产生在所属领域中也是常规的。举例来说，可以使用气相色谱和质谱(GC/MS)，如实例5中所述。其它方法包括脂质提取、薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)，如Waltermann等人(2000)《混沌红球菌菌株PD630作为高价值单细胞油的新来源？三酰基甘油和其它存储脂质的分离和表征(Rhodococcus opacus strain PD630as a new source of high-value single-cell oil？Isolation and
characterization of triacylglycerols and other storage lipids)》《微生物学(Microbiology)》146：1143-1149所述。
characterization of triacylglycerols and other storage lipids)》《微生物学(Microbiology)》146：1143-1149所述。
[0389] 实例8
[0390] 通过在作为生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长的杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)菌株DSM 531产生大约五千克生物质(干重)。从这种生物质中提取己烷可溶性油并对其分析。以下方案用于在搅拌釜生物反应器中由H2、CO2和O2原料生产生物质，且然后从生物质中提取油。
[0391] 装置：使用来自Applikon Biotechnology(Applikon)的两个20升反应器分批生长杀虫贪铜菌培养物。
[0392] 生物反应器：每个生物反应器由安装在支撑架上的玻璃容器与具有带有弹性密封件的不锈钢顶板组成。顶板具有用于多个馈通件的端口，所有端口都具有弹性密封件以防止气体泄漏进入或离开反应器。这些馈通件允许热电偶套管、pH探针、溶解氧探针、进气口、液体入口、出气口、液体取样口等等都安装在顶板上。
[0393] 生物反应器传感器：位于热电偶套管中的温度探针用于监测温度并允许控制加热器。使用pH探针监测pH值，并且如果需要，控制向反应器中添加更高或更低pH的缓冲溶液。使用泡沫传感器控制消泡剂的添加。使用溶解氧探针测量反应器液体中的氧水平，并可用于控制搅拌或打开/关闭进入反应器的气流。所有传感器均由生物反应器控制器/控制台提供动力，控制并提供输入。
[0394] 搅拌：搅拌器通过具有完全密封和磁力耦合的顶板。搅拌器具有外部马达，所述外部马达是围绕搅拌轴的外部部分配合的单独物品。电机速度由允许精确控制转速的外部控制器控制。
[0395] 加热/冷却：通过外部电加热毯加热反应器，所述加热毯使用由Pt 100温度探针经由生物反应器系统控制器控制的闭环比例-积分-微分控制器(PID)。为了保持温度，还要检查冷却指状物以防止搅拌器马达使培养基过热。
[0396] 生物反应器安装：生物反应器系统安装在金属三脚架支架上。使用夹具或链条将此三脚架连接到位于通风橱内的支柱安装件上，以防止反应器被撞倒。将整个三脚架和反应器装置放置在浅塑料容器中以提供二次容器。
[0397] 生物反应器和支持系统的示意图展示于图10中。两个20升生物反应器位于通风橱中，如图11所示。生物反应器安装在通风橱内以容纳氢气释放。所有控制和气源以及气瓶、反应器控制器、质量流量计、氢传感器和气体控制阀都位于通风橱外。图11展示在杀虫贪铜菌在作为唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体上生长的过程中使用的两个20升反应器。
[0398] 控制器/控制台：生物反应器系统控制器/控制台含有控制和操作生物反应器系统的组件。这些装置提供电源、温度控制、搅拌控制，接收来自传感器的输入，基于传感器输入打开和关闭进料泵(酸、碱、消泡剂和其它营养物)，并用于利用电磁阀和转子流量计打开/关闭气流。由于缺乏所有不锈钢组件，这些装置不用于控制氢气以最大限度地降低氢气泄漏的风险。控制器/控制台单元位于罩的外部，远离生物反应器，以在泄漏的情况下最小化暴露于氢气并且最小化操作者直接在生物反应器周围工作的时间。图12展示用于操作反应器的Applikon控制器和控制台。图12中包括控制器、控制台、搅拌器控制器、爆炸性气体检测系统、质量流量计、液位控制器、碱控制存储器、培养基添加存储器和泡沫控制存储器。所有反应器控制器都位于罩外。
[0399] 气体输送：通过穿过顶板的分布器装置将气体输送到生物反应器的下部。位于反应器外部的阀使得能够分别在每个反应器处手动关闭气流。连接到反应器的气体进料管线为柔性不锈钢管线，在反应器头部安装有0.2微米过滤器，以尽可能减少污染。位于罩外部的质量流量计用于控制到反应器的流速。气缸和质量流量计之间的线路具有手动和电磁阀，以用于手动和自动关闭气体。电磁阀连接到爆炸性气体传感器，当在实验室或罩中检测到氢气时，所述爆炸性气体传感器会自动切断气流。
[0400] 储气：使用气柜存储氢气瓶。气柜适当安装且包括通风和洒水器。机柜包括足够的空间来存储多个气缸，以便在旧气缸和新气缸之间轻松切换。
[0401] 安全控制：使用爆炸性气体检测器确定实验室中氢的存在。多个传感器位于实验室和罩周围的战略位置。如果检测到氢气，这些气体检测器被配置成关闭气体输送管线上的电磁阀，从而关闭流向反应器的气流。
[0403] 介质存储：塑料容器或玻璃瓶用于存储新鲜介质，并且在批次运行后回收生物质。
