技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物检测技术领域，具体涉及一种DNA聚合酶的化学修饰方法。
背景技术
[0002] 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是由美国科学家Kary Banks Mulls在1985年发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。这项获得过诺贝尔奖的技术其主要原理是以双链DNA为模板，以人工合成的一段核苷酸序列为引物，以dNTPs为底物，通过DNA聚合酶的催化从而获得大量基因拷贝,DNA聚合酶又称DNA依赖的DNA聚合酶,其主要起到聚合作用：即在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的
配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。
[0003] 最早应用于PCR的DNA聚合酶是Klenow
片段(Klenow fragment，又称克列诺片段)，是最早应用于PCR的DNA聚合酶，但Klenow片段不耐高温，通常在60℃就会失去活性，导致在PCR过程中需要多次补加，从而影响PCR的简便性，随着时代的发展这种酶逐渐被Taq DNA聚合酶所取代。目前应用最广泛的Taq DNA聚合酶由美国黄石公园的
温泉中一种
水生嗜热菌(Thermusaquaticus)YT-1中分离得到。该酶相比最初的Klenow片段，主要特点在于其在热变性反应中不会
钝化，避免重复添加以补全PCR反应中所需的DNA聚合酶；该酶虽然在70℃中加热2h后活性相对最初加入时相差很小，在95℃的环境中加热2h后活性相对最初加入时亦拥有接近一半的活性，但是容易使得PCR反应出现假阴性结果，即非目的基因片段与引物二聚体的产生。
[0004] 为了减少甚至避免这些问题，
热启动PCR应运而生，为了实现这一难题，人们开发出多种方案增强Taq DNA聚合酶的热
稳定性及特异性，以达到良好的热启动效果，得到准确可靠的PCR结果。
[0005] 目前热启动DNA聚合酶的制备方式主要是通过利用Taq DNA聚合酶功能区域的
定位对Taq DNA聚合酶的改造及修饰，主要的修饰方式有核酸适配体修饰，利用寡核苷酸配体与TaqDNA聚合酶结合，从而封闭酶在室温下的活性，这种修饰方式涉及基因技术，其原理相对复杂，并且所需核酸适配体需要非常长的周期筛选，并且目前并未有相关报导发现一种高
亲和性的核酸适配体；特异性
抗体修饰，涉及免疫学的基本原理及技术，以所修饰的Taq DNA聚合酶为
抗原免疫实验动物产生相对应的抗体，经过一系列的筛选后，通过单克隆抗体技术大规模制备该抗体，并利用抗体的蛋白生物活性使其在PCR反应高温条件90℃下失活脱落从而达到PCR热启动的效果，该项修饰技术原理较之核酸适配体修饰要简单易懂，但特定抗体的产生需要非常长的筛选周期，同时容易对免疫动物产生较大的痛苦，不能很好的符合国际实验动物福利。酸酐修饰，主要是利用
马来酸酐与柠康酸酐对特定的活性
氨基酸基团可逆性结合以在常温下封闭其活性，高温下结合脱落从而达到热启动效果，这种修饰方式目前较为被人们推广认同，其实验周期相对以上两类方式较短，但是其经费成本仍然较高，并且修饰方式繁琐。
发明内容
[0006] 本发明意在提供一种成本低且方式简便的热启动DNA聚合酶化学修饰方法，从而增强PCR反应的灵敏性、准确性及高效性。
[0007] 本方案中的一种DNA聚合酶的化学修饰方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一、自构建工程菌中提取的Taq DNA聚合酶；
[0009] 步骤二、化学修饰剂的制备：取EDC、NHS和-COOH溶液，按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于30～37℃
温度下中反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；
[0010] 步骤三、Taq DNA聚合酶修饰：步骤二制备的修饰剂中加入3～6体积的Taq DNA聚合酶充分混合，然后放置于30～37℃温度下反应25min，期间每5min上下颠倒轻柔混匀一次；
[0011] 步骤四、热启动Taq DNA聚合酶：步骤三修饰完成后加入同等体积的1％BSA充分轻柔混匀后，再加入等体积的80％甘油保存于-20℃环境中，即得到热启动Taq DNA聚合酶。
[0012] 有益效果:1、通过本发明的化学修饰方法所制备的热启动Taq DNA聚合酶，在PCR反应中对比未经本发明所述方法修饰的Taq酶及市售的Taq酶其特异性、灵敏性均有显著性的增强，并且可以减少引物二聚体的产生，能很好的达到热启动PCR的效果。
[0013] 2、本发明所述的化学修饰方法中所使用的NHS与EDC有非常多的研究报导，主要是固定化凝胶等应用，并无相关报导应用于热启动DNA聚合酶的制备中，本发明所述的化学修饰方法是一种全新的热启动PCR的实现手段，为制备热启动DNA聚合酶奠定了一种新颖的
基础，并且技术步骤较为简便快捷，可使用于普通技术人员生产；耗费成本较低，可在非常大的程度上减少经费预算。
[0014] 进一步，所述-COOH溶液为乙酸或一水合
柠檬酸。此两种为弱酸或中强酸，能够有效作为羧基供体，同时又不会因为酸性太强而破坏酶的活性结构。
[0015] 进一步，所述步骤二和步骤三的温度为37℃。此温度下能够使EDC、NHS和-COOH溶液充分的混合。
