技术领域
[0001] 本
发明属于
仿生学、人体生理学、
微生物学、
有机化学领域。本发明涉及一种模拟结肠环境发酵系统及基于该系统的模拟发酵方法，具体地说，是涉及离体条件下通过
粪便细菌定植，更换不同改良培养基，模拟结肠环境，模拟发酵的方法。
背景技术
[0002] 由于动物实验会对受试动物产生极大的痛苦，世界各国的科学家都在尝试制作各种结肠发酵
模拟器来代替动物实验，主要有reading模型，其原理是将无菌培养基加入代表近端结肠（pH5.5）的容器1中，并顺序加入容器2和3中，分别模拟横结肠（pH 6.2）和远端结肠（pH 6.8）。使用2M NaOH通过外部pH
控制器控制pH。优点是大肠/结肠是由三个具有独特的pH和发酵活性的区域组成，即近端结肠、横结肠和远端结肠。因此，多隔室系统优化了结肠不同区域的特定条件下微生物群的生长。不足是反应器中接种粪便混悬液与接种结肠内容物相比细菌细胞
密度降低。此外，自由漂浮的细菌细胞系统并不代表在结肠中的浮游和静止状态。SHIME ,TWIN SHIME模型，原理是模拟完整肠道，通过整合上消化道条件，形成五个连续的隔室模拟胃和十二指肠、小肠（空肠和回肠）、升结肠、横结肠和降结肠。一个重要的技术方面是系统的
稳定性，可以在2-3周后达到。优点是SHIME通过添加粘蛋白
覆盖的微
生态系统（其每日替换以模拟粘液层的更新）合成粘膜环境。这种被称为粘膜-SIME（M-SHIME）的模型不仅可以模拟悬浮的肠道微生物，而且还能模拟附着于表面的肠道微生物和粘蛋白降解群落。缺点是造价高昂，对操作人员要求较高。TIM-2模型，原理是在SHIMI等模型上添加了蠕动混合和模拟摄取代谢产物的
透析膜，优点是TIM-2具有独特的蠕动混合和透析系统，可以达到生理
代谢物浓度。不足是缺乏宿主反应。PolyFermS模型，原理是通过将新鲜的粪便微生物群被收集在凝胶珠中，并从外围层释放细菌进入发酵培养基之前倍增达到高密度和较长稳定的发酵时间，优点是这种新方法在长达80天的运行时间内显着改善了体系的细菌密度，增加了系统的稳定性，不足是这种模式的主要局限性在于缺乏透析和缺乏宿主反应。而且，这样的系统需要专有技术和使用昂贵的设备，因此这一种低产量的方法。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种模拟结肠环境的发酵系统以及发酵方法。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种模拟结肠环境的发酵系统，包括肠道菌群定植系统、pH控制系统、气路系统、流速控制系统、
温度及搅拌控制系统；
肠道菌群定植系统包括一级
发酵罐、通过管路同一级发酵罐连通的若干二级发酵罐，管路上设置
蠕动泵；一级发酵罐通过管路与氮气
钢瓶连通；二级发酵罐的出料孔通过设置
蠕动泵的管路与产物收集瓶连通；
二级发酵罐设置模拟肠液培养基补料系统，培养基补料系统的补料瓶通过管路与二级发酵罐相连并在管路上设置单向
阀和蠕动泵；补料瓶还与一级发酵罐连通；
二级发酵罐设置模拟肠液改良培养基补料系统，模拟肠液改良培养基补料系统的培养基放置于改良培养基罐体内并且通过管路与二级发酵罐连通，在管路上设置
单向阀和蠕动泵；
一级发酵罐还通过管路与流通池连通，工业在线pH计测量流经流通池的液体；一级发酵罐通过具有蠕动泵的管路同pH补料瓶连通；
二级发酵罐设置与氮气钢瓶连通的进气管路并且在进气管路上设置流量计、单向阀，二级发酵罐还设置排气管路；
温度及搅拌控制系统为带磁
力搅拌的恒温
水浴锅。
[0005] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：二级发酵罐设置5个，其中1个为空白对照罐，另外4个为发酵处理罐。