[0404] 培养基：用于此实验的MSM培养基描述于喜温细菌，CRC出版社，Boca Raton，FL，Jacob K.Kristjansson编，1992年，第87页，表4。
[0405] 接种物：由存储在-80℃下保存的0.5mL甘油储备液制备DSMZ 531菌株的杀虫贪铜菌接种物。根据实例1中描述的血清瓶方案，在H2/CO2/O2气体混合物上开始复苏培养，在气密血清瓶中将0.5mL甘油储备液加入20mL最低限度盐培养基(MSM)中。将接种物提供在多个容器中，所述容器在生物安全柜内部组合到配备有无菌转移帽组件的单个无菌培养基瓶中。获取接种物的OD和划线。然后使用无菌转移管和蠕动泵将接种物转移到反应器中。接种反应器后，使用样品组件获得批料的起始OD。
[0406] 培养基制备和添加：使用喜温细菌，CRC出版社，Boca Raton，FL，Jacob K.Kristjansson编，1992年，第87页，表4中提供的配方制备所有培养基，除了20升规模所需的较大数量。主要培养基组分(A)在配备有无菌液体转移盖和过滤器组件的20升Nalgene大玻璃瓶中制备。将培养基在大玻璃瓶中高压灭菌，并使用无菌管和蠕动泵转移到高压灭菌的反应器中以避免污染。较少的培养基组分(B和D)在大型储库中制备，并通过使用隔膜使溶液通过一次性无菌0.2微米过滤器直接注入反应器中进行灭菌。使用隔膜最大限度地降低污染风险，因为其可以避免打开反应器。以类似于A的方式处理第四较少的介质组分(C)，其中配备有无菌转移盖的较大存储器用培养基制备，经高压灭菌，并使用无菌管和蠕动泵转移培养基。
[0407] 生物反应器的制备和启动：在开始新接种的批次之前，准备生物反应器用于高压灭菌。将反应器顶板安装在适当位置。连接传输线，夹紧，并用箔覆盖末端并用高压灭菌带密封。将0.2微米过滤器连接到分布器的入气口以对进入的气体进行灭菌。夹紧通风管并用箔密封。安装热电偶套管、冷凝器、泡沫液位探针、冷却盘管、取样装置、可调节液体抽取管和溶解氧探针。覆盖pH探针的端口并用箔密封。然后使反应器在131℃下以干燥循环高压灭菌60分钟。用快速燃烧、乙醇和紫外光的组合对pH探针进行灭菌。在将生物反应器高压灭菌并冷却至室温后，将pH探针插入反应器中，同时反应器和探针都在生物安全柜内。然后将反应器安装在罩中；即冷却线、传输线、电子控制器、加热器、搅拌电机等都连接在一起。尽可能快地将培养基组分A转移到反应器中以使pH探针干燥的时间最短化。打开温度控制和搅拌，如果需要，也开启冷却水。一旦培养基的温度达到所需温度，就通过上述方法将培养基组分B、C和D转移到反应器中。然后开始pH控制。
[0408] 接种生物反应器：如上所述进行新鲜接种。在许多次运行中，来自前一批次的培养基和生物质通过蠕动泵除去，除了用于接种下一批次的残留体积(通常小于1升)。当接种来自前一批次的剩余体积时，在除去大部分培养物后，将无菌培养基组分A在室温下转移到生物反应器中并开启加热。然后经由上述方法转移其余的培养基组分B、C和D。然后打开气流，开大搅拌，且打开pH控制。此时，认为运行已经开始并且已经开始OD。在反应器达到操作温度后，打开冷却。
[0409] 气体组成和流速：气体组成为66.7％H2、23.8％空气、5％O2、9.5％CO2。使用质量流量控制器控制比率。气体流速范围为总气流的0.05到0.3VVM。典型的流速在周末为0.05VVM，在工作日期间为0.2VVM，两个反应器均在运行并具有泡沫控制。在不使用泡沫控制的运行中，使用0.05到0.075VVM的典型值来将泡沫降低到可控制的水平。
[0410] pH控制：使用氢氧化铵(2.0M)来控制生物反应器中培养基的pH值。通过在配备有无菌转移盖和过滤器组件的2升培养瓶中高压灭菌1200mL MilliQ水，并在生物安全柜内加入800mL过滤灭菌的5.0M氢氧化铵来制备氢氧化铵溶液。经由蠕动泵将氢氧化铵自动转移到反应器中，所述蠕动泵由生物反应器控制器使用pH探针信号控制。
[0411] 营养物添加/改良：使用的营养改良改良溶液与初始培养基使用的相同，但数量不同。在运行期间添加矿物质营养素以延长生长并防止发生任何矿物质营养限制。改良溶液使用注射器直接添加到反应器中并通过0.2微米过滤器灭菌或使用蠕动泵通过保持连接到反应器的无菌管添加。通过除去小部分反应器培养基和生物质以保持约15.5L的工作体积来定期(通常每天)手动调节总反应器体积。这样做是为了补偿来自营养物改良剂的水添加和细胞呼吸作用产生的水，以保持稳定的混合动力学并防止溢出。
[0412] 取样：通过液体样品组件从生物反应器中定期取出小等份的培养基溶液。这些用于在Eppendorf Biophotometer Plus上进行OD600测量，并提供用于DNA分析的微量离心样品。将微量离心样品以10000rpm旋转10分钟，并且倾析，并存储在-20℃下。
[0413] 泡沫控制：在达到约15的OD后，泡沫将开始填充顶部空间，且如果不控制，当使用0.2VVM的气体流速时，泡沫将容易填充2升溢流存储器过夜。使用泡沫传感器确定泡沫的存在并打开泵，所述泵将递送硅基消泡剂乳液的溶液。在批次11和12中根据需要调节气体流速和搅拌器速度，以防止过多的泡沫积聚。在气体流速为0.05VVM到0.075VVM时，生物反应器能够在没有消泡剂的情况下运行。然而，泡沫会填满顶部空间；导致少量经由出气口流入泡沫溢流容器。
[0414] 监测并记录温度、pH值和OD。使用划线平板监测细胞纯度。执行使用杀虫贪铜菌在20升规模下的总共9个
[0415] 批次。批次的最终光密度(OD)通常在30与50之间。这些20升批次的结果概述在下表1中。
[0416] 表1.杀虫贪铜菌在3升和20升规模下的一系列批次运行结果.