[0016] 进一步，还包括步骤五对Taq DNA聚合酶进行活性测定。通过活性测定，掌握Taq DNA聚合酶的活性，利于后期对PCR反应。
[0017] 进一步，在步骤三中修饰完后放在
冰面上冷却。冷却的目的是终止修饰反应继续进行，并且低温能够保证酶的稳定性。
附图说明
[0018] 图1是经过NHS/EDC修饰前后，酶的扩增能
力的对比；
[0019] 图2是经过修饰前后的Taq DNA聚合酶进行乙
醛脱氢酶基因突变检测图。
具体实施方式
[0020] 下面通过具体实施方式进一步详细的说明：
[0021]
实施例：一种DNA聚合酶的化学修饰方法，包括以下步骤：
[0022] 步骤一、自构建工程菌中提取的Taq DNA聚合酶；
[0023] 步骤二、化学修饰剂的制备：根据所使用羧基供体的不同，分为两个修饰组：第一组，取EDC、NHS、乙
酸溶液按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于37℃温度下反应25min，期间不时轻柔混匀；第二组，取EDC、NHS、一水合柠檬酸溶液按照体积比为1:9:5的比列充分混匀后于37℃温度下反应25min，期间不时轻柔混匀；
[0024] 步骤三、Taq DNA聚合酶修饰：将第一组按体积均分为A组和B组，第二组按体积均分为C组和D组，向A组和B组内加入3倍体积的Taq DNA聚合酶，C组和D组加入6倍体积的Taq DNA聚合酶；
[0025] 步骤四、热启动Taq DNA聚合酶：步骤三修饰完成的A组、B组、C组和D组放置于冰面上冷却，然后加入同等体积的BSA充分轻柔混匀后，再加入等体积的80％甘油保存于-20℃环境中，即得到热启动Taq DNA聚合酶。
[0026] 将实施例经化学修饰后得到的热启动Taq DNA聚合酶应用于PCR反应，以PCR扩增能力检测分离纯化后的Taq酶的活性，取经本实验方法修饰后热启动Taq DNA聚合酶与修饰前的Taq DNA聚合酶同时进行PCR，PCR所用引物为PPAR引物组，分别为：
[0027] PPAR-R：5’-CGTTGTGTGACATCCCGACAG-3’
[0028] PPAR-F：5’-CCAGTATTTAGGAAGCTGTCCTG-3’
[0029] 扩增模板为HepG2细胞系cDNA；PCR反应体系如下：
[0030]
试剂 体积
PPAR-R 0.5μL
PPAR-F 0.5μL
cDNA 0.5μL
Taq 0.5μL
2xPCR mix 12.5μL
ddH2O 10.5μL
[0031] 所有组分加入后，使用小型低速离心机混匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃复性与延伸20s，35个循环；25℃保存。
[0032] PCR结果使用1.5％琼脂糖凝胶
电泳检测。
[0033] 实验结果如图1所示，由图1可知加入修饰后Taq DNA聚合酶组有明显的目的条带反应，而加入分离提取后Taq DNA聚合酶组则无目的条带反应，说明修饰后Taq DNA聚合酶有活性，且特异性良好，而分离提取后未经修饰Taq DNA聚合酶特异性不强。
[0034] 对比实验1
[0035] 本发明所述化学修饰方法处理后的Taq DNA聚合酶与未经修饰后Taq DNA聚合酶应用于PCR检测比对
[0036] 以乙醛脱氢酶2的第12个外显子的部分序列(GenBank:EU373812.1)作为目的基因序列设计一对引物并命名为ALEX-R与ALEX-F，并在ALEX-R引物后加入一个单
碱基A，以验证乙醛脱氢酶2是否突变，引物序列分别为
[0037] ALEX-R：5,—CTGCCAGGGATTTAGGGTA—3,
[0038] ALEX-F：5,—GAGCAGAGGCTGGGTCTT—3,
[0039] 使用提取的某临床血液样品A和B的基因组DNA，取经本实验方法修饰后Taq酶与分离纯化后的Taq酶同时进行PCR扩增，以检测乙醛脱氢酶基因是否存在突变，PCR反应体系如下：
[0040]试剂 体积
ALEX-R 1μL
ALEX-F 1μL
C-DNA 0.5μL
Taq 0.5μL
dNTPs 0.5μL
MgCl2(25mM) 1.5μL
10xPCR Buffer 2.5μL
ddH2O 17.5μL
[0041] 所有组分加入后，使用小型低速离心机混匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸1min，40个循环；72℃复延伸10min；
12℃保存。
[0042] PCR结果使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0043] 实验结果如图2所示，由图2可知使用分离提取后的Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测效果并不理想，而使用乙酸作为修饰成分所修饰后Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测效果要相对较好，并出现了较明显的目的条带；使用一水合柠檬酸作为修饰成分所修饰后Taq DNA聚合酶进行乙醛脱氢酶基因突变检测效果与使用分离纯化后的Taq DNA聚合酶相比无异。即只有使用修饰后酶液作为PCR体系中Taq DNA聚合酶才具有目的基因片段，其余均无目的基因片段；说明经本发明所述的化学修饰方法处理后的TaqDNA聚合酶具有较强的特异性，可以增强PCR反应的灵敏性及准确性。