[0006] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：一级发酵罐和二级发酵罐为玻璃罐，并且放置在带磁力搅拌的恒温水浴锅中。
[0007] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：恒温水浴锅内水温为37.5℃。
[0008] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：二级发酵罐的补料口设置1个并连通设置三通，三通的另外两个通口分别与模拟肠液培养基补料系统和模拟肠液改良培养基补料系统连通。
[0009] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：产物收集瓶设置5个，并且分别与5个二级发酵罐通过管路连通。
[0010] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：模拟肠液培养基补料系统包括补料瓶；补料瓶通过管路与二级发酵罐补料口的三通连通，并且在管路上设置蠕动泵和单向阀；模拟肠液改良培养基补料系统包括补料罐；补料罐通过管路与二级发酵罐补料口的三通连通，并且在管路上设置蠕动泵和单向阀。
[0011] 一种模拟结肠环境的发酵方法，包括控制参数设置、肠道菌群定植、模拟发酵；控制参数设置具体如下，设定系统温度、系统同期次数、系统pH值以一级发酵罐和二级发酵罐中液体保留时间，还需要设定各个蠕动泵的流速；
粪便细菌定植步骤如下，将发酵罐及管路、肠液培养基进行灭菌，提前制备好粪便定植珠，提前设定好磁力搅拌恒温水浴锅的水温以及搅拌速度；在超净
工作台中将已经灭菌的培养基加入一级发酵罐中体积，同时加入25g的粪便定植珠和灭菌的LLDPE塑料粒子，将一级发酵罐密封，连接管路；打开氮气
开关对发酵罐进行通气除
氧；定植期间氮气开关间歇开启；定植期内间歇更换培养基；
定植结束后，将一级发酵罐产物引入二级发酵罐中进行二级发酵。
[0012] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：控制参数具体的值为，系统温度37.5°C，系统同期次数为2次/天、15min/次； pH值通过0.1M NaOH和0.1M HCl控制在5～6之间；设定一级发酵罐和二级发酵罐罐内液体的体积为250ml，一级发酵罐中液体保留时间为，粪便微生物定植第一天为每8h更换100ml新鲜培养基，24h后每天8h补液25ml新鲜培养基；二级发酵罐平均每天保持8h，流入液体包括1.25ml一级发酵罐流出液23.5的新鲜改良培养基；粪便细菌定植步骤具体为，将发酵罐及管路、肠液培养基进行灭菌，提前制备好粪便定植珠，提前开启磁力搅拌恒温水浴锅将水温设定为37.5°C，并将磁力搅拌转速设置为180r/min；在超净工作台中将已经灭菌的培养基加入一级发酵罐中体积为225ml，并加入25g的粪便定植珠和50g灭菌的LLDPE塑料粒子，将一级发酵罐密封，连接管路，打开氮气开关将流速调至1.0ml/min对发酵罐进行通气除氧；定植期间氮气开关间歇开启，每12h开启一次，每次通气时间为10min；每个12小时更换100ml培养基，定植周期为7天。
[0013] 本发明上述技术方案的进一步改进在于：氮气除氧的方法为，在液体表面加入灭菌的LLDPE塑料粒子使其漂浮在液体表面，达到在除氧过程中物理方法除泡的作用。
[0014] 由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果有：本发明的人