[0417]
[0418]
[0419] 其中8个批次达到高于39的最终OD，一个在较低气流下运行的批次(11号)达到30的OD，且限制到低搅拌速率的批次(5号)仅达到6.7的OD。最高OD为批次7号中达到的50。将生长的所有生物质从培养液中离心。
[0420] 生物质离心和存储：使用Beckman Coulter Allegra X-12R离心机离心从分批运行中收获的发酵液以回收生物质。Allegra-12R具有降到-10℃的制冷温度，且配备有能达3,750 rpm且容量为3升的SX4750浮桶式转头。在一批之后，使用蠕动泵将生物质和培养基从生物反应器中转移到10升聚丙烯简便罐中。将生物质和培养基的简便罐存储在冰箱中直到其离心。每次将3升生物质离心分配在4个750-mL聚碳酸酯离心瓶之间。离心机在4℃下以
3,750rpm运转30分钟。轻轻倒出上清液并用漂白剂灭菌，然后处置。将单批次的脱水生物质合并并存储在冰箱中的聚丙烯瓶中。
3,750rpm运转30分钟。轻轻倒出上清液并用漂白剂灭菌，然后处置。将单批次的脱水生物质合并并存储在冰箱中的聚丙烯瓶中。
[0421] 实例9
[0422] 细胞破裂和从杀虫贪铜菌的湿生物质提取油
[0423] 使用下文所述的异丙醇/己烷油提取程序从湿细胞材料样品中有效提取油。使用这个程序，从作为唯一碳源的CO2生长的杀虫贪铜菌生物质中回收粗己烷提取物，从所述生物质中获得微生物油。图13展示试管，其含有杀虫贪铜菌的粗己烷提取物，所述提取物包含油和聚合物。图14展示从杀虫贪铜菌中提取的油样品，所述杀虫贪铜菌在作为唯一碳源的CO2和作为氢和电子的唯一来源的H2上生长。
[0424] 为了估计湿生物质的水分含量，标记两个空小瓶并记录其重量，并且将1克湿生物质分配到每个小瓶中并使用真空烘箱在60℃下干燥12小时(Binder Safety真空烘箱，型号VDL 115-9030-0040)。样品一式两份进行。
[0425] 为了研究使用溶剂己烷和2-丙醇的脂质提取的工艺参数和操作条件，将10g(A1)和9.4g(A2)湿生物质分别混合到33.5mL和31.5mL 2-丙醇中。然后将细胞悬浮液转移到250mL烧杯中，并将烧杯保持在冰浴上，并以分批模式超声处理20分钟。用2-丙烷对湿生物质进行超声处理，以实现完全的细胞破碎，细胞裂解并从微生物细胞中回收油。使用QSonica Q700超音波震荡器。将温度探针浸入烧杯中以记录超声处理期间的温度变化。使用超音波震荡器或超声波破坏细胞是一种非常常见的细胞裂解方法；超声波是一种循环声压波，频率从20kHz到几千兆赫。在低压循环期间，高强度超声波在液体中产生小的真空气泡。当气泡达到其不再能够吸收能量的体积时，它们在高压循环期间剧烈地破裂并且所产生的剪切力破坏细胞膜。如图15所示，在完全破坏细胞后，生物质的颜色从棕色变为奶油色。超声处理前的生物质浆液展示在图15的左侧，并且超声处理后的生物质浆液展示在右侧。初始生物质悬浮液为粘稠的，但在超声处理后，样品的粘度降低，这可能是由于大分子剪切作用。
[0426] 在2-丙醇中由于超声处理发生细胞裂解后，将33.5mL和31.5mL己烷分别加入到A1和A2并且在60℃下培育一小时。在100rpm下搅拌混合物。在一小时反应时间后，将样品转移到离心管中，并使用台式离心机(Eppendorf离心机R)以3200g离心15分钟。将上清液转移到旋转蒸发仪烧瓶中并使用旋转蒸发器(Rotavap R-210/215)在60℃下蒸馏，所述上清液为己烷、2-丙醇和溶解油、脂质和聚合物的混合物。在60℃和小于200mbar真空压力下蒸发己烷和2-丙醇。蒸发己烷和2-丙醇后，回收约4克黄色油状物。单步蒸馏未使油与聚合物分离，而是将黄色聚合物和油的混合物在混合烧瓶内固化。加入己烷并用于溶解聚合物中的油，沉淀黄色聚合物，并进行第二步蒸馏以分离和回收油。
[0427] 每批200g到250g湿生物质提取
[0428] 在确认小规模提取结果后，开始进行大规模提取工作。将4kg湿杀虫贪铜菌生物质分成20批(每批0.2kg)进行提取，并将每个批次转移到摇瓶中。向每个烧瓶中加入650ml异丙醇。每1.5克湿生物质使用5mL2-丙醇溶剂。将生物质与2-丙醇充分混合以产生均匀的悬浮液。
[0429] 在产生均匀悬浮液后，使用超声处理裂解细胞。QSonica Q700超音波震荡器以连续模式运行，从而完全破坏细胞。超音波震荡器的絮凝物附着在角状物上，并且管子连接到絮状物的入口和出口。将絮状物上的入口管通过蠕动泵并将其浸入含有生物质悬浮液的烧瓶中，同时将来自絮凝物的出口管置于同一烧瓶中以允许循环。为了进行完全的细胞裂解，每克湿生物质消耗1到1.2kJ能量。将温度探针浸入样品烧杯中以记录超声处理期间的温度变化。
[0430] 将由4kg输入物制成的20份中的每一份以100％振幅以分批模式超声处理30分钟，每1分钟超声爆发之间间隔30秒。
[0431] 在用2-丙醇超声处理后，加入每克湿生物质5mL己烷，然后使用KuhnerShaker X在60℃培育样品1小时。每批加入650ml己烷，然后在60℃下培育60分钟。
[0432] 将样品转移到离心管中，并使用Eppendorf离心机R以3200g离心15分钟。将每批生物质分配到4×400mL Eppendorf离心R管中。离心机转速设定为4000rpm，相当于18cm转子半径的3200g。
[0433] 分离细胞团粒后，将有机提取物(即上清液)转移到旋转蒸发器(Rotavap)混合烧瓶中。使用Rotavap将油和聚合物与己烷和2-丙醇分离。将己烷和2-丙醇在60℃和200-100mbar下蒸发，溶剂干燥油。借助于60℃下的加热浴手段加热己烷和2-丙醇。Rotavap的混合瓶产生有效的热传递以快速蒸发并防止局部过热，同时提供有机提取物的平稳混合。将蒸发瓶均匀旋转，并且蒸气管将蒸气形式的己烷和2-丙醇输送到冷凝器中。接收瓶收集冷凝的己烷和2-丙醇。己烷和2-丙醇的沸腾温度在1013mbar下分别为69℃和82℃。然而，己烷和2-丙醇可以在40℃下分别在120和360mbar真空中进行蒸馏。观察到蒸发性能取决于蒸馏压力、加热浴温度和转速以及蒸发烧瓶的尺寸。
[0434] 对于较大规模的提取，在100-mbar真空压力和60℃水加热浴中达到最佳的蒸馏条件；然而，在蒸发己烷和2-丙醇后，将黄色聚合物/油混合物留在混合烧瓶内。为了将油与黄色聚合物分离，重新施加己烷，并且然后通过离心分离聚合物。
[0435] 使聚合物/油/己烷混合物再加热到60℃保持10分钟，转移到离心管中并以3200rpm旋转5分钟。在再加热和离心后，将油分离并隔离并分析。发现油提取物主要含有饱和和单不饱和的C16和C18脂肪酸，包括棕榈酸-棕榈油的主要成分。从4kg湿杀虫贪铜菌生物质(相当于约1kg干生物质)中回收80g粗己烷提取物(即己烷可溶性油)。