体模拟结肠发酵系统，及基于该系统的模拟试验方法。实现了离体条件下模拟人体结肠部分微生物的发酵过程。模拟逼真，具有良好的平行性、稳定性和可重复性。
[0015] 本发明的模拟结肠发酵系统在补气除氧上通过环形管路并在管路上以90度对称刻出菱形气孔，使氮气可以均匀的扩散在液体中，相对其他设备单一的管路通气。具有排气更加均匀，气泡产生较小，排气效率大大提高的特点。
[0016] 本套系统中的动力系统组成，区别于以往的由多个单个蠕动泵，改为六通道同步蠕动泵，在进行共同定量补液时具有更高的一致性。降低了因补料不同而带来的系统误差。提高了同步性和稳定性。
[0017] 本发明中，管路采用同等长度设计，即各补料罐之间的线路长短相同，解决了其他发酵罐在同时补液或者排空时的不一致性，减小了误差。避免了补液过程中尤其是在少量补液时部分长管路发酵罐补液不足的问题。
[0018] 本发明中，改良了充氮气除氧过程中产生气泡的问题，通过在液面加上一层无毒无害耐高温的塑料球LLDPE，可以在液面下鼓泡的时候，通过摩擦作用，使气泡在表层破裂，从而抑制气泡的产生，从而避免了因气泡堆积导致液体喷出这种现象的产生。
[0019] 本发明相较于其他模拟发酵罐少则十几万多则上百万的的造价，具有模
块化设计，造价低廉，后期维护成本低，并且可以重复再利用，所用材料低
碳环保，后期升级改造便利。
附图说明
[0020] 图1是本发明模拟结肠环境的发酵系统示意图；其中，101、一级发酵罐，102、空白对照罐，103-106、发酵处理罐，201、补料瓶，203-206、改良培养基罐体，302-306、产物收集瓶，401、流通池，402、工业在线pH计，403、pH控制补料瓶，901、氮气钢瓶。
具体实施方式
[0021] 下面结合附图及具体
实施例对本发明做进一步详细说明：本发明是一种模拟结肠环境的发酵系统以及发酵方法，该系统基于PolyFermS模型实验方法，在体外条件下，利用该系统和方法可以通过不同的改良培养基真实的模拟结肠环境进行发酵实验，了解其对结肠内细菌的影响，和其代谢产物的影响。
[0022] 如图1所示，该模拟拟结肠环境的发酵系统主要包括肠道菌群定植系统、pH控制系统、气路系统、流速控制系统、温度及搅拌控制系统。
[0023] 其中，肠道菌群定植系统包括一级发酵罐101、通过管路同一级发酵罐101连通的若干二级发酵罐，管路上设置蠕动泵。一级发酵罐101的产物在蠕动泵的作用下经过管路能够流入二级发酵罐。一级发酵罐101还通过管路与氮气901瓶连通，氮气钢瓶901向一级发酵罐101内充入氮气形成无氧环境。经过二级发酵罐的二级发酵最终能够形成发酵产物，二级发酵罐的出料孔通过设置蠕动泵的管路与产物收集瓶连通，在蠕动泵的作用下发酵液经过管路能够进入到产物收集瓶。
[0024] 该系统为二级发酵罐设置有模拟肠液培养基补料系统，用于进行培养基的营养补充。培养基补料系统的补料瓶201通过管路与二级发酵罐相连并在管路上设置单向阀和蠕动泵。补料瓶201还与一级发酵罐101连通。
[0025] 该系统还为二级发酵罐设置有模拟肠液改良培养基补料系统，模拟肠液改良培养基补料系统的培养基放置于改良培养基罐体内，改良培养基罐体还通过管路与二级发酵罐连通，并且在管路上设置单向阀和蠕动泵。在改良培养基罐体内产生改良培养液后，经过蠕动泵的作用通过管路进入到二级发酵罐内。
[0026] 为了能够实时监测一级发酵罐101内的液体的pH值，将一级发酵罐101通过管路与流通池401连通，工业在线pH计402能够测量流经流通池的液体，并能够根据测量情况进行pH的调节。一级发酵罐101还通过设置有蠕动泵的管路同pH补料瓶连通，在需要的时候进行pH调节液的补充来进行pH的调节。该部分为pH控制系统。
[0027] 二级发酵罐也通过管路同氮气钢瓶901连通，具体的是设置进气管路同氮气钢瓶901连通，然后在进气管路上设置流量计、单向阀。氮气钢瓶901也是为了向二级发酵罐中通入氮气保证无氧环境。此外，二级发酵罐还设置排气管路。该部分为气路系统。
[0028] 该系统的温度及搅拌控制系统为带磁力搅拌的恒温水浴锅，能够为整个系统尤其是一级发酵罐和二级发酵罐提供符合人体的温度。磁力搅拌部分能够模拟人体肠道的蠕动。
[0029] pH控制系统主要包括pH计、流通池401、工业在线pH计402以及用于促进液体流动的蠕动泵。流通池401一般为
不锈钢材质制成。蠕动泵用于使液体进行流动，进行pH调节液的补充。pH控制补料瓶403一般为0.1M NaOH和0.1M HCl。
[0030] 气路系统主要包括氮气钢瓶901、细菌
过滤器、单向阀、止水夹以及管路和
接口组成。
[0031] 速率控制系统主要包括若干的蠕动泵及管路。
[0032] 本发明的一个具体的实施例中，二级发酵罐设置5个，其中1个为空白对照罐102，另外4个为发酵处理罐，分别标号为103、104、105、106。改良培养基罐体设置4个，分别标号为203、204、205、206。4个改良培养基罐体分别与四个发酵处理罐102-106连通，空白对照罐102不与改良培养基罐体连通。补料瓶201与空白对照罐102和四个发酵处理罐103-106均连通。
[0033] 产物收集瓶设置5个，分别标号为302、303、304、305、306。
[0034] 为了实现一对多，还设置了一些三通接头和六通接头。
[0035] 该系统中的一级发酵罐101，其主体构成为玻璃瓶体和上部的
盖子。其中盖子上有五个不锈钢柱体作为接口连接罐体内外，并在接口处设有
橡胶垫，以保证罐体内部的密封。其中气体进入口，通过管路与氮气钢瓶901相连。气体出口通过管路与外界空气相连，在管路上都设置有止水夹，用来控制管路的开合。进料孔通过管路经Y型三通与模拟肠液培养基补料瓶相连，通过蠕动泵来进行进料，蠕动泵控制流量为50微升/min 3.5h。出料口通过管路与六通接头相连并通过管路分别与空白对照罐102和四个发酵处理罐103-106连通。通过在出料口的管路上分别设置蠕动泵来提供动力和流量控制，最终，将一级发酵罐101的产物接种至各个二级发酵罐。蠕动泵控制流量为6微升/min 3.5h。
[0036] 一级发酵罐的pH控制系统，罐内液体通过管路与Y型三通相连一端连接二级发酵罐，另一端通过管路与流通池相连，流出液通过管路与Y型三通相连后经经入料口回到一级发酵罐101。工业在线pH计402通过pH
电极测量流经流通池的液体。当pH低于低报限值时，补料继电器打开，接通蠕动泵的电源，蠕动泵开始工作，将0.1M NaOH或0.1M HCL通过管路经pH补料孔进入一级发酵罐101内，从而达到调节pH的作用。在正常补料和出料时则通过关闭止水夹，来关闭管路和管路，对罐内进行正常补料和出料。
[0037] 二级发酵罐气路连接，氮气通过流量计经管路与细菌过滤器连通再经管路与单向阀相连，之后通过管路与六通接头相连后经分别经管路进入空白对照罐102以及发酵处理罐103、104、105、106。排出的气体通过相应的排气管路排出。
[0038] 二级发酵罐的模拟肠液培养基补料系统，包括补料瓶201，所述补料瓶201通过管路先与单向阀相连，通过单向阀后通过管路与六通接头相连，料液分别通过管路与Y型三通相连，再通过管路与空白对照罐102和发酵处理罐103、104、105、106相连。在管路上设置有蠕动泵，通过蠕动泵提供流速和流量控制，从而达到补液的效果。在此，蠕动泵控制流量为50微升/min 8.9h。