[0436] 根据本节描述的方法，从作为氢、电子和碳的唯一来源的H2和CO2产生的各种杀虫贪铜菌样品中提取总共约230ml的油。这相当于约210克油。在这一总量中，从通过本节所述的20升批次运行产生的样品中提取约160ml(140克)油，并且其余来自在H2/CO2底物上的其它连续和分批运行。
[0438] 将由CO2产生并从杀虫贪铜菌中提取的油装载到硅酸柱上并分离成中性脂质(NL)、极性脂质(PL)和游离脂肪酸(FFA)的级分。通过首先转化为甲酯并然后通过气相色谱分析来分析每个级分中的脂质的酰基链分布。通过GC/MS确认各峰的分子量。使用由分析标准建立的相对响应因子，由峰面积计数计算脂肪酰基碳链分布的甲酯重量百分比(wt.％)。
图16展示从杀虫贪铜菌提取的油中存在的脂肪酸链长的分布图。油的主要成分是C16：0，其是棕榈酸。棕榈酸也是棕榈油的主要成分。
图16展示从杀虫贪铜菌提取的油中存在的脂肪酸链长的分布图。油的主要成分是C16：0，其是棕榈酸。棕榈酸也是棕榈油的主要成分。
[0439] 发现油提取后残留的生物质的PHB和蛋白质含量高。
[0440] 实例10
[0441] 从合成气原料或其组分生产氨基酸
[0442] 使用H2/CO2/O2气体混合物和无机盐发酵培养基培养杀虫贪铜菌菌株DSM 531和DSM541。在补充有66.7％H2、9.5％CO2、5％O2和18.8％N2的血清瓶中在30℃和200rpm下于20ml MSM培养基(1L培养基A：9g Na2HPO4.12H2O、1.5g H2PO4、1.0g NH4Cl和0.2g MgSO4.7H2O/1L；10ml培养基B：50mg柠檬酸铁铵和100mg CaCl2/100ml；10ml培养基C：5g NaHCO3/100ml；和1ml微量矿物质溶液：100mg ZnSO4.7H2O、30mg MnCl2.4H2O、300mg H3BO3、
200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)中使培养物生长96小时。
200mg CoCl2.6H2O、10mg CuCl2.2H2O、20mg NiCl2.6H2O和30mg Na2MoO4.2H2O/1L)中使培养物生长96小时。
[0443] 对于生长培养基中的赖氨酸检测，通过离心(10,000rpm，室温下5min)分离1ml细胞(OD＝0.1)，并进一步过滤上清液(200微升)(0.22微米)。收集上清液样品并分析含氨基化合物的分泌，所述含氨基化合物如氨基酸，包括赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，如表2中所示。赖氨酸为六碳分子，且酪氨酸和苯丙氨酸为九碳分子。据观察，杀虫贪铜菌菌株DSM541相比杀虫贪铜菌菌株DSM531将更高浓度的赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分泌到培养基中。对200μl无菌过滤的发酵培养基进行分析。使用清洁和衍生化试剂盒(例如EZ-FaaST
(Phenomenex))分离和衍生化合物，然后进行液相色谱-质谱分析以分离和鉴定由细菌菌株分泌到培养基中的化合物(表2)。在来自DSM 541的培养基中发现的赖氨酸水平比DSM 531高125倍。
(Phenomenex))分离和衍生化合物，然后进行液相色谱-质谱分析以分离和鉴定由细菌菌株分泌到培养基中的化合物(表2)。在来自DSM 541的培养基中发现的赖氨酸水平比DSM 531高125倍。
[0444] 表2.从杀虫贪铜菌分泌的含氨基化合物
[0445]
[0446]
[0447] 实例11
[0448] 将海洋氢弧菌菌株DSM 11271在作为生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长到超过8克/升干细胞密度。遵循以下方案用于在搅拌釜生物反应器中使用包括H2、CO2和O2的气体混合物进行的实验。
[0449] 装置：使用定制的具有PEEK顶板的500mL玻璃发酵罐分批培养培养物；具有一个多孔玻璃料的喷射管，其连接到具有0.2μm过滤器的气体输送管道；用于修正输送的隔膜端口；到底部的汲取管，其具有无菌取样组件，经由管道连接到在出气口上具有0.2μm过滤器的溢流容器的冷凝器；用于碱输送的端口和具有连接到无菌注射器的鲁尔接头的用于碱输送的管道；接地探针；消泡剂输送端口；pH/温度探针；氧化/还原探针(ORP)。使用商业控制器(Electrolab，Fermac 360，英国)将温度控制到37℃，并将pH值控制到6.5。通过反应器底部的加热垫和用于冷却水的整体玻璃夹套保持目标温度。使用6N NH4OH将pH值维持在6.5。将反应器置于搅拌板(VWR 12365-344)上，并使用磁力搅拌棒(十字形，VWR′spinplus′#
58947-828)进行混合。将搅拌板设定到300-400RPM。进入生物反应器的气体流速为1VVM。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气，每个都调节到20psi。将H2和CO2输送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E401/E401，20psi)，其设定气体的相对分数。将空气输送到可变面积流量计(Key Instruments 1G03_R5)。将来自流量配比器的H2/CO2气体混合物吹入空气中，并且然后通过可变面积流量计输送到发酵罐。使用压力计监测发酵罐的气体输送压力。
入口气体流过0.2μm过滤器(Pall，p/n 4251)，并且然后经由一个多孔耐热玻璃料(40-60μm，Sigma-AldrichCLS3953312-C)分散到发酵液中并从反应器经由冷凝器(夹套并冷却)排出到2L泡沫溢流瓶，然后通过另一个0.2μm过滤器(Pall，p/N 4251)，并最后到排气系统。将CO2流量设定为最小c.l.＝5(c.l.＝浮子中心线)，且设定其它气体以达到目标气体组成，根据流量计表计算，通过GC测量组成并调节和重新测量。c.l.H2＝25，c.l.空气＝45用于提供CO2/O2/H2的各自比例为11/6.3/59的气体混合物。使用Foxy探针对流入和流出管线中的O2进行持续监测。取偶尔的气体样品进行GC分析(在1L箔袋中，skcinc.com p/n 262-01)。
58947-828)进行混合。将搅拌板设定到300-400RPM。进入生物反应器的气体流速为1VVM。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气，每个都调节到20psi。将H2和CO2输送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E401/E401，20psi)，其设定气体的相对分数。将空气输送到可变面积流量计(Key Instruments 1G03_R5)。将来自流量配比器的H2/CO2气体混合物吹入空气中，并且然后通过可变面积流量计输送到发酵罐。使用压力计监测发酵罐的气体输送压力。
入口气体流过0.2μm过滤器(Pall，p/n 4251)，并且然后经由一个多孔耐热玻璃料(40-60μm，Sigma-AldrichCLS3953312-C)分散到发酵液中并从反应器经由冷凝器(夹套并冷却)排出到2L泡沫溢流瓶，然后通过另一个0.2μm过滤器(Pall，p/N 4251)，并最后到排气系统。将CO2流量设定为最小c.l.＝5(c.l.＝浮子中心线)，且设定其它气体以达到目标气体组成，根据流量计表计算，通过GC测量组成并调节和重新测量。c.l.H2＝25，c.l.空气＝45用于提供CO2/O2/H2的各自比例为11/6.3/59的气体混合物。使用Foxy探针对流入和流出管线中的O2进行持续监测。取偶尔的气体样品进行GC分析(在1L箔袋中，skcinc.com p/n 262-01)。
[0450] 培养基：1升基础培养基，其含有2.0g K2HPO4、1.0g KH2PO4、5.0g(NH4)2SO4、29.3g NaCl、0.2g MgSO4-7H20、10.0mg CaCl2、10.0mg FeSO4.7H2O、0.6mg NiSO4.7H2O和2.0ml微量元素溶液。微量元素溶液取自喜温细菌，CRC出版社，Boca Raton，FL，Jacob K.Kristjansson编，1992，第87页，表4。
[0451] 自养接种物：在两个含有50mL液体培养基的500ml带塞瓶中制备10％接种气体生长的接种物。将体积为61.5mL的接种物OD6000.75经由汲取管注入生物反应器中到液面以下，以防止在顶部空间中分散。接种后用过滤空气冲洗管线以除去汲取管中捕获的接种物。
[0452] 发酵罐操作：碱添加-用6N NH4OH控制pH值；营养改良-除了由NH4OH的碱添加提供的氮营养外，当发酵液OD＝3时加入0.2克FeSO4.7H2O，且当发酵液OD＝10时加入2克MgSO4.7H2O。测得流入O2为约5％，且流出O2的范围为3-4％。使用具有25mL瓶的无菌取样系统将样品从延伸到反应器底部的管中取出。DNA测序结果证实了海洋氢弧菌并且没有观察到污染在整个运行过程中每天划线的琼脂平板上生长。
[0453] 表3展示在运行期间的不同时间点测量的细胞干重(CDW)密度。在第5天，CDW密度超过8克/升。氯仿/甲醇可溶性脂质和己烷可溶性脂质的含量分别作为在不同时间点取样的生物质的百分比，也在表3中给出。使用上述方法通过GC/MS分析脂质，并发现其含有长度在14到20个碳范围内的脂肪酸。
[0454] 表3
[0455]
[0456] 实例12
[0457] 荚膜红假单胞菌菌株DSM 1710在作为生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长到OD为4.5。按照以下方案进行实验，所述实验使用包括H2、CO2和O2的气体混合物在供给连续气流的1升密封瓶中进行。
[0458] 装置：使用包含一升高压液相色谱(HPLC)溶剂输送瓶的定制系统分批生长培养物，将所述溶剂输送瓶重新用作培养瓶。向这些一升培养瓶连续馈送来自气罐、气体混合器、过滤器(0.2微米)、流量计和加湿器的系统的气体。此气体输送和培养瓶系统在图18中示意性地说明。使用多孔玻璃料将气体分配并混合到溶液中。培养瓶含有200mL液体培养基，并用铝箔包裹，以防止光线穿透培养基。通过将培养瓶浸入水浴中来控制温度。不控制pH值超出将化学缓冲液纳入培养基中的pH值。气体经由0.2微米过滤器从培养瓶中排出，且整个系统安装在通风橱内。气体供应来自压缩的H2和CO2气体混合物，以及单独的压缩O2罐。用于实验的目标混合气体为10％O2、5％CO2和85％H2。来自H2/CO2气罐混合物的流量计设定为25，且来自O2罐的流量计设定为34。这产生如通过GC(岛津制作所GC-8A，TCD检测器，和Alltech CTR I管柱)测量的10.5％O2、5％CO2和84.5％H2的气体混合物，其被认为足够接近用于进行实验的目标混合物。
[0459] 培养基：970ml去离子水；20mg Na2.EDTA；12mg FeSO4.7H2O；200mg MgSO4.7H2O；75mg CaCl2.2H2O；1g NaCl；1g(NH4)2SO4；1mg硫胺素HCl；15□g生物素；1ml微量元素溶液。微量元素溶液：250mL DI水；700mg H3BO3；398mg MnSO4.H2O；188mg Na2MoO4.2H2O；60mg ZnSO4.7H2O；10mg Cu(NO3)2。在高压灭菌之前将pH值调节到7.2。高压灭菌后，加入30ml无菌溶液和1.2g KH2PO4和1.8gK2HPO4。将pH值重新调节到pH＝7.2。
[0460] 接种物：从在250rpm搅拌下在光中光合异养生长的荚膜红假单胞菌中提供10％接种物。在Wall，J.D.，Johansson，B.C.，Gest，H.(1977)《缺乏氮代谢的荚膜红假单胞菌的多效突变体(A pleiotropic mutant of Rhodopseudomonas capsulata defective in nitrogen metabolism)》《. 微生物学文献集(Arch.Microbiol.)》115∶259-263用于具有深绿色的接种物的光异养生长。这种光合异养生长的接种物继而从存储在-80℃下的菌株的甘油储备液开始。
[0461] 操作：10％接种物导致起始OD为0.15。在气体上生长8天后，OD达到4.5。使用Beckman Coulter DU720UV/Vis分光光度计在650nm下测量OD。化学自养生长的培养物的颜色是深红色。使用具有Axioskop研究显微镜(德国蔡司)的相差光学器件观察培养物的湿涂片。使用MacroFIRE装置(Optronics；Galeta，CA)利用PictureFrame(Optronics；Galeta，CA)软件生成显微照片，用于成像和数据存储。荚膜红假单胞菌的显微照片如图19所示。在化学自养生长后，将培养物在4℃下以10,000xg离心15分钟。然后倒出上清液，并将生物质团粒暂时保存在-20℃下，并然后冷冻干燥。离心后回收的荚膜红假单胞菌生物质团粒的图片显示在图20中。以这种方式从荚膜红假单胞菌的单个一升瓶收集总共2.59克湿生物质，所述荚膜红假单胞菌在作为用于生物合成的氢、电子和碳的唯一来源的H2和CO2上生长。提取脂质并使用上述方法通过GC/MS分析，并发现其含有长度主要为16或18个碳的脂肪酸。
[0462] 实例13