[0039] 二级发酵罐的四个发酵处理罐103-106设置有模拟肠液改良培养基补料系统，二级发酵罐的模拟肠液改良培养基分别放置于改良培养基罐体203、204、205、206，分别通过管路与单向阀相连，随后通过管路与Y型三通相连，另一端通过管路，并在蠕动泵的流速和流量控制下，进入到四个发酵处理罐103-106。此处蠕动泵控制流量为50微升/min 7.8h。
[0040] 二级发酵罐的模拟肠液培养基补料系统和二级发酵罐的模拟肠液改良培养基补料系统，两者为间歇工作方式，具体的工作原理为：由于二级发酵罐的顶部预留的补料口只有一个，所以，本系统采用了双补料管搭配Y型三通，通过间歇控制两条管路的开闭，达到间歇式补料的效果，在模拟肠液培养基补料系统工作时二级发酵罐的模拟肠液改良培养基补料系统的管路处于关闭状态，当模拟肠液改良培养基补料系统工作时，模拟肠液培养基补料系统处于关闭状态。
[0041] 二级发酵罐产物出料系统。发酵液经一段时间的发酵后，二级发酵罐中的空白对照罐102以及四个发酵处理罐103、104、105、106，通过设置有蠕动泵的管路依次进入产物收集瓶302、303、304、305、306。
[0042] 该系统在进行补气除氧时，气路系统位于发酵管内的管路，是环形管路并在环形管路上以90度对称刻出菱形气孔，能够使氮气可以均匀的扩散在液体中。
[0043] 该系统中多处使用到了蠕动泵，并且是向平行的多个二级发酵罐进行发酵液的输送，以及进行培养液的补充。该系统优先地使用六通道同步蠕动泵，在进行共同定量补液时具有更高的一致性。
[0044] 该系统在设计管路时，将相同级别罐体之间的管路采用同等长度设计，例如一级发酵罐与二级发酵罐之间的管路，二级发酵罐与产物收集瓶之间的管路，补料瓶与一级发酵罐或二级发酵罐之间的管路等。
[0045] 本发明还公开了一种模拟结肠环境的发酵方法，该方法使用上述的系统。为了便于叙述，将空白对照罐102和四个发酵处理罐103-106同一称为二级发酵罐。
[0046] 该方法主要包括控制参数设置、肠道菌群定植、模拟发酵，三个工作内容。
[0047] 其中，控制参数设置具体如下，设定系统温度、系统同期次数、系统pH值以一级发酵罐和二级发酵罐中液体保留时间，还需要设定各个蠕动泵的流速。
[0048] 在进行控制参数具体的值为，将系统温度37.5°C，系统同期次数为2次/天、15min/次； pH值通过0.1M NaOH和0.1M HCl控制在5～6之间；设定一级发酵罐101和二级发酵罐罐内液体的体积为250ml，一级发酵罐101中液体保留时间为，粪便微生物定植第一天为每8h更换100ml新鲜培养基，24h后每天8h补液25ml新鲜培养基；二级发酵罐平均每天保持8h，流入液体包括1.25ml一级发酵罐流出液23.5的新鲜改良培养基。
[0049] 其中，粪便细菌定植步骤如下，将发酵罐及管路、肠液培养基进行灭菌，提前制备好粪便定植珠，提前设定好磁力搅拌恒温水浴锅的水温以及搅拌速度；在超净工作台中将已经灭菌的培养基加入一级发酵罐中体积，同时加入25g的粪便定植珠和灭菌的LLDPE塑料粒子，将一级发酵罐密封，连接管路；打开氮气开关对发酵罐进行通气除氧；定植期间氮气开关间歇开启；定植期内间歇更换培养基。粪便细菌定植步骤具体为，将一级发酵罐和二级发酵罐及管路、肠液培养基进行灭菌，提前制备好粪便定植珠，提前开启磁力搅拌恒温水浴锅将水温设定为37.5°C来模拟人体肠道内的温度。并将磁力搅拌转速设置为180r/min，通过磁力搅拌带动磁子旋转搅拌来模拟肠道的蠕动。