[0463] 嗜热氢杆菌DSM 6534在1升气密瓶中在作为生长的唯一能源和碳源的H2和CO2和O2气体的混合物上生长。从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)接收到在气体顶部空间下的血清瓶中的嗜热链球菌DSM 6534的活培养物。此活体培养物用于向处于8∶1∶1的H2∶CO2∶O2气氛下的含有MSM培养基的160ml血清瓶提供10％接种物，所述培养基在《嗜热细菌》，Jakob Kristjansson，第5章，第III部分，CRC出版社，1992，第86-88页中给出。接种后600nm下的初始OD为0.03。通过将血清瓶浸入加热的水浴中将血清瓶的温度保持在70℃。没有施加搅拌。观察到培养基变浑浊，并且65小时后OD测量为0.354-大于10倍增加。然后将这个血清瓶作为10％接种物传代培养到1升气密瓶中，所述气密瓶瓶含有120mL MSM培养基和8∶1∶1H2∶CO2∶O2气氛。用水浴将培养瓶保持在70℃，且不搅拌。在64小时的过程中，气体顶部空间被更新一次，且OD增加到0.25。在接下来的24小时内，OD增加到0.42。顶部空间气体再次更新，且两天后OD测量为0.56。取1mL培养液进行DNA提取和测序。
[0464] 测定16S rRNA序列，并将top BLAST hit鉴别为嗜热氢杆菌TK-6菌株。然后从1升瓶中取出培养液，并在4℃下以10,000×g离心15分钟。离心后产生的湿生物质团粒重212mg。如上文实例中所述进行湿生物质的己烷提取。从湿生物质中回收15.2mg己烷可溶性脂质，或7.2％湿生物质重量由己烷可溶性脂质构成。提取脂质并使用上述方法通过GC/MS分析，并发现其具有相对高比例的具有20个碳链长度的脂肪酸。
[0465] 实例14
[0466] 自养黄杆菌菌株DSM 432在作为生长的唯一能源和碳源的H2、CO2和O2气体的混合物上生长到14克/升干细胞密度。对于在搅拌槽生物反应器中使用包括H2、CO2和O2的气体混合物进行的实验，遵循以下方案。
[0467] 装置：使用具有图22中示意性说明的顶板的图21中示意性说明的2升玻璃发酵罐分批生长培养物。用pH和温度探针和商业控制器控制和监测温度和pH值。通过自动添加2N NaOH调节pH值。生物反应器中的端口可用于提供营养补充剂和消泡剂；接种物递送；碱；新培养基；和无菌取样。由涡轮机提供搅拌，并通过玻璃料喷射气体。反应器系统在图23中示意性地说明。其包含压力表；气体流量计；安全和止回阀；0.2微米过滤器；生物反应器容器、传感器、致动器和控制器；冷凝器和泡沫捕集器；和出风口。气体供应来自压缩的H2、压缩的CO2和室内空气，每个都调节到20psi。气体输送系统的示意图如图24中所示。将H2和CO2输送到流量配比器(Matheson G2-4D151-E40l/E401，20psi)，其设定气体的相对分数。流量比例器中使用的设置是c.1.H2＝35；c.1.CO2＝10；和c.l空气＝55。这导致如通过GC(岛津制作所GC-8A，TCD检测器，和Alltech CTR I管柱)测量的64％H2、11％CO2、5.4％O2的气体混合物输送到生物反应器。
[0468] 培养基：用于此实验的MSM培养基描述于喜温细菌，CRC出版社，Boca Raton，FL，Jacob K.Kristjansson编，1992年，第87页，表4。
[0469] 接种物：自养黄杆菌菌株DSM 432接种物从存储在-80℃下的单一甘油储备小瓶开始，将所述接种物转移到一升气密瓶中的200mL MSM中。H2/CO2/O2顶部空间的气压为10psig。将培养瓶在150rpm，30℃下搅拌。
[0470] 发酵罐操作：在接种之前，将1.3升MSM转移到生物反应器容器中。使用NaOH将pH值调节到6.8。将温度设定在30℃下并将搅拌设定在500RPM。通过无菌取样组件每天取样两次以进行OD和脂质分析。所有OD测量均使用Beckman Coulter DU720UV/Vis分光光度计进行。每天一次在显微镜下检查样品以检查细胞形态。将所有培养液样品以12,000×g离心。将
1mL上清液存储在-20℃下进行NH4+分析。将湿生物质团粒暂时存储在-80℃下，并然后冷冻干燥。
1mL上清液存储在-20℃下进行NH4+分析。将湿生物质团粒暂时存储在-80℃下，并然后冷冻干燥。
[0471] OD600和CDW(mg/ml)之间的相关性展示在图25中。此相关性的线性拟合为CDW＝0.9944*(OD600)+0.4101，其中R2＝0.957。图26展示根据此方案在H2/CO2/O2气体底物上生长的氢氧混合气微生物自养黄杆菌的生长曲线。在600nm下测量的最终OD为14.8，并且在H2/CO2/O2气体底物上生长的最终CDW为13.8克/升。在运行开始时短暂的对数生长期后，生物质以大致线性的速率累积，直到在第六天运行终止。提取脂质并使用上述方法通过GC/MS和分析，并发现其具有相对高比例的长度为18个碳的脂肪酸。
[0472] 实例15
[0473] 以下计算仅考虑几何因素和在CO2上生长的氢氧混合气菌株的本质上更高的生产率，其清楚地说明了应用如本文所述的氢氧混合气微生物相比于基于光合生物的那些生物过程的优势。首先，为了比较，在池塘中在CO2上生长的藻类在美国的每单位面积的平均生物质产量，或面积产量报告为13.2g/m2/d[ANL，NREL，PNNL 2012《. 来自藻类脂质的可再生柴油：来自协调模型的成本、排放和资源潜力的综合基准(Renewable diesel from algal lipids：an integrated Baseline for cost，emissions and resource potential from a harmonized model)》.ANL/ESD/12-4；NREL/TP-5100-55431；PNNL-21437.阿尔贡Il：阿尔贡国家实验室；Golden CO：国家可再生能量实验室；Richland WA：太平洋西北部国家实验室》]。
[0474] 使氢氧混合气菌株杀虫贪铜菌在标准的现成实验室规模生物反应器中在H2和CO2上生长，以在6天的过程中使干燥生物质密度超过40克/升。这相当于大约7克/升/天的平均体积生产量。为了将所展示的体积生量率转化为商业规模的预测面积生产量，应该注意的是，氢氧混合气培养与整个发酵工业中使用的商业上已证实的工业生物反应器和设备相容。这些生物反应器通常含有具有十到四十米深的水柱的工作体积[Mads O. Krist Gemaey，Morten S.Hansen，Stuart M.Stocks.《Evaluation of the efficiency of alternative enzyme production technologies(评估替代酶生产技术的效率)》(2012年).；Richard Westlake.《(单细胞蛋白质的大规模连续生产)》。Chemie Ingenieur Technik，58：934-937(1986年1月)]。相比之下，由于光照要求和光线阻挡问题，在表面生物阻挡内部生物接收到光的地方，藻类池塘的深度通常仅限于约10厘米。按比例放大到10到40米水柱的7克/升/天的平均化学自养体积生产量分别对于10m和40m深的情况将得到70,
000到280,000g/m2/d的面积产量。这代表相比于每单位面积的CO2的微藻生产量5,000到20,
000倍的优势。应注意的是，微藻本身对于高等植物农作物(如大豆或玉米)具有2到20倍面积生产量优势。因此，与传统农作物和系统相比，本发明中应用的氢氧混合气微生物在面积生物质生产量和CO2捕获方面可具有至少10,000倍的优势。
000到280,000g/m2/d的面积产量。这代表相比于每单位面积的CO2的微藻生产量5,000到20,
000倍的优势。应注意的是，微藻本身对于高等植物农作物(如大豆或玉米)具有2到20倍面积生产量优势。因此，与传统农作物和系统相比，本发明中应用的氢氧混合气微生物在面积生物质生产量和CO2捕获方面可具有至少10,000倍的优势。
[0475] 已经发现，直接的生物反应器设计变化可以使杀虫贪铜菌在H2和CO2底物上的体积生产量增加到1克/升/小时(即24克/升/天)。这些简单的机械增强提高了在搅拌釜生物反应器中将气体输送到溶液中的传质系数(KLa)，从而显著提高生产率。此外，扩大反应器体积，特别是竖直尺寸，将通过在增加的水柱深度处增加的流体静压力来增强低溶解度气体(如H2和O2)的质量传递。使用反应器设计改进的组合来增加KLa，并且随着扩大而增加的流体静压力，保守地可实现至少2克/升/小时(即48克/升/天)的生物质生产量。
[0476] 这些来自经验数据集的计算说明氢氧混合气系统将生物CO2捕获强化到实用的小面积单元中的破坏性潜力，从而实现有利可图的生物质和蛋白质生产。
[0477] 实例16
[0478] 集成系统可以具有图30中提供的化学计量。
[0479] 生物合成反应式表示源自氢氧混合气微生物杀虫贪铜菌的经验数据的反应，其利用16.4个氢分子和3.2个氧分子以将4.5个CO2分子还原成细胞材料。假设氮源是尿素。人类消化、呼吸和排泄的式中展示人类用氧气氧化产生CO2，其中含氮废物被认为是尿素。在电解公式中假设输入分解水并产生生物合成和呼吸方程中所需的氧和氢的能量。这种平衡系统是涉及人员和杀虫贪铜菌的封闭系统的理想化情况。
[0480] 在某些非限制性实施例中，由杀虫贪铜菌进行的还原CO2的能量效率超过40％。在某些非限制性实施例中，电解水在空间中的能量效率超过70％。在某些非限制性实施例中，电解的能量效率超过75％。在某些非限制性实施例中，整个头尾连接CO2-到-食物系统(即从电力到蛋白质生物质)的净能量效率超过28％。在某些非限制性实施例中，这一整个系统的净效率比等效光合系统的效率高十倍以上。在某些实施例中，包含电解槽和化学自养生物反应器的系统的固定重量低于用于等效藻类系统的光生物反应器和灯的重量。在某些实施例中，包含电解槽和化学自养生物反应器的系统的固定重量低于用于等效藻类系统的光生物反应器和灯的重量，和/或用于高等植物作物的等效系统的灯和水培系统的和/或花盆的重量。
[0481] 实例17
[0482] 图31说明本发明的某些实施例的总体工艺流程图，其具有(A)产生适合于支持从能量输入和原始无机化学品输入(例如水)进行化学合成的电子供体(例如分子氢电子供体)的工艺步骤；(B)，接着将产生的H2电子供体和O2电子受体、水、矿物营养成分，以及从点工业烟道气或其它CO2源捕获的CO2递送到(C)用一个或多个生物反应器(4)容纳的一个或多个化学合成反应步骤，所述化学合成反应步骤利用氢氧微生物来捕获和固定二氧化碳，并通过化学合成反应产生蛋白质生物质；(D)并行地，从电子供体生成步骤(例如O2)中回收剩余的化学副产物；然后是(E)从工艺流中回收生物质产物的工艺步骤；和(F)将未使用的营养物和工艺用水以及维持微生物培养物所需的细胞团回收到碳固定反应步骤(即回到生物反应器中)。
[0483] 在图31中示出的特定实施例中，从点源或发射器捕获含CO2的烟道气。这些源或发射器包括但不限于发电厂、炼油厂或水泥生产商。化学合成所需的电子供体(例如H2)可以从输入的无机化学物质和能量产生。在某些实施例中，通过无二氧化碳排放的方法产生氢。用于制氢的示例性无二氧化碳排放方法包括例如所属领域已知的电解或热化学方法，其由能源供电，所述电源包括但不限于光伏、太阳能、风能、水力发电、核能、地热、增强地热、海洋热能、海浪能或潮汐能。可以将烟道气泵送通过生物反应器(4)，所述生物反应器含有氢氧微生物以及驱动化学合成所需的电子供体和受体以及适于通过化学合成支持微生物培养和碳固定的培养基。在图31中所示的非限制性实施例组中，将氢电子供体和氧气和二氧化碳电子受体以及化学合成和培养物维持和生长所需的其它营养物压缩并连续地添加到生长发酵液中，其被泵入一个或多个含有一种或多种氢氧混合气微生物的生物反应器，所述氢氧混合气微生物例如但不限于以下中的一种或多种：杀虫贪铜菌、混浊红球菌和/或其它红球菌属、海洋氢弧菌、荚膜红假单胞菌、嗜热氢杆菌和/或自养黄色杆菌。在图31中所示的非限制性实施例组中，氧气在化学合成反应中用作电子受体，以用于通过与氧化磷酸化相关的氢氧反应细胞内产生ATP。氧气可以源自烟道气和/或其可以从用于产生氢气的水分解反应产生，和/或气可以从空气中获得。在图31中，来自烟道气的二氧化碳用作有机化合物合成的电子受体(非呼吸；合成代谢)，所述有机化合物合成包括经由利用通过呼吸氢氧反应产生的ATP，和由通过H2细胞内酶催化还原NAD+或NADP+产生的NADH和/或NADPH的生物化学途径。细胞培养物可以连续地流入和流出生物反应器。细胞培养物离开生物反应器后，细胞团可以与液体培养基(5)分离。固液分离可以使用所属领域熟知的方法和设备完成，所述方法和设备例如但不限于连续离心机或使发酵液流动穿过膜过滤器以将细胞团与液体分离。以期望的(例如最佳的)水平补充细胞培养物群所需的细胞团可以再循环回到生物反应器中。可以将剩余的细胞团干燥(8)以形成干生物质产物，其可以进一步后处理(9)成各种饲料、蛋白质、营养、肥料、化学或燃料产品。可以根据所属领域技术人员已知的方法将蛋白质生物质后处理成动物饲料和/或植物肥料制剂。在细胞分离步骤之后，可以从工艺流程中除去化学合成反应的细胞外化学产物并将其回收。然后，去除可能存在的任何非所需废物(7)。如果需要，可以向生物反应器提供替代水和/或营养物以补偿生物质产物和/或其它流出物流的任何损失。
[0484] 实例18
[0485] 化学自养菌株筛选
[0486] 首先使用Almore的Vacu-Quick罐系统针对在板上的化学自养筛选菌株。然后在液体培养物中测试有希望的菌株。