在超净工作台中将已经灭菌的肠液培养基加入一级发酵罐中体积为225ml，并加入25g的粪便定植珠和50g灭菌的LLDPE塑料粒子，将一级发酵罐密封，连接管路，打开氮气钢瓶开关将流速调至1.0ml/min对发酵罐进行通气除氧。该系统模拟肠道中的无氧环境是通过完好的密封，并通过进气孔向罐内通入氮气除氧来实现，在开始接种时通过ORP电极对水中的氧化还原电势进行检测。通气次数为2次/天。定植期间氮气开关间歇开启，每12h开启一次，每次通气时间为10～20min；每个12小时更换100ml培养基，定植周期为7天。
[0050] 在定植结束后，将一级发酵罐产物引入二级发酵罐中进行二级发酵。
[0051] 在该方法中氮气除氧的方法为，在液体表面加入灭菌的LLDPE塑料粒子使其漂浮在液体表面，达到在除氧过程中物理方法除泡的作用。
[0052] 本发明中的一个实施例中，粪便定植珠的制备过程如下，粪便样本由两名健康人（男性，33岁和32岁）捐赠，他们在捐赠前至少3个月未接受抗生素或
益生菌补充。将粪便样品收集在密封容器中的无菌50mL Falcon管中，同时收集一个Anaerogen小袋（Oxoid）以获得厌氧条件，直至在3小时内转移到厌氧
培养箱中（10％CO2,5％H2和85％N2）。在厌氧条件下将配制20g/L的海藻酸钠溶液和海藻酸钠与结冷胶4：1混合溶液，在沸水浴中搅拌溶解，冷却至室温后，加入粪便去除大颗粒的液体，混合均匀。用
注射器分别吸取上述溶液，以10cm左右的高度逐滴滴入到CaCl2溶液中，控制约5滴/s，形成凝胶珠，静置使其进一步硬化。过滤、洗涤凝胶珠，除去表面的CaCl2溶液。
[0053] 在定植的过程中，将粪便定植珠移至一级发酵罐内50ml，并加入200ml灭菌的培养基。37.5摄氏度恒温水浴。开磁力搅拌器，通氮气进行鼓泡排气。厌氧培养12h，粪便微生物定植第一天为每8h更换100ml新鲜培养基，24h后每天8h补液25ml新鲜培养基。
[0054] 以下为模拟结构环境的发酵系统的运行情况，模拟肠道发酵系统的运行
首先，进行各仪器的准备工作，将一级发酵罐、二级发酵罐、补料瓶、废料罐等进行管路之间的连接。然后，将配置好的模拟肠液培养基布料系统的培养液及模拟肠液改良培养培养基的改良培养液加入到罐中，其中一级发酵罐200ml，二级发酵罐各250ml。随后，将整套设备放入高压
蒸汽灭菌锅进行高压灭菌(121度20分钟)，后将其取出并自然冷却，随后，将制作好的粪便定植珠放入一级发酵罐中并密封，并加入塑料小球，使其铺满整个液面。
[0055] 打开恒温水浴锅，将温度调至37.5度，并将磁力旋转速度调至120r/min。随后打开氮气钢瓶的开关，向发酵罐内鼓吹氮气，并将pH控制器打开，调至ORP模式，待其mv降至-120时关闭氮气，开始厌氧发酵。8h后打开1号蠕动泵开始进行补料每8h更换100ml培养基。24h后每8h补料25ml培养基，10天后，开始进行二级发酵罐定植，将一级发酵罐流出液，在蠕动泵的带动下流速为6微升/min 补料3.5h，并控制另一种蠕动泵以50微升/min 补充模拟肠液培养基7.8h。同时打开第三组蠕动泵以50微升/min 8.9h，抽出液体。定植7天后。关闭模拟肠液培养基管路同时打开模拟肠液改良培养基，进行模拟发酵。7天后取样，进行后续的检测。
[0056] 本发明的目的是提供一种模拟结肠环境体外发酵系统一级该系统的发酵方法，该系统基于PolyFermS模型实验方法，在体外条件下，利用该系统和方法可以通过不同的改良培养基真实的模拟结肠环境进行发酵实验，了解其对结肠内细菌的影响，和其代谢产物的影响。该系统具有仿真度高、稳定性好的特点。