[0487] 如上所述制备最低限度盐培养基(MSM)并无菌地合并和加入琼脂糖(1.5％)平板中。测试了来自以下属的162个候选菌株：贪铜菌属；黄色杆菌属；迪茨氏菌属；戈登氏菌属；分枝杆菌属；诺卡菌属；假诺卡氏菌属；节杆菌属；食烷菌属；红球菌属；链霉菌属；红假单胞菌属；红细菌属；和不动杆菌属。
[0488] 将每个菌株划线到最低限度盐培养基(MSM)+琼脂糖(1.5％)平板上。然后将所有相应的平板置于Almore的Vacu-Quick罐系统中。在每个腔室的底部放置用无菌水浸泡的无菌纸巾，以保持腔室中的湿度并防止平板在培育期间干燥。然后将填充有平板的气密室抽空；然后供应H2：CO2：空气(70/10/20)气体混合物。这些气体提供生长的唯一能源和碳源。将气室在30℃下培育7-10天，每天清洗新鲜的气体混合物。
[0489] 对于表现出化学自养生长/菌落的平板，挑选菌落，且然后划线到新鲜的最低限度盐培养基(MSM)+琼脂糖(1.5％)平板上，然后在提供有H2和CO2和空气(70/10/20)的Almore的Vacu-Quick罐系统中进行第二次培养。然后使在第二次培育中表现出强大菌落生长的菌株在液体矿物盐培养基(MSM)中进行化学自养试验。
[0490] 实验在(Chemglass CLS-4209-10，厌氧，18×150mm)Hungate管中进行，所述管的工作体积为5mL，用固体氯丁橡胶塞(Wheaton Science Products，编号：224100331)盖住，用铝盖卷曲。使用设计用于高通量筛选的气体歧管，用H2：CO2：空气(70/10/20)的气体混合物吹扫管。每天用新鲜的气体混合物吹扫管。
[0491] 将管在Multitron Pro Infors HT振荡器中以45°角，在600rpm和30℃下培育96小时。每24小时通过分光光度计(Genesys 10S，UV-Vis分光光度计，Thermo Scientific)测量600nm下的光密度。
[0492] 以下细菌菌株被鉴定为在氢氧混合气混合物上为化学自养的：甲基养节杆菌DSM 14008；混浊红球菌DSM 44304；混浊红球菌DSM 44311；自养黄色杆菌DSM 431；混浊红球菌DSM 44236；赤红球菌DSM 43338；混浊红球菌DSM 44315；耐金属贪铜菌DSM 2839；食醚红球菌DSM 44752；脱硫戈登氏菌DSM 44462；食异戊二烯戈登氏菌DSM 44266；食异戊二烯戈登氏菌DSM 44439；红核戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)DSM 46039；渗滤红球菌(Rhodococcus percolatus)DSM 44240；混浊红球菌DSM 43206；疏水戈登氏菌DSM 44015；
佐氏红球菌DSM 44189；威斯特菲尼亚戈登氏菌DSM 44215、自养黄色杆菌DSM 1618；自养黄色杆菌DSM 2267；自养黄色杆菌DSM 3874；天蓝黄链霉菌(Streptomycetes
coelicoflavus)DSM41471；灰色链霉菌DSM40236；链霉菌属DSM 40434；黄色产色链霉菌DSM
40111；嗜热一氧化碳链霉菌DSM 44293；类球红细菌DSM 158。
佐氏红球菌DSM 44189；威斯特菲尼亚戈登氏菌DSM 44215、自养黄色杆菌DSM 1618；自养黄色杆菌DSM 2267；自养黄色杆菌DSM 3874；天蓝黄链霉菌(Streptomycetes
coelicoflavus)DSM41471；灰色链霉菌DSM40236；链霉菌属DSM 40434；黄色产色链霉菌DSM
40111；嗜热一氧化碳链霉菌DSM 44293；类球红细菌DSM 158。
[0493] 对在利用氢氧混合气混合物作为唯一碳源和能源的液体MSM培养基中生长的氢氧混合气菌株进行完全近似分析，。据观察，对于在算术生长期期间取得的样品，杀虫贪铜菌DSM 531和DSM 541分别累积超过70重量％和超过80重量％的总蛋白质。还观察到杀虫贪铜菌DSM 531和DSM 541合成维生素，所述维生素包括维生素B1、维生素B2和维生素B12。
[0494] 实例19
[0495] 本发明的某些实施例利用间歇的可再生能源(例如太阳能和风能)来产生碳固定所需的H2。CO2源是工业来源，例如发电厂。电解槽通常在低电力需求和高可再生电力供应期间消耗电力。在这种低需求和高可再生发电期间，电力供应的可再生无CO2排放含量在如得克萨斯州、苏格兰和德国的区域中达到高达95％。因此，实际上电解槽正在利用无CO2排放的电力来从水中产生H2，并且如果有任何CO2密集的电力则使用极少。在这些地区中，高可再生电力供应和低电网需求的时段大约发生在50％的时间，因此预计电解槽运行大约50％的时间。现场H2和CO2罐存储缓冲来自工业来源的CO2产生和来自电解槽的H2产生之间的时间差异，使得这两种气体能够连续流入CO2固定生物过程。化学自养氢氧混合气微生物将CO2、H2和矿物质营养素(即NPK)转化为高蛋白质生物质(参见图32)。来自电解槽的O2超过微好氧氢氧混合气生物过程的要求。这种剩余的O2可以作为纯气体副产品出售，或馈送到化石燃烧或动力装置，以便提高单元的热效率并增加从所述单元出来的烟道气流中的CO2浓度。增加的CO2浓度促进碳捕获步骤。
[0496] 在一些实施例中，本发明的整个方法整合三个主要部分，其中两个可以应用市售单元，以及本文所述的化学自养CO2固定生物过程和相关的后处理步骤。用于向生物过程提供CO2和H2的前端的两个市售单元为：CO2烟道气洗涤；和主要使用可再生能源的水电解。为实现碳中和，所述系统可以位于具有高间歇性可再生发电的区域中。电解槽单元仅在低电力需求和可再生电力供应过剩期间汲取电力。这缓解了间歇性可再生能源对电网造成的压力。电解槽技术的一个主要应用是在高需求和低可再生电力供应期间将可再生能源供应过剩期间产生的H2转换回电网电力-实际上向下回归到H2到电力的价值链。本文所述的方法将H2和CO2转化为蛋白质-实际上继续向上延伸从H2到蛋白质的价值链。
[0497] 尽管为了清楚理解的目的已经借助于说明和实施例详细地描述了前述发明，但是对于所属领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下实施某些改变和修改。因此，描述不应被解释为限制本发明的范围，本发明的范围在所附权利要求中描述。
[0498] 本文所引用的所有公开、专利和专利申请出于所有目的都以全文引用的方式并入本文中，其引用程度如同每一个别的公开、专利或专利申请专门并且单独地指示为通过引用如此并入一样。
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